CN107250353B - 二价猪流感病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其是关于一种免疫原性组合物，其包括：a)猪流感的经修饰活H3病毒，及b)猪流感的经修饰活H1病毒。此外，本发明是关于对个体实施免疫的方法，其包括向该个体施用本发明的该免疫原性组合物。此外，本发明是关于治疗或预防有需要的个体中由猪流感病毒引起的临床体征的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物。

Description

二价猪流感病毒疫苗
序列表
本申请含有根据37C.F.R.1.821-1.825的序列表。本申请所附序列表以其整体通过引用并入本文。
发明背景
猪中的流感感染首次报告于1918年且第一猪流感病毒是在1930年自猪分离(Shope,R.E.,1931,J.Exp.Med.54:373-385)。猪流感(SI)是由A型及C型流感病毒引起的猪急性呼吸疾病。其严重程度取决于许多因素，包含宿主年龄、病毒菌株及继发性感染(Easterday,1980,Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 288:433-7)。在1998年之前，在美国，自猪主要分离出“古典”H1N1 SI病毒(SIV)(Kida等人，1994,J Gen Virol 75:2183-8；Scholtissek,1994,Eur J Epidemiol 10:455-8；Olsen等人，2000,Arch Virol.145:1399-419)。在1998年，在美国的多个州分离出亚型H3N2的SIV。
SIV复制限于猪的上呼吸道及下呼吸道的上皮细胞、鼻粘膜、筛骨、扁桃体、气管及肺，且病毒排泄及传播排他性地经由呼吸途径发生。感染性病毒可由此自所提及组织以及扁桃体、支气管肺泡灌洗(BAL)液及鼻、扁桃体或口咽拭子分离(Kristien Van Reeth及Wenjun Ma,2013,Current Topics in Microbiology and Immunology 370:173-200)。
流感病毒体是由含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋核衣壳)及内衬有基质蛋白(M1)的外脂蛋白包膜组成。流感A病毒的分段基因组是由8个编码11种多肽的直链、负极性、单链RNA分子组成，该11种多肽包含：形成核衣壳的RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1及PA)及核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；两种自含脂质包膜突出的表面糖蛋白：血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)、核输出蛋白(NEP)；及促凋亡因子PB1-F2。
A型流感病毒细分成17种H(血凝素)及10种N(神经氨酸酶)亚型，其可产生许多可能组合(称为H1N1、H1N2、H2N1、H2N2、H5N1、H5N2等)(Tong等人，2012,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,109:4269-4274)。血凝素(HA)在病毒至受感染细胞的表面的附接中发挥作用，而神经氨酸酶(NA)在后代病毒自受感染细胞的释放中发挥作用，NA由此在病毒传播中发挥作用(Wang等人，2009,Biochem.Biophys.Res.Commun.,386:432-436)。
流感病毒的病原性是由多种病毒及宿主因子调节。在抵抗病毒感染的宿主因子中，I型干扰素(IFN[α]/[β])系统代表强力抗病毒先天防御机制，其相对较早地确立于真核生物体的进化中(Garcia-Sastre,2002,Microbes Infect 4:647-55)。流感A病毒表现受感染细胞中的非结构蛋白，其是抵抗细胞IFN[α]/[β]反应的NS1蛋白(Garcia-Sastre等人，1998,Virology 252:324-30)。
可利用NS1修饰来产生活减毒SIV，如由Solórzano等人，2005(J Virol 79:7535-7543)、Vincent等人，2012(Journal of Virology 1:10597-10605)及WO2006/083286A2中所阐述。已使用反向遗传学生成表现具有73、99或126个氨基酸(Tx/98NS1D73、Tx/98NS1D99及Tx/98NS1D126)的H3N2SIV(sw/Texas/4199-2/98,Tx/98)的NS1截短蛋白质的减毒SIV。
然而，当前可用于抵抗猪流感病毒(SIV)的商业疫苗是基于H1N1及/或H3N2及/或H1N2 SIV且用于肌内注射的灭活、含佐剂全病毒疫苗(Kristien Van Reeth及Wenjun Ma,2013,Current Topics in Microbiology and Immunology 370:173-200)。在针对来自接种疫苗及/或天然感染的SIV具有高抗体含量的母猪畜群中，小猪的接种疫苗应延迟至12-16周龄以避免干扰母源抗体(MDA)。
由死病毒疫苗诱导的免疫反应存在两大缺点。首先，这些疫苗仅诱导血清抗体，粘膜抗体及另外疫苗诱导的血清HI抗体效价在加强接种疫苗之后2周至6周并不快速降低。其次，经灭活疫苗通常并不进入抗原呈递的内源性路径且不能活化病毒特异性CD8+T细胞或CTL反应。
此外，在组合用于生成组合疫苗的不同抗原时，单一组份的效能可受称为干扰的现象影响。
随着将大部分SIV疫苗用于母猪接种疫苗以在小猪中产生长期母体SIV抗体，产生另一问题(Markowska-Daniel等人，2011,Veterinary Immunology and Immunopathology,142:81-86)。鉴于此，因延长的母体免疫性，小猪的接种疫苗可难以与母猪的接种疫苗进行组合。因此，需要高度有效且可在幼龄施用的SIV疫苗。
发明描述
在阐述本发明的方面之前，必须注意，如本文中且如在随附权利要求中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该(the)”包含复数个指示物。因此，举例而言，在提及“抗原”时包含复数个这些抗原，且在提及“病毒”时包含提及那些本领域技术人员已知的一或多种病毒及其等效物，等等。除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与熟习本发明所属领域技术者通常所理解相同的含义。尽管任何类似或等效于那些本文所述者的方法及材料可用于本发明的实践或测试中，但目前所述者是优选的方法、装置及材料。出于阐述及公开如结合本发明使用的出版物中所报告的细胞系、载体及方法的目的，本文所提及的所有出版物以引用方式并入本文中。本文中没有什么内容应解释为承认本发明没有资格早于根据先前发明的此类公开内容。
本发明解决了现有技术中的固有问题且显著改进最新技术。通常，本发明提供包括以下的免疫原性组合物：a)猪流感的经修饰活H3病毒，及b)猪流感的经修饰活H1病毒。
有利地，由本发明提供的实验数据公开本文所提供免疫原性组合物的安全性及效能及若干有利效应。特定而言，数据提供本文中展示猪流感组份的两种经修饰活H3及H1病毒之间并无干扰。此外，本文所提供的实验数据明确证实，猪流感组份的两种经修饰活H3及H1病毒是协同性地一起作用。
此外，据观察，本发明二价疫苗具有交叉保护效应。
另外，在施用至幼龄小猪(数天龄)及具有母源抗体的小猪时，由本发明提供的实验数据公开本文所提供免疫原性组合物的安全性及效能。因此，据观察，本文所提供的免疫原性组合物与母源抗体并无干扰。
术语“免疫原性组合物”是指包括至少一种在施用免疫原性组合物的宿主中诱发免疫学反应的抗原的组合物。该免疫学反应可为对本发明的免疫原性组合物的细胞及/或抗体调介的免疫反应。优选地，免疫原性组合物诱导免疫反应且更优选地赋予抵抗SIV感染的一或多种临床体征的保护免疫性。宿主亦阐述为“个体”。优选地，本文所阐述或提及的任一宿主或个体是动物。
通常，“免疫反应”包含但不限于一或多种下列效应：产生或活化特异性地针对本发明免疫原性组合物中所包含的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、阻抑性T细胞及/或细胞毒性T细胞及/或γ-δT细胞。优选地，宿主显示保护免疫学反应或治疗反应。“保护免疫学反应”或“保护免疫性”显示为减少或缺乏通常由受感染宿主显示的临床体征、较快恢复时间及/或较低感染性持续时间或受感染宿主的组织或体液或排泄物中的较低病原体效价。
若宿主显示保护免疫学反应以便对新感染的抗性得以增强及/或疾病的临床严重程度会减小，则将免疫原性组合物阐述为“疫苗”。
术语“感染”或“受感染”是指个体的SIV感染。
本领域技术人员已知术语“猪流感病毒”。术语猪流感病毒是指来自引起猪流感的正粘液病毒家族的A型或C型流感病毒。尽管正粘液病毒具有三组：A型、B型及C型，但仅A型及C型流感病毒感染猪。猪流感病毒的亚型包含H1N1、H1N2、H3N2及H3N1。H9N2及H5N1亦可发现于猪中。优选地，猪流感病毒是自猪分离的流感病毒。猪流感病毒含有猪NS1基因。代表性猪NS1基因可参见公开序列数据库(例如基因库)且包含但不限于基因库登录号：AJ293939(A/猪/Italy/13962/95(H3N2))及基因库登录号：AJ344041(A/猪/Cotes d'Armor/1121/00(H1N1))。猪流感病毒变体的实例包含但不限于A/猪/Colorado/1/77、A/猪/Colorado/23619/99、A/猪/Cote d'Armor/3633/84、A/猪/England/195852/92、A/猪/Finistere/2899/82、A/猪/HongKong/10/98、A/猪/HongKong/9/98、A/猪/HongKong/81/78、A/猪/Illinois/100084/01、A/猪/Illinois/100085A/01、A/猪/Illinois/21587/99、A/猪/Indiana/1726/88、A/猪/Indiana/9K035/99、A/猪/Indiana/P12439/00、A/猪/Iowa/30、A/猪/Iowa/15/30、A/猪/Iowa/533/99、A/猪/Iowa/569/99、A/猪/Iowa/3421/90、A/猪/Iowa/8548-1/98、A/猪/Iowa/930/01、A/猪/Iowa/17672/88、A/猪/Italy/1513-1/98、A/猪/Italy/1523/98、A/猪/Korea/CY02/02、A/猪/Minnesota/55551/00、A/猪/Minnesota/593/99、A/猪/Minnesota/9088-2/98、A/猪/Nebraska/1/92、A/猪/Nebraska/209/98、A/猪/Netherlands/12/85、A/猪/NorthCarolina/16497/99、A/猪/North Carolina/35922/98、A/猪/NorthCarolina/93523/01、A/猪/North Carolina/98225/01、A/猪/Oedenrode/7C/96、A/猪/Ohio/891/01、A/猪/Oklahoma/18717/99、A/猪/Oklahoma/18089/99、A/猪/Ontario/01911-1/99、A/猪/Ontario/01911-2/99、A/猪/Ontario/41848/97、A/猪/Ontario/97、A/猪/Quebec/192/81、A/猪/Quebec/192/91、A/猪/Quebec/5393/91、A/猪/Taiwan/7310/70、A/猪/Tennessee/24/77、A/猪/Texas/4199-2/98、A/猪/Wisconsin/125/97、A/猪/Wisconsin/136/97、A/猪/Wisconsin/163/97、A/猪/Wisconsin/164/97、A/猪/Wisconsin/166/97、A/猪/Wisconsin/168/97、A/猪/Wisconsin/235/97、A/猪/Wisconsin/238/97、A/猪/Wisconsin/457/985A/猪/Wisconsin/458/98、A/猪/Wisconsin/464/98及A/猪/Wisconsin/14094/99。
本领域技术人员已知术语“H1N1”及“H3N2”。然而，一般而言，A型流感病毒细分成17种H(血凝素)及10种N(神经氨酸酶)亚型，其可产生许多可能组合(指定为H1N1、H1N2…H2N1、H2N2…H5N1、H5N2…等)。因此，术语“H1N1”及“H3N2”是指SIV的血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)亚型的特定组合。
本领域技术人员已知术语“NS1”。特定而言，“NS1”是指编码流感中的非结构蛋白(NS1)的基因。NS1是由流感A及其他病毒的分段基因组编码的8个分子之一。代表性猪NS1基因可参见公开序列数据库(例如基因库)且包含但不限于基因库登录号：AJ293939(A/猪/Italy/13962/95(H3N2))及基因库登录号：AJ344041(A/猪/Cotesd'Armor/1121/00(H1N1))。然而，术语NS1并不仅是指NS1基因，且亦是指由NS1基因编码的NS1基因产物(例如RNA或蛋白质)。在蛋白质情形下，NS1基因产物是全长且具有野生型NS1活性(例如来自流感A/猪/Texas/4199-2/98)。全长野生型猪NS1蛋白质在217至237个氨基酸之间变化。然而，在大部分情形下，全长野生型猪NS1蛋白质是219个氨基酸。此外，术语“NS1缺失”意指在NS1蛋白质内缺失一或多种氨基酸且在NS1基因或核苷酸序列内分别缺失一或多种核酸。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒具有选自由以下组成的群的N(神经氨酸酶)亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及N10。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒是猪流感的H3N2。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒是猪流感病毒的H1N1。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒在NS1基因中具有一或多种突变。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒在NS1基因内具有缺失。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒是减毒猪流感病毒。
术语“减毒”是指病原体具有减小的毒力。在本发明中，“减毒”与“无毒”同义。在本发明中，减毒SIV是毒力已降低从而不会引起猪流感感染的临床体征但能够在目标哺乳动物中诱导免疫反应者，但亦可意指与感染非减毒SIV且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比在感染减毒SIV的动物中临床体征的发生率或严重程度会降低。在此上下文中，术语“降低(reduce/reduced)”意指与如上文所定义的对照组相比降低至少10％、优选地25％、甚至更优选地50％、仍更优选地60％、甚至更优选地70％、仍更优选地80％、仍更优选地90％、甚至更优选地95％及最优选地100％。因此，减毒、无毒SIV菌株是适于纳入包括经修饰活SIV的免疫原性组合物中者。
因此，本发明提供一种免疫原性组合物，其包括a)猪流感的减毒经修饰活H3病毒及b)猪流感的减毒经修饰活H1病毒。
优选地，如本文所提及的术语“减毒”尤其是关于基因组序列中的遗传改造变化(例如通过截短NS1基因或蛋白质)，其尤其在受感染宿主中产生生长至显著低于野生型猪流感病毒的效价的病毒(在相同条件下繁殖及/或具有缺陷IFN拮抗剂活性时)。
在本发明的另一方面中，将本发明的猪流感H3及H1病毒灭活，从而产生全灭活病毒。因此，本发明亦涉及包括以下的免疫原性组合物：a)猪流感的灭活H3病毒及b)猪流感的灭活H1病毒。优选地，猪流感的经修饰活的H3病毒是猪流感的H3N2且猪流感的经修饰活的H1病毒是猪流感病毒的H1N1。
任一常规灭活方法皆可用于本发明目的。因此，可通过本领域技术人员已知的化学及/或物理处理来实施灭活。优选灭活方法包含添加环化二乙烯亚胺(BEI)，其包含添加2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)(环化成二乙烯亚胺(BEI))的溶液。优选其他化学灭活药物包括但不限于TritonX-100、去氧胆酸钠、鲸蜡基三甲基溴化铵、β-丙内酯、硫柳汞、酚及甲醛(福尔马林)。然而，灭活亦可包括中和步骤。优选中和剂包含但不限于硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠及诸如此类。优选福尔马林灭活条件包含福尔马林浓度介于约0.02％(v/v)-2.0％(v/v)、更优选地约0.1％(v/v)-1.0％(v/v)、仍更优选地约0.15％(v/v)-0.8％(v/v)、甚至更优选地约0.16％(v/v)-0.6％(v/v)及最优选地约0.2％(v/v)-0.4％(v/v)之间。培育时间取决于H3N2及H1N1 NS1缺失突变体的抗性。一般而言，实施灭活过程直至可在适宜培养系统中检测到H3N2及H1N1 NS1缺失突变体不再生长为止。
优选地，猪流感的灭活H3及H1病毒是福尔马林灭活的(优选地使用如上文所阐述的浓度)。
可使用已知技术(例如阐述于Nature,1974,252,252-254或Journal ofImmunology,1978,120,1109-13中者)将本发明的猪流感的灭活H3及H1病毒纳入脂质体中。在本发明的另一实施例中，本发明的猪流感的灭活H3及H1病毒可偶联至适宜生物化合物(例如多糖、肽、蛋白质或诸如此类或其组合)。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒是诱变病毒或重组病毒。
术语“诱变病毒”是指具有突变的病毒。在本发明上下文中，术语“突变”应理解为基因组序列、尤其猪流感病毒的RNA序列的变化。举例而言，可通过天然变化、暴露于UV辐照、暴露于化学诱变剂、通过在非允许宿主中传代、通过重组(亦即通过使用另一具有期望抗原的菌株共感染减毒分段病毒)及/或通过遗传改造(例如使用“反向遗传学”)来生成突变体病毒。
优选地，突变是SIV的NS1基因或蛋白质的缺失。
术语“重组体(reassortant)”是指猪流感病毒中的基因组区段交换为猪流感病毒的另一菌株或亚型。猪流感病毒A具有分段基因组，因此，可通过重组(reassortment)将减毒表型转移至另一菌株中(亦即通过共感染减毒病毒及期望菌株，且选择显示两种表型的重组病毒)。因此，可使用重组技术将减毒表型自亲代猪流感病毒菌株(天然突变体、诱变病毒或遗传改造病毒)转移至不同病毒菌株(野生型病毒、天然突变体、诱变病毒或遗传改造病毒)。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活的H3及H1病毒经遗传改造。
术语“遗传改造”是指通过使用“反向遗传学”方式对猪流感病毒实施突变。优选地，本发明的NS1缺失突变体已进行遗传改造。反向遗传学技术涉及制备含有猪流感病毒RNA中对于病毒聚合酶识别及包装所需生成成熟病毒体的信号较为重要的非编码区域的合成重组病毒RNA。重组RNA是自重组DNA模板合成且在活体外使用纯化病毒聚合酶复合物重构以形成可用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。若在活体外或活体内转录合成RNA期间存在病毒聚合酶蛋白，则达成更有效转染。合成重组RNP可恢复成感染性病毒颗粒。前述技术已为本领域技术人员所熟知。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒具有受损干扰素拮抗剂表型。
术语“受损干扰素拮抗剂表型”是指具有减小或抑制的细胞干扰素免疫反应的猪流感病毒。优选地，猪流感病毒具有减小或抑制的干扰素表现及/或活性。优选地，干扰素(IFN)的一或两种类型的表现及/或活性得以减小或抑制。在本发明的一方面中，IFN-[α]的表现及/或活性受到影响。在另一方面中，IFN-[β]的表现及/或活性受到影响。在另一方面中，IFN-[γ]的表现及/或活性受到影响。优选地，在与IFN-相容系统(例如相同条件下的野生型细胞或动物)中的对照(例如PBS或不含干扰素拮抗剂活性的蛋白质)相比时，IFN-[β]及/或IFN-[γ]的表现及/或活性由具有干扰素拮抗剂活性的蛋白质、多肽等减小5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更高。更优选地，在与相同条件下的IFN-相容系统中的对照(例如PBS或不含干扰素拮抗剂活性的蛋白质)相比时，IFN-[β]及/或IFN-[γ]的表现及/或活性由具有干扰素拮抗剂活性的蛋白质、多肽等减小大约1至大约100倍、大约5至大约80倍、大约20至大约80倍、大约1至大约10倍或大约1至大约5倍或大约40至大约80倍或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。因此，在本发明的另一方面中，免疫原性组合物包括a)猪流感的减毒经修饰活H3病毒及b)猪流感的减毒经修饰活H1病毒，其中两种组份中NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力会减弱。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒在NS1蛋白质的羧基末端处具有一或多种突变。
本领域技术人员已熟知术语“羧基末端”。羧基末端亦称为羧基-末端、C-末端、C-末端尾、C-末端端或COOH-末端。在蛋白质自信使RNA翻译时，其是自N-末端至C-末端产生。因此，羧基末端是氨基酸链(蛋白质或多肽)中由自由羧基(-COOH)封端的一端。
术语“突变”已阐述于上文中。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒具有羧基末端截短NS1蛋白质。
术语“羧基末端截短”是指截短羧基末端的NS1蛋白质。术语“羧基末端”已阐述于上文中。术语“截短(truncated或truncation)”是指在NS1蛋白质内缺失一或多种氨基酸或在NS1基因或核苷酸序列内缺失一或多种核酸。因此，NS1基因产物的氨基末端区域部分得以保留，而NS1基因产物的羧基末端区域部分发生缺失。
优选地，本发明的减毒猪流感病毒包括在NS1基因中含有突变的基因组，该突变使得自NS1的羧基末端缺失5、优选地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、100、105、110、115、119、120、121、125、130、135、140、145、146、147、148、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基或自羧基末端缺失5-170、25-170、50-170、100-170、90-160、100-160或105-160、90-150、5-75、5-50或5-25个氨基酸残基。
更优选地，本发明的减毒猪流感病毒包括在NS1基因中含有突变的基因组，该突变使得缺失NS1基因产物中除以下外所有的氨基酸残基：氨基酸残基1-130、氨基酸残基1-129、氨基酸残基1-128、氨基酸残基1-127、氨基酸残基1-126、氨基酸残基1-125、氨基酸残基1-124、氨基酸残基1-123、氨基酸残基1-122、氨基酸残基1-121、氨基酸残基1-120、氨基酸残基1-115、氨基酸残基1-110、氨基酸残基1-100、氨基酸残基1-99、氨基酸残基1-5、氨基酸残基1-85、氨基酸残基1-80、氨基酸残基1-75、氨基酸残基1-73、氨基酸残基1-70、氨基酸残基1-65或氨基酸残基1-60，其中氨基末端氨基酸是编号1。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒具有包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
因此，在本发明的另一方面中，免疫原性组合物包括a)猪流感的减毒经修饰活H3病毒及b)猪流感的减毒经修饰活H1病毒，其中两种病毒具有包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒具有包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒具有自NS1的羧基末端缺失91、92、93或94个氨基酸残基的羧基末端截短NS1蛋白质。
来自羧基末端的缺失包含自NS1蛋白质的羧基末端缺失85至100、更优选地90至95及甚至更优选地91至94个氨基酸残基。最优选地，自NS1蛋白质的羧基末端缺失91、92、93或94个氨基酸残基。更优选地，自NS1蛋白质的羧基末端缺失93个氨基酸残基。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒具有来自A/猪/Texas/4199-2/98的NS1基因或蛋白质。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒编码包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
在本发明的另一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒编码包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒编码自NS1的羧基末端缺失91、92、93或94个氨基酸残基的羧基末端截短NS1蛋白质。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒是A/猪/Texas/4199-2/98。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒是TX/98/del 126。
术语“TX/98/del 126”是指具有编码包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质的NS1缺失突变体的A/猪/Texas/4199-2/98菌株，其中氨基末端氨基酸是编号1。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒含有来自A/猪/Texas/4199-2/98的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP及M且NS1-126基因是来自A/猪/Texas/4199-2/98。
术语“HA、NA、PB2、PB1、PA、NP及M”是指猪流感病毒的基因区段或基因。一般而言，流感A基因组含有8个编码11种蛋白质的基因区段。这些蛋白质包含形成核衣壳的RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1及PA)及核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；两种自含脂质包膜突出的表面糖蛋白：血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)、核输出蛋白(NEP)及PB1-F2。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒是猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体，其阐述于WO2006/083286A2中且称为TX/98/del 126。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒
a.包括具有cDNA与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所陈述的核酸序列具有至少70％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或
b.包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或
c.包括氨基酸序列与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％一致性的NA及HA蛋白质。
优选地，猪流感的经修饰活H3病毒的特征在于包括具有如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2中所陈述的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或在于包括具有编码具有如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或在于包括具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
然而，猪流感的经修饰活H3病毒应亦涵盖猪流感病毒的变体。这些变体与如上文所描述的猪流感的特异性经修饰活H3病毒(特征在于SEQ ID NO1-4)具有基本上相同的免疫学性质。流感A病毒中的HA及NA表面糖蛋白分别涉及疫苗诱导的免疫性且拥有免疫学性质。术语“具有基本上相同的免疫学性质”涵盖(但不限于)，这些变体基本上有效治疗或预防如下文所阐述由猪流感病毒感染引起的临床体征或改良如下文所阐述的效能参数。
此外，必须理解，本发明所提及的变体应包括如下猪流感的经修饰活H3病毒：
a.包括具有cDNA与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所陈述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或
b.包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或
c.包括具有与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少
91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
本领域技术人员已熟知术语“基因或基因区段”。然而，如上文所陈述，流感A基因组(例如SIV的基因组)含有8个编码11种蛋白质的基因区段。
术语“NA及HA”已定义于上文中。HA(血凝素)及NA(神经氨酸酶)是流感A病毒(例如SIV)中的表面糖蛋白。此外，NA是中和抗体的主要抗原性靶。
术语“核酸序列”是指包含DNA分子、RNA分子、cDNA分子或衍生物的多核苷酸。该术语涵盖单链以及双链多核苷酸。本发明核酸涵盖经分离多核苷酸(亦即自其天然背景分离)及基因修饰形式。此外，亦包括化学修饰的多核苷酸，包含天然修饰的多核苷酸(例如糖基化或甲基化多核苷酸)或人工修饰者(例如生物素化多核苷酸)。此外，必须理解，因基因代码简并，如上文所提及的NA及HA蛋白质可由大量多核苷酸编码。此外，术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且是指任一核酸。术语“核酸”及“多核苷酸”亦具体而言包含由除5个生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基构成的核酸。
术语“cDNA”是指互补DNA，其是自信使RNA(mRNA)模板以由酶反转录酶催化的反应来合成。然而，本领域技术人员已熟知术语“cDNA”。
术语“氨基酸序列”、“多肽”及“蛋白质”可互换使用。术语“氨基酸序列”是指由天然氨基酸以及其衍生物构成的氨基酸序列。天然氨基酸在业内已众所周知且阐述于生物化学的标准教科书中。在氨基酸序列内，氨基酸由肽键连结。此外，氨基酸序列的两端称为羧基末端(C-末端)及氨基末端(N-末端)。
术语“一致性”已为业内所习知且是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、亦即参考序列与拟与参考序列进行比较的给定序列之间的关系。通过在将序列最优选地比对以产生最高序列相似性程度之后比较给定序列与参考序列来测定序列一致性，如通过这些序列串之间的匹配所测定。在该比对时，基于逐个位置来确定序列一致性，举例而言，若在一个位置处核苷酸或氨基酸残基一致，则这些序列在该位置处“一致”。然后将这些位置一致性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列一致性％。序列一致性可易于通过已知方法来计算，包含但不限于那些阐述于以下文献中者：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.编辑，Oxford University Press,NewYork(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，部分I，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.编辑，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其教示内容以引用方式并入本文中。设计用于测定序列一致性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列一致性的方法编成测定给定序列间的序列一致性的公开获得的计算机程序。这些程序的实例包含但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acid Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可自NCBI及其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda,MD20894；Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教示内容以引用方式并入本文中)。这些程序最优选地使用默认空位权重比对序列以在给定序列与参考序列之间产生最高序列一致性程度。作为阐释，对于多核苷酸具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、甚至更优选地95％“序列一致性”的核苷酸序列而言，预计给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列一致，只是给定多核苷酸序列可包含最高15、优选地最高10、甚至更优选地最高5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸。换言的，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选地90％、甚至更优选地95％一致性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中最高15％、优选地10％、甚至更优选地5％的核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或参考序列中全部核苷酸中最高15％、优选地10％、甚至更优选地5％数量的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基
团形式。类似地，对于多肽具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、甚至更优选地95％序列一致性的给定氨基酸序列而言，预计多肽的给定氨基酸序列与参考序列一致，只是给定多肽序列可包含最高15、优选地最高10、甚至更优选地最高5个氨基酸改变/参考氨基酸序列的100个氨基酸。换言的，为获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选地90％、甚至更优选地95％序列一致性的给定多肽序列，参考序列中最高15％、优选地最高10％、甚至更优选地最高5％的氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或参考序列中全部数量氨基酸残基的最高15％、优选地最高10％、甚至更优选地最高5％数量的氨基酸可插入参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在测定序列同源性时，并不包含保守取代作为匹配。
必须理解，优选地，在整个序列中测定上文以百分比(％)形式所引述的序列一致性值。然而，可在包括任一上文所提及核酸序列的至少20、至少50、至少100、至少250或至少500个连续核苷酸的片段中或在包括任一上文所提及氨基酸序列的至少20、至少30、至少50、至少80、至少100或至少150个连续氨基酸的片段中测定上文以百分比(％)形式所引述的序列一致性值。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒是嵌合病毒。
术语“嵌合病毒”是指包括猪流感的经修饰活H1病毒或H1N1猪流感病毒的一或多个核苷酸序列或基因区段及并非来自猪流感的经修饰活H1病毒或H1N1猪流感病毒而是来自另一病毒的一或多个核苷酸序列或基因区段的病毒。优选地，猪流感的经修饰活H1病毒或H1N1NS1缺失突变体猪流感病毒包括来自H1N1亚型的血凝素及神经氨酸酶基因区段，但所有其他基因区段皆是来自另一具有不同(非H1N1)HA及NA亚型的猪流感病毒。更优选地，该其他病毒是H3N2猪流感病毒。
特定而言，可使用重组技术将减毒表型自亲代猪流感病毒菌株(例如上文所阐述H3N2 SIV菌株的羧基末端截短NS1)转移至不同病毒菌株(例如H1N1野生型病毒)。因此，通过该技术，可生成基因组区段已交换为猪流感病毒的另一菌株或亚型的猪流感病毒基因组。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒包括H3 SIV菌株的羧基末端截短NS1、优选地H3N2 SIV菌株的羧基末端截短NS1。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒编码包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
在本发明的另一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒编码包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒编码自NS1的羧基末端缺失91、92、93或94个氨基酸残基的羧基末端截短NS1蛋白质。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒是A/猪/Texas/4199-2/98。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒包括来自H1N1亚型的血凝素及神经氨酸酶基因区段。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒包括来自A/猪/Minnesota/37866/1999的血凝素及神经氨酸酶基因区段。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒含有来自A/猪/Minnesota/37866/1999(H1N1)的HA及NA及来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)的PB2、PB1、PA、NP、M且NS1-126基因是来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒是A/猪/Minnesota/37866/1999及TX/98/del 126的嵌合体。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H1病毒
a.包括具有cDNA与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所陈述的核酸序列具有大于70％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或
b.包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有大于70％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或
c.包括具有与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有大于70％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
优选地，猪流感的经修饰活H1病毒的特征在于包括具有如由SEQ ID NO:5或SEQID NO:6陈述的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或在于包括编码具有如由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8陈述的氨基酸序列的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的核酸序列，或在于包括具有如由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8陈述的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
然而，猪流感的经修饰活H1病毒应亦涵盖猪流感病毒的变体。这些变体与如上文所描述猪流感的特异性经修饰活H1病毒(特征在于SEQ ID NO5至8)具有基本上相同的免疫学性质。流感A病毒中的HA及NA表面糖蛋白分别涉及疫苗诱导的免疫性且拥有免疫学性质。术语“具有基本上相同的免疫学性质”涵盖(但不限于)，这些变体基本上有效地治疗或预防如下文所阐述由猪流感病毒感染引起的临床体征或改良如下文所阐述的效能参数。
此外，必须理解，如本发明所提及的变体应包括如下猪流感的经修饰活H1病毒
a.包括具有cDNA与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所陈述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或
b.包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或
c.包括具有与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
因此，在本发明的另一方面中，免疫原性组合物包括a)猪流感的减毒经修饰活H3N2病毒及b)猪流感的减毒经修饰活H1N1病毒，其中两种病毒具有包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
此外，在本发明的另一方面中，免疫原性组合物包括a)猪流感的减毒经修饰活H3N2病毒及b)猪流感的减毒经修饰活H1N1病毒，其中猪流感的经修饰活H3N2病毒含有来自A/猪/Texas/4199-2/98的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP及M且NS1-126基因是来自A/猪/Texas/4199-2/98，且其中猪流感的经修饰活H1N1病毒含有来自A/猪/Minnesota/37866/1999(H1N1)的HA及NA及来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)的PB2、PB1、PA、NP、M且NS1-126基因是来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)。
另外已展示，在施用本发明的免疫原性组合物的一个剂量之后，该免疫原性组合物的该单一剂量是有效的。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物皆调配用于单一剂量施用。
优选地，单一剂量的总体积介于约0.2ml与2.5ml之间，更优选地介于约0.2ml与2.0ml之间，甚至更优选地介于约0.2ml与1.75ml之间，仍更优选地介于约0.2ml与1.5ml之间，甚至更优选地介于约0.4ml与1.25ml之间，甚至更优选地介于约0.4ml与1.0ml之间，其中单一0.5ml剂量或1.0ml剂量最优选。最优选者是总体积为0.5ml、1ml、1.5ml或2ml的单一剂量。
另外已展示，在施用本发明的免疫原性组合物的一个剂量之后，该免疫原性组合物的该单一剂量是有效的。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物是经鼻内施用。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物对于怀孕及哺乳期间的母猪是安全的。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物对于前两周龄内的猪是安全的。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物对于第一周龄内的猪是安全的。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物对于第一天龄内的猪是安全的。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物对于第0天龄的猪是安全的。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物进一步包括医药上可接受的载剂。
术语“医药上可接受的载剂”包含任何及全部溶剂、分散介质、涂覆剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫攻击剂及其组合。
“稀释剂”可包含水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可尤其包含氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包含白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
在本发明的一方面中，医药上可接受的载剂是磷酸盐缓冲盐水。
优选地，免疫原性组合物进一步包括蔗糖明胶稳定剂。
在本发明的一方面中，医药上可接受的载剂是壳聚醣。
壳聚醣是天然去乙酰化多糖，来自甲壳类动物(例如虾、螃蟹)、昆虫及其他无脊椎动物中几丁质。最近，Rauw等人，2009(Vet Immunol Immuno p134:249-258)证实，壳聚醣可增强活新城鸡瘟疫苗的细胞免疫反应且促进其保护效应。此外，Wang等人，2012(ArchVirol(2012)157:1451-1461)所展示的结果公开壳聚醣作为用于活减毒流感疫苗中佐剂的潜在性。
优选地，免疫原性组合物可进一步包含一或多种其他免疫调节剂，例如介白素、干扰素或其他细胞介素。可用于本发明背景中的佐剂及添加剂的量及浓度可轻易地由本领域技术人员测定。
在一些方面中，本发明免疫原性组合物含有佐剂。本文所用的“佐剂”可包含氢氧化铝及磷酸铝；皂苷，例如QuilA、QS-21(Cambridge Biotech公司，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals公司，Birmingham,AL)；油包水乳液；水包油乳液；水包油包水乳液。该乳液可尤其基于轻质液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(尤其为异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更特定而言为植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，尤其为异硬脂酸酯。油可与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，特定而言为山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇与油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的视情况经乙氧基化的酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言为普流尼克(Pluronic)产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory and Practical Applicationof Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),John Wiley and Sons,NY,pp51-94(1995)及Todd等人，Vaccine15:564-570(1997)。实例性佐剂是阐述于M.Powell及M.Newman编辑(PlenumPress,1995)的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页上的SPT乳液及阐述于该同一本书第183页上的乳液MF59。
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚化合物。优选的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其与糖类或多元醇的聚烯基醚交联。此等化合物称为术语聚羧乙烯制剂(carbomer)(Pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员亦可参照美国专利第2,909,462号，其阐述与聚羟基化化合物交联的这些丙烯酸系聚合物，该聚羟基化化合物具有至少3个(优选不多于8个)羟基，至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团代替。优选基团是那些含有2至4个碳原子者，例如乙烯基、烯丙基及其他乙烯是不饱和基团。不饱和基团自身可含有诸如甲基等其他取代基。以名称卡波姆(Carbopol)(BFGoodrich,Ohio,USA)出售的产品尤其适合。其可与烯丙基蔗糖或与烯丙基异戊四醇交联。其中可提及者是卡波姆974P、934P及971P。最优选使用卡波姆971P。共聚物EMA(Monsanto)属马来酸酐与烯基衍生物的共聚物，其为马来酸酐与乙烯的共聚物。将这些聚合物溶于水中会产生酸性溶液，优选将其中和至生理pH以得到佐剂溶液，将免疫原性的、免疫的或疫苗组合物本身并入至该佐剂溶液中。
其他适宜佐剂尤其包含但不限于RIBI佐剂系统(Ribi公司)、嵌段共聚物(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)(重组的或其他性质的)的不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽或天然或重组的细胞因子或其类似物或内源细胞因子释放的攻击物。
预期佐剂可以约100μg至约10mg/剂量、优选以约100μg至约10mg/剂量、更优选以约500μg至约5mg/剂量、甚至更优选以约750μg至约2.5mg/剂量及最优选地以约1mg/剂量的量添加。另一选择是以最终产物的体积计，佐剂的浓度可为约0.01至50％，优选为约2％至30％，更优选为约5％至25％，仍更优选为约7％至22％，及最优选地为10％至20％。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物包括2log10至8log10猪流感的经修饰活H1病毒及/或2log10至8log10猪流感的经修饰活H3病毒。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物包括2log10至6log10猪流感的经修饰活H1病毒及/或2log10至6log10猪流感的经修饰活H3病毒。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物包括2log10至4log10猪流感的经修饰活H1病毒及/或2log10至4log10猪流感的经修饰活H3病毒。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物是疫苗。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物是二价疫苗。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物有效治疗及/或预防有需要的个体中由SIV引起的临床体征。
术语“治疗及/或预防”是指减小畜群中特定SIV感染的发病率或减小由特定SIV感染引起或与其有关的临床体征的严重程度。因此，术语“治疗及/或预防”亦是指与动物尚未接受如本文所提供的免疫原性组合物的动物群相比，在动物已接受有效量的这些免疫原性组合物的动物群中，减小畜群中感染特定SIV的动物数量(＝减小特定SIV感染的发病率)或减小通常与SIV感染有关或由其引起的临床体征的严重程度。
“治疗及/或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物施用需要此一治疗/预防或可自其获益的个体或个体畜群。术语“治疗”是指在个体或畜群的至少一些动物已感染该SIV且其中这些动物已展示一些由该SIV感染引起或与其有关的临床体征后，施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”是指在患有SIV的该个体的任一感染或至少该动物或动物群中没有动物并不展示任一由该SIV感染引起或与其有关的临床体征之前，施用个体。术语“预防(prophylaxis及preventing)”可在本申请案中互换使用。
本文所用的术语“有效量”意指但不限于诱发或能够诱发个体中的免疫反应的抗原量。该有效量能够减小畜群中特定SIV感染的发病率或减小特定SIV感染的临床体征的严重程度。
优选地，与未治疗或使用可在本发明之前获得的免疫原性组合物治疗但随后感染特定SIV的个体相比，临床体征的发病率或严重程度减小至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、仍更优选地至少90％、仍更优选地至少95％及最优选地100％。
本文所用的术语“临床体征”是指个体中来自SIV的感染体征。感染的临床体征取决于所选病原体。这些临床体征的实例包含但不限于呼吸窘迫、耳炎、被毛粗乱、微热、抑郁症及食欲减小。然而，临床体征亦包含但不限于可自活动物直接观察到的临床体征。可自活动物直接观察到的临床体征的实例包含流鼻涕与眼泪、嗜睡、咳嗽、哮鸣、重击、高热、失重、去水、跛行、消瘦、皮肤苍白、羸弱及诸如此类。
优选地，与未治疗或使用可在本发明之前获得的免疫原性组合物治疗但随后感染特定SIV的个体相比，经治疗个体中临床体征的发病率或严重程度减低是指重量损失降低、较低病毒负荷、肺病灶减少、减少病毒脱落、直肠温度降低或其组合。
术语“个体”是指动物，优选地是指哺乳动物，例如小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、仓鼠、猪、绵羊、狗、猫、马、猴或牛，且亦优选地是指人类。更优选地，个体是猪。
本文所用的术语“有需要(in need或of need)”意指，施用/治疗涉及加强或改良健康或临床体征或对于接受本发明的免疫原性组合物的动物的健康的任一其他阳性医学效应。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒是协同性地一起作用。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒的浓度与单价免疫原性组合物中猪流感的H3病毒浓度及单价免疫原性组合物中猪流感的H1病毒浓度相比减小。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒增加了对抗异源攻击的保护，提供交叉保护效应。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒增加了对抗H1攻击的保护。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒增加了对抗H1N1攻击的保护。
在本发明的一方面中，经修饰活H3病毒是H3N2病毒，优选是如本文所阐述的猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
本发明亦是关于对个体实施免疫的方法，其包括向个体施用如本文所阐述的任一免疫原性组合物。
术语“免疫”是关于通过以下方式达成的主动免疫：向拟免疫的个体施用免疫原性组合物，由此引起针对该免疫原性组合物中所包含的抗原的免疫学反应。
优选地，免疫使得减小畜群中特定SIV感染的发病率或减小由特定SIV感染引起或与其有关的临床体征的严重程度。
此外，使用如本文所提供的免疫原性组合物对有需要的个体进行免疫使得可预防由SIV感染的个体的感染。甚至更优选地，免疫针对SIV感染产生有效、长效、免疫学反应。应理解，该时间段将持续大于2个月、优选地大于3个月、更优选地大于4个月、更优选地大于5个月、更优选地大于6个月。必须理解，免疫不能在实施免疫的所有个体中皆有效。然而，该术语需要畜群的大部分个体有效免疫。
优选地，在此上下文中设计通常(亦即并无免疫化)发生通常由SIV感染引起或与其有关的临床体征的个体畜群。本领域技术人员可易于测定畜群个体是否有效免疫。优选地，若与未实施免疫或使用可在本发明之前获得的免疫原性组合物实施免疫但随后感染特定SIV的个体相比，给定畜群中至少33％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、仍更优选地至少95％及最优选地100％个体的临床体征的发病率或严重程度减小至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、仍更优选地至少90％、仍更优选地至少95％及最优选地100％，则免疫应是有效的。
本发明亦是关于治疗或预防有需要的个体中由猪流感病毒引起的临床体征的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物。
术语“治疗或预防”、“临床体征”、“个体”、“有需要”及“有效量”已定义于其他地方。
本发明亦是关于与相同物种的未经免疫对照组的个体相比减小
有需要个体中病毒脱落的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物。
术语“减少”意指，与未治疗(未实施免疫)但随后感染特定SIV的个体相比，病毒脱落减少至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、仍更优选地至少95％、最优选地100％。本领域技术人员熟知如何量测病毒脱落。
本发明亦是关于与相同物种的免疫化对照组的个体(使用包括猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒的免疫原性组合物实施免疫)相比会减少有需要个体中病毒脱落的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物。
术语“减少”意指，与使用包括猪流感病毒的单价NS1缺失突变体的免疫原性组合物实施免疫但随后感染特定SIV的个体相比，病毒脱落减少至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、仍更优选地至少90％及最优选地至少95％及最优选地100％。本领域技术人员熟知如何量测病毒脱落。
术语“病毒脱落”是指诸如鼻涕等分泌物且另外是指通过咳嗽或喷嚏产生的气体微粒。因此，可通过检验鼻拭子中的病毒效价或通过肺中的病毒效价来测定病毒脱落。术语“病毒脱落”另外涵盖病毒转移至易感动物中(亦即哨点)。本领域技术人员熟知如何量测病毒脱落。
术语“猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒”是指具有H3及H1且为经修饰活病毒的任一SIV病毒。优选地，术语“猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒”是指在NS1蛋白质中具有缺失的任一SIV病毒。此外，术语单价等效于一价且仅是指与多价疫苗(例如二价或三价疫苗)相比的单一SIVNS1缺失突变体。优选地，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是本文所阐述的猪流感病毒的H1N1或H3N2缺失突变体。最优选地，猪流感病毒的单价NS1缺失突变体是本文所阐述的猪流感病毒的H1N1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是猪流感病毒的H1N1NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是如本文所阐述的猪流感病毒的H1N1 NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是猪流感病毒的H3N2NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是如本文所阐述的猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
本发明克服了现有技术的缺陷且提供用于提供针对SIV的增加的猪保护的新颖方法。特定而言，本发明提供向母猪及/或出生后数天内的幼小小猪施用免疫学有效量的疫苗以针对SIV对其实施免疫的方法。
本发明亦是关于对具有抗SIV抗体的个体接种疫苗的方法，其包括向该动物施用单一有效剂量的如本文所阐述的免疫原性组合物的步骤。
术语“抗SIV抗体”是指特异性针对SIV的抗体。这些抗SIV抗体的实例包括但不限于通过使用SIV疫苗对母猪接种疫苗获得的母源抗体或通过母猪的SIV感染获得的母源抗体。此外，小猪中的抗SIV抗体可因应于小猪的SIV感染而出生。术语“抗SIV抗体”应另外意指但不限于，小猪已暴露于或暴露于(母体抗体的被动转移)优选地至少1:10、更优选地大于1:20、甚至更优选地大于1:40、甚至更优选地大于1:80、甚至更优选地1:160、甚至更优选地大于1:320及最优选地大于1:640的可检测抗SIV抗体效价。优选地，抗SIV抗体效价在特异性抗SIV免疫分析中可检测且可量化。
优选地，小猪中的抗SIV抗体是因应于小猪SIV感染而产生。然而，更优选地，那些抗SIV抗体是因应于使用SIV疫苗对母猪接种疫苗或因应于母猪的SIV感染而产生的母源抗体。母源抗体经由初乳及乳液被动转移至小猪中。
使用疫苗抗原干扰母源抗体可减小或甚至消除针对活以及灭活疫苗的免疫反应。已针对活疫苗以及非复制型(亦即灭活或亚单位疫苗)报导母源抗体的疫苗诱导性免疫反应的不同干扰程度(Markowska-Daniel等人，2011,Veterinary Immunology andImmunopathology,142:81-86)。最优选地，动物接种疫苗应始于恰在母体抗体消失时，但此方式可能因个体之间的高度可变性而不可行(Monteil等人，1997)。
因此，用于针对SIV进行免疫化的当前接种疫苗策略涉及向仅两周至三周龄及更老的猪施用疫苗，此乃因小于此年龄组的小猪因先前母猪暴露或接种疫苗而具有关于SIV呈阳性母体抗体。在本发明方法之前，据信，存在母体抗体或其他催乳激素可潜在干扰这些小猪中接种疫苗的效能，此乃因母体抗体能够在小猪免疫系统可识别疫苗且开始分泌其自身抗体之前中和疫苗。因此，在母体免疫性前，应避免幼小小猪的接种疫苗。
面对此问题，若干接种疫苗策略预测出用于幼小动物的两次性接种疫苗方案：第一接种疫苗是在幼龄给予以保护那些具有低母源抗体的动物。众所周知，此第一接种疫苗在具有高母源抗体效价的动物中可能因干扰疫苗抗原而并不有效。为亦保护这些动物，在高母源抗体含量预计已降低时，需要第二接种疫苗。
有利地，由本发明提供的实验数据公开本文所提供的免疫原性组合物在施用具有母源抗体的数天龄小猪时的安全性及效能。实际上，与未经接种疫苗的小猪相比，如本文所阐述在出生之后数天内接种疫苗的小猪具有减少的与疾病有关的临床体征。
本发明亦是关于预防或减少个体的早期SIV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物。
有利的是，由本发明所提供的实验数据公开本文所提供的免疫原性组合物在施用数天龄小猪及具有母源抗体的小猪时的安全性及效能。然而，当前针对SIV进行免疫化的接种疫苗策略涉及向仅两周至三周龄及更老的猪施用疫苗，此乃因小于此年龄组的小猪可因先前母猪暴露或接种疫苗而具有关于SIV呈阳性母体抗体。因此，本发明另外涉及预防或减少个体的早期SIV感染的方法。
优选地，拟实施免疫的猪为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天龄。更优选地，拟实施免疫的该猪为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天龄。最优选地，拟实施免疫的该猪为1、2、3、4、5、6或7天龄。
然而，必须理解，在对数天龄小猪接种疫苗之后，小猪的免疫系统需要数天来建立针对SIV感染的免疫性。因此，优选地，在前24h龄内对小猪实施免疫。
然而，更优选地，在分娩之前至少使用本文所阐述的免疫原性组合物对怀孕母猪接种疫苗一次，且另外，在数天内(优选地在第一周龄内或在前24h龄内)使用本文所阐述的免疫原性组合物对出生小猪接种疫苗。因此，小猪已由母源免疫性保护且另外由疫苗诱导性免疫性保护。
术语“早期SIV感染”是指猪幼龄的SIV感染。幼龄SIV感染是指动物在前四周龄内、更优选地在前三周龄内、最优选地在前两种周龄之间具有SIV感染。
术语“减少”意指，与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，早期SIV感染减少至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、仍更优选地至少90％及最优选地至少95％及最优选地100％。
在本发明的另一方面中，该个体是选自由猪、牛、猫及狗组成的列表。
在本发明的一方面中，施用免疫原性组合物一次。
应理解，单一剂量仅施用一次。如实例中所展示，如本文所提供的免疫原性组合物已证实在向有需要的个体施用单一剂量之后是有效的。
优选地，单一剂量的总体积介于约0.2ml与2.5ml之间，更优选地介于约0.2ml与2.0ml之间，甚至更优选地介于约0.2ml与1.75ml之间，仍更优选地介于约0.2ml与1.5ml之间，甚至更优选地介于约0.4ml与1.25ml之间，甚至更优选地介于约0.4ml与1.0ml之间，其中单一0.5ml剂量或1.0ml剂量最优选。最优选者是总体积为0.5ml、1ml、1.5ml或2ml的单一剂量。
在本发明的一方面中，以两个或更多个剂量施用免疫原性组合物。
然而，可以两个或更多个剂量施用免疫原性组合物，其中在施用第二(加强)剂量之前施用第一剂量。优选地，在第一剂量之后至少15天施用第二剂量。更优选地，在第一剂量之后15天与40天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少17天施用第二剂量。仍更优选地，在第一剂量之后17天与30天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少19天施用第二剂量。仍更优选地，在第一剂量之后19天与25天之间施用第二剂量。最优选地，在第一剂量之后至少21天施用第二剂量。在二时次施用方案的一优选方面中，免疫原性组合物的第一及第二剂量是以相同量施用。优选地，每一剂量使用上文所指定的优选量，其中1ml剂量的第一及第二剂量最优选。除第一及第二剂量方案外，替代实施例包括其他后续剂量。举例而言，可在这些方面中施用第三、第四或第五剂量。优选地，以与第一剂量相同的量施用后续第三、第四及第五剂量方案，其中各剂量之间的时间范围与上文所提及第一及第二剂量之间的时间一致。
在本发明的另一方面中，经鼻内施用该免疫原性组合物。
优选地，局部或全身性施用免疫原性组合物。常用的适宜施用途径是经口或非经肠施用，例如鼻内、静脉内、肌内、腹膜腔内、皮下以及吸入。然而，端视化合物的性质及作用模式，亦可通过其他途径施用免疫原性组合物。然而，最优选地，经鼻内施用免疫原性组合物。
在本发明的一方面中，个体是猪流感病毒母体抗体阴性。
本领域技术人员熟知如何量测母源抗SIV抗体。
在本发明的一方面中，将免疫原性组合物在怀孕及哺乳期间施用母猪。
有利的是，由本发明所提供的实验数据公开免疫原性组合物在怀孕母猪中的有效性及安全性。
因此，提供通过以下方式针对SIV对猪接种疫苗的方法：在分娩之前向怀孕母猪施用本发明SIV疫苗至少次，优选地在分娩之前施用两次且最优选地在分娩之前施用三次(“重复剂量”)。然而，优选地，在分娩之前使用本发明SIV疫苗利用该疫苗的单一剂量对怀孕母猪接种疫苗一次。然而，在向母猪施用疫苗三次时，第一施用应发生于在分娩之前50天与60天之间，优选地在分娩之前52天与58天之间，且最优选地在分娩之前54天与56天之间。第二施用应发生于在分娩之前30天与40天之间，优选地在分娩之前32天与38天之间，且最优选地在分娩之前34天与36天之间。最终施用应发生于在分娩之前10天与20天之间，优选地在分娩之前12天与18天之间，且最优选地在分娩之前14天与16天之间。
另外发现，出人意料地，母体免疫性并不干扰出生后不久的小猪的成功接种疫苗，且实际上，如本文所阐述在出生之后约一个月内接种疫苗的小猪与未经接种疫苗小猪相比具有减少的与疾病有关的临床体征。特定而言，已展示，在小猪已于前三周龄内、在第一周龄内、在一天龄内及在前24小时龄内接种疫苗时，并不干扰小猪的成功接种疫苗。
在本发明的一方面中，在第一月龄内向猪施用免疫原性组合物。
优选地，拟实施免疫的猪介于1天龄至40天龄、1天龄至30天龄、1天龄至21天龄之间，更优选地，拟实施免疫的该个体介于1天龄至10天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至9天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至8天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至7天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至6天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至5天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至4天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至3天龄之间、甚至更优选地1或2天年龄及最优选地1天龄或0天龄。
更优选地，拟实施免疫的该猪为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天龄。
有利的是，由本发明提供的实验数据公开免疫原性组合物在约3周龄及更幼小小猪中的有效性。
在本发明的一方面中，在前两周龄内向猪施用免疫原性组合物。
在本发明的一方面中，在第一周龄内向猪施用免疫原性组合物。
在本发明的另一方面中，在1天龄时向猪施用免疫原性组合物。有利的是，由本发明提供的实验数据公开免疫原性组合物在1天龄小猪中的有效性。
在本发明的另一方面中，在前24h龄内向猪施用免疫原性组合物。
有利的是，由本发明提供的实验数据公开免疫原性组合物在前24h龄内的猪中的有效性。
必须理解，前24h龄内的猪为24h龄或更幼小。优选地，拟实施免疫的该猪介于1h龄至24h龄、2h龄至24h龄、4h龄至24h龄、6h龄至24h龄、8h龄至24h龄、10h龄至24h龄、12h龄至24h龄、14h龄至24h龄、16h龄至24h龄、18h龄至24h龄、20h龄至24h龄、22h龄至24h龄之间。更优选地，拟实施免疫的该猪为1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h龄。
在本发明的一方面中，个体为猪流感病毒母体抗体阳性。本领域技术人员熟知如何量测母源抗SIV抗体。
优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约102pfu(蚀斑形成单位)至约108pfu/剂量、优选地约103pfu至约107pfu/剂量的量、甚至更优选地以约104pfu至约107pfu/剂量的量、最优选地以约104pfu至约106pfu/剂量的量包括猪流感的经修饰活H1病毒或本发明H1N1SIV。
更优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu/剂量的量包括猪流感的经修饰活H1病毒或本发明H1N1 SIV。
优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约102pfu(蚀斑形成单位)至约108pfu/剂量、优选地约103pfu至约107pfu/剂量的量、甚至更优选地以约104pfu至约107pfu/剂量的量、最优选地以约104pfu至约106pfu/剂量的量包括猪流感的经修饰活H3病毒或本发明H3N2SIV。更优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu/剂量的量包括猪流感的经修饰活H3病毒或本发明H3N2 SIV。
优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约102pfu(蚀斑形成单位)至约108pfu每一组份/剂量、优选地约103pfu至约107pfu每一组份/剂量的量、甚至更优选地以约104pfu至约107pfu每一组份/剂量的量、最优选以约104pfu至约106pfu每一组份/剂量的量包括猪流感的经修饰活H3及H1病毒或本发明的H1N1及H3N2 SIV。更优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu每一组份/剂量的量包括猪流感的经修饰活H3及H1病毒或本发明的H1N1及H3N2SIV。
优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约1至约10log10FAID50/ml(荧光抗体感染剂量)/剂量、优选地约2至约8log10FAID50/ml/剂量的量、优选地以约2至约7log10FAID50/ml/剂量的量、更优选地以约2至约6log10 FAID50/ml/剂量的量、甚至更优选地以约2至约5log10FAID50/ml/剂量的量、最优选以约2至约4log10 FAID50/ml/剂量的量包括猪流感的经修饰活H1病毒或本发明H1N1 SIV。更优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或log10 FAID50/ml/剂量的量包括猪流感的经修饰活H1病毒或本发明H1N1 SIV。
优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约1至约10log10FAID50/ml(荧光抗体感染剂量)/剂量、优选地约2至约8log10 FAID50/ml/剂量的量、优选地以约2至约7log10FAID50/ml/剂量的量、更优选地以约2至约6log10 FAID50/ml/剂量的量、甚至更优选地以约2至约5log10FAID50/ml/剂量的量、最优选地以约2至约4log10 FAID50/ml/剂量的量包括猪流感的经修饰活H3病毒或本发明H3N2 SIV。更优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或log10 FAID50/ml/剂量的量包括猪流感的经修饰活H3病毒或本发明H3N2 SIV。
优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约1至约10log10FAID50/ml(荧光抗体感染剂量)每一组份/剂量、优选地约2至约8log10FAID50/ml每一组份/剂量的量、优选地以约2至约7log10 FAID50/ml每一组份/剂量的量、更优选地以约2至约6log10 FAID50/ml每一组份/剂量的量、甚至更优选地以约2至约5log10 FAID50/ml每一组份/剂量的量、最优选地以约2至约4log10 FAID50/ml每一组份/剂量的量包括猪流感的经修饰活H3及H1病毒或本发明的H1N1及H3N2 SIV。更优选地，本发明的二价免疫原性组合物以约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或log10 FAID50/ml每一组份/剂量的量包括猪流感的经修饰活H3及H1病毒或本发明的H1N1及H3N2。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物包括2log10至8log10猪流感的经修饰活H1病毒及/或2log10至8log10猪流感的经修饰活H3病毒。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物包括2log10至6log10猪流感的经修饰活H1病毒及/或2log10至6log10猪流感的经修饰活H3病毒。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物包括2log10至4log10猪流感的经修饰活H1病毒及/或2log10至4log10猪流感的经修饰活H3病毒。
在本发明的一方面中，与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少病毒脱落、降低直肠温度或其组合。
术语“减小(reducing、reduced、reduction)”或“降低”意指，与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，效能参数(重量损失、病毒负荷、肺病灶、病毒脱落、直肠温度)减低至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％及最优选地100％。本领域技术人员熟习如何量测效能参数的改良。
有利的是，由本发明提供的实验数据公开免疫原性组合物通过降低病毒负荷、减小肺病灶及减少病毒脱落所达成的有效性。
在本发明的一方面中，与使用猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒实施免疫的相同物种的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少病毒脱落、降低直肠温度或其组合。
本领域技术人员已熟知术语“病毒负荷”。术语病毒负荷在本文中可与术语病毒效价互换使用。病毒负荷或病毒效价是活动性病毒感染的严重程度的量度，且可通过本领域技术人员已知的方法来测定。该测定可基于(例如)通过至病毒蛋白的抗体结合来检测病毒蛋白及另外或另一选择为通过扩增方法(例如RT-PCR)来检测病毒核酸。通过核酸扩增方法监测血浆中的病毒体相关性病毒RNA是广泛用于评价逆转录病毒疾病的状态及进展及评估预防性及治疗性干预的有效性的参数。可通过估计所涉及体液中的活病毒量(例如RNA拷贝数/毫升血样血浆)来计算实例性病毒负荷或病毒效价。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是猪流感病毒的H1N1NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是如本文所阐述的猪流感病毒的H1N1 NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是猪流感病毒的H3N2NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒是如本文所阐述的猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，治疗或预防使得与相同物种的未经治疗对照组的动物相比病毒负荷期缩短。
在本发明的一方面中，治疗或预防使得自攻击或感染之后第5天病毒脱落会减少。
在本发明的另一方面中，治疗或预防使得自攻击或感染之后第1天病毒脱落会减少。
在本发明的另一方面中，治疗或预防使得自攻击或感染之后第2天病毒脱落会减少。
有利的是，由本发明提供的实验数据公开在攻击之后接受本文所阐述免疫原性组合物的猪中SIV病毒的脱落会减少。
优选地，与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，自使用SIV攻击或感染之后第5天、更优选地自攻击或感染之后第4天、更优选地自攻击或感染之后第3天及最优选地自攻击或感染之后第1或2天SIV病毒的脱落会减少。
术语“病毒脱落减少”意指，与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，脱落减少至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％及最优选地100％。本领域技术人员熟知如何量测脱落减小。
在本发明的一方面中，与使用猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒实施免疫的相同物种的个体相比，使用较低浓度的如本文所阐述的免疫原性组合物对个体实施免疫。
术语“较低浓度”意指，在与猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒或猪流感病毒的单价NS1缺失突变体相比时，如本文所阐述猪流感的经修饰活H3及H1病毒或H1N1及猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体在本发明的二价免疫原性组合物中的浓度减低大约1倍至大约100倍、大约5倍至大约80倍或大约20倍至大约80倍或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、72、75、80、85、90、95或100倍。本领域技术人员熟知如何量测病毒浓度。实例是蚀斑形成单位分析、焦点形成分析、终点稀释分析(例如TCID50或FAID50)、蛋白质分析、血球凝集分析、双金鸡宁酸分析、单一放射免疫扩散分析、透射电子显微术、可调式阻性脉冲感测、流式细胞术、定量聚合酶链式反应、酶联免疫吸附分析及诸如此类。优选地，本发明的二价免疫原性组合物分别以约1至约4log10 FAID50/ml(萤光抗体感染剂量)/剂量、约2至约4log10 FAID50/ml/剂量、最优选地约2至约3log10 FAID50/ml/剂量的量包括本发明的猪流感的经修饰活H3及H1病毒或SIV的H1N1 NS1及H3N2 NS1缺失突变体。本文所阐述的二价免疫原性组合物是协同组合，其以有效诱导保护个体免受有毒SIV菌株之后续攻击的量包括：i)如本文所阐述猪流感的经修饰活H1病毒或猪流感病毒的H1N1 NS1缺失突变体及ii)如本文所阐述猪流感的经修饰活H3病毒或猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。特定而言，与仅包括猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒或猪流感病毒的NS1缺失突变体的免疫原性组合物相比，需要较低浓度的如本文所阐述的二价免疫原性组合物来诱导个体保护。因此，与猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒或猪流感病毒的NS1缺失突变体相比，包括猪流感的经修饰活H3及H1病毒或猪流感病毒的H1N1 NS1及H3N2 NS1缺失突变体的二价疫苗产生较大保护。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒是协同性地一起作用。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3及H1病毒的浓度与单价免疫原性组合物中猪流感的H3病毒浓度及单价免疫原性组合物中猪流感的H1病毒浓度相比减小。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒增加了对抗异源攻击的保护，提供交叉保护效应。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒增加了对抗H1攻击的保护。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒增加了对抗H1N1攻击的保护。
在本发明的一方面中，猪流感的经修饰活H3病毒是猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感的单价经修饰活H3病毒是如本文所阐述的猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
本文所提供的实验数据中展示，猪流感的经修饰活H3及H1病毒或猪流感病毒的H1N1 NS1及H3N2缺失突变体一起的组合令人吃惊地其效力大于个别组份的聚集效应。
本发明二价疫苗的协同效应极其清楚地显示为其能够在以远低于单价H1N1疫苗所需含量的内容物含量施用时提供保护。本发明二价疫苗以仅3.13log10 FAID50/mL的总剂量施用即提供保护，与之相比，单价疫苗在以4.99log10 FAID50/mL的剂量(约大于二价疫苗的总剂量72倍)施用之后展示类似保护程度。此外，Vincent等人，2012(Journal ofVirology 19:10597-10605)已展示，1×106TCID50(对应于6log10FAID50)的单价H3N2会提供保护(约大于二价疫苗的总剂量741倍)。因此，二价疫苗中的H1及H3组份的浓度显著小于单价疫苗中所需的浓度。此是令人吃惊的意外协同效应。
另外亦存在证据证实在考虑攻击病毒的量时二价疫苗的协同效应。单价疫苗即使以较高剂量施用亦对小于相同攻击分离株大约3倍的攻击仅提供类似保护程度。
自这些研究中所生成的数据得出以下的结论：当疫苗以二价产物施用时与其作为单价产物施用时相比远低的抗原剂量下，自鼻道脱落的病毒量会减少、肺部呈病毒分离株阳性会减少且主要效能参数泛总肺病灶会减少。总而言之，数据指示，单一鼻内剂量的二价疫苗比在这些研究中幼稚猪中所使用的较高剂量单价疫苗更为有效。
本发明协同组合较为有利，此乃因不良效应的机会得以减低。
另外，含有低于个别组份的浓度的二价疫苗的制造亦明显较为容易且较为便宜。此外，除上述协同浓度效应外，存在另一令人吃惊的有利协同效应。H3组份与H1组份协同作用。二价疫苗的协同效应极其清楚地显示为其能够提供对于异源H1N2(A/猪/NorthCarolina/001169/2006)SIV分离株的保护。因此，存在交叉保护效应。此效应另外具有协同性，此乃因本发明二价疫苗是如上文所阐述以远低于单价疫苗所需含量的内容物含量施用。
在本发明的一方面中，猪流感病毒的单价NS1缺失突变体是猪流感病毒的H1N1NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感病毒的单价NS1缺失突变体是如本文所阐述的猪流感病毒的H1N1 NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感病毒的单价NS1缺失突变体是猪流感病毒的H3N2NS1缺失突变体。
在本发明的一方面中，猪流感病毒的单价NS1缺失突变体是如本文所阐述的猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
本发明亦是关于如本文所阐述的免疫原性组合物的用途，其用于治疗及/或预防个体的猪流感病毒感染。
本发明亦是关于如本文所阐述的免疫原性组合物的用途，其用于制造药物。
本发明亦是关于如本文所阐述的免疫原性组合物，其用作药物。
本发明亦是关于如本文所阐述的免疫原性组合物，其用于治疗及/或预防个体的猪流感病毒感染的方法。
本发明提供下列实施方案：
1.一种免疫原性组合物，其包括：a)猪流感的经修饰活H3病毒，及b)猪流感的经修饰活H1病毒。
2.如实施方案1的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒具有选自由以下组成的群的N(神经氨酸酶)亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及N10。
3.如实施方案1或2的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒是猪流感的H3N2及/或猪流感的该经修饰活H1病毒是猪流感病毒的H1N1。
4.如实施方案1至3中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒在NS1基因中具有一或多种突变。
5.如实施方案1至4中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒在该NS1基因内具有缺失。
6.如实施方案1至5中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒是减毒猪流感病毒。
7.如实施方案1至6中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒是诱变病毒或重组病毒。
8.如实施方案1至7中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒经遗传改造。
9.如实施方案1至8中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒具有受损干扰素拮抗剂表型。
10.如实施方案1至9中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒在该NS1蛋白质的羧基末端处具有一或多种突变。
11.如实施方案1至10中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒具有羧基末端截短NS1蛋白质。
12.如实施方案1至11中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒具有包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
13.如实施方案1至12中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒具有包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质。
14.如实施方案1至11中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒具有自NS1的羧基末端的羧基末端缺失91、92、93或94个氨基酸残基截短NS1蛋白质。
15.如实施方案1至14中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒具有来自A/猪/Texas/4199-2/98的NS1基因或蛋白质。
16.如实施方案1至15中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒编码包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
17.如实施方案1至16中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒编码包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
18.如实施方案1至15中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒编码自NS1的羧基末端的羧基缺失91、92、93或94个氨基酸残基末端截短NS1蛋白质。
19.如实施方案1至18中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒是A/猪/Texas/4199-2/98。
20.如实施方案1至19中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒是TX/98/del 126。
21.如实施方案1至20中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒含有来自A/猪/Texas/4199-2/98的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP及M且该NS1-126基因是来自A/猪/Texas/4199-2/98。
22.如实施方案1至21中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒a)包括具有cDNA与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所陈述的核酸序列具有至少70％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或b)包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或c)包括氨基酸序列与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％一致性的NA及HA蛋白质。
23.如实施方案1至22中任一项的猪流感病毒的H1N1NS1缺失突变体，其中猪流感的该经修饰活H3病毒a)包括具有cDNA与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所陈述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或b)包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或c)包括具有与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
24.如实施方案1至23中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒是嵌合病毒。
25.如实施方案1至24中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒包括H3SIV菌株的羧基末端截短NS1、优选地H3N2SIV菌株的羧基末端截短NS1。
26.如实施方案1至25中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒编码包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
27.如实施方案1至26中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒编码包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
28.如实施方案1至25中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒编码自NS1的羧基末端缺失91、92、93或94个氨基酸残基的羧基末端截短NS1蛋白质。
29.如实施方案1至28中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒是A/猪/Texas/4199-2/98。
30.如实施方案1至29中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒包括来自H1N1亚型的血凝素及神经氨酸酶基因区段。
31.如实施方案1至30中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒包括来自A/猪/Minnesota/37866/1999的血凝素及神经氨酸酶基因区段。
32.如实施方案1至31中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒含有来自A/猪/Minnesota/37866/1999(H1N1)的HA及NA及来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)的PB2、PB1、PA、NP、M且NS1-126基因是来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)。
33.如实施方案1至32中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒是A/猪/Minnesota/37866/1999及TX/98/del 126的嵌合物。
34.如实施方案1至33中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H1病毒a)包括具有cDNA与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所陈述的核酸序列具有大于70％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或b)包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有大于70％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或c)包括具有与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有大于70％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
35.如实施方案1至34中任一项的猪流感病毒的H1N1NS1缺失突变体，其中猪流感的该经修饰活H1病毒a)包括具有cDNA与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所陈述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或b)包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或c)包括具有与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
36.如实施方案1至35中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物经调配用于单一剂量施用。
37.如实施方案1至36中任一项的免疫原性组合物，其中经鼻内施用该免疫原性组合物。
38.如实施方案1至37中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于在怀孕及哺乳期间的母猪是安全的。
39.如实施方案1至38中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于前两周龄内、优选地第一周龄内的猪是安全的。
40.如实施方案1至39中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于第0天龄的猪是安全的。
41.如实施方案1至40中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包括医药上可接受的载剂。
42.如实施方案1至41中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至8log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至8log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
43.如实施方案1至41中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至6log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至6log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
44.如实施方案1至41中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至4log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至4log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
45.如实施方案1至44中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物是疫苗。
46.如实施方案1至45中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物是二价疫苗。
47.如实施方案1至46中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物有效治疗及/或预防有需要的个体中由SIV引起的临床体征。
48.如实施方案1至47中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒是协同性地一起作用。
49.如实施方案1至48中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒的浓度与单价免疫原性组合物中猪流感的H3病毒浓度及单价免疫原性组合物中猪流感的H1病毒浓度相比减小。
50.如实施方案1至49中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒增加了对抗异源攻击的保护。
51.如实施方案1至50中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒增加了对抗H1攻击的保护。
52.如实施方案1至51中任一项的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒增加了对抗H1N1攻击的保护。
53.一种对个体实施免疫的方法，其包括向该个体施用如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物。
54.一种治疗或预防有需要的个体中由猪流感病毒引起的临床体征的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物。
55.一种与相同物种的未经免疫对照组的个体相比会减少有需要个体中病毒脱落的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物。
56.一种与使用猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒实施免疫的相同物种免疫化对照组的个体相比会减少有需要个体中病毒脱落的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物。
57.一种对具有抗SIV抗体的个体接种疫苗的方法，其包括向该动物施用单一有效剂量的如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物的步骤。
58.一种预防或减少个体的早期SIV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物。
59.如实施方案53至58中任一项的方法，其中该个体选自由猪、牛、猫及狗组成的列表。
60.如实施方案53至59中任一项的方法，其中施用该免疫原性组合物一次。
61.如实施方案53至59中任一项的方法，其中以两个或更多个剂量施用该免疫原性组合物。
62.如实施方案53至61中任一项的方法，其中经鼻内施用该免疫原性组合物。
63.如实施方案53至62中任一项的方法，其中该个体是猪流感病毒母体抗体阴性。
64.如实施方案53至63中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用在怀孕及哺乳期间的母猪。
65.如实施方案53至64中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用第一个月龄内的猪。
66.如实施方案53至65中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用前两周龄内、优选地第一周龄内的猪。
67.如实施方案53至66中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用第1天龄的猪。
68.如实施方案53至67中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用前24h龄内的猪。
69.如实施方案53至62及64至68中任一项的方法，其中该个体呈猪流感病毒母体抗体阳性。
70.如实施方案53至69中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至8log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至8log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
71.如实施方案53至69中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至6log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至6log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
72.如实施方案53至69中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至4log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至4log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
73.如实施方案53至72中任一项的方法，其中与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少病毒脱落、降低直肠温度或其组合。
74.如实施方案53至72中任一项的方法，其中与使用猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒实施免疫的相同物种的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少病毒脱落、降低直肠温度或其组合。
75.如实施方案53至74中任一项的方法，其中该治疗或预防使得与相同物种的未经治疗对照组的动物相比病毒负荷期缩短。
76.如实施方案53至75中任一项的方法，其中该治疗或预防使得自攻击或感染之后第5天病毒脱落会减少。
77.如实施方案53至76中任一项的方法，其中该治疗或预防使得自攻击或感染之后第1天或第2天病毒脱落会减少。
78.如实施方案53至77中任一项的方法，其中与使用猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒实施免疫的相同物种的个体相比，该个体是使用较低浓度的如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物实施免疫。
79.如实施方案56、74或78中任一项的方法，其中猪流感的该单价经修饰活H3或H1病毒是猪流感病毒的H1N1 NS1缺失突变体。
80.如实施方案79的方法，其中猪流感病毒的该H1N1 NS1缺失突变体是如实施方案1至52的猪流感病毒的H1N1 NS1缺失突变体。
81.如实施方案56、74或78中任一项的方法，其中猪流感的该单价经修饰活H3或H1病毒是猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
82.如实施方案81的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体是如实施方案1至52的猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
83.如实施方案53至82中任一项的方法，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒是协同性地一起作用。
84.如实施方案53至83中任一项的方法，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒的浓度与单价免疫原性组合物中猪流感的H3病毒浓度及单价免疫原性组合物中猪流感的H1病毒浓度相比是减低的。
85.如实施方案53至84中任一项的方法，其中猪流感的该经修饰活H3病毒会增加对抗异源攻击的保护。
86.如实施方案53至85中任一项的方法，其中猪流感的该经修饰活H3病毒会增加对抗H1攻击的保护。
87.如实施方案53至86中任一项的方法，其中猪流感的该经修饰活H3病毒会增加对抗H1N1攻击的保护。
88.如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物，其用于对个体实施免疫的方法中，该方法包括向该个体施用该免疫原性组合物。
89.如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要个体中由猪流感病毒引起的临床体征的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物。
90.如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物，其用于与相同物种的未经免疫对照组的个体相比会减少有需要个体中的病毒脱落的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物。
91.如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物，其用于与使用猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒实施免疫的相同物种免疫对照组的个体相比会减少有需要个体中病毒脱落的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物。
92.如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物，其用于对具有抗SIV抗体的个体接种疫苗的方法中，该方法包括向该动物施用单一有效剂量的该免疫原性组合物的步骤。
93.如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物，其用于预防或减少个体中的早期SIV感染的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物。
94.如实施方案88至93中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该个体是选自由猪、牛、猫及狗组成的列表。
95.如实施方案88至94中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物施用一次。
96.如实施方案88至94中任一项所使用的免疫原性组合物，其中以两个或更多个剂量施用该免疫原性组合物。
97.如实施方案88至96中任一项所使用的免疫原性组合物，其中经鼻内施用该免疫原性组合物。
98.如实施方案88至97中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该个体是猪流感病毒母体抗体阴性。
99.如实施方案88至98中任一项所使用的免疫原性组合物，其中将该免疫原性组合物施用在怀孕及哺乳期间的母猪。
100.如实施方案88至99中任一项所使用的免疫原性组合物，其中将该免疫原性组合物施用第一月龄内的猪。
101.如实施方案88至100中任一项所使用的免疫原性组合物，其中将该免疫原性组合物施用前两周龄内、优选地第一周龄内的猪。
102.如实施方案88至101中任一项所使用的免疫原性组合物，其中将该免疫原性组合物施用第1天龄猪。
103.如实施方案88至102中任一项所使用的免疫原性组合物，其中将免疫原性组合物施用前24h龄内的猪。
104.如实施方案88至97及99至103中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该个体呈猪流感病毒母体抗体阳性。
105.如实施方案88至104中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至8log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至8log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
106.如实施方案88至104中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至6log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至6log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
107.如实施方案88至104中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至4log10猪流感的该经修饰活H1病毒及/或2log10至4log10猪流感的该经修饰活H3病毒。
108.如实施方案88至107中任一项所使用的免疫原性组合物，其中与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少病毒脱落、降低直肠温度或其组合。
109.如实施方案88至108中任一项所使用的免疫原性组合物，其中与使用猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒实施免疫的相同物种的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少病毒脱落、降低直肠温度或其组合。
110.如实施方案88至108中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该治疗或预防使得与相同物种的未经治疗对照组的动物相比病毒负荷期缩短。
111.如实施方案88至110中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该治疗或预防使得自攻击或感染之后第5天病毒脱落会减少。
112.如实施方案88至111中任一项所使用的免疫原性组合物，其中该治疗或预防使得自攻击或感染之后第1天或第2天病毒脱落会减少。
113.如实施方案88至112中任一项所使用的免疫原性组合物，其中与使用猪流感的单价经修饰活H3或H1病毒实施免疫的相同物种的个体相比，该个体是使用较低浓度的如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物实施免疫。
114.如实施方案91、109或113中任一项所使用的免疫原性组合物，其中猪流感的该单价经修饰活H3或H1病毒是猪流感病毒的H1N1 NS1缺失突变体。
115.如实施方案114所使用的免疫原性组合物，其中猪流感病毒的该H1N1 NS1缺失突变体是如实施方案1至52的猪流感病毒的H1N1 NS1缺失突变体。
116.如实施方案91、109或113中任一项所使用的免疫原性组合物，其中猪流感的该单价经修饰活H3或H1病毒是猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
117.如实施方案116所使用的免疫原性组合物，其中猪流感病毒的该H3N2NS1缺失突变体是如实施方案1至52的猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
118.如实施方案88至117中任一项所使用的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒是协同性地一起作用。
119.如实施方案88至118中任一项所使用的免疫原性组合物，其中猪流感的这些经修饰活H3及H1病毒的浓度与单价免疫原性组合物中猪流感的H3病毒浓度及单价免疫原性组合物中猪流感的H1病毒浓度相比减小。
120.如实施方案88至119中任一项所使用的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒增加了对抗异源攻击的保护。
121.如实施方案88至120中任一项所使用的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒增加了对抗H1攻击的保护。
122.如实施方案88至121中任一项所使用的免疫原性组合物，其中猪流感的该经修饰活H3病毒增加了对抗H1N1攻击的保护。
123.如实施方案1至52中任一实施方案的免疫原性组合物，其用作药物。
124.一种如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物的用途，其用于治疗及/或预防个体的猪流感病毒感染。
125.一种如实施方案1至52中任一项的免疫原性组合物的用途，其用于制造药物。
126.一种猪流感的经修饰活H1病毒。
127.如实施方案1的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒具有选自由以下组成的群的N(神经氨酸酶)亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及N10。
128.如实施方案126或127的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒是猪流感病毒的H1N1。
129.如实施方案126至128中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒在NS1基因中具有一或多种突变。
130.如实施方案126至129中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒在NS1基因内具有缺失。
131.如实施方案126至130中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒是嵌合病毒。
132.如实施方案126至131中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒包括H3 SIV菌株、优选地H3N2 SIV菌株的羧基末端截短NS1。
133.如实施方案126至132中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒编码包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
134.如实施方案126至132中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒编码包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
135.如实施方案126至132中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒编码自NS1的羧基末端缺失91、92、93或94个氨基酸残基的羧基末端截短NS1蛋白质。
136.如实施方案126至135中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒的该NS1基因或蛋白质是来自A/猪/Texas/4199-2/98。
137.如实施方案126至136中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒包括来自H1N1亚型的血凝素及神经氨酸酶基因区段。
138.如实施方案126至137中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒包括来自A/猪/Minnesota/37866/1999的血凝素及神经氨酸酶基因区段。
139.如实施方案126至138中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒含有来自A/猪/Minnesota/37866/1999(H1N1)的HA及NA及来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)的PB2、PB1、PA、NP、M且NS1-126基因是来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)。
140.如实施方案126至139中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒是A/猪/Minnesota/37866/1999及TX/98/del 126的嵌合体。
141.如实施方案126至140中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒a)包括具有cDNA与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所陈述的核酸序列具有大于70％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或b)包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有大于70％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或c)包括具有与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有大于70％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
142.如实施方案126至141中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒，其中猪流感的该经修饰活H1病毒a)包括具有cDNA与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所陈述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或b)包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或c)包括具有与如SEQ ID NO:7或SEQID NO:8中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
143.一种免疫原性组合物，其包括如实施方案126至142中任一项的猪流感的经修饰活H1病毒。
144.如实施方案143的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物经调配用于单一剂量施用。
145.如实施方案143或144的免疫原性组合物，其中经鼻内施用该免疫原性组合物。
146.如实施方案143至145中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于在怀孕及哺乳期间的母猪是安全的。
147.如实施方案143至146中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于前两周龄内、优选地第一周龄内的猪是安全的。
148.如实施方案143至147中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于第一天龄内的猪是安全的。
149.如实施方案143至148中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包括医药上可接受的载剂。
150.如实施方案143至149中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至8log10猪流感的该经修饰活H1病毒。
151.如实施方案143至149中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至6log10猪流感的该经修饰活H1病毒。
152.如实施方案143至149中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括2log10至4log10猪流感的该经修饰活H1病毒。
153.如实施方案143至152中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物是疫苗。
154.如实施方案143至153中任一项的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物有效治疗及/或预防有需要的个体中由SIV引起的临床体征。
155.一种对个体实施免疫的方法，其包括向该个体施用如实施方案143至154中任一项的免疫原性组合物。
156.一种治疗或预防有需要的个体中由猪流感病毒引起的临床体征的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如实施方案143至154中任一项的免疫原性组合物。
157.一种与相同物种的未经免疫对照组的个体相比会减少有需要个体中病毒脱落的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如实施方案143至154中任一项的免疫原性组合物。
158.一种对具有抗SIV抗体的个体接种疫苗的方法，其包括向该动物施用单一有效剂量的如实施方案143至154中任一项的免疫原性组合物的步骤。
159.一种预防或减少个体的早期SIV感染的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如实施方案143至154中任一项的免疫原性组合物。
160.如实施方案155至159中任一项的方法，其中该个体是选自由猪、牛、猫及狗组成的列表。
161.如实施方案155至160中任一项的方法，其中施用该免疫原性组合物一次。
162.如实施方案155至160中任一项的方法，其中以两个或更多个剂量施用该免疫原性组合物。
163.如实施方案155至162中任一项的方法，其中经鼻内施用该免疫原性组合物。
164.如实施方案155至163中任一项的方法，其中该个体是猪流感病毒母体抗体阴性。
165.如实施方案155至164中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用在怀孕及哺乳期间的母猪。
166.如实施方案155至165中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用第一月龄内的猪。
167.如实施方案155至166中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用前两周龄吗、优选地第一周龄内的猪。
168.如实施方案155至167中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用第1或2天龄的猪。
169.如实施方案155至168中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用第一天龄内的猪。
170.如实施方案155至163及165至169中任一项的方法，其中该个体呈猪流感病毒母体抗体阳性。
171.如实施方案155至170中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至8log10猪流感的该经修饰活H1病毒。
172.如实施方案155至170中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至6log10猪流感的该经修饰活H1病毒。
173.如实施方案155至170中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至4log10猪流感的该经修饰活H1病毒。
174.如实施方案155至173中任一项的方法，其中与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少病毒脱落、降低直肠温度或其组合。
175.如实施方案155至174中任一项的方法，其中该治疗或预防使得与相同物种的未经治疗对照组的动物相比病毒负荷期缩短。
176.如实施方案155至175中任一项的方法，其中该治疗或预防使得自攻击或感染之后第5天病毒脱落会减少。
177.如实施方案155至176中任一项的方法，其中该治疗或预防使得自攻击或感染之后第1或2天病毒脱落会减少。
178.一种对个体实施免疫的方法，其包括在前两周龄内向个体施用包括猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体的免疫原性组合物。
179.一种治疗或预防有需要的个体中由猪流感病毒引起的临床体征的方法，该方法包括在前两周龄内向该个体施用治疗有效量的包括猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体的免疫原性组合物。
180.一种与相同物种的未经免疫对照组的个体相比会减少有需要个体中病毒脱落的方法，该方法包括在前两周龄内向该个体施用治疗有效量的包括猪流感病毒的H3N2NS1缺失突变体的免疫原性组合物。
181.一种对具有抗SIV抗体的个体接种疫苗的方法，其包括在前两周龄内向该动物施用单一有效剂量的包括猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体的免疫原性组合物的步骤。
182.一种预防或减少个体的早期SIV感染的方法，该方法包括在前两周龄内向该个体施用治疗有效量的包括猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体的免疫原性组合物。
183.如实施方案178至182中任一项的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体编码包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
184.如实施方案178至182中任一项的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体编码包括NS1氨基酸1至126的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸是编号1。
185.如实施方案178至182中任一项的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体编码自NS1的羧基末端缺失91、92、93或94个氨基酸残基的羧基末端截短NS1蛋白质。
186.如实施方案178至185中任一项的方法，其中流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体猪的NS1基因或蛋白质是来自A/猪/Texas/4199-2/98。
187.如实施方案178至186中任一项的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体是TX/98/del126。
188.如实施方案178至187中任一项的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体含有来自A/猪/Texas/4199-2/98的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP及M且NS1-126基因是来自A/猪/Texas/4199-2/98。
189.如实施方案178至188中任一项的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体是阐述于WO2006/083286A2中且指定为TX/98/del 126的猪流感病毒的H3N2NS1缺失突变体。
190.如实施方案178至189中任一项的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体包括具有cDNA与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所陈述的核酸序列具有至少70％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或包括氨基酸序列与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％一致性的NA及HA蛋白质。
191.如实施方案178至190中任一项的方法，其中猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体包括具有cDNA与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所陈述的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或包括具有编码氨基酸序列与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的NA及HA蛋白质的NA及HA基因的基因区段的核酸序列，或具有与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列的NA及HA蛋白质。
192.如实施方案178至191中任一项的方法，其中该个体选自由猪、牛、猫及狗组成的列表。
193.如实施方案178至192中任一项的方法，其中施用该免疫原性组合物一次。
194.如实施方案178至192中任一项的方法，其中以两个或更多个剂量施用该免疫原性组合物。
195.如实施方案178至194中任一项的方法，其中经鼻内施用该免疫原性组合物。
196.如实施方案178至195中任一项的方法，其中该个体是猪流感病毒母体抗体阴性。
197.如实施方案178至196中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用在怀孕及哺乳期间的母猪。
198.如实施方案178至197中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用第一周龄内的猪。
199.如实施方案178至198中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用第1天或第2天龄的猪。
200.如实施方案178至199中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物施用第一天龄内的猪。
201.如实施方案178至195及197至200中任一项的方法，其中该个体呈猪流感病毒母体抗体阳性。
202.如实施方案178至201中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至8log10猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体。
203.如实施方案178至201中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至6log10猪流感病毒的该H3N2 NS1缺失突变体。
204.如实施方案178至201中任一项的方法，其中该免疫原性组合物包括2log10至4log10猪流感病毒的H3N2 NS1缺失突变体。
205.如实施方案178至204中任一项的方法，其中与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，该方法产生选自由以下组成的群的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少病毒脱落、降低直肠温度或其组合。
206.如实施方案178至205中任一项的方法，其中该治疗或预防使得自攻击或感染之后第5天病毒脱落会减少。
207.如实施方案178至206中任一项的方法，其中该治疗或预防使得自攻击或感染之后第1天病毒脱落会减少。
208.如实施方案178至207中任一项的方法，其中该方法提供针对异源攻击的保护。
209.如实施方案178至208中任一项的方法，其中该方法提供针对H1攻击的保护。
210.如实施方案178至209中任一项的方法，其中该方法提供针对H1N1攻击的保护。
实施例
下列实施例仅意欲阐释本发明。其不应以任一方式限制权利要求的范围。
实施例1：
用于繁殖经修饰活疫苗分离株且用于调配二价疫苗的方法。
可使用不同系统来繁殖经修饰活疫苗分离株。在此实例中，阐述两种用于生成抗原且最终生成二价疫苗的所评估不同系统的材料及方法。
二价疫苗中经修饰活疫苗分离株的一般特征。
使用反向遗传学，生成各自编码羧基截短NS1蛋白质的H1N1 NS1突变体及H3N2NS1突变体。H3N2 NS1突变体已阐述于Solórzano等人，2005(J Virol79:7535-7543)、Vincent等人，2012(Journal of Virology 19:10597-10605)及WO2006/083286A2中。
对于H1N1而言，将来自亲代H1N1(A/猪/Minnesota/37866/1999)的血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)基因与来自(A/猪/Texas/4199-2/98)的PB2、PB1、PA、NP、M及NS-126基因进行组合。所生成H1N1 NS1突变体由此含有2种来自亲代H1N1的基因及6种来自亲代H3N2的基因。
对于H3N2而言，组合来自A/猪/Texas/4199-2/98(H3N2)的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M及NS-126基因，并且将所得病毒指定为TX98 H3N2 NS1 SIV。
鸡胚蛋中经修饰活疫苗分离株的生长及二价疫苗的调配。
通过将一种或其他经修饰活病毒注射至尿囊液中来接种(尿囊接种)6至7天的鸡胚蛋。使用单独预先标记蛋群组来培养H1N1 NS1分离株及H3N2 NS1分离株。在使用各别病毒接种之后，将蛋培育三至四天，然后冷冻至少4小时，随后收获含有病毒的尿囊液。等分试样是由含有高浓度的各别经修饰活病毒的所收获尿囊液组成。将所有含有病毒的等分试样储存于-40℃下或低于-40℃下，直至需要其用于疫苗调配为止。
在疫苗调配之前，将每一含有病毒的尿囊液的等分试样解冻且实施滴定以测定病毒浓度，从而可作出疫苗调配的计画。测定病毒原料的病毒量后，在接种疫苗之前，可将两种分离株以及磷酸盐缓冲盐水直接掺和一起，以达到用于动物研究所期望的内容物。
基于细胞的组织培养液中的经修饰活疫苗分离株的生长及二价疫苗的调配。
通过在更换培养基且添加含胰蛋白酶培养基之后，向器皿中添加一种或其他经修饰活病毒来接种含有6至8天龄EVERO细胞培养液的器皿。使用单独预先标记器皿群组来培养H1N1分离株及H3N2分离株。在使用其各别病毒接种之后，将器皿培育最长7天，然后收获。等分试样是由含有高浓度的各别经修饰活病毒的所收获培养基组成。将所有病毒等分试样储存于-40℃下或低于-40℃，直至需要其进行疫苗调配为止。
在疫苗调配之前，将每一含病毒培养基的等分试样解冻且实施滴定以测定病毒浓度，从而可作出疫苗调配的计画。测定病毒原料的病毒量后，可将两种分离株以及稳定剂(蔗糖明胶稳定剂)及磷酸盐缓冲盐水(仅视需要)直接掺和一起，然后冻干。控制每一病毒原料的体积以达到用于将来动物研究所期望的内容物含量。在掺和后，将二价疫苗材料无菌转移至无菌玻璃瓶中，然后将瓶载入冻干器中。然后使冻干器经受冷冻干燥循环以制备储存于约4℃下直至用于动物研究中的疫苗。
在即将接种疫苗之前，使用适当体积的磷酸盐缓冲盐水将含于玻璃瓶内的冻干二价疫苗进行再水合，以达成用于动物研究的期望效价。
实施例2：
单一不同剂量经鼻内施用1-6天龄呈母体免疫性阴性反应猪只导致鼻中病毒脱落 减少、来自肺的分离株减少及肺病灶减少
研究设计考虑、疫苗调配、给药资讯及效能总结。
研究1
在研究的第0天，使用蛋繁殖疫苗病毒以表1中所指示的内容物含量对小猪(按组安置于中单独屋中)施打疫苗。在接种疫苗之前，一如通过健康检查所测定，仅约一周龄或更小的健康猪才容许招募至研究中。使用2mL个别疫苗通过施加1mL至每一鼻孔中来对每一猪接种疫苗。根据设施标准操作程序，针对测试动物的年龄及条件提供适当饲料比例。在整个研究中，水是随时自由地提供给测试动物。
表1.研究1：疫苗内容物含量
组编号 H1N1效价(log<sub>10</sub>TCID<sub>50</sub>/mL) H3N2效价(log<sub>10</sub>TCID<sub>50</sub>/mL)
较高剂量 7.28 8.10
较低剂量 6.28 7.10
在攻击之前，将小猪断奶且移动至接种室中，然后约于研究的第36天，使用2mL异源H1N2(A/猪/NorthCarolina/001169/2006)SIV分离株以7.10log10/mL的效价通过气管内接种方式攻击麻醉下的小猪。每天自攻击处收集鼻拭子直至尸体剖检为止，且然后对肺病灶进行评分，并在尸体剖检时收集肺组织。通过其减少鼻拭子中及来自肺组织的病毒分离株数量的能力以及其减少接种疫苗组中的肺病灶的能力来评估疫苗效能。
如表2中所显示，一如通过来自鼻拭子及来自肺组织的病毒分离株的减少以及肺病灶的减少所证实，以较高剂量及较低剂量接种疫苗的动物得以保护而免受异源攻击影响(当与在未接受接种疫苗之后接受攻击的猪组进行相比较时)。
表2.研究1：疫苗效能总结
Figure BDA0001379188920000551
Figure BDA0001379188920000561
自此研究中所生成的数据得出结论，自鼻孔脱落的病毒量会减少，肺中病毒负荷会减少且主要效能参数泛总肺病灶会减少，其综合指示，使用此研究中所使用两种内容物含量的单一鼻内剂量对于在一至六天龄内接种疫苗的幼稚猪是有效的。
研究2
在研究的第0天，使用重构冻干组织培养液(EVERO细胞)繁殖的疫苗病毒以表3中所指示的内容物含量对小猪(按组安置于单独屋中)接种疫苗。一如通过在接种疫苗之前的健康检验所测定，仅约一周龄或更小的健康猪才容许招募至研究中，。使用1mL个别疫苗通过将完整体积施加至一个鼻孔中来对每一猪接种疫苗。根据设施标准操作程序，针对测试动物的年龄及条件提供适当饲料比例。在整个研究中，水是随时自由地提供给测试动物。
表3.研究2：疫苗内容物含量
Figure BDA0001379188920000562
在攻击之前，将小猪断奶且移动至接种室中，然后约于研究的第25天，使用2mL异源H1N2(A/猪/NorthCarolina/001169/2006)SIV分离株以7.96log10/mL的效价通过气管内接种在麻醉下攻击小猪。每天自攻击收集鼻拭子直至尸体剖检为止，且然后对肺病灶进行评分且在尸体剖检时收集肺灌洗液。通过其减少鼻拭子中及来自肺灌洗液的病毒分离株数量的能力以及其减少接种疫苗组中的肺病灶的能力来评估疫苗效能。
如表4中所显示，一如通过来自鼻拭子及来自肺灌洗液的病毒分离株的减少以及肺病灶的减少所证实，以所有剂量接种疫苗的动物得以保护而免受异源攻击影响(在与在未接受接种疫苗之后接受攻击的猪组进行比较时)。
表4.研究2：疫苗效能总结
Figure BDA0001379188920000571
自此研究中所生成的数据得出结论，自鼻孔脱落的病毒量会减少，肺部呈病毒分离株阳性会减少且主要效能参数泛总肺病灶会减少，其综合指示，使用此研究中所使用三种内容物含量的单一鼻内剂量对于在一至六天龄内接种疫苗的幼稚猪是有效的。
研究3
在研究的第0天，使用重构冻干组织培养液(EVERO细胞)繁殖的疫苗病毒以表5中所指示的内容物含量对小猪(按组安置于单独屋中)接种疫苗。一如通过在接种疫苗之前的健康检验所测定，仅约一周龄或更小的健康猪才容许招募至研究中。使用1mL个别疫苗通过将完整体积施加至一个鼻孔中来对每一猪接种疫苗。根据设施标准操作程序，针对测试动物的年龄及条件提供适当饲料比例。在整个研究中，水是随时自由地提供给测试动物。
表5.研究3疫苗内容物含量
Figure BDA0001379188920000572
在攻击之前，将小猪断奶且移动至接种室中，然后约于研究的第30天，使用2mL异源H3N2(A/猪/Nebraska/97901-10/2008)SIV分离株以6.09log10/mL的效价通过气管内接种在麻醉下攻击小猪。每天自攻击收集鼻拭子直至尸体剖检为止，且然后对肺病灶进行评分且在尸体剖检时收集肺灌洗液。通过其减少鼻拭子中及来自肺灌洗液的病毒分离株数量的能力以及其减少接种疫苗组中的肺病灶的能力来评估疫苗效能。
如表6中所展示，一如通过来自鼻拭子及来自肺灌洗液的病毒分离株的减少以及肺病灶的减少所证实，以所有剂量接种疫苗的动物得以保护而免受异源攻击影响(在与在未接受接种疫苗之后接受攻击的猪组进行比较时)。
表6.研究3疫苗效能总结
Figure BDA0001379188920000581
自此研究中所生成的数据得出结论，自鼻孔脱落的病毒量会减少，肺部呈病毒分离株阳性会减少且主要效能参数泛总肺病灶会减少，其综合指示，使用此研究中所使用三种内容物含量的单一鼻内剂量对于在一至六天龄内接种疫苗的幼稚猪是有效的。
实施例3：
对三周龄母体免疫性阴性猪的单一剂量鼻内施用
研究设计考虑、疫苗调配、给药资讯及效能总结。
研究4
在研究的第0天，使用蛋繁殖疫苗病毒以表7中所指示的内容物含量对猪(按组安置于单独屋中)接种疫苗。一如通过在接种疫苗之前的健康检验所测定，仅约三周龄的健康猪才容许招募至研究中。使用4mL疫苗通过将2mL施加至每一鼻孔中来对每一猪接种疫苗。根据设施标准操作程序，针对测试动物的年龄及条件提供适当饲料比例。在整个研究中，水是随时自由地提供给测试动物。
表7.研究4疫苗内容物含量
组编号 H1N1效价(log<sub>10</sub>TCID<sub>50</sub>/mL) H3N2效价(log<sub>10</sub>TCID<sub>50</sub>/mL)
二价 7.38 7.97
约于研究的第28天，使用2mL异源H1N1(A/猪/Indiana/1726/88)SIV分离株以6.63log10/mL的效价或使用2mL异源H3N2(A/猪/Nebraska/97901-10/2008)SIV分离株以7.58log10/mL的效价通过气管内接种在麻醉下攻击小猪。每天自攻击收集鼻拭子直至尸体剖检为止，且然后对肺病灶进行评分且在尸体剖检时收集肺组织。通过其减少鼻拭子中及来自肺组织的病毒分离株数量的能力以及其减少接种疫苗组中肺病灶的能力来评估疫苗效能。
如表8中所展示，一如通过来自鼻拭子及来自肺组织的病毒分离株的减少以及肺病灶的减少所证实，接种疫苗的动物得以保护而免受异源H1N1攻击影响(在与在未接受接种疫苗之后接受攻击的猪组进行对比时)。对于经肌内使用相同疫苗接种疫苗的猪而言，看到类似结果(数据未展示)。亦在表8中展示，一如通过来自肺组织的病毒分离株的减少以及肺病灶的减少所证实，接种疫苗的动物得以保护而免受异源H3N2攻击影响(在与在未接受接种疫苗之后接受攻击的猪组进行对比时)。自攻击的日(在攻击之前)直至尸体剖检的日收集鼻拭子。因并无二价接种疫苗动物在H1N1攻击之后脱落病毒且未经接种疫苗动物在攻击后两天才开始脱落(数据未展示)，所以二价疫苗可防止经接种疫苗猪只在攻击后两天的攻击病毒的脱落。
表8.研究4疫苗效能总结
Figure BDA0001379188920000591
自此研究中所生成的数据得出结论，在H1N1后自鼻孔脱落的病毒量会减少，且肺中的病毒负荷会减少以及在使用任一病毒攻击之后主要效能参数泛总肺病灶会减少。以此研究中所使用内容物含量给予的单一鼻内剂量对于在三周龄时接种疫苗的幼稚猪是有效的。
实施例4：
单一剂量鼻内施用在怀孕期间的安全性
研究设计考虑、疫苗调配物、给药资讯及安全性总结。
研究5
约于研究的第-28天，使用蛋繁殖疫苗病毒以表9中所指示的内容物含量对8个小母猪接种疫苗。一如通过在接种疫苗之前的健康检验所测定，仅健康怀孕小母猪容许招募至研究中。使用2mL疫苗通过将1mL施加至每一鼻孔中来对每一小母猪接种疫苗。根据设施标准操作程序，针对测试动物的年龄及条件提供适当饲料比例。在整个研究中，水是随时自由地提供给测试动物。
表9.研究5疫苗内容物含量
组编号 H1N1效价(log<sub>10</sub>TCID<sub>50</sub>/mL) H3N2效价(log<sub>10</sub>TCID<sub>50</sub>/mL)
二价 6.52 7.71
在接种疫苗之后，通过每天观察且记录每一接种疫苗小母猪的临床体征来评估疫苗的安全性。对于接种疫苗时与分娩时之间的任一小母猪而言，并未记录有重大临床体征。然而，在三只小母猪中记录有一些微小临床体征，但并未观察到体征直至在接种疫苗之后第五天，且并无体征持续超过于4天。
自此研究中所生成的数据得出结论，在以此研究中所使用的内容物含量施用小母猪时且在怀孕的大约第90天接种疫苗时，疫苗是安全的。
实施例5：
单一剂量经鼻内施用1-8天龄呈母体免疫性阳性的猪只
研究设计考虑、疫苗调配、给药资讯及效能总结。
研究5
约于研究的第-28天，使用蛋繁殖疫苗病毒以表1中所指示的内容物含量对8个小母猪接种疫苗以诱导母体免疫性。使用2mL疫苗通过将1mL施加至每一鼻孔中来对每一小母猪接种疫苗。所有小母猪皆是在研究的第0天之前分娩，在第0天时使用蛋繁殖疫苗病毒以表10中所指示的内容物含量对小猪接种疫苗。一如通过在接种疫苗之前的健康检验所测定，仅约一周龄或更小的健康猪才容许招募至研究中。使用2mL个别疫苗通过施加1mL至每一鼻孔中来对每一猪接种疫苗。根据设施标准操作程序，针对测试动物的年龄及条件提供适当饲料比例。在整个研究中，水是随时自由地提供给测试动物。
表10.研究5疫苗内容物含量
组编号 H1N1效价(log<sub>10</sub>TCID<sub>50</sub>/mL) H3N2效价(log<sub>10</sub>TCID<sub>50</sub>/mL)
二价小母猪 6.52 7.71
二价猪 5.84 7.32
在攻击之前，将小猪断奶且移动至接种室中，然后约于研究的第42天，使用2mL异源H1N2(A/猪/NorthCarolina/001169/2006)SIV分离株以7.61log10/mL的效价通过气管内接种在麻醉下攻击小猪。每天自攻击收集鼻拭子直至尸体剖检为止，且然后对肺病灶进行评分且在尸体剖检时收集肺灌洗液。通过其减少鼻拭子中及来自肺灌洗液的病毒分离株数量的能力以及其减少接种疫苗组中的肺病灶的能力来评估疫苗效能。
如表11中所显示，一如通过来自鼻拭子及来自肺灌洗液的病毒分离株的减少以及肺病灶的减少所证实，使用二价疫苗接种疫苗的动物得以保护而免受异源攻击影响(在与在未接受接种疫苗之后接受攻击的猪组进行对比时)。
表11.研究5疫苗效能总结
Figure BDA0001379188920000611
自此研究中所生成的数据得出结论，自鼻孔脱落的病毒量会减少，肺中的病毒负荷会减少且主要效能参数泛总肺病灶会减少，其综合指示，使用此研究中所使用两种内容物含量的单一鼻内剂量对于一至八天龄内接种疫苗的呈母体免疫性阳性的猪只是有效的。
实施例6：
单一剂量经鼻内施用二价疫苗较单价疫苗具有利效应
研究设计考虑、疫苗调配、给药资讯及效能总结。
研究6及研究1
在两个各别研究的研究的第0天，使用组织培养液(EVERO细胞)繁殖的疫苗病毒以表12中所指示的内容物含量对小猪(按组安置于单独屋中)接种疫苗。一如通过在接种疫苗之前的健康检验所测定，仅约一周龄或更小的健康猪容许招募至研究中。在研究1中，使用1mL单价疫苗通过施加1/2mL至每一鼻孔中来对每一猪接种疫苗。在研究6中，使用1mL二价疫苗通过施加全部体积至左鼻孔中来对每一猪接种疫苗。根据设施标准操作程序，针对测试动物的年龄及条件提供适当饲料比例。在整个研究中，水是随时自由地提供给测试动物。
表12.研究1及6疫苗内容物含量
Figure BDA0001379188920000621
N/A＝不适用
在两个各别研究中的攻击之前，将小猪断奶且移动至接种室中，然后约于研究的第25天，使用2mL异源H1N2(A/猪/North Carolina/001169/2006)SIV分离株以7.44log10/mL(在研究6中)及7.92log10/mL(在研究1中)的效价通过气管内接种在麻醉下攻击小猪。每天自攻击收集鼻拭子直至尸体剖检为止，且然后对肺病灶进行评分且在尸体剖检时收集肺灌洗液。通过其减少鼻拭子中及来自肺灌洗液的病毒分离株数量的能力以及其减少接种疫苗组中的肺病灶的能力来评估疫苗效能。
如表13中所显示，研究6中使用单价疫苗接种疫苗的动物需要4.99log10 FAID50/mLH1N1疫苗病毒的剂量，然后其得以保护而免受异源攻击影响。保护可通过以下各项证实：在与在该相同研究中未接受接种疫苗之后接受攻击的猪组进行对比时，来自鼻拭子及来自肺灌洗液的病毒分离株会减少且肺病灶会减少。
在表2中亦显示，当以含有2.84log10 FAID50/mLH3N2疫苗病毒的二价疫苗施用时，研究1中的动物仅需要2.81log10 FAID50/mLH1N1疫苗病毒的剂量便可保护其免于异源攻击。保护性二价疫苗中所包含的抗原的计算总剂量为3.13log10 FAID50/mL，此时将每一抗原的量加至一起。保护可通过以下各项证实：当与在该相同研究中未接受接种疫苗之后接受攻击的猪组进行对比时，来自鼻拭子及来自肺灌洗液的病毒分离株会减少且肺病灶会减少。
表13.研究1及6疫苗效能总结
Figure BDA0001379188920000631
本文所提供的实验数据显示，猪流感病毒的H1N1 NS1及H3N2缺失突变体一起的组合令人吃惊地其效力是大于个别组份的聚集效应。本发明二价疫苗的协同效应极其清楚地显示是当其能够在以远低于单价H1N1疫苗所需含量的内容物含量施用时提供保护。本发明二价疫苗以仅3.13log10 FAID50/mL的总剂量施用即提供保护，与的相比，单价疫苗在以4.99log10 FAID50/mL的剂量(约大于二价疫苗的总剂量72倍)施用之后才能显示类似保护程度。此外，Vincent等人，2012(Journal of Virology 19:10597-10605)已证实，1×106TCID50(对应于6log10 FAID50)的单价H3N2才会提供保护(约大于二价疫苗的总剂量741倍)。因此，二价疫苗中的H1及H3组份的浓度显著低于单价疫苗中所需的浓度。此是令人吃惊的意外协同效应。
另外亦存在证据证实在考虑攻击病毒的量时二价疫苗的协同效应。单价疫苗即使以较高剂量施用时，亦仅能提供相同攻击分离株大约低3倍的攻击所产生的类似保护程度。
自这些研究中所生成的数据得出结论，当以二价产物形式施用疫苗时的抗原剂量远低于以单价产物形式施用时的剂量下，自鼻孔脱落的病毒量会减少，肺部呈病毒分离株阳性会减少且主要效能参数泛总肺病灶会减少。总而言的，数据指示，单一剂量经鼻内施用二价疫苗更有效于在这些研究中的幼稚猪中所使用的较高剂量单价疫苗。
本发明协同组合较为有利，此乃因不良效应的机会会减小。另外，含有低于个别组份的浓度的二价疫苗的制造亦明显较为容易且较为便宜。
此外，除上述协同浓度效应外，存在另一令人吃惊的有利协同效应。H3N2组份与H1N1组份协同作用。二价疫苗的协同效应极其清楚地显示是其能够提供对于异源H1N2(A/猪/North Carolina/001169/2006)SIV分离株的保护。因此，存在交叉保护效应。此效应另外具有协同性，此乃因本发明二价疫苗是如上文所阐述以远低于单价疫苗所需含量的内容物含量施用。
伴随此申请案的序列的全部内容以引用方式并入本文中：
SEQ ID NO:1H3N2(A/猪/Texas/4199-2/98)的NA的核苷酸序列：
Figure BDA0001379188920000641
Figure BDA0001379188920000651
SEQ ID NO:2 H3N2(A/猪/Texas/4199-2/98)的HA的核苷酸序列：
Figure BDA0001379188920000652
Figure BDA0001379188920000661
SEQ ID NO：3 H3N2(A/猪/Texas/4199-2/98)的NA的氨基酸序列：
MNPNQKIITIGSVSLTIATMCFLMQIAILVTTVTLHFKQYECNYPPNNQVILCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCKITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNRHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGHDENATASFIYDGRLVDSIGSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGRADTKILFIEEGKIVHISPLLGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINVKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDRSSSSNCLNPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTINEKLRSGYETFKVIEGWSKPNSKLQINRQVIVDRGDRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVWWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
SEQ ID NO：4 H3N2(A/猪/Texas/4199-2/98)的HA的氨基酸序列：
MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFIERSKAYSNCYPYDVPDYSSLRSLVASSGTLEFTNEDFNWTGVAQDGGSYSCKRGSVKSFFSRLNWLHKLEYKYPALNVTMPNNDKFDKLYIWGVHHPSTDSEQTSLYVQAIGRVTVSTKSSQQTVIPNIGSRPWVRGISSRISIYWTIVKPGDILLISSTGNLIAPRGYFKIRNGKSSIMRSDAPIDNCYSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPKYVKQKTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQVNGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI
SEQ ID NO：5 H1N1(A/猪/Minnesota/37866/1999)的NA的核苷酸序列：
Figure BDA0001379188920000671
Figure BDA0001379188920000681
SEQ ID NO:6 H1N1(A/猪/Minnesota/37866/1999)的HA的核苷酸序列：
Figure BDA0001379188920000682
SEQ ID NO：7 H1N1(A/猪/Minnesota/37866/1999)的NA的氨基酸序列：
MNTNQRIITIGTVCLIVGIVSLLLQIGNIVSLWISHSIQTGEKNHSEICNQNVITYENNTWVNQTYVNISNTNIADGQGVTSIKLAGNSSLCPISGWAIYSKDNSIRIGSKGDIFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDRHSNGTVKDRSPYRTLMSCPIGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGMGWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNKILRTQESECVCINGSCFTIMTDGPSNGQASYKIFKMEKGKIIKSVELDAPNYHYEECSCYPDTGKVMCVCRDNWHASNRPWVSFDRNLDYQIGYICSGVFGDNPRSNDGKGNCGPVLSNGANGVKGFSFRYGNGVWIGRTKSISSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSIKQDIIALTDWSGYSGSFVQHPELTGMNCIKPCFWVELIRGQPKESTIWTSGSSISFCGVDSETASWSWPDGADLPFTIDK
SEQ ID NO：8 H1N1(A/猪/Minnesota/37866/1999)的HA的氨基酸序列：
MKAILVVLLYAFTTANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEEKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLFTASSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKASSWPNYETSRGVTAACPYAGANSFYRNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINNKEKEVLVLWGIHHPSTSTDQQSLYQNADAYVFVGSSKYSKKFKPEIATRPKVRDQAGRMNYYWTLVEPGDTITFEATGNLVVPRYAFAMKRGSGSGIIISDTSVHDCNTNCQTPKGAINTSLPFQNIHPVTIGECPKYVKSKKLRMATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADRKSTQSAIDGITNKVNSIIEKMNSQFTAVGKEFNHLEKRIENLNRKVDDGFLDVWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTEVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
序列表
<110> 勃林格殷格翰动物保健有限公司
<120> 二价猪流感病毒疫苗
<130> P10-0169
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1496
<212> DNA
<213> swine influenza virus
<400> 1
tattggtctc agggagcaaa agcaggagta aagatgaatc caaatcaaaa gataataacg 60
attggctctg tttctctcac tattgccaca atgtgcttcc ttatgcaaat tgccatcctg 120
gtaactactg taacattgca tttcaagcaa tatgaatgca actacccccc aaacaaccaa 180
gtaatactgt gtgaaccaac aataatagaa agaaacataa cagagatagt gtatctgacc 240
aacaccacca tagagaagga aatatgcccc aaactagcag aatacagaaa ttggtcaaag 300
ccgcaatgta aaattacagg atttgcacct ttttccaagg acaattcgat taggctttcc 360
gctggtgggg acatttgggt gacaagagaa ccttatgtgt catgcgatcc tgacaagtgt 420
tatcaatttg cccttggaca gggaacaaca ctaaacaaca ggcattcaaa tgacacagta 480
catgatagga ccccttatcg aaccctattg atgaatgagt tgggtgttcc atttcatttg 540
ggaaccaagc aagtgtgcat agcatggtcc agctcaagtt gtcacgatgg aaaagcatgg 600
ctgcatgttt gtgtaactgg gcatgatgaa aatgcaactg ctagcttcat ttacgatggg 660
aggcttgtag atagtattgg ttcatggtcc aaaaaaatcc tcaggaccca ggagtcggaa 720
tgcgtttgta tcaatggaac ttgtacagta gtaatgactg atgggagtgc ttcaggaaga 780
gctgatacta aaatattatt cattgaggag gggaaaatcg ttcatattag cccattgtta 840
ggaagtgctc agcatgtcga ggagtgctcc tgttatcctc gatatcctgg tgtcagatgt 900
gtctgcagag acaactggaa aggctccaat aggcccatcg tagatataaa tgtaaaggat 960
tatagcattg tttccagtta tgtgtgctca ggacttgttg gagacacacc cagaaaaaac 1020
gacagatcca gcagtagcaa ttgcctgaat cctaacaatg aggaaggggg tcatggagtg 1080
aaaggctggg cctttgatga tggaaatgac gtgtggatgg gaagaacgat caacgagaag 1140
ttacgctcag gttatgaaac cttcaaagtc attgaaggct ggtccaaacc taactccaaa 1200
ttgcagataa ataggcaagt catagttgac agaggtgata ggtccggtta ttctggcatt 1260
ttctctgttg aaggcaaaag ctgcatcaat cggtgctttt atgtggagtt gataagggga 1320
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<211> 1791
<212> DNA
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ttgagtgcat taattaaaaa cacccttgtt tctactaata cgagacgata t 1791
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<212> PRT
<213> swine influenza virus
<400> 3
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ala Thr Met Cys Phe Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Val Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Cys Asn Tyr Pro Pro Asn Asn
35 40 45
Gln Val Ile Leu Cys Glu Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu
50 55 60
Ile Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
Leu Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Lys Ile Thr Gly
85 90 95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys
115 120 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Arg His
130 135 140
Ser Asn Asp Thr Val His Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met
145 150 155 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile
165 170 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
180 185 190
Cys Val Thr Gly His Asp Glu Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asp
195 200 205
Gly Arg Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Lys Lys Ile Leu Arg
210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe
245 250 255
Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Ile Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ala
260 265 270
Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg
275 280 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp
290 295 300
Ile Asn Val Lys Asp Tyr Ser Ile Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly
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Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Asn Asp Arg Ser Ser Ser Ser Asn
325 330 335
Cys Leu Asn Pro Asn Asn Glu Glu Gly Gly His Gly Val Lys Gly Trp
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Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Asn Glu
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Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser
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Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Gln
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<212> PRT
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20 25 30
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gacatgttac ccaggagatt tcatcaatta tgaagagcta agagagcagt tgagctcagt 420
gtcatcattt gaaagatttg agatattccc caaggcaagt tcatggccca attatgaaac 480
aagcagaggt gtgacggcag catgtcctta tgctggagca aacagcttct acagaaattt 540
aatatggctg gtaaaaaaag gaaattcata cccaaagctc agcaaatctt atattaacaa 600
taaggagaag gaagtcctcg tgctatgggg cattcaccat ccatctacta gtactgacca 660
acaaagtctc taccagaatg cagatgccta tgtttttgta ggatcatcaa aatacagcaa 720
gaaattcaag ccagaaatag caacaagacc caaagtgagg gaccaagcag ggagaatgaa 780
ctattactgg acactagtag agcctggaga cacaataaca ttcgaagcaa ccggaaatct 840
agtggtacca agatatgcct tcgcaatgaa gagaggctct ggatctggta ttatcatttc 900
agatacatca gtccacgatt gcaatacgaa ttgtcaaaca cccaaaggtg ctataaacac 960
cagtcttcca tttcagaaca tacatccagt cacaatagga gaatgtccga aatatgtcaa 1020
aagcaaaaaa ttgagaatgg ctacaggatt aaggaatatc ccgtccattc aatctagagg 1080
cctgtttgga gccattgctg gctttattga ggggggatgg acaggaatga tagatggatg 1140
gtacggttat caccatcaaa atgagcaggg atcaggatat gcagccgacc gaaaaagcac 1200
acagagtgcc attgacggga tcactaacaa ggtaaattct attattgaaa agatgaactc 1260
acaattcaca gcagtgggca aagaattcaa ccacctggaa aagagaatag agaatttgaa 1320
cagaaaggtt gatgatggtt ttctggatgt ttggacttac aatgccgagc tgttggttct 1380
gttggaaaat gaaaggactt tggattatca cgattcaaat gtgaagaacc tatatgaaaa 1440
agtaagaagc cagctaaaaa acaatgccaa ggaaattgga aatggctgct ttgaatttta 1500
ccacaaatgt gatgacacat gcatggagag cgtcaaaaat gggacttatg attacccaaa 1560
atactcagaa gaagcaaaac taaacagaga ggagatagat ggggtaaagc tggaatcaac 1620
agaggtttac cagattttgg cgatctattc aactgtcgcc agttcattgg tactgttagt 1680
ctccctgggg gcaatcagct tctggatgtg ctccaatggg tctttacagt gcagaatatg 1740
tatttaaaat tgggatttca gaggcatgag aaaaacaccc ttgtttctac taatacgaga 1800
cgatat 1806
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<213> swine influenza virus
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Val Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gln Ile Gly Asn Ile Val Ser Leu
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Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Glu Lys Asn His Ser Glu Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Asn Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln
50 55 60
Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Ile Ala Asp Gly Gln Gly Val
65 70 75 80
Thr Ser Ile Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Ser Gly
85 90 95
Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly
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Cys Pro Ile Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
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Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe
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Lys Met Glu Lys Gly Lys Ile Ile Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro
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Pro Val Leu Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Arg
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Ser Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp
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545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
6

Claims (33)

1.一种免疫原性组合物，其包括：a)猪流感的经修饰活H3N2病毒，和b)猪流感的经修饰活H1N1病毒，其中所述猪流感的经修饰活H3N2病毒和H1N1病毒编码包括NS1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短NS1蛋白质，其中氨基末端氨基酸为编号1，且其中所述NS1蛋白质源自A/猪/Texas/4199-2/98。
2.如权利要求1的免疫原性组合物，其中所述猪流感的经修饰活H3N2和H1N1病毒是经减毒的。
3.如权利要求1的免疫原性组合物，其中所述猪流感的经修饰活H3病毒是含有来自A/猪/Texas/4199-2/98的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP和M的TX/98/del 126且NS1-126基因来自A/猪/Texas/4199-2/98，且其中所述猪流感的经修饰活H1病毒含有来自H1N1亚型A/猪/Minnesota/37866/1999的HA和NA以及来自H3N2亚型A/猪/Texas/4199-2/98的PB2、PB1、PA、NP、M且所述NS1-126基因来自H3N2亚型A/猪/Texas/4199-2/98。
4.如权利要求2的免疫原性组合物，其中所述猪流感的经修饰活H3病毒是含有来自A/猪/Texas/4199-2/98的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP和M的TX/98/del 126且NS1-126基因来自A/猪/Texas/4199-2/98，且其中所述猪流感的经修饰活H1病毒含有来自H1N1亚型A/猪/Minnesota/37866/1999的HA和NA以及来自H3N2亚型A/猪/Texas/4199-2/98的PB2、PB1、PA、NP、M且所述NS1-126基因来自H3N2亚型A/猪/Texas/4199-2/98。
5.如权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，其中所述猪流感的经修饰活H3N2病毒
a.包括NA和HA基因的核酸序列，所述NA和HA基因的cDNA分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示，或
b.包括编码NA和HA蛋白质的NA和HA基因的核酸序列，其中所述NA和HA蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，或
c.包括NA和HA蛋白质，其中所述NA和HA蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示，
和/或其中所述猪流感的经修饰活H1N1病毒：
a.包括NA和HA基因的核酸序列，所述NA和HA基因的cDNA分别如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示，或
b.包括编码NA和HA蛋白质的NA和HA基因的核酸序列，其中所述NA和HA蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，或
c.包括NA和HA蛋白质，其中所述NA和HA蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示。
6.如权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，其中所述猪流感的经修饰活H3N2和H1N1病毒协同性地一起作用。
7.如权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，其中所述猪流感的经修饰活H3N2及H1N1病毒的浓度与单价免疫原性组合物中猪流感的H3N2病毒浓度及单价免疫原性组合物中猪流感的H1N1病毒浓度相比是减少的。
8.如权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，其中所述猪流感的经修饰活H3N2病毒增加针对异源攻击的保护。
9.如权利要求8的免疫原性组合物，其中所述异源攻击是H1攻击。
10.如权利要求8的免疫原性组合物，其中所述异源攻击是H1N1攻击。
11.权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物在制备用于对个体实施免疫的试剂盒中的用途。
12.权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防有需要个体中由猪流感病毒引起的临床体征的试剂盒中的用途。
13.权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物在制备用于与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，减少有需要个体中的病毒脱落的试剂盒中的用途。
14.权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物在制备用于与使用猪流感的单价经修饰活H3N2或H1N1病毒实施免疫的相同物种免疫对照组的个体相比，减少有需要个体中病毒脱落的试剂盒中的用途。
15.权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物在制备对具有抗SIV抗体的个体接种疫苗的试剂盒中的用途。
16.权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物在制备用于预防或减少个体中早期SIV感染的试剂盒中的用途。
17.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述个体选自猪、牛、猫和狗。
18.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物为单次施用剂型。
19.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物为鼻内施用剂型。
20.如权利要求17的用途，其中所述个体为怀孕及哺乳期间的母猪。
21.如权利要求17的用途，其中所述个体为第一月龄内、前两周龄内或第一周龄内的猪。
22.如权利要求17的用途，其中所述个体是猪流感病毒母体抗体阳性的。
23.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物包括2log10至8log10的所述猪流感的经修饰活H1N1病毒和/或2log10至8log10的所述猪流感的经修饰活H3N2病毒。
24.如权利要求11至16中任一项的用途，其中与相同物种的未经免疫对照组的个体相比，所述免疫原性组合物产生选自以下的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少脱落、降低直肠温度或其组合。
25.如权利要求11至16中任一项的用途，其中与用单价经修饰活H3N2或H1N1流感病毒实施免疫的相同物种的个体相比，所述免疫原性组合物产生选自以下的效能参数改良：减少重量损失、较低病毒负荷、减少肺病灶、减少脱落、降低直肠温度或其组合。
26.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物使得与相同物种的未经免疫对照组的动物相比病毒负荷期缩短。
27.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物使得自攻击或感染之后第2天脱落减少。
28.如权利要求11至16中任一项的用途，其中与用单价经修饰活H3N2或H1N1流感病毒实施免疫的相同物种的个体相比，所述个体为使用较低浓度的如权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物实施免疫的个体。
29.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物中的猪流感的经修饰活H3N2和H1N1病毒协同性地一起作用。
30.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物中的猪流感的经修饰活H3N2和H1N1病毒的浓度与单价免疫原性组合物中猪流感的H3N2病毒浓度及单价免疫原性组合物中猪流感的H1N1病毒浓度相比是减少的。
31.如权利要求11至16中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物中的猪流感的经修饰活H3N2病毒增加针对异源攻击的保护。
32.如权利要求31中任一项的用途，其中所述异源攻击是H1攻击。
33.如权利要求31中任一项的用途，其中所述异源攻击是H1N1攻击。
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