CN106474467A - 伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法，用伪狂犬病病毒接种BHK细胞，在生物反应器内进行细胞悬浮培养，收获病毒液，经甲醛灭活后，加入吐温‑80制成水相，然后与油佐剂或水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗。本发明首次采用BHK细胞系生产伪狂犬病病毒(Bartha‑K61株)灭活疫苗，为伪狂犬疫病的防控提供了有效措施。采用BHK细胞悬浮培养的生产方式具有无外源因子污染，易于规模化生产，能较好的维持病毒抗原稳定等优点，并能缩短疫苗研发周期与生产周期，具备突发疫情中疫苗供应应急的能力。

Description

伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体地说，涉及一种伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，被国际动物卫生组织(OIE)列为B类传染病。临床症状为发热、奇痒、红肿、出血；全身阵发性痉挛；磨牙、鸣叫；四肢麻痹、倒地不起和脑脊髓炎等。其宿主范围非常广泛，猪是该病原的天然宿主和传染源，此病对养猪业危害极大，蛀牙引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率及种猪不育。该病最早发现于美国，目前分布于全世界50多个国家和地区，对养猪业的发展构成了严重的威胁，已引起世界各国的高度重视。该病在我国的发生也已比较严重，是现在危害我国规模养猪业最严重的疫病之一。疫苗是预防、控制甚至消灭伪狂犬病最主要的措施之一。国内外已研制出常规弱毒疫苗、灭活疫苗、基因缺失疫苗等。但PRV是一种疱疹病毒，可在感染猪体内形成持续感染，终身带毒，常规弱毒苗免疫可以控制发病，但不能清除病毒。目前，在国外，弱毒疫苗的应用比较普遍，但是未经充分致弱的弱毒疫苗的毒力可能返强而导致疾病流行，从而建立潜伏感染，并存在散毒的风险；采用PRV基因缺失弱毒苗进行防控PR，这为伪狂犬病的根除计划打下了基础，但这种疫苗生产方式操作较为复杂，且需要操作熟练的研究人员；传统灭活疫苗生产方式不能满足未来我国对伪狂犬病的预防与控制需求，主要表现在以下几个方面：(1)生产周期长，难以在短时间内实现大规模疫苗生产；(2)生产工艺落后，劳动力密集，生产成本高。鉴于伪狂犬病病毒灭活疫苗在我国猪病防控过程中的重要作用，亟待开发一种制备伪狂犬病灭活疫苗的新工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，用伪狂犬病病毒接种BHK细胞，在生物反应器内进行细胞悬浮培养，收获病毒液，经甲醛灭活后，加入吐温-80制成水相，然后与油佐剂或水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗。
本发明中涉及的伪狂犬病病毒为Bartha-K61株，所述BHK细胞为BHK-21。
前述的方法，按病毒与细胞总数之比1:1000-1:100进行接种。
前述的方法，病毒接种的BHK细胞为悬浮培养的BHK细胞，待细胞培养液中BHK细胞密度达3.0×106/ml-8.0×106/ml后接种病毒。
前述的方法，在生物反应器内进行细胞悬浮培养的条件为：37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm，培养24-72h；
本发明使用的生物反应器为&CELLIGEN 310Fermentor/Bioreactor。
本发明使用的细胞培养液为BS-SFM V液体培养基(购自苏州市沃美生物技术有限公司，商品编号BSS20314-2)，pH值7.0-7.4。
前述的方法，待细胞完全病变后，停止培养，冻融，离心，取上清，测定TCID50值，在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范围为检验合格的病毒液，向病毒液中加入终浓度0.1％-0.15％的甲醛(优选甲醛终浓度0.15％)，37℃灭活24h-36h(优选24h)。
前述的方法，向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与油佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，水相与油佐剂的质量比为3:7-9:1，优选1:2；所述油佐剂是由白油、司盘-80和硬脂酸铝按93:5:2的质量比组成。
前述的方法，向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，所述水佐剂为聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为1％-10％，优选1％-3％。
在本发明的一个具体实施方式中，所述伪狂犬病灭活疫苗按以下方法制备得到：
(1)接种所用病毒液的制备：用病毒生长液将伪狂犬病病毒Bartha-K61株进行倍比稀释后，以1‰比例接种已长成单层的BHK-21细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中，培养24-72h，待75％细胞出现病变后停止培养，反复冻融3次后收获，12000r/min离心10min，取上清，测定病毒液的TCID50值，分装后保存于-20℃备用；
(2)BHK-21细胞系的悬浮培养与传代：将悬浮培养的BHK-21细胞计数后，用细胞培养液稀释成一定浓度后，接种至生物反应器内，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm的条件下进行细胞悬浮培养24-72h，待细胞长到密度达3.0×106/ml-8.0×106/ml后进行传代或接种病毒；
(3)病毒在悬浮培养细胞上的增殖：用病毒生长液将伪狂犬病病毒Bartha-K61株进行倍比稀释后，按照病毒与细胞总数之比1:1000-1:100进行接种，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm的条件下振荡培养24-72h，待细胞完全病变后，停止培养，反复冻融3次后收获，12000r/min离心10min，取上清，测定病毒液的TCID50值，分装后保存于-20℃备用；
(4)甲醛灭活：向检验合格的病毒液中加入终浓度0.15％的甲醛，37℃灭活24h；
(5)伪狂犬病灭活疫苗的制备：
向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与油佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，水相与油佐剂的质量比为1:2；所述油佐剂是由白油、司盘-80和硬脂酸铝按93:5:2的质量比组成；或者
向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，所述水佐剂为聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为1％-3％；
其中，步骤(1)和(3)中所用病毒生长液为DMEM高糖液体培养基(购自 bylife technologiesTM，商品编号12800-058 1L)。
本发明首次采用BHK细胞系生产伪狂犬病病毒(Bartha-K61株)灭活疫苗，为伪狂犬疫病的防控提供了有效措施。采用BHK细胞悬浮培养的生产方式具有无外源因子污染，易于规模化生产，能较好的维持病毒抗原稳定等优点，并能缩短疫苗研发周期与生产周期，具备突发疫情中疫苗供应应急的能力。通过伪狂犬灭活疫苗对猪的攻毒保护试验结果表明，本发明的伪狂犬病灭活疫苗产品具有良好的安全性，免疫后可产生理想的免疫保护效果，可作为犬科动物伪狂犬疫病防控的候选疫苗株。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”。
以下实施例中所用病毒生长液为DMEM高糖液体培养基(购自 by lifetechnologiesTM，商品编号12800-058 1L)。所用细胞培养液为BS-SFM V液体培养基(购自苏州市沃美生物技术有限公司，商品编号BSS20314-2)，pH值7.0-7.4。所用生物反应器为&CELLIGEN 310 Fermentor/Bioreactor。
实施例1伪狂犬病病毒(Bartha-K61株)的接种与繁殖
包括以下步骤：
1、用病毒生长液将伪狂犬病病毒Bartha-K61株进行倍比稀释后，以1‰比例接种已长成单层的BHK-21细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中，培养24-72h，待75％细胞出现病变后停止培养，反复冻融3次后收获，12000r/min离心10min，取上清，测定病毒液的TCID50值，分装后保存于-20℃备用。
2、BHK-21细胞系的悬浮培养与传代：将悬浮培养的BHK-21细胞计数后，用细胞培养液稀释成一定浓度后，接种至生物反应器内，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm的条件下进行细胞悬浮培养24-72h，待细胞长到密度达3.0×106/ml-8.0×106/ml后进行传代或接种病毒。
3、病毒在悬浮培养细胞上的增殖：用病毒生长液将伪狂犬病病毒Bartha-K61株进行倍比稀释后，按照病毒与细胞总数之比1:1000进行接种，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm的条件下振荡培养24-72h，待细胞完全病变后，停止培养，反复冻融3次后收获，12000r/min离心10min，取上清，测定病毒液的TCID50值，在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范围内检验合格，分装后保存于-20℃备用。
实施例2伪狂犬病病毒(Bartha-K61株)的接种与繁殖
步骤3：按照病毒与细胞总数之比1:100进行接种，于37℃恒温振荡悬浮培养24h，其余操作同实施例1。
所得病毒液的TCID50值在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范围内为检验合格，分装后保存于-20℃备用。
实施例3伪狂犬病病毒(Bartha-K61株)的接种与繁殖
步骤3：按照病毒与细胞总数之比1:500进行接种，于37℃恒温振荡悬浮培养48h，其余操作同实施例1。
所得病毒液的TCID50值在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范围内为检验合格，分装后保存于-20℃备用。
实施例4伪狂犬病灭活疫苗的制备
1、油佐剂疫苗的制备：向检验合格的病毒液中加入终浓度0.15％的甲醛，37℃灭活24h。经检测抗原完全灭活后，向灭活的病毒液中混入吐温-80后制成水相，与油相一同乳化，分装后制成成品疫苗。其中水相包含90份灭活病毒液和10份吐温-80；油相包含93份白油、5份司盘-80和2份硬脂酸铝。
疫苗A：对应于实施例1的病毒液。乳化时水相1份，油相2份。
疫苗B：对应于实施例2的病毒液。乳化时水相3份，油相7份。
疫苗C：对应于实施例1的病毒液。乳化时水相9份，油相1份。
2、水佐剂疫苗的制备：向检验合格的病毒液中加入终浓度0.15％的甲醛，37℃灭活24h。经检测抗原完全灭活后，向灭活的病毒液中混入吐温-80后制成水相，与水佐剂--聚丙烯酸一同乳化，分装后制成成品疫苗。
疫苗D：对应于实施例1的病毒液。所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为1％。
疫苗E：对应于实施例2的病毒液。所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为2％。
疫苗F：对应于实施例3的病毒液。所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为3％。
实施例5伪狂犬病灭活疫苗的免疫效力评价
1、免疫与攻毒：将13头50日龄的PRV阴性仔猪随机分成3组，第一组为免疫组(5只)，第二组为感染对照组(5只)，第三组为空白对照组(3只)。第一组肌肉注射实施例4制备的疫苗A，2ml/头份，第二组肌肉注射PBS，2ml/头份。7日后，第一组和第二组仔猪分别通过鼻腔进行伪狂犬病病毒ZY-2014株(见潘文,马良,张贺楠,邵葳,李晓冉,黄书林.猪伪狂犬病病毒ZY-2014株的分离与鉴定.中国兽药杂志.2016(05):1-6.)BHK细胞毒液攻毒(攻毒剂量为107.0TCID50/ml)，第三组肌肉注射PBS(磷酸缓冲盐溶液)各2ml，不攻毒。
按照相同的猪只数量和分组分别进行疫苗B～F的免疫与攻毒试验，注射剂量、伪狂犬病病毒毒株及攻毒方法同上。
2、抗体水平监测与临床症状
①抗体水平监测：分别观察用疫苗A～F免疫后猪群的临床症状，并用阻断ELISA试验检测免疫前和免疫7d后伪狂犬病病毒IgE的抗体水平。
②临床症状：攻毒后每日监测每头猪只的体温和临床症状，并检测鼻腔排毒情况。免疫前，所有试验猪只精神良好，采食正常，无伪狂犬病临床症状，gE抗体检测结果为阴性。试验过程中，疫苗A～F的空白对照组(第三组)所有猪只均无临床症状，体温正常，鼻拭子检测结果为阴性，无伪狂犬病病毒排毒；攻毒对照组(第二组)在攻毒3d后，所有猪只体温开始陆续升高到40.5℃以上，有些试验猪只高温可持续7d，所有猪只攻毒后3～7d表现精神沉郁、食欲减退、出现伪狂犬病典型临床症状(咳嗽、打喷嚏、流脓性鼻分泌物和呼吸困难，共济失调等)，并陆续出现死亡，鼻拭子检测结果为阳性。免疫山羊4只表现正常。
疫苗A和B：免疫猪5只表现正常，均无明显伪狂犬病临床症状。免疫保护组(第一组)在接种疫苗后7d，所有猪只gE抗体均为阴性，攻毒后并未表现出明显的临床症状，体温正常，2头猪的鼻拭子检测结果为阳性，但与攻毒对照组相比，排毒量显著降低，持续时间明显较短。
疫苗C～F：免疫猪4只表现正常，均无明显伪狂犬病临床症状。免疫保护组(第一组)在接种疫苗后9d，所有猪只IgE抗体均为阴性，攻毒后并未表现出明显的临床症状，体温正常，3头猪的鼻拭子检测结果为阳性，但与攻毒对照组相比，排毒量显著降低，持续时间明显较短。
3、猪只攻毒后的组织病理学检测
疫苗A～F:于攻毒后1周分别在免疫保护组、攻毒对照组和空白对照组各取1只猪，取PRV易感部位的组织进行病理学检测。通过病理学观察，A～F疫苗的保护组和空白对照组猪只未观察到异常组织变化。攻毒对照组猪只可见卡他性肠炎，肺充血、充血和坏死点，脑膜明显充血，脑脊髓液过多。脑组织切片可见血管套及弥散性局部胶质细胞坏死。
4、免疫组化检测
疫苗A～F:采用ABC技术进行免疫组化检测，高免抗PRV病毒血清均未在A～F疫苗的保护组和空白对照组猪只的易感组织器官检测到PRV抗原的分布。疫苗保护组和空白对照组的免疫组化无明显差别，而攻毒对照组猪只的组织器官可见明显的PRV抗原分布。
5、T淋巴细胞增殖试验
疫苗A～F:于免疫后1周采集各免疫组、攻毒对照组、空白对照组猪只的外周血，分离淋巴细胞，分别用Bartha-K61疫苗毒和ConA进行刺激，最后检测淋巴细胞特异性与非特异性增殖情况。结果显示，除空白对照组和攻毒对照组外，各疫苗免疫组T淋巴细胞均出现较明显的特异性和非特异性增殖反应。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，用伪狂犬病病毒接种BHK细胞，在生物反应器内进行细胞悬浮培养，收获病毒液，经甲醛灭活后，加入吐温-80制成水相，然后与油佐剂或水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述伪狂犬病病毒为Bartha-K61株，所述BHK细胞为BHK-21。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，按病毒与细胞总数之比1:1000-1:100进行接种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，病毒接种的BHK细胞为悬浮培养的BHK细胞，待细胞培养液中BHK细胞密度达3.0×106/ml-8.0×106/ml后接种病毒。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在生物反应器内进行细胞悬浮培养的条件为：37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm，培养24-72h；其中，所用细胞培养液为BS-SFM V液体培养基，pH值7.0-7.4。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，待细胞完全病变后，停止培养，冻融，离心，取上清，测定TCID50值，在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范围内为检验合格的病毒液，向病毒液中加入终浓度0.1％-0.15％的甲醛，37℃灭活24h-36h。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与油佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，水相与油佐剂的质量比为3:7-9:1，优选1:2；所述油佐剂是由白油、司盘-80和硬脂酸铝按93:5:2的质量比组成。
8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，所述水佐剂为聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为1％-10％，优选1％-3％。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)接种所用病毒液的制备：用病毒生长液将伪狂犬病病毒Bartha-K61株进行倍比稀释后，以1‰比例接种已长成单层的BHK-21细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中，培养24-72h，待75％细胞出现病变后停止培养，反复冻融3次后收获，12000r/min离心10min，取上清，测定病毒液的TCID50值，分装后保存于-20℃备用；
(2)BHK-21细胞系的悬浮培养与传代：将悬浮培养的BHK-21细胞计数后，用细胞培养液稀释成一定浓度后，接种至生物反应器内，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm的条件下进行细胞悬浮培养24-72h，待细胞长到密度达3.0×106/ml-8.0×106/ml后进行传代或接种病毒；其中，所述生物反应器为&CELLIGEN310Fermentor/Bioreactor；
(3)病毒在悬浮培养细胞上的增殖：用病毒生长液将伪狂犬病病毒Bartha-K61株进行倍比稀释后，按照病毒与细胞总数之比1:1000-1:100进行接种，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm的条件下振荡培养24-72h，待细胞完全病变后，停止培养，反复冻融3次后收获，12000r/min离心10min，取上清，测定病毒液的TCID50值，分装后保存于-20℃备用；
(4)甲醛灭活：向检验合格的病毒液中加入终浓度0.15％的甲醛，37℃灭活24h；
(5)伪狂犬病灭活疫苗的制备：
向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与油佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，水相与油佐剂的质量比为1:2；所述油佐剂是由白油、司盘-80和硬脂酸铝按93:5:2的质量比组成；或者
向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，所述水佐剂为聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为1％-3％；
其中，步骤(1)和(3)中所用病毒生长液为DMEM高糖液体培养基。
10.根据权利要求1-9任一项所述方法制备的伪狂犬病灭活疫苗。
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