CN102952785A

CN102952785A - 猪伪狂犬病毒、疫苗组合物及其应用

Info

Publication number: CN102952785A
Application number: CN2012104674822A
Authority: CN
Inventors: 唐波; 张道华; 张雪花; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2032-11-19
Also published as: CN102952785B

Abstract

本发明提供猪伪狂犬病毒、疫苗组合物及其应用，属于生物技术领域。本发明的猪伪狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCCNO.6604。本发明还提供疫苗组合物，包括灭活的猪伪狂犬病毒PRV-JS株和兽药学上可接受的佐剂。该疫苗组合物还包括兽药学上可接受载体。本发明从各地猪场分离的猪伪狂犬病流行毒株中筛选出猪伪狂犬病毒PRV-JS株，该毒株具有良好的免疫原性，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种。本发明提供的疫苗组合物免疫后，猪产生的抗体水平较高，持续期长。采用本发明制备的疫苗组合物可用于预防猪伪狂犬病毒引起的母猪繁殖障碍、种猪不育症及其它猪的伪狂犬病。

Description

猪伪狂犬病毒、疫苗组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株猪伪狂犬病毒、疫苗组合物及其应用。

背景技术

猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus）属于疱疹病毒科中疱疹病毒亚科猪疱疹病毒Ⅰ型，能引起急性传染的猪伪狂犬病（Aujeszky′s disease）。猪伪狂犬病在世界范围内大流行，对全球的养猪业危害极大,造成巨大的经济损失。猪发生伪狂犬病以后,其临床症状取决于感染猪的年龄、病毒株的毒力、感染的剂量和途径。成年猪一般呈隐性感染,怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊和种猪不育等综合症候群。15日龄以内的仔猪发病死亡率可达100%,断奶仔猪发病率40%,死亡率20%左右；对成年肥猪可引起生长停滞,增重缓慢等。目前本病被认为是威胁养猪生产和引起死亡的主要疾病之一。

疫苗接种是有效防制猪伪狂犬病最经济、有效的方法。我国目前预防猪伪狂犬病的疫苗主要Bartha -K61株和BUK株等基因缺失弱毒活疫苗，弱毒疫苗免疫效果好沿用多年，至今在伪狂犬病的防制中仍起着重要作用。但是在实际生产中该病并没有得到很好的控制，其中存在的问题引起疫苗研究者的重视。首先，弱毒疫苗可引起潜伏感染, 并有散毒的危险，部分接种猪尽管血清中存在中和抗体, 但排毒期仍可持续数年。其次，弱毒疫苗株在动物体内可能会与野毒或不同的基因缺失疫苗株之间发生基因重组从而变成强毒株成为新的传染源。再次，未经充分致弱或过度致弱的疫苗株不仅不能诱导足够的免疫保护反应, 反而可能引起疾病及免疫抑制。对仔猪来说，其体内的母源抗体一定程度上影响了弱毒活疫苗的免疫效果。所以，猪伪狂犬灭活疫苗比弱毒疫苗能更有效地预防和控制伪狂犬病。但是，现有技术中存在的猪伪狂犬灭活疫苗的免疫效果、抗体持续期都不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一株猪伪狂犬病毒PRV-JS株，该毒株对目前流行的猪伪狂犬病毒有很好的免疫原性。

本发明的另一目的是提供一种疫苗组合物，该疫苗组合物免疫猪抗体水平较高，持续期长。

本发明还提供猪伪狂犬病毒PRV-JS株在制备预防由猪伪狂犬病毒所致疾病药物中的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

猪伪狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.6604。

猪伪狂犬病毒PRV-JS株的保藏信息如下：

生物材料（株）：PRV-JS

分类命名:猪疱疹病毒

型

拉丁文学名： Pseudorabies virus

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2012年9月24日

保藏编号：CGMCC NO. 6604.

一种疫苗组合物，包括灭活的猪伪狂犬病毒PRV-JS株和兽药学上可接受的佐剂。该疫苗组合物还包括兽药学上可接受载体。

所述疫苗组合物的制备方法，包括如下步骤：

制备水相：将吐温-80与灭活的猪伪狂犬病毒PRV-JS株病毒液按体积比4：96混合均匀，得到水相；

制备油相：将司本-80与注射用白油按照体积比为6：94混匀，得到油相；

乳化：将油相和水相按照体积比为3：1混合并乳化，获得所述疫苗组合物。

所述疾病为猪伪狂犬病毒引起的仔猪神经症状、母猪繁殖障碍及种猪不育症。

该疫苗组合物还包括兽药学上可接受载体。

本发明从各地猪场分离的猪伪狂犬病流行毒株中筛选出猪伪狂犬病毒PRV-JS株，该毒株具有良好的免疫原性，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种。本发明提供的疫苗组合物免疫后，猪产生的抗体水平较高，持续期长。采用本发明制备的疫苗组合物可用于预防猪伪狂犬病毒引起的母猪繁殖障碍、种猪不育症及其它猪的伪狂犬病。

附图说明

图1接种了含毒材料的BHK21细胞的照片。

图2 正常BHK21细胞的照片。

图3 断奶仔猪攻毒后的体温变化。

图4 是发病猪各组织PCR鉴定的电泳图，其中泳道1-阴性对照，泳道2-脑，泳道3-淋巴，泳道4-肺，泳道5-肾，泳道6-脾，泳道7-2000 DNA Maker。

图5 仔猪免疫猪伪狂犬病灭活疫苗后的ELISA抗体水平。

图6 显示攻毒后仔猪的体温变化。

图7 猪伪狂犬病灭活疫苗免疫后备母猪ELISA抗体消长规律。

具体实施方式

实施例1 猪伪狂犬病毒的获得和特性测定

1.病毒分离

采集我国江苏南京地区某一养猪场发病仔猪的脾、肺、肾、淋巴组织作为含毒材料。先将含毒材料无菌操作置于乳钵中，然后加入灭菌生理盐水5ml,反复磨细；在每毫升处理过的含毒材料中加入青霉素200U和链霉素200U，混匀,将其放入-20 ℃冰箱内反复冻融3次，每次快冻快融以使病毒能从破碎的细胞中释放出来； 12000 r/min 离心10min，取上清接种至BHK21细胞（购买自ATCC，即美国模式培养物集存库）培养。培养2天后, 与正常BHK21细胞（图2）相比，含毒材料接种的BHK21细胞出现明显拉网样病变（图1）。将培养物冻融2次后，获得病毒液。

2.病毒鉴定

提取本实施例标题1中所获病毒液中的DNA，具体步骤如下：取病毒液400μL，加入12.5μL蛋白酶K和50μL、浓度为10%的SDS溶液，混匀，56℃作用30min；依次加入200μL氯仿和200μL苯酚，剧烈振荡15s，室温放置5min；4℃，12000转离心10min；取上清，加入等体积的氯仿混匀，室温放置5min；4℃，12000转离心10min；取上清加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积、浓度为3M的乙酸钠溶液，-20℃放置30min；4℃，12000转离心10min；弃上清，加入75%的乙醇1000μL洗涤；4℃，7500转离心5min；弃上清，干燥10min；加入15μL双蒸水溶解沉淀并作为模板进行PCR扩增。

设计一对gE蛋白基因区域引物进行PCR鉴定，上游引物PRV-F（SEQ ID NO:1）: CCCTGGACGCGAACGGCACGATG；下游引物PRV-R（SEQ ID NO:2）: GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA。

PCR扩增的反应体系（50ul）：模板5μL, GC Buffer 25μL,Mg²⁺ 3μL, dNTP 2μL, PRV-F 1μL, PRV-R 1μL, Taq DNA聚合酶 0.5μL，H₂0 12.5μL。

PCR反应程序：94℃ 预变性5min；进入循环：94℃ 60s，68℃ 60s，72℃ 60s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将PCR扩增出的目的片段进行测序，结果显示片段为850bp，具体序列如SEQ ID NO:3所示。

在NCBI进行BLAST分析，发现测序的片段与猪伪狂犬病毒基因相似率达到98%以上（结果见表1），证明此毒株为猪伪狂犬病毒。

表1目的片段序列分析比对

序列号	种类	相似率
			AY683136.1	Suid herpesvirus 1 strain SH glycoprotein gI (US7) and glycoprotein gE (US8) genes, partial cds	99%
AF171937.1	Suid herpesvirus 1 (strain Ea) glycoprotein gE (gE) gene, complete cds	99%
			AY249861.1	Pseudorabies virus glycoprotein gE (gE) and 11 kDa protein genes, complete cds; and 28 kDa protein gene, partial cds	98%
AY170318.1	Pseudorabies virus strain Min-A glycoprotein E (gE) gene, complete cds	98%
			AF306511.1	Pseudorabies virus Ea glycoprotein I (gI) gene, complete cds	99%
AY173124.1	Pseudorabies virus strain LA glycoprotein E (gE) gene, complete cds	99%
			GQ926932.1	Suid herpesvirus 1 strain LXB6 glycoprotein E gene, complete cds	99%
EF552427.1	Suid herpesvirus 1 strain GDSH glycoprotein gE (gE) gene, complete cds	99%

所有酶和试剂盒均购自TaKaRa公司。

将本实施例步骤1所得病毒液中含有的病毒命名为猪伪狂犬病毒PRV-JS株，并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏, 其微生物保藏号是：CGMCC NO.6604。

3、病毒培养

将BHK21细胞接种至含10% FCS（胎牛血清）的 DMEM培养液（Gibco公司）培养，当BHK21细胞生长覆盖率达80%，去培养液。按感染复数为0.005接种本实施例标题1所得病毒液，加入维持液于37℃培养。培养36-48h，显微镜下观察，细胞达80%CPE(细胞病变)时，冻融收获。连续传代2代，收获猪伪狂犬病毒PRV-JS株病毒液（缩写为PRV-JS株病毒液）。所述维持液为含有2%FBS的DMEM液（Gibco公司）。

4、病毒检测

取本实施例标题3所得PRV-JS株病毒液进行下述检测：

（1）无菌检验：取PRV-JS株病毒液接种T.G小管及G.A斜面各2支，每支接种量为0.2ml，接种后的T.G小管和G.A斜面分别取1支置37℃培养，其它则置于25℃培养，观察3-5日。无菌生长为合格。培养5日后观察均无细菌、霉菌生长，证明分离到的PRV-JS株中不含有细菌和霉菌。

（2）病毒含量：将PRV-JS株病毒液用DMEM液作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度，每个稀释度分别接种至生长良好的BHK21细胞培养板(96孔)，每孔接种量为0.1ml，然后向各孔分别加入0.1ml含2%（体积浓度）小牛血清的DMEM液，同时设立DMEM液阴性对照孔，37℃下培养，观察细胞病变（CPE），计算TCID₅₀。结果显示：该病毒的滴度为每0.1毫升≥10^6.5TCID₅₀。

（3）家兔致病力试验：将PRV-JS株病毒液颈部肌肉接种家兔。接种PRV-JS株病毒的家兔36-42小时内死亡，接种部位暴露出红色肌肉组织，四肢呈角弓反张状态。对照组两只家兔健康无异常。

（4）仔猪致病力试验：将PRV-JS株病毒液颈部肌肉注射接种2头断奶仔猪，接种剂量为2.0 mL／头。被攻毒断奶仔猪分别编号为攻毒-1和攻毒-2。同时设对照组，包括两头断奶仔猪，分别编号为对照-1和对照-2，均不接种。如图3所示，攻毒后1天,被攻毒猪体温升高，对照猪正常。观察5日，攻毒猪精神沉郁，发抖，呕吐、腹泻，其中1头猪有神经症状，攻毒后第4天死亡。剖检，肾脏有针尖大的出血点,脑膜充血、出血病变。分别将发病猪脑、肺、脾、肾和淋巴组织进行PCR扩增，结果各组织均扩增约850bp的目的基因片段（见图4）。

实施例1结果表明分离到的毒株为猪伪狂犬病毒，接种BHK21细胞具有很高的病毒滴度，对家兔及断奶仔猪具有很强的致病力。

实施例2 制备含灭活猪伪狂犬病毒PRV-JS株的疫苗组合物

1、BHK21细胞种子繁殖及扩大培养

从液氮罐中取出冻存的BHK21细胞管，迅速置37℃水浴融化，将细胞移入装有10ml DMEM培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟。弃上清液，用生长液悬浮细胞，之后加入细胞培养瓶中，于37℃、5%CO₂条件下培养。当细胞覆盖率达100%时，用0.1%胰酶-EDTA液消化细胞。按体积比1：3传代培养。所述生长液为含10%FBS（新生牛血清）的DMEM液。

2、病毒培养

将细胞生长覆盖率达80%的BHK21细胞培养物，去生长液。按感染复数为0.5%接种PRV-JS株病毒液，加入含2%FBS的DMEM液，37℃培养。当显微镜下观察到细胞达80% CPE时，收获病毒液，连续传代3代。当病毒含量达到10^7.0TCID₅₀/0.1ml为合格。

3、病毒液的灭活

在病毒含量合格的病毒液中加入甲醛，使甲醛的终浓度达到0.1%（体积浓度），于37℃作用24小时，其间每隔1小时搅拌或振摇一次，获得灭活后的病毒液。灭活结束后置2-8℃，可保存1个月。

4、灭活检验

将灭活后的病毒液用DMEM液1：10稀释后，接种生长致密的BHK21细胞培养板(6孔)，接种量为每孔0.1ml。另外每孔加入含2%小牛血清的DMEM液2ml，同时设立阴性对照孔，37℃下培养，观察细胞病变（CPE）。盲传3代，如果无细胞病变（CPE）则表明灭活完全。

5、制备含灭活的猪伪狂犬病毒PRV-JS株的疫苗组合物

制备水相：将吐温-80与灭活病毒液按体积比4：96混合均匀，即得到水相。

油相：将司本-80与注射用白油按照体积比为6：94混匀均匀，即得到油相。

乳化：将油相和水相按照体积比为3：1进行混合并乳化，得到含灭活的猪伪狂犬病毒PRV-JS株的疫苗组合物。乳化质量需要达到规定的质量标准。

含灭活的猪伪狂犬病毒PRV-JS株的疫苗组合物（简称为猪伪狂犬病灭活疫苗）用于预防伪狂犬病毒引起的母猪繁殖障碍、种猪不育症及其它猪的伪狂犬病。本疫苗的接种途径是颈部肌肉注射。

实施例3 猪伪狂犬病灭活疫苗的安全检验

检验按照实施例2方法制备的猪伪狂犬病灭活疫苗的安全性。

每批疫苗用伪狂犬抗体阴性的30-35日龄健康仔猪和健康怀孕母猪各5头，每头肌肉注射2头份（4ml）猪伪狂犬病灭活疫苗，另设置不接种疫苗的同类型猪作对照组。

接种后观察14天，所有试验猪观察指标包括体温、精神、食欲等局部和全身反应，结果见表2。通过表2可以看出：所有试验猪精神、体温、食欲等均未见异常。疫苗接种仔猪未见疫苗接种引起的异常反应；疫苗接种怀孕母猪正常妊娠，无流产发生（每批中对照组的结果一致，所以未在表中列出）。因此该猪伪狂犬病灭活疫苗是安全的。

表2灭活疫苗安全检验结果

Figure 2012104674822100002DEST_PATH_IMAGE004

实施例4 猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫原性试验

以实施例2制备的猪伪狂犬病灭活疫苗，来进行下面的试验。

1、仔猪攻毒保护试验：将15日龄健康仔猪分为免疫组和对照组，其中免疫组有4头，对照组有2头。免疫组仔猪分别编号为免疫-1、免疫-2、免疫-3和免疫-4，各仔猪肌注接种猪伪狂犬病灭活疫苗，接种剂量为2ml/只。对照组仔猪分别编号为对照-1和对照-2，肌注生理盐水2ml/头。免疫后2周，免疫组各仔猪同剂量加强免疫1次。首次免疫后1周、2周、3周、4周分别采血分离血清，用猪伪狂犬病毒ELISA抗体检测试剂盒（购自武汉科前动物生物制品有限责任公司，阻断法）检测血清ELISA抗体的OD₆₃₀值，当S／N＜0.6为阳性（S是样品检测OD₆₃₀值，N是阴性对照孔OD₆₃₀值）。结果见图5，该图中免疫组和对照组的S／N值均取平均值，该结果显示仔猪免疫后1周抗体均很快上升且处于较高水平。

首次免疫后28天，用PRV-JS株病毒液颈部肌肉注射实验仔猪，2.0 mL／头。所述PRV-JS株病毒液的含量为10^7.0TCID₅₀/0.1ml。观察7天，每天测量体温观察精神状态及饮食、水情况。攻毒后，对照组体温升高，各组仔猪的体温变化见图6。免疫猪精神状态、饮食基本正常，体温在攻毒后第2天略为升高。对照猪攻毒后精神沉郁、发抖、呕吐、腹泻并有神经症状，分别于攻毒后第4、5天死亡。

攻毒保护试验结果显示，猪伪狂犬病灭活疫苗免疫仔猪能够具有很好的免疫保护作用，使免疫仔猪能够抵抗强毒的攻击，表明该猪伪狂犬病PRV-JS株具有良好的免疫原性。

3、后备母猪免疫原性试验：将健康后备母猪20头进行分组试验，分为4组，每组5头。4组母猪分别为0.5ml /只免疫剂量组、1ml /只免疫剂量组、2ml/只免疫剂量组和对照组。免疫组，在配种前45天肌注猪伪狂犬病灭活疫苗，接种剂量分别0.5ml/只、1 ml/只、2 ml/只，间隔2周后等剂量疫苗加强免疫一次。对照组注射生理盐水，2ml/头。首次免疫后2周、4周、2月、4月、6月、8月后采血分离血清，用猪伪狂犬病毒ELISA抗体检测试剂盒（阻断法，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司）检测ELISA抗体读取OD₆₃₀值，计算S／N（S是样品检测OD₆₃₀值，N是阴性对照孔OD₆₃₀值），S／N＜0.6为阳性。

结果见图7，图中各组取S／N值的平均值。从图中可见，该疫苗首次免疫后备母猪2周后ELISA抗体全部转阳，首次免疫后1-4个月抗体处于较高水平，至首次免疫后8个月抗体仍全部为阳性。该结果表明猪伪狂犬病PRV-JS株具有较好的免疫原性，是良好的疫苗用毒株。猪伪狂犬病灭活疫苗免疫后，后备母猪产生的抗体水平高，抗体持续时间长。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 猪伪狂犬病毒、疫苗组合物及其应用

<130> 2012111501

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PRV-F

<400> 1

ccctggacgc gaacggcacg atg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PRV-R

<400> 2

gggtggcacg cggtctcgaa gca 23

<210> 3

<211> 850

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒PRV-JS株

<400> 3

gaagcacacc atggtcaccg ccacggcgtc gcagccgcgg acgggcagga acgtcccaga 60

tccccggcca gcacggcgcc gtcgccgcgc gcgtcgaggg tgaagttggc gccctcggac 120

acgttcacca gatgggccgg gggcgcctcc ctcagggagg cgagggccga gccgaagccc 180

gcgcggcggt cgtcgccgtc gaggtcgccg ttgaggtcat cgtcgtcggc ctcggtggag 240

aggtcgtccc agacctcggc cgagggactc gggacctcgg tgacggggcc tggggtcgtc 300

tcggcggaga gactcggggc ctcggtggag agcgccaggg ccagcagcgc caggagctgc 360

gcggcgcgca gcagaaaggg ccgcatggtc tcaaccccgg tgtgtgcgag actcgcgggg 420

gtgcccaggt ttaaaacggc gcggacggag ataaaacgcc acccacaaaa ttatgcaaac 480

accacctttt tattgttctt ctgcgatggt ggcgagcttc tggcgcagct cggccaacgt 540

catcttgggc tgggggacgg gcgccccggc gacggggttg gggggcgggc gccgcggggg 600

cgccgcgtgg accgccgatc cgcgcccggg tcgcggccgg tagatgcgat tccgcgcgca 660

gcgccgggct acgcaggcga tcccgcccag gaagatcagg aggacgacga tcgtgggccc 720

cagcaccatg gctatcttcc cggggctccg ggcgcccgcc gtggcgtggc ggcggcgagc 780

aggacgcgcg acacgacgct ggcgttcagc accatcgtgc cgttcgcgtc cagggtcccg 840

ggcaccgggg 850

Claims

1.猪伪狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.6604。

2.一种疫苗组合物，其特征在于：包括灭活的猪伪狂犬病毒PRV-JS株和兽药学上可接受的佐剂。

3.根据权利要求2所述疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物还包括兽药学上可接受载体。

4.权利要求2所述疫苗组合物的制备方法，包括如下步骤：

制备油相：将司本-80与注射用白油按照体积比为6：94混合均匀，得到油相；

5.猪伪狂犬病毒PRV-JS株在制备预防由猪伪狂犬病毒所致疾病药物中的应用。

6.根据权利要求5所述猪伪狂犬病毒PRV-JS株在制备预防由猪伪狂犬病毒所致疾病药物中的应用，其特征在于所述疾病为猪伪狂犬病毒引起的仔猪神经症状、母猪繁殖障碍及种猪不育症。