CN103656634A

CN103656634A - 抗猪圆环病毒和猪传染性胸膜肺炎感染疫苗组合物及制备

Info

Publication number: CN103656634A
Application number: CN201210314958.9A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2032-08-30
Also published as: CN103656634B

Abstract

本发明涉及一种抗猪圆环病毒2型及猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物及制备方法。该二联疫苗组合物含有猪圆环病毒2型抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原，免疫程序简单，能同时有效的防治猪圆环病毒2型相关疾病和猪传染性胸膜肺炎。与单苗相比，该二联疫苗组合物并没有产生免疫干扰现象，疫苗免疫效果没有下降，而且猪胸膜肺炎放线杆菌可以增强猪圆环病毒2型抗原的免疫效果。该二联疫苗组合物的制备工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。

Description

抗猪圆环病毒和猪传染性胸膜肺炎感染疫苗组合物及制备

技术领域

本发明属于畜牧类生物制药技术领域，涉及一种抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物及其制备方法。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一种呼吸系统重要传染病。本病主要引起猪的一种伴有胸膜炎的纤维素性、出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速死亡，发病率和死亡率均在50%以上，它可发生于任何年龄的猪只，尤其是在集约化养猪场，一旦发生会造成重大经济损失。

临床上一般分为最急性、急性、亚急性和慢性。最急性型多发生在断奶仔猪群中，一头或几头猪突然发病，病猪体温高达41.5℃，精神沉郁，食欲不振，有短暂的腹泻或呕吐，剖检后病理变化主要存在于呼吸系统，最急性或急性迅速死亡的猪只气管和支气管内充满泡沫状血样粘性渗出物、肺充血、水肿，肺炎病灶变暗，变硬，质地脆弱，纤维素性胸膜炎区呈现暗红色或发黑。

猪胸膜肺炎放线杆菌最早被称为副溶血嗜血杆菌（H.parahaemolyties），该病原菌生长要求严格，为革兰氏阴性球杆菌，有荚膜。该病原菌血清型众多，根据辅酶Ⅰ（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）依赖性，可以分为生物I型和生物II型，其中依赖NAD的猪胸膜肺炎放线杆菌划为生物I型（Biovar I），不依赖NAD的猪胸膜肺炎放线杆菌划为生物II型（Biovar II），采用传统血清型方法，又可细分为15个血清型。其中生物I型包括血清1~12型和15型，生物II型包括血清13型和14型。

目前该病的预防主要是对流行区域进行病原菌的分离鉴定，确定流行的优势血清型，研制具有特异性保护作用的灭活疫苗，并制订相应的防治对策，是许多国家所采用的方法。但是该病原血清型众多，给该病的预防与控制带来了困难，因此，血清型的划分及其所采用的方法显得非常重要。

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS），而且还与猪皮炎与肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease syndrome,PRDC）、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从20世纪90年代发现可致病猪以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群中感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大爆发，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国在2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50%，给我国的养猪业也造成了严重的打击。

PCV2为单股环状的DNA病毒，无囊膜，20面体对称，基因组全长1767bp或1768bp，整个基因组包括11个开放阅读框（Open reading frame,ORF），其中ORF1和ORF2为两个主要阅读框。ORF1与同属的猪圆环病毒1型（PCV1）高度同源，编码与病毒复制相关的酶类。而ORF2在PCV1和PCV2之间差异相对较大，编码分子量约为30kDa的主要结构蛋白（衣壳蛋白）（Capsid protein，CP）能够与PCV2感染的猪血清特异性结合，并且具有中和活性。

目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，国外只有梅里亚动物保健公司（Merial）生产全病毒灭活苗，但只适用于母猪免疫；国内均为全病毒灭活苗，且应用的佐剂均含有一定量的矿物油；PCV2亚单位疫苗目前有两家公司生产，勃林格殷格翰动物保健有限公司（Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，美国）的FLEX系列茵格发（Ingelvac）猪圆环病毒疫苗和英特威/先灵葆雅动物保健公司(intervet/schering-plough)的PCV2疫苗；富道动物保健公司（Fort Dodge）研制的PCV2疫苗属于嵌合病毒灭活苗。

专利CN 102058880A披露了一种猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的生产方法。该方法以胸膜肺炎放线杆菌1型HT株菌、5型SZ株菌和7型DY株菌为疫苗制备菌株，经培养，收获培养物，再经灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗。该方法所采用的APP1、5、7型抗原毒力较弱，免疫原性不够强，并且，制备的疫苗为油佐剂疫苗，会对免疫猪只造成一定程度的应激，采用该方法制得的疫苗免疫成本较高。

专利CN 101549155A公开了一种猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是以猪圆环病毒Ⅱ型DBN-SX07株为毒种，经烷化剂灭活后作为抗原，再加入油佐剂乳化配制而成。该方法采用细胞转瓶培养技术生产种毒，使抗原效价很难突破10^5.5TCID₅₀/ml，使生产成本提升。其所制备的猪圆环病毒II型灭活疫苗使用油佐剂，会对免疫猪只造成一定程度的应激。所制得的疫苗用于商品猪需要免疫2次，影响免疫效果及相关免疫成本。

专利CN 102174086A公开了一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白和亚单位疫苗。该重组猪圆环病毒Cap蛋白为大肠杆菌表达，该蛋白系截除N端富含精氨酸的核定位信号区域，该蛋白克隆入原核表达载体得到重组表达载体，该重组表达载体转染大肠杆菌BL21（DE3）表达获得。该疫苗利用大肠杆菌表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白，所得到的蛋白多为包涵体形式存在，不具备天然蛋白的活性，其免疫原性也会大打折扣。该疫苗的抗原蛋白纯化是减少疫苗副反应的重要一环，同时也是提高疫苗成本的因素，此方式难以大规模推广和应用。该疫苗配制采用弗氏完全佐剂或不完全佐剂，会影响疫苗吸收，对疫苗效果产生副反应。

上述疫苗均为只能防治一种疾病的疫苗，联苗是未来疫苗发展和应用的趋势，应用新技术、新材料研制出可与其它疫苗联合应用的猪圆环病毒疫苗，同时预防两种或多种疾病，这样既能降低动物应激，提高动物福利，又能减少员工免疫的工作量，降低免疫相关成本。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种免疫成本低廉，采用畜类易于接受的佐剂，可以同时预防猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型两种传染病，并能避免多次接种造成免疫应激反应及免疫效果降低的疫苗及其制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗猪圆环病毒2型（PCV2）及猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物及制备方法。该二联疫苗组合物含有猪圆环病毒2型抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原，免疫程序简单，能同时有效的防治猪圆环病毒2型病和猪传染性胸膜肺炎。与单苗相比，该二联疫苗组合物并没有产生免疫干扰现象，疫苗免疫效果没有下降，而且猪胸膜肺炎放线杆菌可以增强猪圆环病毒2型抗原的免疫效果。该二联疫苗组合物的制备工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。

为此，本发明提供了一种抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物，其包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。

根据本发明，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原中的一种或几种，并且，所述猪圆环病毒2型抗原选自猪圆环病毒2型全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。优选所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分。

本发明中所述用语“猪圆环病毒2型全病毒抗原”是指猪圆环病毒2型病毒在其受体细胞内寄生并以复制方式增殖后达到所需的病毒量，该病毒经灭活、减毒等方式处理后获得的抗原，该抗原包含病毒本身所具备的核酸和蛋白质，只是其存在形式会有差异。

本发明中，所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份（2ml）含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量至少为10^5.5TCID₅₀。优选所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份（2ml）含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为4.5×10^5.0TCID₅₀~10^6.0TCID₅₀。进一步优选所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份（2ml）含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为9×10^5.0TCID₅₀。

在本发明的一个优选实施例中，所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株、PCV2LG株、PCV2DBN-SX07-2的抗原或疫苗和/或PCV2亚单位抗原。优选所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株（保藏编号为CGMCC No.23890，公开于专利文献CN101240264A）和/或PCV2 ORF2蛋白。

也就是说，由于PCV2基因组大小为1767bp或1768bp，不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90%以上，因此PCV2SH株（GenBank登录号为AY686763）、PCV2LG株（GenBank登录号为HM038034）、PCV2DBN-SX07-2（GenBank登录号为HM641752）的抗原或疫苗均在本发明保护范围之内。

本发明中，所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为序列表SEQ NO.1的DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO.2的氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75%以上的氨基酸序列的蛋白。优选所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQNO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白同源性在80%以上的氨基酸序列的蛋白。进一步优选所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQ NO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白同源性在90%以上的氨基酸序列的蛋白。

本发明中，所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为0.5~20μg/头份。优选所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为5~10μg/头份。

本发明中，所述猪圆环病毒2型抗原还包含至少一种猪圆环病毒2型灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗。所述PCV2抗原还可以选自，例如，梅里亚公司（Merial）的Circovac-PCV2；辉瑞公司（Pfizer）的Suvaxyn-PCV2；哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗（DBN-SX07株）和基因工程亚单位疫苗，如勃林格殷格翰公司（Boehringer-Ingelheim）的猪圆环病毒疫苗（Ingelvac

）。

同样的，根据本发明，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为猪胸膜肺炎放线杆菌全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪胸膜肺炎放线杆菌细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。优选所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的全菌体。

本发明中所述用语“全菌体”，是指具有完整细胞壁、细胞膜、细胞质、核体等基本结构的细菌完整细胞体。而全菌体抗原则是指由上述细菌完整细胞体经灭活或减毒的处理后获得的抗原。

本发明中所述用语“猪胸膜肺炎放线杆菌”，也称为“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌”或“胸膜肺炎放线杆菌”(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)，该病原菌生长要求严格，为革兰氏阴性球杆菌，有荚膜。

同样，本发明中所述用语“猪胸膜肺炎放线杆菌抗原”，也称为“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原”或“胸膜肺炎放线杆菌抗原”。

在本发明的一个具体的实施例中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，其选自目前已鉴定的1~15个血清型中的一种或几种。

本发明的一个优选实施例中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原是灭活的血清型为1型、5型和7型的混合抗原。优选所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的血清1型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌体。

所述胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株（Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype1 strain LC，APP-1）的保藏编号为:CCTCC NO：M 2011458；所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株（Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5strainYC，APP-5）的保藏编号为:CCTCC NO：M 2011459；所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株（Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7strain YS，APP-7）的保藏编号为:CCTCCNO：M 2011460；上述菌株均保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）。保藏日期：2011年12月9日。

正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。因此，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA（16S rRNA）来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的副猪嗜血杆菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。

因此，本发明中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在80%以上的菌株。优选所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在90%以上的菌株。更为优选的，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在95%~99%以上的菌株。也就是说，不改变猪传染性胸膜肺炎三株菌株（LC株、YC株和YS株）16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪胸膜肺炎放线菌，获得与本发明猪胸膜肺炎放线菌16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。

本发明中，所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型的含量至少为1.0×10⁷CFU/头份，优选血清1型的含量为2.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，进一步优选的是血清1型的含量为3.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，更为优选的是血清1型的含量为4.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，最为优选的是血清1型的含量为5.0×10⁷CFU/头份。

所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型的含量至少为1.0×10⁷CFU/头份，优选血清5型的含量为2.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，进一步优选的是血清5型的含量为3.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，更为优选的是血清5型的含量为4.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，最为优选的是血清5型的含量为5.0×10⁷CFU/头份。

所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的含量至少为1.0×10⁷CFU/头份，优选血清7型的含量为2.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，进一步优选的是血清7型的含量为3.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，更为优选的是血清7型的含量为4.0×10⁷~5×10⁷CFU/头份，最为优选的是血清7型的含量为5.0×10⁷CFU/头份。

在本发明的一个实施例中，所述二联疫苗组合物还包含疫苗佐剂，所述佐剂为进口的新型水佐剂Montanide GEL PR聚合物（包括同系列佐剂）佐剂，并且，在所述疫苗组合物中，所述疫苗佐剂含量为10wt%~25wt%。

新型水佐剂为畜类易于接受的佐剂，采用该佐剂配制疫苗，可以提高疫苗的可吸收性，同时可以避免油佐剂所具有的应激等副作用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述二联疫苗组合物还含有疫苗总量0.01wt%的硫柳汞。

本发明还提供了一种根据本发明所述二联疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤：将两种以上的抗原混合后制得抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物，其中，所述抗原包括猪圆环病毒2型抗原与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。

根据本发明，所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体的附加抗原。例如，所述其它猪的病原体的附加抗原可以选自猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、猪链球菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪流行性感冒抗原、副猪嗜血杆菌抗原中的一种或几种。

可任意选择的，在制备根据本发明所述二联疫苗组合物的配苗步骤中，所述抗原还包括其它猪的病原体的附加抗原。

根据本发明方法，本发明还包括在配苗步骤之前的制备猪圆环病毒2型抗原的步骤及制备猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的步骤。

在根据本发明的一个具体实施方案中，所述二联疫苗组合物包含抗原和佐剂；其中抗原包含已灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪圆环病毒2型SH株抗原；所述佐剂为进口的新型水佐剂Montanide GEL PR聚合物（包括同系列佐剂）佐剂。所述四种抗原的比例为：猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株：血清5型YC株：血清7型YS株:猪圆环病毒2型SH株=2:2:2:2；所述四种抗原总体积为所述疫苗总体积的75%~90%。在所述二联疫苗组合物中，猪胸膜肺炎放线杆菌含量为灭活前猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、血清5型、血清7型活菌数均不少于2.0×10⁷CFU／头份，猪圆环病毒2型SH株抗原含量不少于10^6.0TCID₅₀/头份。所述二联疫苗组合物中还含有疫苗总量0.01wt%的硫柳汞。

在根据本发明的一个进一步具体的实施方案中，所述抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的疫苗组合物的制备方法，包含如下步骤：

（1）分别将猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株、血清7 型YS株、猪圆环病毒2型SH株菌（毒）种繁殖培养，得到猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和猪圆环病毒2型SH株病毒液。

（2）分别将步骤（1）培养得到的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液中按各自总量加入0.3%（v/v）的甲醛溶液，放置37℃灭活24h，期间搅拌3~5次，根据计数结果浓缩菌液；猪圆环病毒2型SH株病毒液中加入0.2%（v/v）的甲醛溶液，放置37℃灭活18h，期间搅拌3~5次，根据毒力测定结果调整病毒液含量。

（3）将上述已灭活、浓缩的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪圆环病毒2型SH株病毒液，按2:2:2:2比例混合，并加入疫苗总量0.01wt%的硫柳汞，然后和佐剂进行乳化，佐剂含量为10wt%~25wt%；成品猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗抗原含量为灭活前猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、血清5型、血清7型活菌数均不少于2.0×10⁷CFU／头份，灭活前猪圆环病毒2型SH株抗原含量不少于10^6.0TCID₅₀/头份。

（4）以适量体积分装新型猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗，盖上瓶盖，并压铝盖。

在上述抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的疫苗组合物的制备过程中，从步骤（1）培养好的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和猪圆环病毒2型SH株病毒液取样，进行纯粹性检验和活菌计数；从步骤（2）已灭活好的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株菌液和猪圆环病毒2型SH株病毒液取样进行灭活检验和安全性检验；对步骤（3）得到的新型猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗进行无菌检验、安全检验和效力检验，以确保疫苗的安全性、可靠性。

本发明基于现有技术不足而提供一种可以同时预防由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒2型引起的猪圆环病毒2型相关疾病及二者的混合感染的新型猪传染性胸膜肺炎、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗（LC株+YC株+YS株+SH株）；临床上达到一针多防的效果，降低成本，并可以满足不同用户的要求。

本发明中预防和治疗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物中，两种抗原成分混合后，彼此之间不仅未产生互相免疫干扰的现象，而且意外发现猪胸膜肺炎放线杆菌可以增强猪圆环病毒2型抗原的免疫效果。正如本发明实施例所证明，在猪圆环病毒2型抗原量减半的情况下仍旧可以维持猪圆环病毒2型抗原的免疫效果，这在本领域技术人员看来是出乎意料的。

本发明还进一步采用畜类易于接受的水佐剂代替传统的油佐剂用于配制疫苗，在避免佐剂造成的副反应的同时，也提高了疫苗的可吸收性。

本发明中抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的抗原效价高，免疫方便快捷，与现有疫苗中的分次免疫，至少需要打2针或者3针才能防治以上2种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。通过本发明中抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的疫苗组合物与常规单苗的效力比较发现，本发明的二联苗安全性更佳，避免了多次免疫接种出现的不良反应。

附图说明

图1是实施例5中PCV2-ORF2目的片段大小图；

图1中附图标记的含义如下：1PCV2-ORF2目的片段；2DL2000Marker

图2是实施例5中重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白SDS-PAGE电泳图；

图2中附图标记的含义如下：1预染低分子量蛋白质Marker;2pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母24h后收获的培养上清；3pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母48h后收获的培养上清；4pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母72h后收获的培养上清；5细胞阴性对照。

图3是实施例5中重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白Western blotting（蛋白印迹）图；

图3中附图标记的含义如下：1预染低分子量蛋白质Marker；2pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母24h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；3pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母48h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；4pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母72h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；5细胞阴性对照与阳性血清反应结果。

菌种保藏

胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株（Actinobacillus pleuropneumoniae serotype1strain LC，APP-1），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏编号：CCTCC NO：M2011458。

猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株（Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype5strain YC，APP-5），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏编号：CCTCCNO：M 2011459。

猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株（Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype7strain YS，APP-7），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏编号：CCTCCNO：M 2011460。

为获得免疫性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮鉴定合格后冻干保存并保藏。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染疫苗组合物的制备和检验

1.生产用菌（毒）种的制备

猪圆环病毒2型SH株的制备：将毒种用MEM培养基（

Invitrogen公司）作10倍稀释，按5％体积接种于PK15（ATCC，保藏编号为CCL-33）细胞培养，37℃吸附30min，加入含4%犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37℃培养4日，冻融2~3次，收获病毒，病毒滴度为10^6.5TCID₅₀/ml。

猪胸膜肺炎放线杆菌菌种的制备：将猪胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、5型YC株和7型YS株划线接种于含5%（v/v）新生牛血清的TSA/NAD平板，37℃培养24h，各挑选5个以上典型菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。一级菌种挑取单个菌落，接入含5%（v/v）新生牛血清的TSB/NAD液体培养基中，37℃摇床180rpm振荡培养16h，同时取样革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态均匀，符合猪胸膜肺炎放线杆菌的形态特征，应无任何杂菌生长，作为二级种子。

其中：含5%（v/v）血清的TSA/NAD平板的制备方法：胰蛋白大豆琼脂（TrypticSoy Agar，TSA，BD Difico产品）40克加入949ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，温度降至60℃左右，加入50ml过滤除菌的牛血清，1ml过滤除菌的1%NAD，充分摇匀后倒平皿。

含5%（v/v）新生牛血清的TSB/NAD液体培养基：胰大豆蛋白肉汤（TrypticSoy Broth，TSB，BD Difico产品）30克加入949ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，加入50ml过滤除菌的牛血清，1ml过滤除菌的1%NAD即成。

2.病毒液或菌液的培养制备

猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞（购自ATCC），倒去细胞培养液，将毒种液按0.1~0.2TCID₅₀/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附30min，加入细胞维持液，置37℃旋转（10~12转/h）培养。每日观察1~2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存，应不超过2个月。

猪胸膜肺炎放线杆菌（1型LC株、5型YC株和7型YS株）菌液的制备：将鉴定合格的猪胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、5型YC株和7型YS株的二级种子菌液分别按1:1000（v/v）接种于TSB/NAD液体培养基，置37℃摇床180rpm培养。培养至12~16h，收获。

3.病毒液或菌液的处理

猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理：将病毒液用中空纤维滤柱（孔径10μm与0.45μm）过滤，除去细胞碎片。

猪胸膜肺炎放线杆菌（1型LC株、5型YC株和7型YS株）菌液的处理：将三种菌液分别以连续离心机（10000转/min）离心后再以PBS（0.01mol/L，pH7.2~7.4）复溶至原体积。

4.病毒液或菌液的灭活

猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活：将检验合格的步骤3处理的病毒液加入甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2％（V/V），随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18h灭活完毕，加入0.2%（w/v）的焦亚硫酸钠终止灭活，置2~8℃保存。

猪胸膜肺炎放线杆菌（1型LC株、5型YC株和7型YS株）菌液的灭活：将步骤3中三种不同血清型的菌液，按培养基体积比，缓慢加入终浓度为0.3%（v/v）的甲醛溶液，置37℃灭活，其间每隔4h搅拌一次，24h后取出，进行灭活效果和纯粹检验。

5.含量测定

（1）猪圆环病毒SH株病毒含量测定

将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO₂的温箱中继续培养24h，换含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24h；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID₅₀。每ml病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀。

（2）猪胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、5型YC株和7型YS株活菌数测定

将取样按10倍系列稀释至10^-5~10^-7，接种于TSA/NAD固体培养基，37℃培养24h后，选择菌落数在30和300之间的平板进行菌落计数，活菌数应为3.0×10⁹~5×10⁹CFU/ml。

（3）抗原含量测定结果：

3批猪圆环病毒2型SH株、猪胸膜肺炎放线杆菌LC株、YC株和YS株分别培养三批，分别为K001，K002和K003。抗原的含量见表1，PCV2SH病毒液含量均在10^6.0TCID₅₀/ml以上。

表1 抗原含量测定（滴度）

6.灭活效果测定

（1）猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活检验

取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37℃吸附1h后弃病毒液，加入新细胞维持液，37℃培养2日，应无CPE，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用IFA法检测，应无绿色PCV2阳性细胞产生。

（2）猪胸膜肺炎放线杆菌灭活检验

制备6个平皿的TSA/NAD固体培养基，无菌操作将灭活的菌液在其中3个TSA/NAD固体培养基平皿上滴加1滴，用接种环划线，置37℃普通温箱培养，同时设立3个不接菌的TSA/NAD固体培养基作对照。24h后观察，平皿必须无任何细菌生长，同时对照未接菌的2个培养基也应无细菌生长，继续观察结果至48h 6个平皿中都应无细菌生长。

（3）灭活结果

3批猪圆环病毒2型SH株、猪胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、YC株和YS株的灭活检验结果见表2，灭活是彻底的。

表2 3批抗原的灭活检验效果

7.浓缩

将猪圆环病毒2型SH株、猪胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、猪胸膜肺炎放线杆菌5型YC株和猪胸膜肺炎放线杆菌7型YS株分别用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为300Kda）作3倍(体积比）浓缩。

8.配苗

配方见表3，将浓缩后的四种抗原液按2:2:2:2（V/V）混合后，再与GEL佐剂（法国赛比克SEPPIC公司）按90:10（W/W）混合，并以300转/min搅拌30min。表3疫苗的配方及含量

9.性状检验

灰白色混悬液，长时间静置底部有少量沉淀。振荡后呈均匀混悬液。

10.无菌检验

按《中华人民共和国兽药典》（2005年版）附录第169~171页进行，应无菌生长。

性状和无菌检验结果见表4，三批疫苗批号为Y001、Y002、Y003，由上述批号K001、K002、K003的毒（菌）株抗原制备获得，分别经过无菌检验及性状检验，结果三批疫苗成品均是合格。

表4 3批疫苗的性状及无菌检验结果

11.安全检验

用28~35日龄猪传染性胸膜肺炎抗体及猪圆环病毒2型抗体阴性仔猪5头，各颈部肌肉注射二联疫苗4ml，观察14日，注苗局部无严重反应，且全部健活为合格。

批号为Y001、Y002、Y003的三批疫苗，分别经过安全检验，结果三批疫苗成品均是合格，注射部位、全身、脏器均未见异常，结果见表5。

表5 3批疫苗的安全检验

12.效力检验

（1）猪圆环病毒2型效力检验

用14~21日龄健康易感仔猪15头，分成3组，每组5头，第1组每头颈部肌肉注射疫苗1ml，疫苗使用上述批号为Y001、Y002、Y003的三批疫苗，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种，第2组作非免疫攻毒对照，第3组作空白对照（非免疫、非攻毒），均隔离饲养观察。首免后5周对所有猪称重，第1、2组各用PCV2SH株（含10^6.0TCID₅₀/ml）滴鼻1ml、肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒第4、7日，分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。攻毒对照组应至少4头发病，免疫组应至少4头保护。

（2）猪胸膜肺炎放线杆菌效力检验

用28~35日龄猪胸膜肺炎抗体阴性仔猪10头，分2组，每组5头，每头颈部肌肉注射疫苗1ml，2周后二免每头颈部肌肉注射疫苗1ml。每组2免后14日连同对照猪5头，分别腹腔内注射1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株和7型YS株菌液各3ml，观察14日。每组免疫猪至少保护4头；对照猪至少3头死亡或者4头发病为合格。

上述批号为Y001、Y002、Y003的疫苗，分别经过效力检验，结果见表6，可以看出，三批疫苗均对猪圆环病毒2型SH株、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株和7型YS株菌株免疫攻毒保护，并且均表现良好的免疫效果。

表6 3批疫苗的效力检验结果

实施例2：PCV2灭活全病毒抗原疫苗对PCV2攻毒免疫效果与PCV2灭活病毒抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌灭活抗原的疫苗组合物对PCV2攻毒免疫效果比较

用实施例1制备抗原(即K001批抗原，见表2）分别制备猪圆环病毒2型、猪胸膜肺炎放线杆菌（血清1型+血清4型+血清5型）疫苗组合物（V1）和（V2）、猪圆环病毒疫苗（V3）和（V4），具体配方如下：

1.猪圆环病毒2型、猪胸膜肺炎放线杆菌（血清1型+血清4型+血清5型）疫苗组合物（V1）总体积约100ml：

2.猪圆环病毒2型、猪胸膜肺炎放线杆菌（血清1型+血清4型+血清5型）疫苗组合物（V2）总体积约100ml：

3.猪圆环病毒2型灭活疫苗（V3）总体积约100ml：

灭活的PCV2病毒液(含10^6.0TCID₅₀/ml) 45.0ml

0.85%的生理盐水 45.0ml

Montanide^TM Gel 10wt%

（4）猪圆环病毒2型灭活疫苗（V4）总体积约100ml：

灭活PCV2病毒液(含10^6.0TCID₅₀/ml) 22.5ml

0.85%的生理盐水 67.5ml

Montanide^TM Gel 10wt%

选21~28日龄断奶仔猪30头，分为6组，每组5头（见表7）；第1组每头猪分别颈部肌肉疫苗（V1）2ml，免疫后21d再次接种2ml；第2组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗（V2）2ml，免疫后21d再次接种2ml；第3组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗（V3）2ml，免疫后21d再次接种2ml；第4组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗（V4）2ml，免疫后21d再次接种2ml；第5作为攻毒对照组，第6组作为空白对照组。在首次免疫后35d，第1、2、3、4、5组各用PCV2SH株（含10^6.0TCID₅₀/ml）滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第6组不攻毒，攻毒后第4、7日，分别在第1、2、3、4、5、6组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基（Thio），10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、组织损伤和免疫组织化学（IHC）检测PCV2病毒抗原结果进行判定。

表7 试验分组及处理

体温产生情况见表8，可见疫苗组合物（V1）和抗原含量减半的疫苗组合物（V2）免疫的猪只PCV2攻毒后几乎无体温升高，而猪圆环病毒2型灭活疫苗（V3）及PCV2抗原含量减半的V4疫苗免疫的猪只PCV2攻毒后大多有1~2天短暂的体温升高40.5℃以上，甚至有的体温升高达3天。

表8 PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较

组织损伤及免疫组化检测抗原情况见表9，可见疫苗组合物（V1）免疫的猪只PCV2攻毒后无病理损伤且未检测到PCV2抗原，而猪圆环病毒2型灭活疫苗（V2）免疫的猪，5头猪中有1头检测到了PCV2抗原且其有病理圆环病毒特征性的病理损伤（间质性肺炎、淋巴结淋巴细胞损伤和多核巨细胞的出现及单核巨噬细胞浸润等）。

表9 PCV2攻毒后各组试验猪组织损伤及IHC检测

组别	动物数量（N）	肺部病变	淋巴结病变	IHC检测
					V1	5	0/5	0/5	0/5
V2	5	0/5	1/5	0/5
					V3	5	3/5	2/5	2/5
V4	5	3/5	3/5	2/5
					攻毒对照组	5	4/5	5/5	5/5
空白对照组	5	0/5	0/5	0/5

[0150] 本研究的结果令人意外：使用猪圆环病毒2型（PCV2）与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原组合时，不仅能够用于免疫猪以提供良好的免疫效果，而且保留了原PCV2抗原成分的良好的免疫效力，其效果也优于单独的猪圆环病毒2型灭活疫苗，尤其在抗原含量减半的情况下依然具有了单用PCV抗原而无法达到的效果持了猪圆环病毒2型（PCV2）抗原的免疫效果，三种抗原对PCV2免疫起到了协同作用，同时由于佐剂品种和量均相同，显然这种协同作用是三种抗原在一起引起的。即本发明疫苗组合物对抗PCV2的免疫效果优于单独使用PCV2抗原的免疫效果。尤其在PCV2抗原量减半的情况下依然保持了猪圆环病毒2型（PCV2）抗原的免疫效果，上述结果出乎本领域技术人员的意料。

实施例3：猪传染性胸膜肺炎灭活抗原疫苗组合物及PCV2灭活病毒抗原、猪传染性胸膜肺炎灭活抗原的疫苗组合物对猪胸膜肺炎放线杆菌攻毒保护效果比较

用实施例1制备的抗原K001批抗原按实施例2方法分别制备猪圆环病毒2型、猪胸膜肺炎放线杆菌（血清1型＋血清5型+血清7型）疫苗组合物（V1）、猪胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗（血清1型＋血清5型+血清7型）（V2），具体配方如下。

（1）猪圆环病毒2型、猪胸膜肺炎放线杆菌（血清1型＋血清5型+血清7型）疫苗组合物（V1)：

(2)猪胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗（血清1型＋血清5型+血清7型）灭活疫苗(V2)：

选35~40日龄断奶仔猪50头，分为10组，每组5头（见表10）；第1、2、3组每头猪分别颈部肌肉注射猪胸膜肺炎放线杆菌（1型+5型+7型）、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗（V1）2ml，免疫后21日再次接种2ml；第4、5、6组每头猪分别颈部肌肉注射猪胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗（1型+5型+7型）2ml，免疫后21日再次接种2ml；第7、8、9组不接种。在首次免疫后35日，第1、4、7组每头猪分别经滴鼻方式攻入1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第2、5、8组每头猪分别经滴鼻方式攻入1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第3、6、9组每头猪分别经滴鼻方式攻入1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第10组不攻毒作空白对照。

表10 试验分组及处理程序

组别	D0	D21	D35	D45
					1	V1，2ml/头	V1，2ml/头	LC株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
2	V1，2ml/头	V1，2ml/头	YC株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
					3	V1，2ml/头	V1，2ml/头	YS株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
4	V2，2ml/头	V2，2ml/头	LC株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
					5	V2，2ml/头	V2，2ml/头	YC株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
6	V2，2ml/头	V2，2ml/头	YS株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
					7	不免疫	不免疫	LC株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
8	不免疫	不免疫	YC株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
					9	不免疫	不免疫	YS株3ml（含1.0×10⁸CFU）攻击	扑杀
10	不免疫	不免疫	不攻毒	扑杀

试验结果如表11，疫苗组合物（V1）对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株及血清7型YS株的攻毒保护分别为5/5（100%）、5/5（100%）和4/5（80%），猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗（血清1型+血清5型+血清7型）对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株及血清7型YS株的攻毒保护分别为4/5（80%）、5/5（100%）和4/5（80%）。

表11 副猪嗜血杆菌攻毒后各组比较结果

组别	动物数量	发病数量	死亡数量	保护率
					1	5	0	0	5/5
2	5	0	0	5/5
					3	5	1	0	4/5
4	5	1	0	4/5
					5	5	0	0	5/5
6	5	1	0	4/5
					7	5	5	3	0/5
8	5	5	4	0/5
					9	5	5	4	0/5
10	5	0	0	/

本研究的结果令人意外:使用本发明猪圆环病毒2型（PCV2）与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原组合制成的疫苗混合使用时可以保留原猪胸膜肺炎放线杆菌抗原成分的良好的免疫效力，这与本领域技术人员的认识和理解区别很大。

实施例3证明，本发明的猪圆环病毒2型（PCV2）与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原组合做成联合疫苗，猪圆环病毒2型（PCV2）抗原对猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的免疫效果没有影响，具有显著的进步。

实施例4：猪胸膜肺炎放线杆菌（1型+5型+7型）、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗与单独使用两种疫苗（猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗或猪圆环病毒2型灭活疫苗）的免疫效果和免疫副作用比较

1.材料

猪胸膜肺炎放线杆菌（1型+5型+7型）抗原、猪圆环病毒2型抗原疫苗组合物，选用实施例2中的实验室制品（V1）（每ml疫苗含灭活前PCV2为1.0×10^6.0TCID₅₀，猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、血清5型和血清7型抗原含量为3.0×10^7.0cfu，每头份用量为1ml，免疫两次）；猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株）（V2），普莱柯生物工程股份有限公司生产（批号为100903，每ml疫苗含灭活前PCV2为5.0×10^5.0TCID₅₀；每头份用量为1ml，免疫两次）；猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗（APP血清1型、2型和7型）（V3），武汉科前生物制品有限公司（批号为111007，每ml疫苗含灭活前猪胸膜肺炎放线杆菌1型、2型和7型抗原含量为5×10⁸cfu；每头份用量为1ml，免疫两次）。

2.动物试验设计

选35~40日龄断奶仔猪65头，分为13组，每组5头（见表12）；第1、2、3、4组每头猪分别颈部肌肉注射猪胸膜肺炎放线杆菌（1型+5型+7型）、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗（批号001）2ml，免疫后14d再次接种2ml；第5、6、7、8组每头猪分别左侧颈部肌肉注射猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗（APP血清1型、2型和7型）1ml，右侧颈部肌肉注射猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株）1ml，免疫后14d再次接种各1ml；第9、10、11、12组不接种。在首次免疫后35d，第1、5、9组每头猪分别经滴鼻方式攻入1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后第14日扑杀剖检；第2、6、10组每头猪分别经滴鼻方式攻入1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后第14日扑杀剖检；第3、7、11组每头猪分别经滴鼻方式攻入1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后第14日扑杀；第4、8、12组每头猪分别经PCV2SH株（含10^6.0TCID₅₀/ml）滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第13组不攻毒，攻毒后第4、7日，分别在第4、8、12、13组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。

KLH/ICFA为弗氏不完全佐剂（ICFA）乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH）（含KLH为0.5mg/ml），KLH及ICFA均购自Sigma公司；Thio为巯基乙酸培养基，购自Sigma公司。

表12 试验分组及处理

试验结果如表13，疫苗组合物对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株及血清7型YS株的攻毒保护为5/5（100%）、5/5（100%）和4/5（80%），对PCV2SH株的攻毒保护为5/5（100%），两种单苗联用对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株及血清7型YS株的攻毒保护为5/5（100%）、5/5（100%）和4/5（80%），对PCV2SH株的攻毒保护为4/5（80%）。

表13 疫苗组合物与单价疫苗的对照试验

注：不良反应表现为注射局部红肿，体温升高，厌食，精神不振。

由表13可见显示出良好的免疫保护效果，表明本发明的疫苗组合物与单苗的免疫效果基本相当；从接种剂量比较而言，疫苗组合物打2针，共2ml，两种单苗联用需打4针，共4ml，显而易见的效果是疫苗组合物使用更为方便，省时省力；从安全角度来讲，疫苗组合物的安全性相对安全，单苗联用有1/5的试验猪有不良反应，因为注射的剂量相对比疫苗组合物要增加1倍；综合述之，疫苗组合物不仅要使用方便，应激小。

实施例5：猪圆环病毒2型ORF2蛋白及其制备方法

1.克隆猪圆环病毒2型ORF2基因到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得重组酵母表达载体pPIC9K-ORF2。

（1）引物的设计

以PCV2-ORF2基因序列为参考，应用Oligo6.0引物设计软件设计引物，

P1上游：5'-AGG

GGCATCTTCAACACC-3'

P2下游：5'-CCTTAGGGGTTAAGTGGGG-3'

在上下游引物5'端分别加上核酸限制性内切酶BamH I和EcoRI识别序列（倾斜下划线部分），目的片段长约702bp。

（2）PCV2病毒核酸的提取

1mlDNAzol Reagent

加入含有0.1ml的PCV2-SH株病毒液的离心管中上下颠倒3次摇匀；室温下静置5min；4℃离心（10，000rpm、10min）后，将上清液移至新离心管；向其中加入0.5ml无水乙醇，上下颠倒混匀后室温下静置5min，4℃离心（4000rpm、2min）后，静置1min，然后吸去管内液体；向试管中加入1ml75%乙醇，上下颠倒混匀5次后，静置1min，吸去乙醇，此步骤重复两次后，让样品在空气中自然干燥（5min）；于离心管中缓慢加入30μl 8mmol/LNaOH溶解DNA，然后在-20℃下贮存备用。

（3）PCV2-ORF2基因的PCR扩增并连接入克隆载体pMD18-T（购自Takara公司，货号：D101A）

以步骤②中制备的PCV2的基因组DNA为模板，用步骤①中设计的引物P1、P2将目的基因ORF2进行PCR扩增。将PCV2-ORF2基因连接到pMD18-T载体中，命名为pMD18-T-ORF2质粒。用核酸限制性内切酶BamH I与EcoRI双酶切鉴定及测序鉴定。PCR结果见图1。第1孔为PCV2-ORF2目的片段，大小为702bp，第2孔为DL2000Marker。由电泳图谱与测序结果可知，重组连接载体中PCV2-ORF2蛋白基因含序列表中的SEQ ID NO.1序列。

（4）表达载体pPIC9K-ORF2质粒构建

用核酸限制性内切酶BamH I与EcoRI双酶切pMD18-T-ORF2质粒，用胶回收试剂盒回收PCV2-ORF2基因片段。与同样经过BamH I与EcoRI双酶切pPIC9K质粒(购自Pharmacia公司)的胶回收目的片段进行连接，构建表达载体pPIC9K-ORF2。用BamH I与EcoRI双酶切及PCR鉴定，采用PCR方法分析，用煮-冻-煮制备模板，以通用引物5’AOX1和3’AOX1为引物，其序列为5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和5’-GCAAATGGCAT TCTGACATCC-3’进行PCR鉴定为阳性重组质粒。

2.重组阳性质粒pPIC9K-ORF2转化酵母GS115菌株（购自Life Technologies公司，货号：C18100）

将鉴定后的阳性重组表达质粒pPIC9K-ORF2线性化后，电转化毕赤酵母GS115，获得阳性基因工程菌GS115/pPIC9K-ORF2。该基因工程菌经过G418抗性平板、PCR与Southern-blot鉴定为含3个拷贝表达盒的重组酵母菌株，用15%（v/v）甘油进行菌种保存。

3.毕赤酵母表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白

（1）阳性菌株的诱导表达及重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的鉴定

以pPIC9k质粒转化GS115酵母菌的阳性重组酵母菌为阴性对照，同时挑取重组酵母菌株于BMGY(Buffered glycerol-complex medium油缓冲复合诱导培养基)培养基中，培养至OD600为3时，5000rpm离心15min收集菌体，转至三角锥瓶，加BMMY培养基稀释至OD600为1，以8层无菌纱布封口，30℃250rpm摇床培养72h。为了维持诱导表达，每隔24h添加100%甲醇至终浓度为0.5%（v/v），分别于24h、48h、72h取1.5ml培养物于灭菌离心管中，于12000rpm离心15min，分别收集上清，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，过滤后进行SDS-PAGE电泳，结果见图2。第1孔为蛋白质Marker；第2孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母24h后收获的培养上清；第3孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母48h后收获的培养上清；第4孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母72h后收获的培养上清；第5孔为细胞阴性对照。由图可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白大小与预测蛋白一致。经测序可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列为序列表中的 SEQ ID NO.2序列。

（2）重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的免疫原性鉴定

SDS-PAGE电泳后，再进行转膜，将凝胶上的收获的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，加上针对猪圆环病毒2型ORF2蛋白的单抗，再加上带有标记物的二抗。然后判定重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的表达。结果见附图3，其中，第1孔为蓝色预染低分子量蛋白质Marker；第2孔为24h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；第3孔为48h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果，第4孔为72h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果，第5孔为细胞阴性对照与阳性血清反应结果。用Westernblotting分析表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白。用猪的抗猪圆环病毒2型高免血清对重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白进行检测。结果显示，在硝酸纤维素膜上仅观察到一条分子量大小与预期大小一致的特异性条带，说明表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白能够同猪圆环病毒2型抗体特异性结合，证明重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白具有特异的猪圆环病毒2型免疫原性。

（3）收获和纯化重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白

将72h诱导表达的培养物经10000rpm离心20min，分离沉淀和上清液，沉淀弃去，上清液通过1μm滤膜进行过滤，然后通过密理博超滤系统（Millipore公司）浓缩纯化，纯化后的样品溶液通过紫外分光光度计进行蛋白含量测定，表达量为55mg/L。纯化后加入二乙烯亚胺使最终浓度为7mmol/L二乙烯亚胺（BEI）灭活重组表达产物，48h后加入终浓度为7mmol/L的硫代硫酸钠中和。

实施例6：猪圆环病毒抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的疫苗组合物的制备

抗原：采用实施例5制备的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2蛋白抗原和实施例1的猪胸膜肺炎放线杆菌抗原(k001批进行3倍浓缩，猪胸膜肺炎放线杆菌1型灭活抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌5型灭活抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌7型灭活抗原菌液浓度为灭活前3.0×10⁷CFU/ml）。

卡波姆溶液制备:将卡波姆Carbomer 934P（青岛天力源生物科技有限公司）溶解在去离子水中，制成25mg/ml的储备溶液12℃30min高压灭菌，4℃保存。

2%W/V的壳聚糖溶液的制备：0.5mol/L乙酸钠溶液用4.lg乙酸钠（购自SigmaChemical Co.，St.Louis，MO）溶于50ml去离子水，用约7ml冰乙酸将pH调至4.5，再加入1.5ml冰乙酸补偿聚氨基葡萄糖的加入对溶液pH的影响。溶液总体积用去离子水调至l00ml，2g壳聚糖（上海其胜生物制品有限公司产品，聚合度88.5%）缓慢加入上述乙酸钠溶液并不断搅拌2-3h直到壳聚糖溶解。0.22μm滤膜过滤除去杂质，112℃30min高压灭菌，4℃保存。

表14 猪圆环病毒病、副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物试验例主要组成（每头份疫苗为2ml）

制备方法:

按照表14的配比，在无菌容器中依次加入上述含量比例的猪圆环病毒2型ORF2蛋白、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株灭活抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株灭活抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株灭活抗原，卡波姆溶液和壳聚糖溶液，用PBS液（pH值为7.2~7.4）混合搅拌30min既得猪圆环病毒抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的疫苗组合物。

实施例8：猪圆环病毒抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原疫苗组合物免疫学试验和攻毒试验

疫苗免疫25日龄PCV2抗体阴性仔猪（普莱柯生物工程股份有限公司动物房饲养），每组8头，同时设未接种疫苗不攻毒阴性对照猪8头及未接种疫苗攻毒对照猪8头。免疫组进行一次免疫，免疫后21天对免疫组和攻毒对照进行病毒攻击，毒株选用强毒(PCV2-SH株强毒10^6.0TCID₅₀/ml)，每头猪滴鼻1ml，颈部肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7天分别在两腋下和两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。在第11天和19天腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。不接种疫苗不攻毒阴性对照组单独隔离饲养。攻毒后28天进行剖杀。

在首免疫前、攻毒前和剖杀前，对所有猪只收集血样，通过ELISA进行PCV2血清抗体分析。试验结果见表3。攻毒后28天剖检全部猪只，观察各组织器官病理变化、拍照记录。符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。

A.临床症状：仔猪体温升高（≥40℃），应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；

B..病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；

C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。表14中各个试验组的免疫结果见表15。

表15 各组试验猪PCV2血清抗体分析结果

表16 各组试验动物发病判定结果

结果分析：根据试验动物临床症状、剖检病理变化检测和病原的PCR检测判断结果，其中不免疫攻毒对照组仔猪全部发病，所有试验组均不发病。

实施例7：PCV2ORF2重组蛋白抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原疫苗组合物免疫仔猪后PCV2攻毒保护效果比较

本项研究设计是为了证实佐剂相同的情况下疫苗组合物（PCV2重组蛋白亚单位抗原+猪传染性胸膜肺炎放线杆）与单独的猪圆环病毒2型重组蛋白亚单位疫苗在相同佐剂情况下的免疫效果

将猪胸膜肺炎放线杆菌灭活抗原和PCV2ORF2蛋白，按照表18制备猪圆环病毒抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的疫苗组合物，在无菌容器中依次加入猪圆环病毒ORF2蛋白、猪胸膜肺炎放线杆菌1型抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌5型抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌7型抗原，加入疫苗佐剂，用PBS（磷酸盐缓冲液pH为7.2~7.4）液调整体积。

表18 各试验疫苗的配方（每头份疫苗为2ml）

选35~40日龄断奶仔猪30头，分为6组，每组5头（见表19）；第1组每头猪分别颈部肌肉疫苗（V1）2ml，免疫后21d再次接种2ml；第2组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗（V2）2ml，免疫后21d再次接种2ml；第3组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗（V3）2ml，免疫后21d再次接种2ml；第4组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗（V4）2ml，免疫后21d再次接种2ml；第5作为攻毒对照组，第6组作为空白对照组。在首次免疫后35d，第1、2、3、4、5组各用PCV2SH株（含10^6.0TCID₅₀/ml）滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第4组不攻毒，攻毒后第4、7日，分别在第1、2、3、4、5、6组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基（Thio），10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据微观病理组织变化及免疫组织化学（IHC）检测PCV2病毒抗原结果进行免疫效果比较。

表19 试验分组及处理

组织损伤及免疫组化检测抗原情况见表20，可见疫苗组合物（V1）免疫的猪只PCV2攻毒后无病理损伤且未检测到PCV2抗原，而猪圆环病毒2型灭活疫苗（V2）免疫的猪5头猪有1头检测到了pcv2抗原且其有病理圆环病毒特征性的病理损伤（间质性肺炎、淋巴结淋巴细胞损伤和多核巨细胞的出现及单核巨噬细胞浸润等）。

表20PCV2攻毒后各组试验猪组织损伤及IHC检测

组别	动物数量（N）	肺部病变	淋巴结病变	IHC检测
					V1	5	0/5	0/5	0/5
V2	5	1/5	0/5	0/5
					V3	5	1/5	2/5	2/5
V4	5	3/5	3/5	2/5
					攻毒对照组	5	4/5	5/5	5/5
空白对照组	5	0/5	0/5	0/5

本领域一直认为亚单位ORF2疫苗与其他抗原的疫苗组合物，由于蛋白容易变性或与其他抗原相结合，可能会效果变差。但本研究的结果令人意外:在使用猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2蛋白作为PCV2抗原时，其与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的组合抗原制备的疫苗组合物，表现出了灭活PCV2全病毒抗原与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的组合抗原制备的疫苗组合物相同或基本相同的免疫效果。

此外，本发明的疫苗组合物不仅能够用于免疫猪以提供良好的免疫效果，而且保留了原PCV2抗原成分的良好的免疫效力，其效果也优于单独的猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗，即本发明疫苗组合物的对抗PCV2的免疫效果优于单独使用PCV2ORF2蛋白亚单位疫苗的免疫效果。尤其在PCV2抗原量减半的情况下依然保持了猪圆环病毒2型（PCV2）抗原的免疫效果，上述结果也出乎本领域技术人员的意料。

实施例8：PCV2ORF2重组蛋白抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原疫苗组合物、与猪胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗免疫后猪胸膜肺炎放线杆菌攻毒保护效果比较

将猪胸膜肺炎放线杆菌抗原和猪圆环病毒2型ORF2蛋白，按照表21制备猪圆环病毒抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的疫苗组合物，在无菌容器中依次加入猪圆环病毒ORF2蛋白、猪胸膜肺炎放线杆菌1型抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌5型抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌7型抗原，加入疫苗佐剂，用PBS液（pH值7.2~7.4）调整体积。

表21 各试验疫苗的配方（每头份疫苗为2ml）

选35~40日龄断奶仔猪50头，分为10组，每组5头（见表22）；第1、2、3组每头猪分别颈部肌肉注射猪胸膜肺炎放线杆菌（1型+5型+7型）、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗（V1）2ml，免疫后21日再次接种2ml；第4、5、6组每头猪分别颈部肌肉注射猪胸膜肺炎放线杆菌病灭活疫苗（1型+5型+7型）2ml，免疫后21日再次接种2ml；第7、8、9、10组不接种。在首次免疫后35日，第1、4、7组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第2、5、8组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第3、6、9组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第10组不攻毒作空白对照。

表22 试验分组及处理程序

组别	D0	D21	D35	D45
					1	V1，2ml/头	V1，2ml/头	LC株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
2	V1，2ml/头	V1，2ml/头	YC株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
					3	V1，2ml/头	V1，2ml/头	YS株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
4	V2，2ml/头	V2，2ml/头	LC株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
					5	V2，2ml/头	V2，2ml/头	YC株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
6	V2，2ml/头	V2，2ml/头	YS株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
					7	不免疫	不免疫	LC株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
8	不免疫	不免疫	YC株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
					9	不免疫	不免疫	YS株3ml（含1×10⁸CFU）攻击	扑杀
10	不免疫	不免疫	不攻毒	扑杀

试验结果如表23，疫苗组合物（V1）对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株及血清7型YS株的攻毒保护均为5/5（100%），猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗（血清1型＋血清5型+血清7型）（V2）对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株及血清7型YS株的攻毒保护均为5/5（100%）。

表23副猪嗜血杆菌攻毒后各组比较结果

组别	动物数量	发病数量	死亡数量	保护率
					V1	5	0	0	5/5
V1	5	0	0	5/5
					V1	5	0	0	5/5
V2	5	0	0	5/5
					V2	5	0	0	5/5
V2	5	0	0	5/5
					1型攻毒对照组	5	5	3	/
5型攻毒对照组	5	5	4	/
					7型攻毒对照组	5	5	4	/
空白对照组	5	0	0	/

[0242] 通常认为，在亚单位ORF2疫苗与其他抗原的疫苗组合物中，由于蛋白容易与其他抗原相结合，可能会导致其他疫苗的效果变差。并且，现有技术认为蛋白成分通常会干扰猪胸膜肺炎放线杆菌抗原的效果，联合使用通常会部分抵消猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗的免疫原性。但本研究结果令人意外，在含有猪胸膜肺炎放线杆菌灭活抗原及猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2蛋白的疫苗组合物中，依然保留了猪胸膜肺炎放线杆菌成分的良好的免疫效力，并能同时为抗猪圆环病毒2型（PCV2）与猪胸膜肺炎放线杆菌感染提供良好的免疫效果。

实施例9：猪圆环病毒2型、猪胸膜肺炎放线杆菌（血清1型＋血清5型+血清7型）疫苗组合物不同配比疫苗免疫效果比较

由于猪圆环病毒2型、猪胸膜肺炎放线杆菌（血清1型＋血清5型+血清7型）疫苗组合物各成分可以采用不同含量及配比的方式组合成不同的疫苗，并从中选出最优成分配比及含量，本实施例在于通过一系列对比试验，支持以上实施例中所采用的数据。

猪圆环病毒2型抗原及猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为实施例1中K002批抗原，猪圆环病毒2型抗原含量为10^6.5TCID₅₀/ml，猪胸膜肺炎放线杆菌LC株、YC株和YS株抗原都为3.0×10⁷CFU/ml。疫苗具体配方如下：

表24 猪圆环病毒病、副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物试验例具体配比（每头份疫苗为2ml）

1.效力检验

（1）猪圆环病毒2型效力检验

用14~21日龄健康易感仔猪15头，分成3组，每组5头，第1组每头颈部肌肉注射疫苗1ml，疫苗使用上述为疫苗1、疫苗2、疫苗3的三种疫苗，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种，第2组作非免疫攻毒对照，第3组作空白对照（非免疫、非攻毒），均隔离饲养观察。首免后5周对所有猪称重，第1、2组各用PCV2SH株（含10^6.0TCID₅₀/ml）滴鼻1ml、肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒第4、7日，分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种 1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。攻毒对照组应至少4头发病，免疫组应至少4头保护。

（2）猪传染性胸膜肺炎部分

用28~35日龄猪传染性胸膜肺炎抗体阴性仔猪10头，分2组，每组5头，每头颈部肌肉注射疫苗1ml，2周后二免每头颈部肌肉注射疫苗1ml。每组2免后14日连同对照猪5头，分别腹腔内注射1个致死剂量的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株和7型YS株菌液各3ml，观察14日。每组免疫猪至少保护4头；对照猪至少3头死亡或者4头发病为合格。

上述疫苗为疫苗1、疫苗2、疫苗3，分别经过效力检验，结果见表25，可以看出，三种疫苗均对猪圆环病毒2型SH株、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株和7型YS株菌株免疫攻毒保护，并且均表现良好的免疫效果。

表2 53种疫苗的效力检验结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物，其包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。

2.根据权利要求1所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原中的一种或几种，并且，所述猪圆环病毒2型抗原选自猪圆环病毒2型全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为猪胸膜肺炎放线杆菌全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪胸膜肺炎放线杆菌细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。

3.根据权利要求2所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量至少为10^5.5TCID₅₀；

所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的全菌体。

4.根据权利要求3所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为4.5×10^5.0TCID₅₀～10^6.0TCID₅₀；

所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2 SH株、PCV2 LG株、PCV2 DBN-SX07-2的抗原组合物或疫苗组合物和/或PCV2亚单位抗原；

所述猪传染性胸膜肺炎抗原为灭活的血清型为1型、5型和7型的混合抗原；

所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型的含量至少为1.0×10⁷CFU/头份，血清5型的含量至少为1.0×10⁷CFU/头份，血清7型的含量至少为1.0×10⁷CFU/头份。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于：

所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为9×10⁵⁰TCID₅₀；

所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型的含量为2.0×10⁷～5×10⁷CFU/头份，血清5型的含量为2.0×10⁷～5×10⁷CFU/头份，血清7型的含量为2.0×10⁷～5×10⁷CFU/头份；

所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2 SH株和/或PCV2 ORF2蛋白；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的血清1型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌体；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株(Actinobacillus pleuropneumoniaeserotypel strain LC)的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011458；所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5strain YC)的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011459；所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7strain YS)的保藏编号为：CCTCCNO：M 2011460；上述菌株均保藏于中国典型培养物保藏中心。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于：

所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为0.5～20μg/头份；

所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型的含量为3.0×10⁷～5×10⁷CFU/头份，血清5型的含量为3.0×10⁷～5×10⁷CFU/头份，血清7型的含量为3.0×10⁷～5×10⁷CFU/头份；

所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为序列表SEQ NO.1的DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO.2的氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75％以上的氨基酸序列的蛋白；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在80％以上的菌株。

7.根据权利要求6所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为5～10μg/头份；

所述二联疫苗组合物中猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型的含量为5.0×10⁷CFU/头份，血清5型的含量为5.0×10⁷CFU/头份，血清7型的含量为5.0×10⁷CFU/头份；

所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQ NO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白同源性在80％以上的氨基酸序列的蛋白；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在90％以上的菌株。

8.根据权利要求7所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQ NO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白同源性在90％以上的氨基酸序列的蛋白；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原包括分别与所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、5型YC株及7型YS株的16S rRNA的同源性在95％～99％以上的菌株。

9.一种根据权利要求1～8中任意一项所述二联疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤：将两种以上的抗原混合后制得抗猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎感染的二联疫苗组合物，其中，所述抗原包括猪圆环病毒2型抗原与猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。

10.根据权利要求1～8中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体的附加抗原。