CN103468647A

CN103468647A - 猪流感h1n1和h3n2亚型的二价灭活疫苗

Info

Publication number: CN103468647A
Application number: CN2013103966279A
Authority: CN
Inventors: 金梅林; 杨影; 徐高原
Original assignee: WUHAN KEQIAN ANIMAL BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd; Huazhong Agricultural University
Current assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL CO., LTD.; Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2013-09-03
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-03
Also published as: CN103468647B

Abstract

本发明属于动物病毒学技术领域，具体涉及一种猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗与应用。所述的二价灭活疫苗是由H1N1亚型猪流感病毒H1N1 SIV TJ株，保藏号为：CCTCC NO：V201107和H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株，保藏号为：CCTCC NO：V201308制备而成。本发明的猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗安全性好，免疫保护效果达到80%以上。

Description

猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗

技术领域

本发明属于动物病毒学技术领域，具体涉及一种猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗，该二价灭活疫苗是由H1N1TJ株+H3N2HuN-1株共同制备的。本发明还涉及由该H1N1亚型和H3N2的亚型感病毒株制备的灭活疫苗的应用。

背景技术

猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）属正粘病毒科A型流感病毒属，A型流感在包括人、猪、马、水貂、海洋动物、家养和野生鸟类等许多物种中分离到(Qi，Pang et al.2009)。表面抗原HA和NA对流感病毒毒宿主范围、抗原性、致病性、检测诊断非常重要。根据其表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸（NA）的不同可以分为不同的亚型(Vincent，Swenson et al.2009)。目前，在鸟类、人、哺乳动物中鉴定的有HA（H1-H16）16种亚型和NA（N1-N9）9种亚型(Fouchier，Munster et al.2005)。在中国大陆，报道过11(H1N1、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N3、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2)种亚型的猪流感。世界范围内猪群中流行的猪流感主要有H3N2、H1N1和H1N2三种亚型(Brown2000)，包括经典的H1N1、类禽的H1N1、类人或类禽的H3N2、重配的H3N2和各种亚型的H1N2亚型(Brown2000;Webby，Swenson et al.2000;Qi，Pang et al.2009)。

SIV感染都可造成呼吸道上皮的损伤，临床症状为咳嗽急促，急性爆发可以起明显的流感样症状，发病突然，潜伏期1-3天，发病率可高达100%，病程简单，致死率低，通常低于1%。但是仔猪感染或SIV感染引起细菌性疾病的继发感染可造成较高的死亡率。感染猪群表现为食欲减退、嗜睡、扎堆。运动可引起严重的阵发性咳嗽，体温升高，呼吸困难，出现张口呼吸和腹式呼吸。如果没有引起继发感染，个体动物的临床症状在5-7天内消失，猪群症状在10-14天内消失(Zhou，Senne et al.1999;Karasin，Schutten et al.2000;Gramer，Lee et al.2007)。流感爆发可引起怀孕母猪的流产，造成母猪流感的原因并不是胚胎感染了流感病毒，因为流感病毒并不能扩散到全身，而是因为感染造成了怀孕母猪的体温升高。疾病发生迅速，能在1周内通过血液-妊娠屏障。与猪繁殖与呼吸综合征不同，猪流感引起的流产主要在感染2-3周内(Kothalawala，Toussaint et al.2006)。虽然SIV致死率通常较低（1-4%），但是病毒感染可以引起体重减轻和发育缓慢。感染猪在感染的3-4周内体重能够下降12磅(Kothalawala，Toussaint et al.2006)。猪流感因为症状不明显，而在猪场中常常被忽略，使得猪群长期带毒排毒，不但可以直接引起仔猪的死亡，同时猪流感可以引起其他疾病的发生，而导致病程加重，给养猪业造成极大的损失。粗略估算，中国畜牧业每年因为动物疫病，约损失500亿元以上的产值，每年防治动物疫病以及处理突发性公共卫生事件所花费的人力、物力、财力更高达数千亿元。

感染猪与未感染猪的直接接触传播是主要的传播方式(Kothalawala，Toussaint et al.2006)，这种直接的传播在动物运输过程中是常见的。集约化猪场因为密集饲养而可能具有更高的传播风险(Saenz，Hethcote et al.2006)。病毒可能通过猪的鼻子的相互接触，或通过干掉的粘液直接传播。由喷嚏或咳嗽形成的气溶胶传播也是重要的传播途径。流感病毒在猪群中传播迅速，通常几天内全部猪群感染(Kothalawala，Toussaint et al.2006)。SIV也可能由野生动物传播，比如说野猪就可以在农场之间传播流感病毒(Vicente，Leon-Vizcaino et al.2002)。

猪流感病毒在世界范围的猪群中是普遍的。猪流感病毒从猪到人的传播并不常见，也不引起人流感，通常只是引起血液中抗体的产生。如果传播不能引起人的流感，它被称为动物性SIV，长期暴露在猪群中的人感染猪流感的风险更高。20世纪中，流感亚型的鉴定成为可能，而使SIV向人的传播能够得到精确的诊断。2009年以前，仅有50例SIV感染人的病例确诊，这种感染人的SIV不能够在人和人之间进行传播，人感染猪流感病毒引起寒颤、发烧、喉咙肿痛、肌肉肿痛、严重的头疼、咳嗽、身体虚弱、不适等流感样症状。

华中农业大学预防兽医学实验室从2001以来就开展了SI的相关研究，不间断的分离地方流行毒株，从宿主猪上分离到的病毒大多为H1N1亚型，也分离到部分H3N2亚型的猪流感病毒。本申请人2009年至2012年期间通过对国内多个规模化猪场的近16000多份血清的HI检测结果发现，H1亚型猪流感感染的阳性率平均达到41.83%。新型甲型H1猪流感感染的阳性率平均达到38.06%；H3亚型猪流感感染的阳性率平均达到40.28%。由于我国的规模化猪场未注射猪流感疫苗，其阳性率真实的反应了猪群受猪流感感染的程度。

到目前为止，尚未见到有关猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，制备一种猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗。该二价灭活疫苗含有申请人分离的猪流感H1N1亚型H1N1TJ株和猪流感H3N2HuN-1株，本发明还包括该灭活疫苗的制备方法及其应用。

本发明从分离鉴定的流行毒株中筛选出免疫原性好、增殖滴度高的病毒株作为猪流感二价灭活疫苗制苗毒株，通过最佳接种剂量、最佳培养温度、最适收获时间等培养条件的优化，培育出效价稳定的猪流感病毒。对疫苗的生产工艺、安全性、保护效果、免疫程序和有效期研究表明该疫苗是安全有效的。

具体地，本发明通过以下方案实现：

本发明的猪流感H1N1亚型猪流感病毒是从某发病猪场的鼻拭子样品中分离得到，经RT-PCR扩增，连接T载体进行测序检测鉴定该病毒为H1N1亚型猪流感病毒（H1N1swine influenza virus）。申请人将该病毒株命名为H1N1SIV TJ株（H1N1亚型猪流感病毒TJ株），该毒株于2011年3月25日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为：CCTCC NO：V201107，该毒株已公开，参见中国发明专利公开号：CN102747045A;公开日：2012年10月24日；专利申请号：201110097884.3。

H3N2亚型猪流感病毒株（即本发明二价疫苗疫苗株）是从某发病猪场的鼻拭子样品中分离得到，经RT-PCR扩增，连接T载体进行测序检测鉴定该病毒为H3N2亚型猪流感病毒H3N2swine influenza virus，申请人将该病毒株命名为H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株，A/Swine/HuHan/01/2008(H3N2)，该毒株于2013年4月18日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为：CCTCCNO：V201308。通过将所述的病毒株接种鸡胚培养，收获尿囊液，超滤浓缩后经β-丙内酯灭活，将两种病毒液混合后与矿物油佐剂混合成乳化制成猪流感H1N1和H3N2亚型二价灭活疫苗。

本发明分离毒株的微生物鉴定

形态特征描述：

流感病毒是负链RNA病毒。基因组是分节段的，每个RNA病毒都由核蛋白包被形成RNP复合体。RNPs由基质蛋白（M₁）构成完整的膜包裹。脂类来自宿主细胞膜，而在病毒粒子内部是RNA依赖性聚合酶蛋白（PA、PB1和PB2），两个重要的跨膜蛋白分别是棒状的HA和蘑菇状的NA。典型的流感病毒在电镜下呈球形（如图2所示），直径为80～120nm，平均为100nm。该流感病毒具有囊膜，在囊膜表面有许多放射性排列的纤突，病毒粒子的中心有一直径为40～60nm的电子密度高的锥状核心。

本发明的优点是：

1、本发明提供了两种新的猪流感病毒毒株，由这两个毒株制备的猪流感H1N1和H3N2亚型二价灭活疫苗能有效预防H1及H3亚型猪流感病毒引起的猪流感。

2、本发明制备的疫苗安全性良好，试验证明具有良好的安全性，免疫保护效果达到80%以上。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。为H3N2HuN-1株的序列，长度为bp。

附图说明

图1：是本发明的总体技术流程图。

图2：猪流感病毒的电镜图。其中图2a为H1N1TJ株的电镜照片，其中图2b为H3N2HuN-1株的电镜照片。

图3：HA、NA基因的凝胶电泳图。

图4：pMD-18T载体图谱。

图5：本发明制备的猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗注射猪的颈部的吸收情况的病理切片。其中：图5a是灭活疫苗中的抗原正在逐渐的刺激机体产生特异性的抵抗力，淋巴细胞正在逐渐的吞噬这些油脂细胞；图5b是非免疫对照猪的肌肉组织和脂肪组织间未观察到明显的油脂细胞和淋巴细胞聚集。

图6：免疫猪与未免疫对照猪攻毒后剖解的病理变化图。其中图6a是H1N1TJ株接种对照猪的肺部实变，图6b是H1N1TJ株接种免疫猪的肺部正常。

具体实施方案

实施例1制备实施例

1、猪流感病毒相关病毒株的分离与鉴定

1.1猪流感病毒H1N1TJ株的分离鉴定

从某猪场疑似流感感染的猪群中采集鼻拭子，接种鸡胚，收集鸡胚尿囊液，经RT-PCR方法检测后确定为猪流感病毒H1N1亚型，将该病毒株命名为猪流感病毒H1N1SIV TJ株。具体操作步骤如下：

1.1.1鸡胚增殖

将病料处理液加入双抗（最终浓度为10000U/ml），于33～35℃孵育30分钟后，经绒毛尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，每份病料接种4鸡胚枚，每胚0.2ml。接种的鸡胚置33～35℃孵育96小时，湿度保持为60～65%，定时照蛋。24小时内死亡的鸡胚弃去。取24～96小时死亡和存活的鸡胚置2～8℃冷却过夜或-20℃以下冷却1～2小时，无菌收集尿囊液，12,000转/分钟离心10分钟，以去除红细胞和大的杂质，上清留进行HA试验和HI试验。对于第一代尿囊液为阴性的上清按以上方法盲传三代，如仍为阴性则弃之，阳性置-70℃以下保存备用。

1.1.2血凝（HA）试验及血凝抑制（HI）试验

采用“胰酶-加热-高碘酸盐”方法处理血清，以去除血清中的非特异抑制因子。具体方法见规程附注2。

H1N1亚型SIV接种鸡胚后绝大部分鸡胚在96小时内不致死鸡胚。经过2代传代后，在96小时内有50%的鸡胚死亡，收获的尿囊液HA效价在1：128～1：256之间，最高可达1：256，第4代时96小时内80%鸡胚死亡，尿囊液HA效价在1：256～1：1024之间，最高可达1：1024，结果见表1。

表1 样品接种传代次数及HA价

1.1.3鸡胚半数感染滴度（EID₅₀）试验

病毒用生理盐水作10倍系列倍比稀释，稀释至10^-5～10^-9，接种9～11日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，每胚接种0.2ml，33～35℃孵育，每天检查鸡胚2次，记下死亡鸡胚数量和时间，按Reed-Muench法计算EID₅₀。结果见表3。Reed-Muench法计算EID₅₀其原理为：当高浓度病毒接种鸡胚时，鸡胚不感染，而用低浓度病毒接种鸡胚时，鸡胚不感染；同理感染积累，当低剂量接种时就能被感染的鸡胚，用高剂量接种时肯定会被感染，所以感染累积应从低病毒接种量往高接种量方面累积，见表2。

表2 Reed-Muench法计算EID₅₀结果

计算方法如下：

lgEID₅₀＝高于50％感染的病毒最高稀释度的对数＋距离比例×稀释度之间的差。

lgEID₅₀＝-7+（-1×0.667）=-7.67

则EID₅₀＝10^-7.67/0.2ml

表3 分离株EID₅₀测定结果

Figure 2013103966279100002DEST_PATH_IMAGE001

1.1.4HA和NA测序鉴定

（1）提取鸡胚尿囊液的RNA，RT-PCR扩增：

反转录用的引物序列Uni12（单链）：5’-AGCAAAAGCAGG-3’

猪流感病毒cDNA合成：

在20μL反转录体系中进行，依次加入以下组分：

AMV Reverse Transcriptase XL(50U/μL) 1.0μL；

RNase inhibitor(40U/μL) 0.5μL；

5×RNA PCR Buffer 4.0μL；

Uni12prime(10pmol)r 1.5μL；

dNTPs（10mmol） 2μL；

RNA模板 11μL；

将上述试剂或酶混匀后置PCR仪上，于42℃下反应60min，95℃下反应5min进行反转录，反应产物直接用于PCR或于4℃下保存备用。

扩增HA基因（登录号为Eu004444.1）。NA（登录号为Eu004442.1）。

扩增用的引物的核苷酸序列如下：

扩增HA基因：

上游引物p15’-AGCAAAAGCAGGGG-3’，

下游引物P25’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；得到扩增片段大小为1700bp左右。

扩增NA基因：

上游引物p15’-AGCAAAAGCAGGAGT-3’，

下游引物P25’-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3’；扩增片段大小为1500bp左右。

PCR反应体系：

在25μL PCR体系中（依次加入以下组分）：

Trans-Taq聚合酶(2U) 0.5μL；

10×Buffer 2.5μL；

dNTP（2mmol） 2μL；

上游引物 1μL；

下游引物 1μL；

cDNA 3μL；

ddH₂O 16μL；

PCR反应参数：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，30个循环；72℃延伸10min。HA、NA基因的的扩增结果分别见（图3a，图3b），将PCR产物纯化后连接pMD18-T载体（购自宝生物工程大连有限公司，其载体图谱见图4），选取阳性病料克隆HA和NA基因送上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与NCBI数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU004444.1和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU004442.1进行比对确定本发明的分离株为猪流感病毒（swine influenza virus）H1N1亚型。申请人将这毒株命名为猪流感病毒H1N1SIV TJ株，于2011年3月25日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为：CCTCC NO：V201107；该毒株已公开，参见中国发明专利公开号：CN102747045A;公开日：2012年10月24日；专利申请号：201110097884.3。

1.2H3N2HuN-1株的分离鉴定

从某猪场疑似流感感染的猪群中采集鼻拭子，接种鸡胚，收集鸡胚尿囊液，经RT-PCR方法检测后确定为猪流感病毒H3N2亚型，将该病毒株命名为H3N2猪流感病毒HuN-1株。

具体操作步骤如下：

1.2.1鸡胚增殖

1.2.2血凝（HA）试验及血凝抑制（HI）试验

采用“胰酶-加热-高碘酸盐”方法处理血清，以去除血清中的非特异抑制因子。

H3N2亚型SIV经过4代传代后，尿囊液HA效价在8log₂～9log₂之间，结果见表4。

表4 样品接种传代次数及HA效价

1.2.3鸡胚半数感染滴度（EID₅₀）试验

病毒用生理盐水作10倍系列倍比稀释，稀释至10^-5～10^-9，接种9～11日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，每胚接种0.2ml，33～35℃孵育，每天检查鸡胚2次，记下死亡鸡胚数量和时间，按Reed-Muench法计算EID₅₀，结果见表6。其原理为：当高浓度病毒接种鸡胚时，鸡胚不感染，而用低浓度病毒接种鸡胚时，鸡胚不感染；同理感染积累，当低剂量接种时就能被感染的鸡胚，用高剂量接种时肯定会被感染，所以感染累积应从低病毒接种量往高接种量方面累积，见表5。

表5 Reed-Muench法计算EID₅₀的结果

计算方法如下：

lgEID₅₀＝-7+（-1×0.667）=-7.67

则EID₅₀＝10^-7.67/0.2ml

表6 分离株EID₅₀测定结果

1.2.4HA和NA测序鉴定

（1）提取鸡胚尿囊液的RNA，RT-PCR扩增：

反转录用的引物序列Uni12（单链）：5’-AGCAAAAGCAGG-3’

猪流感病毒cDNA合成：

在20μL反转录体系中进行，依次加入以下组分：

AMV Reverse Transcriptase XL(50U/μL) 1.0μL；

RNase inhibitor(40U/μL) 0.5μL；

5×RNA PCR Buffer 4.0μL；

Uni12prime(10pmol)r 1.5μL；

dNTPs（10mmol） 2μL；

RNA模板 11μL；

扩增HA（登录号为KC620455.2）。NA（登录号为KC620456.2）。引物对的核苷酸序列如下：

扩增HA基因上游引物p15’-AGCAAAAGCAGGGG-3’，

下游引物P25’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；

扩增片段大小为1700bp左右。

扩增NA基因上游引物p15’-AGCAAAAGCAGGAGT-3’，

下游引物P25’-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3’；

扩增片段大小为1500bp左右。

PCR反应体系：

在25μL PCR体系中（依次加入以下组分）：

Trans-Taq聚合酶(2U) 0.5μL；

10×Buffer 2.5μL；

dNTP（2mmol） 2μL；

上游引物 1μL；

下游引物 1μL；

cDNA 3μL；

ddH₂O 16μL；

PCR反应参数：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，30个循环；72℃延伸10min。HA、NA基因的的扩增结果分别见（图3a，图3b），将PCR产物纯化后连接pMD18-T载体（载体图谱见图4），选取阳性病料克隆HA和NA送上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与NCBI数据库 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC620455.2和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC620456.2进行比对确定本发明的分离株为猪流感病毒（swine influenza virus）H3N2亚型。申请人将这毒株命名为H3N2亚型猪流HuN-1株，A/Swine/HuHan/01/2008(H3N2)，于2013年4月18日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为：CCTCC NO：V201308。

2猪流感病毒H1N1TJ株和猪流感病毒H3N2HuN-1株的特性

2.1H1N1TJ株病毒株特性

（1）血凝抑制试验按“中华人民共和国兽药典”第三部（中国兽药典委员会编，中国农业出版社，2010版，以下简称“中国兽药典”）HI试验方法配制4单位H1N1TJ株病毒液，然后用四种阳性血清进行交叉试验。该病毒凝集红细胞的特性能被流感H1阳性参考血清特异性中和，不能被H3、H5、H9阳性参考血清中和。H1N1TJ株第1代HA效价为1:32，传至第2代HA为1:256。

（2）回归试验将H1N1TJ株病毒用灭菌生理盐水稀释至2.0ml含10⁷EID₅₀病毒，以气管途径对60～65日龄的仔猪进行攻毒，每头接种2.0ml。逐日观测猪只的食欲、精神状态，是否有流感样症状，并每日测其体温，采集攻毒猪鼻拭子，按常规方法进行病毒分离。将病毒接种仔猪后12h时由4头猪开始分别出现包括流鼻涕，咳嗽、厌食、精神萎靡、不愿走动，5天后，猪只症状逐渐消失，趋于康复。将病毒接种仔猪后在60小时至72小时体温出现升高，随后下降，在96小时体温又达到40.0℃以上，120小时后体温恢复正常，体温有一定的波动。用拭子采集攻毒第1～5天的猪鼻拭子，在第2～5天里少部分鼻拭子样品能检测到病毒。第5日剖杀所有攻毒猪，观察肺部病理变化，TJ株攻毒后有4头猪观察到明显的实变。

（3）毒种传代试验将经过鸡胚有限稀释克隆连续传代得到的，具有稳定血凝效价的H1N1TJ病毒液作为原始种子液，以原始种子液H1N1TJ（F0）进行传代，第一代为F1依次传至F8代，取传代毒种第2代（F2）、第4代（F4）、第6代（F6）、第8代（F8）用1%的鸡红细胞进行病毒血凝滴度测定。其HA效价均≥8log₂。

（4）纯净性试验

1）无菌检验将上述步骤（3）得到的F8代毒种按照“中国兽药典”规定的方法进行，利用硫乙酸盐培养基（简称T.G，参见中国兽药典第三部）、酪胨琼脂斜面（简称G.A参见中国兽药典第三部）和葡萄糖蛋白胨汤（简称G.P，参见中国兽药典第三部）进行无菌检验。

2）支原体检验将H1N1TJ株的F8代毒种接种改良Frey氏培养基（参见中国兽药典第三部），按“中国兽药典”规定方法进行检验。

3）外源病毒检测H1N1SIV TJ株基础种子批F8代病毒液，进行适当稀释与猪流感病毒高免血清进行中和，取中和后的病毒液按现行中国兽药典规定的方法进行外源病毒检测。

应用分子生物学检查法通PCR或者RT-PCR的方法检测本发明的H1N1TJ株F8代毒种中是否存在牛病毒性腹泻病毒（试验中的毒株BVDV Oregon C24V株，购自中国兽医药品监察所）、伪狂犬病毒（伪狂犬病毒，龙晓婷等，伪狂犬病毒在潜伏感染猪体内的组织分布，畜牧兽医学报，2008年，第39卷，第5期：645-651）、猪细小病毒（吕建强等，猪细小病毒-伪狂犬病毒二联油乳剂灭活疫苗的研制，中国兽医杂志，2005年，第41卷，第6期：17-20）、猪瘟病毒（郭东春等，猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达，中国预防兽医学报，2006年，第28卷，第1期：6-9）、猪圆环病毒的污染（宋云峰等，猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达，中国兽医学报，2007年，第27卷，第2期：155-158）。结果显示本实施例制备的F1～F8代毒种中并没有这些病毒的污染。

结果表明H1N1TJ株F8代毒种无细菌、支原体、外源病毒污染。结果见表1，表明本发明所涉及的病毒是纯净的。

（5）红细胞凝集试验按“中国兽药典”规定方法进行检验，HA效价为8～9log₂。

结果见表7。

（6）H1N1TJ株病毒含量测定将H1N1TJ株F8代毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释后，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-84个稀释度，每个稀释度经尿囊腔分别接种9日龄SPF鸡胚各4枚，每胚0.2ml，置相对湿度60～65%，温度33～35℃继续孵育。定时照胚，弃去24小时内死亡鸡胚，24小时后死胚随时收获，至72小时无论死胚活胚均逐个收获鸡胚尿囊液，分别测定红细胞凝集（HA）效价≥4log₂判定为感染，按照Reed-Muench法（参照实施例1的1.1.3）计算EID₅₀。结果每0.2ml猪流感H1N1亚型病毒含量为≥10^6.5EID₅₀。

试验结果见表7。

表7 H1N1TJ株F8代毒种纯净、HA效价及病毒含量检测结果

说明：表1中的HA为血凝素缩写。

（7）免疫原性试验将猪流感病毒H1N1TJ株F4代毒种用β-丙内酯溶液灭活，按油相和水相5:5的重量比进行乳化制成水包油包水型灭活疫苗后，颈部肌肉注射25～30日龄猪流感病毒H1N1血凝抑制抗体阴性（HI≤1:8）仔猪5头，每头注射剂量为2ml。首免14日后进行二免，二免后21日，连同非免疫对照猪5头，采集血清进行HI效价测定并用H1N1TJ株进行气管内接种，每头猪接种2ml（含10^7.0EID₅₀），自攻毒后连续3日观察记录咳嗽、流鼻涕、鼻炎等流感样症状，同时监测体温反应。采集第3日的鼻拭子样品进行病毒分离，攻毒后第5日剖杀所有仔猪观察肺部病理变化。免疫猪应至少4头保护，对照组应至少4头发病。

发病判定标准：

出现上呼吸道症状：出现上呼吸道症状攻毒后1～3日出现体温升高（超过40℃，持续1日以上）、咳嗽、流鼻涕、鼻炎（有粘性鼻液通过采鼻拭子时的刺激排出）、呼吸困难、精神沉郁等任一项或多项，就判为出现呼吸道症状。

病毒分离阳性：攻毒后第3日采集所有攻毒猪的鼻腔拭子，每份拭子样品经尿囊腔途径接种9～11日龄易感鸡胚各5枚，每份接种样品中有1枚鸡胚液的HA效价不低于1:16，即判为病毒分离阳性。

出现肺脏病理变化：攻毒后第5日剖杀所有攻毒仔猪，逐头观察肺脏变化，肺脏出现斑点状或斑块状实变的病理变化。

以上3项出现任意2项者，即判定为发病。

凡免疫组至少4头获得免疫保护，攻毒对照组至少4头发病的，说明本发明制备疫苗具有良好的免疫效力。

攻毒试验结果见表8所述。

表8 H1N1TJ F4代毒种免疫原性检测结果

（8）特异性试验将H1N1TJ株F4代毒种用猪流感H1、H3、H5、H9亚型及猪细小病毒特异性抗血清进行HI试验。HI试验结果表明，H1N1TJ株F4毒种对猪流感H1亚型特异性抗血清为阳性反应，对H3、H5、H9亚型及猪细小病毒特异性阳性血清均为阴性反应。

（9）对鸡胚的毒力试验将H1N1TJ株F4代毒种用灭菌生理盐水作10^-4倍稀释后，尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，33～35℃孵育72小时。鸡胚至少死亡80％。

2.2猪流感H3N2亚型HuN-1病毒株特性

（1）血凝抑制试验按“中华人民共和国兽药典”第三部（中国兽药典委员会编，中国农业出版社，2010版，以下简称“中国兽药典”）HI试验方法配制4单位H3N2HuN-1株病毒液，然后用四种阳性血清进行交叉试验。该病毒凝集红细胞的特性能被流感H1阳性参考血清特异性中和，不能被H1、H5、H9阳性参考血清中和。H3N2HuN-1株第1代HA效价为1:32，传至第2代HA为1:256。

（2）回归试验将H3N2HuN-1株病毒用灭菌生理盐水稀释至2.0ml含10⁷EID₅₀病毒，以气管途径对60～65日龄的仔猪进行攻毒，每头接种2.0ml。逐日观测猪只的食欲、精神状态，是否有流感样症状，并每日测其体温，采集攻毒猪鼻拭子，按常规方法进行病毒分离。将病毒接种仔猪后12h时由4头猪开始分别出现包括流鼻涕，咳嗽、厌食、精神萎靡、不愿走动，5天后，猪只症状逐渐消失，趋于康复。将病毒接种仔猪后接种后1日体温出现升高，随后下降，在第3日、4日、5日还有个别猪的体温达到40.0℃以上，然后体温恢复正常，体温有一定的波动。用拭子采集攻毒第1～5天的猪鼻拭子，在第2～5天里少部分鼻拭子样品能检测到病毒。第5日剖杀所有攻毒猪，观察肺部病理变化，HuN-1株攻毒后有5头猪观察到明显的实变。

（3）毒种传代试验将经过鸡胚有限稀释克隆连续传代得到的，具有稳定血凝效价的H3N2HuN-1病毒液作为原始种子液，以原始种子液H3N2HuN-1（F0）进行传代，第一代为F1依次传至F8代，取传代毒种第2代（F2）、第4代（F4）、第6代（F6）、第8代（F8）用1%的鸡红细胞进行病毒血凝滴度测定。其HA效价≥8log₂。

（4）纯净性试验

1）无菌检验将上述步骤（3）得到的F8代毒种分别按照“中国兽药典”规定的方法进行，利用硫乙酸盐培养基（简称T.G，参见中国兽药典第三部）、酪胨琼脂斜面（简称G.A参见中国兽药典第三部）和葡萄糖蛋白胨汤（简称G.P，参见中国兽药典第三部）进行无菌检验。

2）支原体检验将H3N2HuN-1株的F8代毒种分别接种改良Frey氏培养基（参见中国兽药典第三部），按“中国兽药典”规定方法进行检验。

3）外源病毒检测H3N2HuN-1株基础种子批F8代病毒液，进行适当稀释与猪流感病毒高免血清进行中和，取中和后的病毒液按现行中国兽药典方法进行外源病毒检测。

应用分子生物学检查法通PCR或者RT-PCR的方法检测本发明的H3N2HuN-1株F8代毒种中是否存在牛病毒性腹泻病毒（BVDV Oregon C24V株，购自中国兽医药品监察所）、伪狂犬病毒（龙晓婷等，伪狂犬病毒在潜伏感染猪体内的组织分布，畜牧兽医学报，2008年，第39卷，第5期：645-651）、猪细小病毒（吕建强等，猪细小病毒-伪狂犬病毒二联油乳剂灭活疫苗的研制，中国兽医杂志，2005年，第41卷，第6期：17-20）、猪瘟病毒（郭东春等，猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达，中国预防兽医学报，2006年，第28卷，第1期：6-9）、猪圆环病毒的污染（宋云峰等，猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达，中国兽医学报，2007年，第27卷，第2期：155-158）。结果显示F1～F8代毒种中并没有这些病毒的污染。

结果表明H3N2HuN-1株F8代毒种无细菌、支原体、外源病毒污染。结果见表9，表明本发明所涉及的病毒是纯净的。

（5）红细胞凝集试验按“中国兽药典”规定方法进行检验，HA效价为9log₂。

结果见表9。

（6）H3N2HuN-1病毒含量测定将H3N2HuN-1株F8代毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释后，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-84个稀释度，每个稀释度经尿囊腔分别接种9日龄SPF鸡胚各4枚，每胚0.2ml，置相对湿度60～65%，温度33～35℃继续孵育。定时照胚，弃去24小时内死亡鸡胚，24小时后死胚随时收获，至72小时无论死胚活胚均逐个收获鸡胚尿囊液，分别测定红细胞凝集（HA）效价≥4log₂判定为感染，按照Reed-Muench法计算EID₅₀。结果每0.2ml猪流感H3N2亚型病毒含量为≥10^6.5EID₅₀。

试验结果见表9。

表9 H3N2HuN-1株F8代毒种纯净、HA效价及病毒含量检测结果

说明：表1中的HA为血凝素缩写。

（7）免疫原性试验将H3N2HuN-1株F4代毒种用β-丙内酯溶液灭活，按油相和水相5:5的重量比进行乳化制成水包油包水型灭活疫苗后，颈部肌肉注射25～30日龄猪流感病毒H1N1血凝抑制抗体阴性（HI≤1:8）仔猪5头，每头注射剂量为2ml。首免14日后进行二免，二免后21日，连同非免疫对照猪5头，采集血清进行HI效价测定并用H3N2HuN-1株进行气管内接种，每头猪接种2ml（含10^7.0EID₅₀），自攻毒后1～3日每日采集1次所有攻毒猪的鼻腔拭子，每份拭子样品分别经尿囊腔途径接种9～11日龄易感鸡胚各5枚，每胚0.2ml，孵育观察3日，无论死胚、活胚鸡胚液血凝价，5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液的HA价不低于1:16判为感染，即判为发病。1头猪的1～3日的鼻拭子样品中只要有1日的鼻拭子样品病毒分离阳性就判该攻毒猪发病。

免疫猪应至少4头保护，对照组应至少4头发病。

发病判定标准：

HuN-1株病毒，自攻毒后1～3日每日采集1次所有攻毒猪的鼻腔拭子，每份拭子样品分别经尿囊腔途径接种9～11日龄易感鸡胚各5枚，每胚0.2ml，孵育观察3日，无论死胚、活胚鸡胚液血凝价，5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液的HA价不低于1:16判为感染，即判为发病。1头猪的1～3日的鼻拭子样品中只要有1日的鼻拭子样品病毒分离阳性就判该攻毒猪发病。凡免疫组至少4头获得免疫保护，攻毒对照组至少4头发病的，说明本发明制备疫苗具有良好的免疫效力。

攻毒试验结果见表10所述。

表10 H3N2HuN-1F4代毒种免疫原性检测结果

（8）特异性试验将H3N2HuN-1株F4代毒种用猪流感H1、H3、H5、H9亚型及猪细小病毒特异性抗血清进行HI试验。HI试验结果表明，H3N2HuN-1株F4毒种对猪流感H3亚型特异性抗血清为阳性反应，对H1、H5、H9亚型及猪细小病毒特异性阳性血清均为阴性反应。

（9）对鸡胚的毒力试验将H3N2HuN-1株F4代毒种用灭菌生理盐水作10^-4倍稀释后，尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，33～35℃孵育72小时。鸡胚至少死亡80％。

3、猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗的制备

3.1制苗材料的选择

鸡胚的选用来自饲养管理良好的健康鸡群所产的鸡蛋，每批鸡胚要经过严格筛选。外检共4项：白壳、大小、破损及脏胚，内检共9项：去除沙壳、偏气室、游气室、倒置胚、无精蛋、终止胚、弱胚、污染胚、裂缝胚。检验合格的鸡胚可以作为制苗材料。

3.2H1N1TJ株制苗用毒液的制备

3.2.1病毒接种取猪流感H1N1SIV TJ亚型株生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-4稀释后，尿囊腔接种9日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，置相对湿度60%～65%，温度33～35℃条件下孵育，不必翻蛋。

3.2.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋2次，弃去24小时内死亡鸡胚，24小时后死亡鸡胚随时取出，至72小时，不论鸡胚死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却至少12小时。

3.2.3收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，以无菌剥除气室部位囊膜壳，在收获胚液前，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者弃去不用。死胚和活胚分开收获，收获鸡胚尿囊液于灭菌容器中，若干个收获鸡胚液为一组，每组抽样进行检验。

3.2.4检验：对收获的病毒样品进行无菌检验、红细胞凝集试验和病毒含量测定，应无菌生长，HA效价≥7log₂，每0.2ml病毒含量应≥10^6.5EID₅₀。对检验合格的样品注明名称、收获日期、代次等。收获的胚液灭活前置2～8℃保存，应不超过3日。

3.3H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株制苗用毒液的制备

3.3.1病毒接种：取H3N2HuN-1株生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-4稀释后，尿囊腔接种9日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，置相对湿度60%～65%，温度33～35℃条件下孵育，不必翻蛋。

3.3.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋2次，弃去24小时内死亡鸡胚，24小时后死亡鸡胚随时取出，至72小时，不论鸡胚死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却至少12小时。

3.3.3收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，以无菌剥除气室部位囊膜壳，在收获胚液前，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者弃去不用。死胚和活胚分开收获，收获鸡胚尿囊液于灭菌容器中，若干个收获鸡胚液为一组，每组抽样进行检验。

3.3.4检验：对收获的病毒样品进行无菌检验、红细胞凝集试验和病毒含量测定，应无菌生长，HA效价≥8log₂，每0.2ml病毒含量应≥10^6.5EID₅₀。对检验合格的样品注明名称、收获日期、代次等。收获的胚液灭活前置2～8℃保存，应不超过3日。

3.4浓缩将猪流感H1N1TJ株和猪流感H3N2HuN-1株病毒液，用连续流离心机12000r/min离心10分钟，无菌收集上清，以去除大颗粒的细胞碎片。采用切向流膜堆和超滤系统，利用分子筛超滤工艺，通过选择合适的膜型和工作条件，对猪流感H1N1TJ株和猪流感H3N2HuN-1株鸡胚尿囊液进行浓缩试验。预处理过的鸡胚尿囊液经100KD的超滤膜堆体积浓缩到原来的2～4倍（即原来体积的1/2～1/4），并留样测定EID₅₀效价，每0.2ml病毒含量应≥10^7.0EID₅₀。浓缩后的鸡胚尿囊液随即进行灭活。

3.5灭活经浓缩检验合格后的两种病毒鸡胚尿囊液分别注入灭活罐，按0.0025%的终浓度为加入β-丙内酯溶液，边加边搅拌，使其充分混合，置2～8℃下灭活24小时，期间6小时搅拌1次，再取出置于37℃作用2小时。灭活完成后取样做灭活检验及无菌检验，置2～8℃下保存过夜，保存时间应不超过7日。

3.6半成品检验

无菌检验按现行《中国兽药典》附录，对灭活后的H1N1TJ株和H3N2HuN-1株病毒液进行无菌检验，应无菌生长。

3.7灭活检验

取灭活的病毒液接种9日龄易感鸡胚10枚，每胚0.2ml，置33～35℃培养72小时。24小时内死亡的不计数，收获鸡胚液，测定HA价，应为阴性，并盲传1代，测定HA价，如为阴性，即灭活完全。

3.8油乳剂灭活疫苗的制备

3.8.1油相制备SEPPIC公司的MONTANIDE^TM ISA206，用隔水尼龙膜（0.2μm）过滤可得到无菌的佐剂。

3.8.2水相制备将检验合格的H1N1TJ株和H3N2HuN-1株灭活病毒液按体积比1:1比例混合均匀。

3.8.3乳化按油相和水相5:5的重量比进行乳化。

3.8.4分装将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，并贴上标签。

4成品检验

4.1性状乳白色或淡粉红色均匀乳状液。

剂型为水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层现象管底析出水相应不多于0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

4.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

4.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.4安全检验用25～30日龄猪流感病毒H1N1、H3N2亚型血凝抑制抗体阴性（HI≤1:8）健康仔猪5头，各颈部肌肉注射疫苗4ml（2头份），观察14日，应无不良反应，且全部健活。

4.5效力检验

4.5.1TJ株部分采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫保护性试验进行检验。

4.5.1.1血清学方法用25～30日龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗2ml。首免14日后进行二免，二免后21日，连同非免疫对照猪5头，分别采血分离血清，测定血凝抑制抗体，5头免疫猪血凝抑制抗体几何平均滴度（GMT）应不低于1:64（SIV H1N1GMT不低于1:64），5头非免疫对照猪为阴性。

4.5.1.2TJ株免疫保护性试验

取25～30日龄猪流感病毒血凝抑制抗体的阴性健康易感仔猪5头，颈部肌肉注射疫苗2ml。首免14日后进行二免，每头2ml。二免后21日，连同对照组5头，各气管接种2ml（每0.2ml病毒含量应≥10^6.0EID₅₀）TJ株病毒，自攻毒后连续3日观察记录咳嗽、流鼻涕、鼻炎等流感样症状，同时监测体温反应。采集第3日的鼻拭子样品进行病毒分离，攻毒后第5日剖杀所有仔猪观察肺部病理变化。免疫猪应至少4头保护，对照组应至少4头发病。

TJ株攻毒后的发病判定标准

（1）出现流感临床症状（上呼吸道症状）攻毒后1～3日出现体温升高（超过40℃，至少1日，每天早上测量一次体温并观察临床症状）、咳嗽、流鼻涕、鼻炎（有粘性鼻液通过采鼻拭子时的刺激排出）、呼吸困难等任一项或多项流感症状，就判为出现流感临床症状。

（2）病毒分离阳性攻毒后第3日采集所有攻毒猪的鼻腔拭子，每份拭子样品经尿囊腔途径接种9～11日龄易感鸡胚各5枚，每份接种样品中有1枚鸡胚液的HA效价不低于1:16，即判为病毒分离阳性。

（3）出现肺脏病理变化攻毒后第5日剖杀所有攻毒仔猪，逐头观察肺脏变化，肺脏出现斑块状实变的病理变化。

以上3项出现任意2项，即判为发病。

4.5.2HuN-1株部分采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫保护性试验进行检验。

4.5.2.1血清学方法用25～30日龄健康易感仔猪（见附注1）5头，每头颈部肌肉注射疫苗2ml。首免14日后进行二免，二免后21日，连同非免疫对照猪5头，分别采血分离血清，测定血凝抑制抗体，5头免疫猪血凝抑制抗体（见附注2）几何平均滴度（GMT）应不低于1:64（SIV H3N2GMT不低于1:64），5头非免疫对照猪为阴性。

4.5.2.2HuN-1株免疫保护性试验

取25～30日龄猪流感病毒血凝抑制抗体的阴性健康易感仔猪5头，颈部肌肉注射疫苗2ml。首免14日后进行二免，每头2ml。二免后21日，连同对照组5头，各气管接种2ml（每0.2ml病毒含量应≥10^6.0EID₅₀）HuN-1株病毒，自攻毒后1～3日每日采集1次所有攻毒猪的鼻腔拭子，每份拭子样品分别经尿囊腔途径接种9～11日龄易感鸡胚各5枚，每胚0.2ml，孵育观察3日，无论死胚、活胚鸡胚液血凝价，5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液的HA价不低于1:16判为感染，即判为发病。1头猪的1～3日的鼻拭子样品中只要有1日的鼻拭子样品病毒分离阳性就判该攻毒猪发病。免疫猪应至少4头保护，对照组应至少4头发病。

其他项目的检测步骤如下：

用于预防由H1及H3亚型猪流感病毒引起的猪流感。免疫期为4个月。

使用前使疫苗恢复至室温并充分摇匀。

推荐免疫程序商品猪在25～30日龄时免疫，首免14日后进行二免，种公猪每年春秋季各免疫1次；初产母猪在产前8～9周首免，4周后二免，以后每胎产前4～5周免疫1次。

实施例2本发明的猪流感病毒二价灭活疫苗的安全性试验

（1）疫苗与试验动物

用本发明人试制的3批猪流感病毒二价灭活疫苗，批号分别为110301、110302、110403。供试用的猪品种为大约克，由湖北省咸宁市神童牧业有限责任公司提供，为商用猪品种。

本实施例检测了以上3批实验室疫苗的安全性，包括流感病毒二价灭活疫苗疫苗对仔猪、妊娠母猪一次单剂量接种的安全性、单剂量重复接种的安全性和一次超剂量接种的安全性。

（2）对断奶仔猪一次单剂量接种的安全性

将3批流感病毒二价灭活疫苗疫苗分别通过颈部肌肉接种25～30日龄健康断奶仔猪，每批流感病毒二价灭活疫苗疫苗注射5头，每头以1次单剂量2ml接种，5头空白对照，观察14日，并测定体温。结果见表11。

表11 本发明3批疫苗单剂量接种25～30日龄断奶仔猪的安全性检测

（3）对断奶仔猪单剂量重复接种的安全性

将3批本发明制备的猪流感病毒二价灭活疫苗疫苗分别通过颈部肌肉接种25～30日龄健康断奶仔猪，每批疫苗注射5头，每头接种2ml，21日后进行第2次重复接种，2ml/头，5头空白对照，观察靶动物的临床表现，第2次接种后观察14日，并测定体温。结果在整个观察期间体温、食欲、精神状态都正常。结果见表12

表12 3批二价灭活疫苗对25～30日龄健康断奶仔猪单剂量重复接种的安全性检测

（4）对断奶仔猪一次超剂量接种的安全性试验

取3批流感病毒二价灭活疫苗疫苗分别通过颈部肌肉接种25～30日龄健康断奶仔猪，每批流感病毒二价灭活疫苗疫苗注射5头，每头超剂量接种4ml，5头空白对照，观察14日。并测定体温。结果见表13。

表13 3批二价灭活疫苗超剂量接种25～30日龄健康断奶仔猪后的安全性检测

（5）对妊娠母猪一次单剂量接种的安全性

将3批疫苗分别通过颈部肌肉接种健康妊娠70日母猪，每批疫苗注射5头，每头接种2ml，5头空白对照，观察临床表现，并测定体温。结果显示3批灭活疫苗接种的健康妊娠70日母猪在整个观察期间体温、食欲、精神状态都正常（表14），产仔正常，没有出现流产、死胎等情况（表15）。

表14 3批二价灭活疫苗一次单剂量接种健康妊娠母猪后的安全性检测

表15 健康妊娠母猪一次单剂量接种二价灭活疫苗疫苗后的产仔情况

（6）猪流感H1N1 和 H3N2亚型的二价灭活疫苗对妊娠母猪单剂量重复接种的安全性

将3批猪流感H1N1 和 H3N2亚型的二价灭活疫苗分别通过颈部肌肉接种健康妊娠母猪，每批疫苗注射5头，每头接种2ml，5头空白对照，21日后进行第2次重复接种，2ml/头，观察靶动物的临床表现，第2次接种后共观察14日，并测定体温。结果3批疫苗分别通过颈部肌肉以2ml剂量重复接种的健康妊娠母猪，在整个观察期间体温、食欲、精神状态都正常（表16），所产仔猪也全部健活（表17）。

表16 3批二价灭活疫苗对健康妊娠母猪单剂量重复接种的安全性检测

表17 健康妊娠母猪单剂量重复接种猪流感H1N1 和 H3N2亚型的二价灭活疫苗后的产仔情况

（7）猪流感H1N1 和 H3N2亚型的二价灭活疫苗对妊娠母猪一次超剂量接种的安全性

将3批猪流感H1N1 和 H3N2亚型的二价灭活疫苗分别经颈部肌肉接种5头妊娠70日的健康母猪，每头猪接种两倍免疫剂量（4ml），5头空白对照，观察其临床表现和产仔情况。3批灭活疫苗接种的妊娠母猪1次超剂量接种4ml剂量后没有出现体温方面的异常变化（表18），在整个观察期内均没有出现不良反应，且最后的产仔成绩也无显著差异，没有出现流产、死胎和木乃伊胎。上述结果说明3批灭活疫苗对母猪的繁殖性能无影响，对妊娠母猪是安全的（表19）。

表18 3批二价灭活疫苗一次超剂量接种健康妊娠70日母猪后的安全性检测

表19 健康妊娠母猪一次超剂量接种猪流感H1N1 和 H3N2亚型的二价灭活疫苗的产仔情况

通过3批猪流感二价灭活疫苗(H1N1TJ株+H3N2HuN-1株)对靶动物（妊娠母猪、断奶仔猪）单剂量接种、单剂量重复接种及一次超剂量接种的试验，与空白对照组的均未观察到免疫动物体温明显升高及精神等方面的异常；且妊娠母猪产仔正常，未出现死胎、流产和弱仔等现象。

在断奶仔猪一次单剂量接种后的二免后1个月选择1头（猪号1031）剖解，观察疫苗注射部位的吸收情况，同时剖解1头（猪号1036）同日龄的非免疫猪作为对照。在二免后1个月剖解免疫猪观察猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗的吸收情况，活体颈部皮肤未观察到肿包，疫苗接种部位未出现坏死，从疫苗接种部位组织病理学切片来看疫苗吸收状况良好（见图5）。从图5a中我们可以看到，灭活疫苗中的抗原正在逐渐的刺激机体产生特异性的抵抗力。淋巴细胞正在逐渐的吞噬这些油脂细胞。从图5b中我们可以看到，非免疫对照猪的肌肉组织和脂肪组织间未观察到明显的油脂细胞和淋巴细胞聚集。

实施例3H1N1亚型猪流感病毒和H3N2亚型猪流感病毒的二价灭活疫苗的疫苗效力试验

（1）猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗与试验动物

用本发明人试制的3批猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗，批号分别为110301、110302、110403。25～30日龄猪流感病毒H1N1、H3N2亚型血凝抑制抗体阴性（HI≤1:8）健康仔猪为实验动物，由湖北省咸宁市神童牧业有限责任公司提供。

（2）疫苗接种

每批疫苗免疫10头猪，每头猪经颈部肌肉注射疫苗2ml，同时设条件相同的10头未免疫猪作为对照。

（3）血清抗体检测及攻毒试验

TJ株免疫保护性试验

取25～30日龄猪流感病毒血凝抑制抗体的阴性健康易感仔猪5头，颈部肌肉注射疫苗2ml。首免14日后进行二免，每头2ml。二免后21日，连同对照组5头，各气管接种2ml（每0.2ml病毒含量应≥10^6.0EID₅₀）TJ株病毒，自攻毒后连续3日观察记录咳嗽、流鼻涕、鼻炎等流感样症状，同时监测体温反应。采集第3日的鼻拭子样品进行病毒分离，攻毒后第5日剖杀所有仔猪观察肺部病理变化。免疫猪应至少4头保护，对照组应至少4头发病

TJ株攻毒后的发病判定标准

以上3项出现任意2项，即判为发病。

HuN-1株免疫保护性试验

（4）抗体检测及攻毒试验结果

3批猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗对猪流感病毒H1N1、H3N2亚型血凝抑制抗体阴性（HI≤1:8）健康仔猪首免后14日进行二免，二免后21日，测定抗体水平，各组连同对照组5头，各气管接种2ml（每0.2ml病毒含量应≥10^6.0EID₅₀）TJ株、2ml（每0.2ml病毒含量应≥10^6.0EID₅₀）HuN-1株自攻毒后连续3日观察记录咳嗽、流鼻涕、鼻炎等流感样症状，同时监测体温反应。采集第3日的鼻拭子样品进行病毒分离，攻毒后第5日剖杀所有仔猪观察肺部病理变化。结果见表20、21。

表20 3批实验室疫苗二免后21日用H1N1亚型TJ株攻毒情况

注：”+”为出现流感症状；病毒分离阳性者（4log₂）；出现实变；判为发病；

“-”为症状阴性，病毒分离阴性；未出现实变；判为无反应；

表21 3批实验室疫苗二免后21日用H3N2亚型病毒HuN-1株攻毒情况

“–”为症状阴性，病毒分离阴性；未出现实变；判为无反应；

从表12、13可以看出，3批猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗免疫断奶仔猪，首免后14日进行二免，二免后21日，采集免疫猪血清，用SIV H1N1、SIV H3N2两种参考抗原分别测定免疫猪的HI效价，结果表明SIV H1N1和SIV H3N2两种抗血清效价均在6log₂以上，分别用TJ株和HuN-1株进行气管内注射攻毒，免疫猪有个别出现鼻炎症状，或病毒分离阳性。利用本发明制备的猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗免疫猪保护率均在4/5以上。而非免疫对照猪发病率均为5/5。说明本发明制备的猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗具有良好的免疫效果。

名词与术语说明：

1)本说明书中猪流感病毒H1N1SIV TJ株有时简称为TJ株或H1N1TJ株，为同一病毒株。

2)本说明书中H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株有时简称为HuN-1株或H3N2HuN-1株，为同一病毒株。

Claims

1.一种分离的猪流感H3N2亚型疫苗株，其特征在于：该疫苗株是H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为：CCTCC NO：V201308。

2.一种由保藏号为CCTCC NO：V201107的H1N1亚型猪流感病毒株和保藏号为CCTCCNO：V201308的H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株制备的猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗。

3.权利要求1所述的疫苗株在制备猪流感H1N1和H3N2亚型的二价灭活疫苗中的应用。