CN103083655B - 预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents
预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103083655B CN103083655B CN201210221969.2A CN201210221969A CN103083655B CN 103083655 B CN103083655 B CN 103083655B CN 201210221969 A CN201210221969 A CN 201210221969A CN 103083655 B CN103083655 B CN 103083655B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vaccine
- deactivation
- type
- antigen
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明提供了一种猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体的疫苗组合物，包含灭活的猪圆环病毒2型抗原、灭活的副猪嗜血杆菌、灭活的猪肺炎支原体以及疫苗佐剂。本发明的疫苗组合物，可起到打一针该疫苗即可预防猪圆环病毒病、猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌病三种病的目的，且三种抗原混合后制备成本发明的疫苗组合物时抗原含量是普通单苗抗原含量的1/2，和现有的打三针单疫苗才能预防这三种传染病比较，本发明的技术方案更加经济实用，降低了生产成本，简化了免疫程序，同时也降低了防疫成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌以及猪肺炎支原体感染的疫苗组合物，属于兽用疫苗领域。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。除PMWS外，PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。
副猪嗜血杆菌病又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称格拉泽氏病。是由副猪嗜血杆菌引起。副猪嗜血杆菌只感染猪，可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％临床症状取决于炎症部位，包括发热、呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪或死亡。母猪发病可流产，公猪有跛行。哺乳母猪的跛行可能导致母性的极端弱化。死亡时体表发紫，肚子大，有大量黄色腹水，肠系膜上有大量纤维素渗出，尤其肝脏整个被包住，肺的间质水肿。
猪肺炎支原体是猪支原体肺炎的病原体。该疾病导致体重增加减少和饲养效率降低，是养猪业经济损失的重要原因。该疾病导致持续几周的持续性咳嗽、被毛失去光泽、生长迟缓和外观不壮实。在感染动物尤其是在腹顶端和心叶观察到特征性病变紫色到灰色实变区。虽然该疾病的死亡率低，但受感染的猪常常易于受到机会病原体的继发感染，从而导致死亡或应激。每年的经济损失佑计在2亿～2.5亿美元之间。
PCV感染可引起猪的免疫抑制，从而使机体更易感染其他病原，这也是猪圆环病毒与猪副猪嗜血杆菌、肺炎支原体混合感染的重要原因，混合感染病猪的病死率也将大大提高，有的可达25%～40%。但是，由于联合疫苗（疫苗组合物），如二联疫苗或三联疫苗中，多种抗原相互间存在干扰或影响，导致目前市场上还未见有猪圆环病毒病、副猪嗜杆菌病、猪支原体肺炎三联苗的产品，也未见有相关的文献和专利。因此，目前对于预防猪圆环病毒、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体共感染或继发感染，只能使用猪圆环病毒病灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病灭活疫苗、猪支原体肺炎疫苗分别进行三次免疫来预防和控制，导致免疫程序复杂、免疫次数增多，免疫成本增加，猪只的免疫应激次数增多，影响猪只的生长性能。
发明内容
本发明通过大量的筛选研究，意外发现将猪圆环病毒2型（PCV2）、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体的抗原，三种抗原并不会相互干扰或影响；相反地，猪圆环病毒2型（PCV2）、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体的抗原组合物和疫苗组合物不仅能够产生足够的保护性免疫应答，同时还意外发现相对于每种抗原或三种抗原的单苗免疫效果均得到了增强。特别令人意外地，在PCV2、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体抗原量减半的情况下，三种抗原或其疫苗组合物仍能维持良好的免疫效果，至少与每种抗原或抗原的单苗的免疫效果相同或类似。因此，本发明可以提供预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）病、副猪嗜血杆菌病、猪支原体肺炎的疫苗组合物，达到一针免疫预防三种疫病的效果，在显著地降低成本和节省人力的情况下，可以显著地提高对三种病毒或细菌的病原体的感染之免疫效力，对预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌以及猪肺炎支原体混合感染或继发感染有特别好的效果。
技术方案
为了实现上述目的，本发明预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物，其包含猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原和猪肺炎支原体抗原
优选地，本发明所述的疫苗组合物为包括灭活的猪圆环病毒2型基因型（PCV2）2a、2b、2c或2d基因型的一种或任意几种的组合；和/或PCV2ORF2蛋白、与灭活的副猪嗜血杆菌、灭活的猪肺炎支原体。
本发明中的术语“猪圆环病毒2型抗原”是指含有至少一种PCV2抗原形式的任何组合物，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、优选为灭活的PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列（如ORF2蛋白）的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。PCV2抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原：如梅里亚公司（Merial）的 辉瑞公司（Pfizer）的 PCV2；哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗（DBN-SX07株）和基因工程亚单位疫苗（如勃林格殷格翰公司（Boehringer-Ingelheim）的Ingelvac ）
因PCV2基因组大小为1767bp或1768bp，不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90%以上，因此PCV2 SH株（GenBank登录号为AY686763）、PCV2LG株（GenBank登录号为HM038034）、PCV2 DBN-SX07-2（GenBank登录号为HM641752）均在本发明之内。
优选地，本发明疫苗组合物中，猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原，优选PCV2 SH株，保藏号为CGMCC No.23890，公开于专利文献CN101240264A。
优选地，本发明疫苗组合物中，所述的灭活的猪圆环病毒2型每剂量或每头份含量灭活前为3×105.0～108.0TCID50/头份；更优选，本发明所述的灭活的猪圆环病毒2型含量为灭活前5×105.0TCID50/头份。
优选地，本发明疫苗组合物中，猪圆环病毒2型抗原为含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成份；更优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2 ORF2蛋白。其中，本发明PCV2 ORF2蛋白，优选序列表SEQNO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75%以上的蛋白，更优选地为同源性在80%以上的、最优选在90%以上的蛋白。即所有能达到本发明目的的蛋白序列或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的蛋白。本发明对PCV2 ORF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV2ORF2蛋白都可用作本文所述PCV2 ORF2 DNA和／或多肽的来源。
优选地，本发明疫苗组合物中，所述PCV2 ORF2蛋白的含量为2~20μg/头份，更优选10μg/头份，最优选20μg/头份。
优选地，本发明疫苗组合物中，所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型。更优选地，本发明疫苗组合物中，所述的副猪嗜血杆菌血清4型为保藏号为CCTCC No.M2011172的副猪嗜血杆菌JS株；所述的副猪嗜血杆菌血清5型为保藏号为CCTCC No.M2011173的副猪嗜血杆菌ZJ株。
更优选地，本发明疫苗组合物中，所述的灭活的副猪嗜血杆菌4型含量为5×108～4×109CFU/头份，副猪嗜血杆菌5型含量为5×108～4×109CFU/头份。最优选地，本发明疫苗组合物中，所述的灭活的副猪嗜血杆菌4型含量为1×109CFU/头份，副猪嗜血杆菌5型含量为1×109CFU/头份。
本发明中术语“副猪嗜血杆菌抗原”是指含有至少一种副猪嗜血杆菌抗原形式的任何组合物，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。副猪嗜血杆菌的野毒株，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的1～15个血清型或无法定血清型的副猪嗜血杆菌。优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌，更优选为灭活形式的副猪嗜血杆菌，最优选，所述副猪嗜血杆菌抗原是灭活的血清型为4型和5型的混合抗原；最 优选为副猪嗜血杆菌灭活的血清4型菌株为JS株，所选用的灭活的副猪嗜血杆菌血清5型菌株为ZJ株。副猪嗜血杆菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原副猪嗜如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1；海博莱公司（Hipra）的Hiprasuis-Glasser）；武汉科前动物生物制品有限责任公司的副猪嗜血杆菌灭活疫苗（4型MD0322株+5型SH0165株）。
正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。但是同源性比较如果针对全部的基因来进行比对，在实际上是非常巨大的工程，不太可行，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA（16S rRNA）来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的副猪嗜血杆菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，
16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）
因此，本发明包括与副猪嗜血杆菌两株菌株（JS株、ZJ株）16SrRNA的同源性在80%上以上的菌株，更优选与JS株或ZJ株16SrRNA同源性在至少90%，至少95%，至少95%～99%的副猪嗜血杆菌菌株，即不改变副猪嗜血杆菌两株菌株（JS株、ZJ株）16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的副猪嗜血杆菌，获得与本发明副猪嗜血杆菌16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。
优选地，本发明疫苗组合物中，所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体。更优选地，所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2012年6月13日，保藏号为CCTCC No.M2012230。
优选地，本发明疫苗组合物中，猪肺炎支原体HN0613株抗原灭活前含量为107～109CCU／头份；更优选地，本发明疫苗组合物中，猪肺炎支原体HN0613株抗原灭活前含量1×108CCU/头份。
本发明中术语“猪肺炎支原体抗原”是指含有灭活的猪肺炎支原体抗原，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答。猪肺炎支原体包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是完整的猪肺炎支原体，优选为灭活形式，更优选为猪肺炎支原体HN0603株或J株。副猪嗜血杆菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原猪肺炎支原体如勃林格殷格翰公司的 M.hyo；哈药集团公司的瑞倍适Respisure和RespisureOne；美国普泰克公司的MycoGard;美国辉瑞公司的RespiFend MH；梅里亚动物保健公司的猪克喘；国内生产的168株活疫苗。
优选地，本发明疫苗组合物中，所述的疫苗佐剂混合物为Gel 01（法国SCIPPIC）、氢氧化铝胶、矿物油、可代谢油、卡波姆（Carbomer）、蜂胶、ISA206（法国SCIPPIC）、ISA760VG（法国SCIPPIC）的一种或几种的组合。优选地，本发明所述佐剂混合物可代谢油包括一种或多种角鲨烯、角鲨烷的菇烯烃以及维生素E，所述佐剂混合物的终浓度是约2～30%v/v。
更优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆（Carbomer）（商品名Carbopol）、Gel 01（法国SCIPPIC）、铝胶、白油；最优选地，发明所述的疫苗佐剂为Gel 01（法国SCIPPIC）。
优选地，本发明疫苗组合物中，相对于疫苗组合物的总重，所述的疫苗佐剂的用量为5%～60%重量，所述的抗原成份的用量为40%～95%重量，即灭活的猪圆环病毒2型、灭活的副猪嗜血杆菌、灭活的猪肺炎支原体的用量占疫苗组合物的总重为40%～95%重量。
作为本发明的另外一个方面，本发明的提供一种猪肺炎支原体菌株，菌株名称为HN0613株，保藏编号为CCTCC M2012230，保藏单位为位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保 藏日期：2012年6月13日。
由上可知，本发明选用毒种为猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型及猪肺炎支原体；本发明制备的疫苗组合物，可起到打一针该疫苗即可预防猪圆环病毒病、猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌病三种病的目的，和现有的打三针单疫苗才能预防这三种传染病比较，本发明的技术方案更加经济实用，简化了免疫程序，降低了生产成本和防疫成本，具备商业成功的基础。
附图说明
图1为Friis固体培养基猪肺炎支原体菌落狄氏染色图；
图2为猪肺炎支原体PCR鉴定图。
具体实施方式
菌株（毒株）的来源
所选用的猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2，PCV2）毒株为PCV2b基因型SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏号为CGMCCNo.23890。
所选用的血清4型副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis，HPS)菌株为JS株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏号为CCTCC No.M2011172。
所选用的血清5型副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis，HPS)菌株为ZJ株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏号为CCTCC No.M2011173。
所选用的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）菌株为J株，购自ATCC（美国典型培养物保藏中心，ATCC编号为：25934；猪肺炎支原体HN0613株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2012年6月25日，保藏号为CCTCC No.M2012230。
本发明实施例中肺病变指数评分标准：根据7个肺叶病变程度进 行评定，最大得分为28分。特异性损伤的肺叶面积为0%时，记为0分，1%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，大于75%为4分。
本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。
本实施例中的疫苗组合物、三联疫苗或联苗均指预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物，即至少包含猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原和猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物，本发明实施例中使用的单苗为含有猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原和猪肺炎支原体抗原中一种的疫苗，用于评价本发明的疫苗组合物、三联疫苗或联苗的免疫效力。
本发明中所用的pH 7.2的PBS液配方为：1000ml蒸馏水中加入NaCl 9g、Na2HPO4·12H2O 6g、NaH2PO4.2H2O 0.4g，本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体的疫苗组合物中三种抗原的制备
1.1生产用菌（毒）种的制备
猪圆环病毒2型SH的制备：将毒种PCV2SH株用MEM液体培养基（用购自美国Invitrogen公司的MEM干粉培养基按说明书配制）作1:9稀释，然后按细胞培养液体积的5％接种于PK15（ATCC，保藏号为CCL-33）单层细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液（MEM液体培养基中添加4%犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸），37℃培养4日，冻融2~3次，收获病毒，病毒滴度为106.5TCID50/ml。
副猪嗜血杆菌菌种的制备：将副猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血 杆菌5型ZJ株划线接种于含5%新生牛血清和0.005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，美国BBI公司）的胰蛋白大豆琼脂（TSA，购自美国BD公司）平板（简称TSA/NAD平板），37℃培养24～48小时，各挑选5个以上典型菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。一级种子挑取单个菌落，接入含5%新生牛血清和0.005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，美国BBI公司）的胰蛋白大豆肉汤（TSA，购自美国BD公司）（简称TSB/NAD液体培养基），37℃摇床180rpm振荡培养12小时，同时取样革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态均匀，符合副猪嗜血杆菌的形态特征，无任何杂菌生长，作为二级种子
其中：含5%血清的TSA/NAD平板的制备方法：胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA，BD Difico产品）40克加入945ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，温度降至60℃左右,加入50ml过滤除菌的牛血清，5ml过滤除菌的1%NAD，充分摇匀后倒平皿。
含5%新生牛血清的TSB/NAD液体培养基：胰大豆蛋白肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB，BD Difico产品）30克加入940ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，加入50ml过滤除菌的牛血清，10ml过滤除菌的0.01%NAD即成。
猪肺炎支原体菌种的制备：冻干菌种启封后，按10%接种量接种液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检，作为一级生产种子。取一级种子按5%接种量接种液体养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检，作为二级生产种子。
猪肺炎支原体液体培养基的配方:牛心浸出液(BD公司)300ml，双蒸水360m1，校正pH值到7.4,121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份:Hank's平衡盐溶液(10×)40m1,0.25(W/V)酚红10m1,马血清200m1，5%(W/V)水解乳蛋白100m1,25%W/V酵母浸出液20m1，10000IU/ml青霉素10ml。
1.2病毒液或菌液的培养与制备
猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞，倒去细胞培养液（MEM液体培养基中添加6%犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸），将毒种液体积比按0.1～0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液（步骤1.1所述），置37℃旋转（10~12转/小时）培养。每日观察1~2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存。
副猪嗜血杆菌（4型JS株与5型ZJ株）菌液的制备：将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型JS株与副猪嗜血杆菌5型ZJ株的二级种子分别按1:100（v/v）接种于TSB/NAD液体培养基（步骤1.1所述），置37℃摇床200rpm培养。培养至12～16小时，收获。
猪肺炎支原体菌液的制备：将鉴定合格的猪肺炎支原体HN0603株的二级种子分别按5%（v/v）接种于液体培养基（步骤1.1所述），37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获。
1.3病毒液或菌液的处理
猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理：将步骤1.2的病毒液用中空纤维滤柱（Millipore公司孔径10μm与0.45μm）过滤，除去细胞碎片。
副猪嗜血杆菌（4型JS株与5型ZJ株）菌液的处理：将步骤1.2的两种菌液（副猪嗜血杆菌ZJ株与JS株）分别以连续离心机（10000转/分钟）离心后再以PBS（pH值为7.2～7.4）复溶至离心前的体积。
1.4浓缩 将猪圆环病毒2型SH、副猪嗜血杆菌4型JS株、副猪嗜血杆菌5型ZJ株、分别用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为300Kda）作5倍(体积比）浓缩，用同样的方式对猪肺炎支原体HN0603株抗原液进行10倍浓缩。
1.5含量测定
1.5.1猪圆环病毒SH株病毒液的含量测定
将病毒液用MEM液体培养基（步骤1.1所述)按本领域技术人员通用方法作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，每个稀 释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO2的温箱中继续培养24小时，换细胞维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID50。
1.5.2副猪嗜血杆菌ZJ株与JS株菌液的活菌数测定
菌液取样，按本领域技术人员熟知的方法作10倍系列稀释，取10-6、10-72个稀释度接种于前述TSA/NAD固体培养基，每个平板接种0.1ml，37℃培养24小时后，选择菌落数在30和300之间的平板进行菌落计数。
1.5.3猪肺炎支原体的菌液活菌计数测定
将含酚红指示剂的液体培养基分装至小试管中，设两排，每排13支，1.8ml/支，取0.2ml待检培养物接种至第一支小试管，混匀后依次10倍稀释至第12支小试管，第13管为对照管，置37℃摇振培养，记录21天为止产生颜色变化的最高管数，以判定CCU滴度，取两排结果的平均值。
1.6病毒液或菌液含量测定结果：
猪圆环病毒2型SH株、副猪嗜血杆菌4型JS株及副猪嗜血杆菌5型ZJ株以及猪肺炎支原体含量见表1。
表1含量测定
1.7病毒液或菌液的灭活
猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活：将检验合格的步骤1.3处理的病毒液加入甲醛溶液（洛阳市化学试剂厂分析纯，含量为37%～40%），使甲醛溶液的终浓度为0.2％（V/V），37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活病毒液置2~8℃保存。
副猪嗜血杆菌（4型JS株与5型ZJ株）菌液的灭活：将步骤3中二种不同血清型的菌液，加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％（V/V），37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活菌液置2~8℃保存。
猪肺炎支原体菌液的灭活：将步骤3中二种不同血清型的菌液，加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％（V/V），37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活菌液置2~8℃保存。
1.8灭活效果测定
1.8.1猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活检验：取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37℃吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37℃培养2日，应无细胞病变（CPE），连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用间接免疫荧光法（IFA）检测，无绿色PCV2阳性细胞产生。
1.8.2副猪嗜血杆菌灭活检验：制备6个平皿的TSA/NAD固体培养基，无菌操作将灭活的菌液在其中3个TSA/NAD固体培养基平皿上滴加1滴，用接种环划线，置37℃普通温箱培养，同时设立3个不接菌的TSA/NAD固体培养基作对照。24小时后观察，平皿必须无任何细菌生长,同时对照未接菌的2个培养基也应无细菌生长,继续观察结果至48小时6个平皿中都无细菌生长。
1.8.3猪肺炎支原体灭活检验：取1ml灭活菌液接种50ml液体培养基，37℃培养，于第5、10日各移植一次，最后一次移植后继续培养观察11日，培养基pH值应不降低，培养基着色均应不发生变化。
1.8.3灭活结果
猪圆环病毒2型SH株、副猪嗜血杆菌4型JS株、副猪嗜血杆菌5型JS株及猪肺炎支原体的灭活检验结果见表2，说明灭活的结果是彻底的。
表2抗原的灭活检验效果
1.8.4猪圆环病毒2型亚单位抗原的制备：
按照专利CN101884787A中所述方法进行制备PCV2亚单位抗原，即按照下面的步骤制备PCV2ORF2蛋白（即PCV2亚单位抗原）：
1、首先设计引物Spe-ATG(5'-cgactagtatgacgtatccaaggaggcgt-3')和引物Hind-TAA(5'-gcaagctttattcattaagggttaagttggg-3')，以保藏号为CGMCCNo.2389的PCV2-SH株的基因组DNA为模板，扩增PCV2 ORF2基因(即，SEQ ID NO 1序列)，并将扩增的ORF2基因克隆入pMD-18T载体中，获得重组载体pT-ORF2，重组载体pT-ORF2含序列表中的SEQ ID NO1序列。
设计四条引物，以pT-ORF2为模板，通过融合PCR方法在ORF2基因序列5`端引入蜂毒素信号肽核苷酸序列和限制性酶SpeⅠ和HindⅢ酶切位点。引物如下：
HBM-F1 5'-tttcttacatctatgcgacgtatccaaggaggcgt-3'
HBM-R1 5'-ggcaacgttgactaagaatttcatactagtatcgtccac-3'
HBM-F2 5'-ttatggtcgtatacatttcttacatctatgcg-3'
HBM-R2 5'-aaacaagggcaacgttgactaagaatttc-3'
通过SpeⅠ和HindⅢ双酶切带有蜂毒素信号肽核苷酸序列的ORF2序列，并将其克隆入转移载体pFastBacTM1（Invitrogen），构成包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的载体pFastBacP2，其中，重组转移载体pFastBacP2含蜂毒素信号肽核苷酸序列，即含序列表中的SEQ ID NO2序列；
2、将pFastBacP2转化含有病毒穿梭质粒Bacmid的大肠杆菌DH10Bac（购自Invitrogen公司），获得重组质粒Bacmid-P2；PCR筛选，提取阳性质粒，制备阳性重组质粒Bacmid-P2 DNA。采用 Reagent转染Sf9细胞（购自Invitrogen公司），待细胞出现病变后，进行重组病毒噬斑纯化和病毒扩增，然后通过通用引物M13F和M13R进行PCR验证目的重组ORF2基因。纯化获得重组杆状病毒，命名为vBac-P2，将vBac-P2重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞High FiveTM（购自Invitrogen公司）。在含有200~350ml的EXPRESS FIVE SFM培养基的500ml转瓶中无菌悬浮培养HighFiveTM细胞，接种细胞密度为0.3~0.6×106个细胞/ml。当细胞密度达到1×106个细胞/ml时，用重组病毒vBac-P2接种各转瓶，接种到各转瓶中的重组杆状病毒具有不同的感染复数（M.O.I.），分别是0.01、0.1、1。接种重组杆状病毒后，以26~28℃，转速为100rpm，培养4天。
3、在上述High FiveTM细胞培养瓶中，接种后每12小时对各瓶取样，即48h、60h、72h、84h和96h取样。各样品以10,000g离心20分钟，分离上清液和沉淀。上清液通过1μm的滤膜进行过滤，过滤后进行SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计测定上清液中的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白及其含量，并由测序可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列含序列表中的SEQ ID NO3序列。制备使用PBS（0.01mM，pH7.4）将重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白浓度稀释至50μg/ml，置-20℃以下保存。
实施例2、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪支原体肺炎抗原疫苗组合物的制备：
为了比较不同抗原含量疫苗组合物的免疫效果，制备疫苗组合物时共选择4种佐剂进行，分别为MontanideTM Gel（法国赛比克SEPPIC公司生产）、铝胶、白油、角鲨烯，每种佐剂分别制备猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪支原体肺炎抗原疫苗组合物及猪圆环病毒病、副猪嗜血杆菌病、猪支原体肺炎单苗，其中各单苗分别制备两种抗原含量梯度的疫苗，一种单苗的抗原含量与猪圆环病毒病、副猪嗜血杆菌病、猪支原体肺炎疫苗组合物（或称本发明的疫苗组合物或三联疫苗）中的相应抗原含量相同，另外一种单苗的抗原含量是本发明的疫苗组合物中的相应抗原含量的2倍。具体配制情况如下：
2.1使用Gel佐剂疫苗
配制方法:配方如表3。取实施例1制备的PCV2抗原、副猪嗜血杆菌抗原以及猪肺炎支原体抗原。将浓缩后的四种抗原液根据联苗及单苗中最终的抗原含量制备成混合抗原液或直接制备成抗原液，然后将抗原液与Gel 01佐剂（法国赛比克SEPPIC公司生产）按90:10（V/V）混合，用pH为7.2的PBS液补充体积以500转/分钟搅拌30分钟即可。
表3GEL 01佐剂疫苗的配方及含量（每头份以2ml疫苗计）
具体制备过程如下：
疫苗1和疫苗1’的制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原5ml、Mhp支原体HN0613株或Mhp支原体J株抗原5ml，副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各10ml，然后加入pH为7.2的PBS液60ml，最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
疫苗2和疫苗3的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2 SH抗原10ml或5，pH为7.2的PBS液80ml或85ml，最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
疫苗4和疫苗5的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活的副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各20ml或10，然后加入pH为7.2的PBS液50ml或70ml，最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
疫苗6、疫苗6’、疫苗7和疫苗7’的制备：在无菌烧杯中依次加 入实施例1制备灭活Mhp支原体HN0613株抗原或Mhp支原体J株抗原10ml或5ml，然后加入pH为7.2的PBS液80ml或85ml，最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml
2.2铝胶佐剂疫苗
配制方法:配方如表4。取实施例1制备浓缩后的四种抗原液，根据联苗及单苗中最终的抗原含量制备成混合抗原液或直接制备各抗原液，然后将抗原液铝胶佐剂（丹麦brenntag-biosector公司生产， ）按70:30（V/V）混合，以用PH为7.2的PBS液补充体积，500转/分钟搅拌120分钟即可。
表4铝胶佐剂疫苗的配方及含量（每头份以2ml疫苗计）
具体制备过程如下：
疫苗8的制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原5ml、Mhp支原体HN0613株抗原5ml，副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各10ml，然后加入pH为7.2的PBS液40ml,最后加入铝胶佐剂30ml，37℃，500转/分钟，搅拌120分钟，即得疫苗100ml。
疫苗9和疫苗10的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原10ml或5ml，pH为7.2的PBS液60ml或65ml，最后加入铝胶佐剂30ml，37℃，500转/分钟，搅拌120分钟，即得疫苗100ml。
疫苗11和疫苗12的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活的副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各20ml或10ml，然后加入pH为7.2的PBS液30ml或50ml，最后加入铝胶佐剂30ml，37℃，500转/分钟，搅拌120分钟，即得疫苗100ml。
疫苗13和疫苗14的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活Mhp支原体HN0613株抗原10ml或5ml，然后加入pH为7.2的PBS液60ml或65ml，最后加入铝胶佐剂30ml，37℃，500转/分钟，搅拌120分钟，即得疫苗100ml。
2.3矿物油佐剂疫苗
配制方法:配方如表5。取实施例1制备的抗原，将浓缩后的四种抗原液根据联苗及单苗中最终的抗原含量制备成混合抗原液或直接制备各抗原液，向抗原液中按4:96体积比的比例加入灭菌的吐温80，搅拌均匀后即为水相。按注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝1.5份的比例制备油相，取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热深化至半透明再与全量司本-80及注射白油混合均匀，116℃灭菌30分钟即为油相。按水相和油相2:3的比例进行乳化，乳化时以12000转/分钟乳化10分钟即可。
表5铝胶佐剂疫苗的配方及含量（每头份以2ml疫苗计）
具体制备过程如下：
疫苗15的制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原5ml、Mhp支原体HN0613株抗原5ml，副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各10ml，然后加入pH为7.2的PBS液6ml，最后加入4ml吐温80混匀即为40ml水相，另取一无菌烧杯，加入60ml上述制备的油相，将水相加入油相中进行乳化，乳化时以12000转/分钟乳化10分钟即得疫苗100ml。
疫苗16和疫苗17的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原10ml或5，pH为7.2的PBS液26ml或31ml，最后加入4ml吐温80混匀即为40ml水相，另取一无菌烧杯，加入60ml上述制备的油相，将水相加入油相中进行乳化，乳化时以12000转/分钟乳化10分钟即得疫苗100ml。
疫苗18和疫苗19的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活的副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各20ml或10，然后不加入pH为7.2的PBS液或加20ml，最后加入4ml吐温80混匀即为水相，另取一无菌烧杯，加入60ml上述制备的油相，将水相加入油相中进行乳化，乳化时以12000转/分钟乳化10分钟即得疫苗100ml。
疫苗20和疫苗21的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活Mhp支原体HN0613株抗原10ml或5ml，然后加入pH为7.2的PBS液26ml或31ml，最后加入4ml吐温80混匀即为40ml水相，另取一无菌烧杯，加入60ml上述制备的油相，将水相加入油相中进行乳化，乳化时以12000转/分钟乳化10分钟即得疫苗100ml。
2.4角鲨烯佐剂疫苗
配制方法:配方如表6取实施例1制备的抗原，将浓缩后的四种抗原液根据联苗（即疫苗组合物）及单苗中最终的抗原含量制备成混合抗原液或直接制备各抗原液，然后将抗原液与含角鲨烯的佐剂按50:50（V/V）混合，以500转/分钟搅拌10分钟即可。佐剂制备方法如下：将无菌PBS(pH7.2)与Tween80混匀为水相，在将Span85与角鲨烯混匀为油相，之后在不断搅拌5000rpm的条件下缓慢加入油相，水相与油相混匀后开启乳化机，乳化10min。在将乳化的精制混合物经均质机循环6次，过滤后保存于4℃备用。佐剂体系各种成份的比例为：Tween80 0.5％、Span85 0.5％、角鲨烯5％，pH 7.2PBS。
表6角鲨烯混合佐剂疫苗的配方及含量（每头份以2ml疫苗计）
具体制备过程如下：
疫苗22的制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原5ml、Mhp支原体HN0613株5ml，副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各10ml，然后加入pH为7.2的PBS液20ml，最后加入按上述方法制备的角鲨烯佐剂50ml，37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
疫苗23和疫苗24的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原10ml或5，pH为7.2的PBS液40ml或45ml，最后加入按上述方法制备的角鲨烯佐剂50ml，37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
疫苗25和疫苗26的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活的副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各20ml或10，然后加入pH为7.2的PBS液10ml或30ml，最后加入按上述方法制备的角鲨烯佐剂50ml，37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
疫苗26和疫苗27的制备：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备 灭活Mhp支原体HN0613株抗原10ml或5ml，然后加pH为7.2的PBS液40ml或45ml，最后加入按上述方法制备的角鲨烯佐剂50ml，37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
实施例3、猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原疫苗组合物及各单个抗原的疫苗组合物苗对猪的免疫效果对比试验
3.1试验用疫苗免疫仔猪
按实施例2所述方法制备的不同佐剂猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体的疫苗组合物（疫苗1、疫苗1’、疫苗8、疫苗15、疫苗22）和猪圆环病毒2型灭活疫苗（疫苗2、疫苗3、疫苗9、疫苗10、疫苗16、疫苗17、疫苗23、疫苗24）、猪副猪嗜血杆菌病灭活疫苗（疫苗4、疫苗5、疫苗11、疫苗12、疫苗18、疫苗19疫苗25、疫苗26）、猪支原体肺炎灭活疫苗（疫苗6、疫苗6’、疫苗7、疫苗7’、疫苗13、疫苗14、疫苗20、疫苗21、疫苗27、疫苗28），并经过无菌等检验合格后用于试验。
选14～21龄仔猪290头，共58组，5头/组。免疫组54组。每种佐剂本发明的三联疫苗组合物免疫4组20头仔猪，每种副猪嗜血杆菌病灭活疫苗免疫2组10头仔猪，每种PCV灭活疫苗免疫1组5头仔猪，每种猪支原体肺炎灭活疫苗免疫1组5头仔猪。对照组4组20头仔猪。具体免疫仔猪分组及免疫头数见表7；按分组每头猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗2ml，免疫后14d再次接种2ml；同时设置相同条件仔猪4组作为对照组。
表7疫苗组合物与单苗免疫分组
3.2仔猪免疫后攻毒
PCV攻毒：在首次免疫后35d，取各佐剂本发明的疫苗组合物免疫猪4组共20头、不同抗原含量猪圆环病毒型灭活疫苗免疫猪8组共40头，对照组仔猪1组5头，免疫组和对照组仔猪各用PCV2 SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻1ml/头、肌肉注射2ml/头，攻毒后第4、7日，分别在每头攻毒猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。
副猪嗜血杆菌4、5型攻毒：在首次免疫后35d，取各佐剂本发明的疫苗组合物免疫猪8组共40头、各佐剂不同抗原含量副猪嗜血杆菌病灭活疫苗免疫猪8组80头、对照组仔猪2组10头。各组免疫组和对照组仔猪分别用4型、5型菌株进行攻毒,每种菌株各免疫组和对照组攻5头，腹腔注射3ml，攻毒剂量为4型9.0×109CFU/头、5型6.0×109CFU/头，攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。
猪肺炎支原体攻毒：在首次免疫后70d，取各佐剂本发明的疫苗组合物免疫猪4组共20头、各佐剂不同抗原含量猪支原体肺炎灭活疫苗免疫猪8组40头、对照组仔猪5头，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，免疫组和对照组仔猪各1组（5头）用CVCC354株（购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株）气管注射5ml/头（100MID），攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分 析。
各试验组仔猪均在攻毒前称重，观察结束时称重，计算攻毒后至观察结束时的平均日增重。
3.3攻毒后结果
3.3.1PCV攻毒
PCV攻毒后，体温变化情况见表8，可见4种佐剂疫苗组合物（疫苗1（HN0613株）、疫苗1’（J株）、疫苗6、疫苗11、疫苗16、疫苗21）和单苗（疫苗2、疫苗9、疫苗16、疫苗23）的免疫猪只体温升高均为一过性升高，大多体温升高一天后很快恢复正常，无其它临床症状；单苗（疫苗3、疫苗10、疫苗17、疫苗24）的免疫猪只在攻毒后体温升高40.5℃以上1～4天，而攻毒对照组猪只攻毒后所有猪只体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。
表8PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较
表9PCV攻毒后各组试验动物发病判定结果
PCV攻毒后符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。
A.临床症状：仔猪体温升高（≥40℃），应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；
B.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄 或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；
C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。
表10免疫仔猪PCV攻毒后保护情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）
PCV攻毒后，体温变化、临床症状及PCR检测抗原情况及攻毒 保护情况见表8~表10。当联苗抗原含量是单苗抗原含量的1/2时，本发明的疫苗组合物和猪圆环病毒2型单苗（疫苗2、疫苗9、疫苗16、疫苗23）免疫的猪只PCV2攻毒后几乎无临床症状、无病理损伤且几乎未检测到PCV2抗原，免疫组有零星个别猪只表现出临床症状或病理变化或PCR检测到PCV抗原。仅疫苗2、疫苗9、疫苗16和疫苗23免疫猪只各有1头发现有肺部病变或淋巴结病变，疫苗16和疫苗23免疫猪只各有1头猪检测有PCV抗原，而非免疫攻毒对照组4/5以上猪只均有有临床症状、病理变化病理圆环病毒特征性的病理损伤（间质性肺炎、淋巴结淋巴细胞损伤和多核巨细胞的出现及单核巨噬细胞浸润等），且5/5猪只全部检测到PCV抗原。各疫苗免疫组PCV攻毒后达到4/5以上的保护效果，而非免疫攻毒组4/5以上发病。此外，本发明的疫苗组合物免疫猪、猪圆环单苗免疫猪平均日增重均显著的高于非免疫对照攻毒猪，本发明的疫苗组合物免疫猪和猪圆环单苗免疫猪平均日增生无显著差异。说明本发明的疫苗组合物中猪圆环病毒2抗原含量为单苗中猪圆环病毒2抗原含量的1/2的情况下，相同佐剂含猪圆环病毒2抗原的本发明的疫苗组合物与单苗所能达到免疫保护效果相当。
然而，本发明的疫苗组合物抗原含量与单苗（疫苗3、疫苗10、疫苗17、疫苗24）抗原含量相同时，单苗免疫猪攻毒后临床表现较明显，检测时病理变化、PCR检测率均明显高于本发明的疫苗组合物组，发病率达2/5~3/5，而本发明的疫苗组合物组免疫猪均未发病。表明抗原含量相同的情况下，本发明的疫苗组合物中PCV抗原的免疫保护效果明显优于PCV单苗保护效果。
以上结果表明，三种抗原混合后的本发明的疫苗组合物对PCV2的免疫效果有意想不到的增强作用。
3.3.2猪肺炎支原体攻毒
猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表11。结果表明，4种佐剂疫苗组合物（疫苗1（HN0613株）、疫苗1’（J株）、疫苗8、疫 苗15、疫苗23）免疫猪平均肺病变指数与相应佐剂抗原含量相同的猪支原体肺炎单苗（疫苗7（HN0613株）、疫苗7’（J株）、疫苗14、疫苗21、疫苗28）免疫猪平均肺病变指数相比，联苗和单苗组间存在显著差异，相同猪肺炎支原体抗原含量单苗免疫组仔猪肺病变明显，平均肺病变指数接近非免疫攻毒对照组。此外平均日增重也存在显著差异，本发明的疫苗组合物免疫猪只平均日增重均显著高于相同抗原含量的单苗组仔猪。表明猪肺炎支原体抗原含量相同的情况下，本发明的疫苗组合物免疫效明显优于单苗。
当本发明的疫苗组合物猪肺炎支原体抗原含量是4种佐剂猪支原体肺炎灭活疫苗（疫苗6（HN0613株）、疫苗6’（J株）、疫苗13、疫苗20、疫苗27）抗原含量的1/2时，本发明的疫苗组合物与单苗免疫猪平均肺病变指数差异不显著，平均日增重差异不明显。说明联苗组合物中含有1/2单苗的猪肺炎支原体抗原含量就能达到与单苗免疫相同的免疫效果。
猪肺炎支原体攻毒结果见表12。结果表明，本发明的疫苗组合物中猪肺炎支原体抗原含量是单苗（疫苗6（HN0613株）、疫苗6’（J株）、疫苗13、疫苗20、疫苗27）的1/2，对猪肺炎支原体的攻毒保护效果达类似，均达4/5~5/5的免疫保护效果；而单苗（疫苗7（HN0613株）、疫苗7’（J株）、疫苗14、疫苗21、疫苗28）猪肺炎支原体抗原含量与本发明的疫苗组合物相同，对猪肺炎支原体的攻毒保护效果较差，仅过2/5~3/5的保护效果。表明三种抗原混合增强了猪肺炎支原体的免疫保护效果。
表11猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）
表12猪肺炎支原体攻毒保护情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）
3.3.3副猪嗜血杆菌攻毒
副猪嗜血杆菌4、5型攻毒菌株攻毒后，试验结果如表13。结果表明当联苗中副猪嗜血杆菌抗原含量与单苗抗原含量相同时，本发明的疫苗组合物（疫苗1（HN0613株）、疫苗1’（J株）、疫苗8、疫苗15、疫苗22）对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护分别为4/5（80%）～5/5（100%），而4种佐剂副猪嗜血杆菌病单苗（疫苗5、疫苗12、疫苗19、疫苗26）的免疫攻毒保护效果对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护仅为2/5（40%）～3/5（60%），本发明的疫苗组合物仔猪平均日增重显著高于单苗免疫组仔猪。当抗原含量相同时，本发明的疫苗组合物的免疫效果明显优于单苗的免疫保护效果。
当联苗中抗原含量是单苗抗原含量的1/2时，本发明的疫苗组合物（疫苗1、疫苗1’、疫苗8、疫苗15、疫苗22）对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护分别为4/5（80%）～5/5（100%），与4种佐剂副猪嗜血杆菌病单苗（疫苗4、疫苗11、疫苗18、疫苗25）的免疫攻毒保护效果相当，平均日增重也无明显差异。表明三种抗原配制成 的本发明的疫苗组合物对副猪嗜血杆菌的免疫效果起到了增强的作用。
表13副猪嗜血杆菌攻毒后免疫仔猪保护情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）
实施例4：PCV2ORF2重组蛋白抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支 原体抗原的疫苗组合物免疫仔猪后攻毒保护效果比较对比试验
本项研究设计是为了比较猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物中PCV抗原使用重组蛋白亚单位抗原或全病毒抗原后的免疫保护效果。
1、含有PCV2 ORF2亚单位疫苗的配制
配制方法:配方如表14。取实施例1制备的PCV2抗原、PCV2ORF2蛋白、副猪嗜血杆菌抗原以及猪肺炎支原体抗原。将浓缩后的抗原液根据疫苗组合物及单苗中最终的抗原含量制备成混合抗原液或直接制备成抗原液，然后将抗原液与Gel 01佐剂（法国赛比克SEPPIC公司生产）按90:10（V/V）混合，用pH为7.2的PBS液补充体积以500转/分钟搅拌10分钟即可。
表14各试验疫苗的配方（每头份疫苗为2ml）
具体配制方法如下：
疫苗2、疫苗4、疫苗6为实施例配制的疫苗。
疫苗29制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备的PCV2 ORF2蛋白抗原2ml、Mhp支原体HN0613株5ml、副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各10ml，然后加入pH为7.2的PBS液63ml，最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
2、试验用疫苗免疫仔猪
将制备的疫苗组合物（疫苗29）和猪圆环病毒2型灭活疫苗（疫苗2）、猪副猪嗜血杆菌病灭活疫苗（疫苗4）、猪支原体肺炎灭活疫苗（疫苗6），并经过无菌等检验合格后用于试验。
选14～21龄仔猪60头，共12组，5头/组。免疫组8组。本发明的疫苗组合物免疫4组20头仔猪，副猪嗜血杆菌病灭活疫苗免疫2组10头仔猪，PCV灭活疫苗免疫1组5头仔猪，猪支原体肺炎灭活疫苗免疫1组5头仔猪。对照组4组20头仔猪。具体免疫仔猪分组及免疫头数见表14；单苗按分组每头猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗2ml，免疫后14d再次接种2ml，本发明的疫苗组合物仅在14日龄免疫一次，颈部肌肉注射2ml/头，同时设置相同条件仔猪4组作为对照组。免疫分组情况见表14。
表14本发明的疫苗组合物及单苗免疫分组
3、仔猪免疫后攻毒
PCV攻毒：在首次免疫后35d，取本发明的疫苗组合物免疫猪5 头、猪圆环病毒型灭活疫苗免疫猪5头，对照组仔猪1组5头，免疫组和对照组仔猪各用PCV2 SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻1ml/头、肌肉注射2ml/头，攻毒后第4、7日，分别在每头攻毒猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重、病理变化和病毒抗原检测结果进行判定。
副猪嗜血杆菌4、5型攻毒：在首次免疫后35d，取本发明的疫苗组合物免疫猪2组共10头、副猪嗜血杆菌病灭活疫苗免疫猪2组10头、对照组仔猪2组10头。各组免疫组和对照组仔猪分别用4型、5型菌株进行攻毒，腹腔注射3ml，攻毒剂量为4型9.0×109CFU/头、5型6.0×109CFU/头，攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。
猪肺炎支原体攻毒：在首次免疫后70d，取本发明的疫苗组合物免疫猪5头、疫苗6免疫猪5头、对照组仔猪5头，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，免疫组和对照组仔猪各1组（5头）用CVCC354株（购自中国兽医药品监察所）气管注射5ml/头（100MID），攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。
各试验组仔猪均在攻毒前称重，观察结束时称重，计算攻毒后至观察结束时的平均日增重。
4、仔猪攻毒后结果
4.1PCV攻毒
PCV攻毒后，体温变化情况见表16，可见含有PCV ORF2蛋白亚单位疫苗组合物（疫苗29）和单苗（疫苗2）的免疫猪只体温升高均为一过性升高，大多体温升高一天后很快恢复正常，无其它临床症 状；而攻毒对照组猪只攻毒后所有猪只体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。
表16PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较
表17PCV攻毒后各组试验动物发病判定结果
PCV攻毒后符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。
A.临床症状：仔猪体温升高（≥40℃），应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；
B.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；
C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。
表18免疫仔猪PCV攻毒后保护情况
PCV攻毒后，临床症状、病理变化及PCR检测抗原情况及攻毒保护情况见表17、表18。本发明的疫苗组合物（疫苗29）和猪圆环病毒2型单苗（疫苗2）免疫的猪只PCV2攻毒后几乎无临床症状、无病理损伤且几乎未检测到PCV2抗原，免疫组有零星个别猪只表现出临床症状或PCR检测到PCV抗原，本发明的疫苗组合物免疫猪有一头猪表现出临床症状，单苗中有一头猪抗原检测阳性，但联苗和单苗免疫猪均未发病。而非免疫攻毒对照组5/5猪只均有有临床症状、圆环病毒病特征性的病理损伤（间质性肺炎、淋巴结淋巴细胞损伤和多核巨细胞的出现及单核巨噬细胞浸润等），且5/5猪只全部检测到PCV抗原。本发明的疫苗组合物和单苗免疫组PCV攻毒后达到5/5的保护效果，而非免疫攻毒组5/5发病。此外，本发明的疫苗组合物和单苗免疫猪平均日增重均显著的高于非免疫对照攻毒猪，本发明的疫苗组合物免疫猪和猪圆环单苗免疫猪平均日增生无显著差异。说明本发明的疫苗组合物中猪圆环病毒2抗原为PCV ORF2蛋白时，免疫注射一次的免疫保护效果与全病毒PCV2型单苗的免疫保护效果相当。
4.2猪肺炎支原体攻毒
猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表19。结果表明，疫苗组合物（疫苗29）免疫猪平均肺病变指数与猪支原体肺炎单苗（疫苗6（HN0613株））免疫猪平均肺病变指数相比，两组间无显著差异，平均日增重也无显著差异。与疫苗组合物组、单苗组相比，对照组仔猪攻毒后平均肺病变指数显著高于本发明的疫苗组合物组和单苗组，平均日增生显著低于本发明的疫苗组合物组和单苗组。
攻毒保护结果见表20，本发明的疫苗组合物和单苗对猪肺炎支原体的攻毒保护效果达类似，达4/5~5/5的免疫保护效果；而对照组仔猪5/5发病。表明本发明的疫苗组合物中PCV抗原为ORF2蛋白时，免疫一次对猪肺炎支原体的保护效果与全病毒猪支原体肺炎单苗的免疫保护效果相当。
表19猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）
表20猪肺炎支原体攻毒保护情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）
4.3副猪嗜血杆菌攻毒
副猪嗜血杆菌4、5型攻毒菌株攻毒后，试验结果如表21。结果表明本发明的疫苗组合物（疫苗29）和单苗（疫苗4）对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护达4/5（80%）～5/5（100%），联苗和单苗免疫攻毒保护效果相当，平均日增重也无明显差异。表明本发明的疫苗组合物中PCV抗原为ORF2蛋白时，免疫一次对副猪嗜血杆菌的保护效果与常规副猪嗜血杆菌病单苗的免疫保护效果相当。
表21副猪嗜血杆菌攻毒后免疫仔猪保护情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）
通过实施例1、2、3的试验说明，4种佐剂本发明的疫苗组合物中猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌抗原含量为各相应佐剂单苗的1/2时，攻毒结果显示4种佐剂配制的本发明的疫苗组合物与各相应佐剂单苗保护效果相当，攻毒后各免疫组间仔猪平均日增重相近，无明显差异，与非免疫攻毒组差异显著。而当各单苗抗原含量与本发明的疫苗组合物中相应抗原含量相同时，本发明的疫苗组合物对猪圆环病毒病、猪支原体肺炎、副猪嗜血杆菌病的免疫保护效果均明显优于各单苗的免疫保护效果。以上实施例结果表明本发明的疫苗组合物中各抗原混合制备成疫苗时，各抗原间有明显的免疫增强效果。实施例4的结果说明，本发明中本发明的疫苗组合物的PCV2抗原为PCV2ORF2蛋白时，只需免疫一次，其免疫保护效果与常规猪圆环病毒病灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病灭活疫苗、猪支原体肺炎灭活疫苗免疫保护效果相当。实施例1～4结果说明本发明的疫苗组合物中的PCV2抗原可选择全病毒抗原或PCV2 ORF2蛋白。
本发明能达到一针防这三病的效果，且在疫苗制备过程中由于抗原含量的减少而使得生产成本大大降低。针对猪圆环病毒病、副猪嗜血杆菌病和猪支原体肺炎混合感染的预防和控制，本发明有明显的技术优势和而且使用方便、成本低廉，具有商业上成功的基础
实施例5：不同抗原含量疫苗组合物的制备
抗原不同猪支原体肺炎HN0613株抗原、猪圆环病毒抗原、猪副猪嗜血杆菌抗原灭活疫苗组合物（即三联苗）如表22，其制备方法和过程同实施例2所述疫苗1的制备方法。
表22其它抗原含量的本发明疫苗组合物的配方及含量（每头份以2ml计）
三联苗A制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原3ml、Mhp支原体HN0613株0.5ml，副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各5ml，然后加入pH为7.2的PBS液76.5ml,最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
三联苗B制备过程：配制此疫苗时需先将实施例1制备的猪圆环病毒液在次进行浓缩，浓缩20倍；实施例1制备的副猪嗜血杆菌抗原菌液在次进行浓缩，浓缩5倍，实施例1制备的猪肺炎支原体抗原菌液在次进行浓缩，浓缩2倍。按在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原50ml、Mhp支原体HN0613株25ml，副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各8ml，然后加入pH为7.2的PBS液7ml，最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
三联苗C制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备的PCV2ORF2蛋白抗原5ml、Mhp支原体HN0613株0.5ml、副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各5ml，然后加入pH为7.2的PBS液74.5ml，最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
三联苗D制备过程：配制此疫苗时实施例1制备的副猪嗜血杆菌抗原菌液在次进行浓缩，浓缩5倍；实施例1制备的猪肺炎支原体抗原菌液在次进行浓缩，浓缩2倍。在无菌烧杯中依次加入实施例1制备的PCV2ORF2蛋白抗原20ml、Mhp支原体HN0613株25ml、副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各8ml，然后加入pH为7.2的PBS液29ml，最后加入Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。
实施例6含猪支原体肺炎HN0613株抗原、猪圆环病毒抗原、猪副猪嗜血杆菌抗原三联灭活疫苗组合物的对猪圆环病毒的免疫效果试验。
6.1试验用疫苗免疫仔猪
按实施例5所述方法制备的猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎、猪副猪嗜血杆菌病的三联灭活疫苗（表22中疫苗A、疫苗B、疫苗C、疫苗D）并经过无菌等检验合格后用于试验。
选14～21日龄仔猪35头，共8组，5头/组。免疫组分为4组，分别免疫疫苗A、疫苗B、疫苗C和疫苗D，余下1组5头作为对照组（表24）每头猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗2ml；对照组不免疫，健康对照组不免疫不攻毒。
6.2仔猪免疫后攻毒
PCV攻毒：在首次免疫后35d，取本发明的疫苗组合物A、B、C、D免疫猪各5头，对照组仔猪5头，免疫组和对照组仔猪各用PCV2 SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻1ml/头、肌肉注射2ml/头，攻毒后第4、7日，分别在每头攻毒猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml）， 每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重、病理变化和病毒抗原检测结果进行判定。
6.3攻毒后结果
4.1PCV攻毒
PCV攻毒后，体温变化情况见表23，可见各疫苗免疫猪只体温升高均为一过性升高，大多体温升高一天后很快恢复正常，无其它临床症状；而攻毒对照组猪只攻毒后所有猪只体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。
表23PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较
表24PCV攻毒后各组试验动物发病判定结果
PCV攻毒后符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。
A.临床症状：仔猪体温升高（≥40℃），应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；
B.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；
C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。
表25免疫仔猪PCV攻毒后保护情况
PCV攻毒后，临床症状、病理变化及PCR检测抗原情况及攻毒保护情况见表24、表25。本发明的疫苗组合物A、B、C、D免疫的猪只PCV2攻毒后几乎无临床症状、无病理损伤且几乎未检测到PCV2抗原，免疫组有零星个别猪只表现出临床症状或PCR检测到PCV抗原，但免疫猪均未发病。而非免疫攻毒对照组5/5猪只均有有临床症状、圆环病毒病特征性的病理损伤（间质性肺炎、淋巴结淋巴细胞损伤和多核巨细胞的出现及单核巨噬细胞浸润等），且5/5猪只全部检测到PCV抗原。本发明的疫苗组合物A、B、C、D免疫组PCV攻毒后达到5/5的保护效果，而非免疫攻毒组5/5发病。此外，本发明的 疫苗组合物猪平均日增重均显著的高于非免疫对照攻毒猪，疫苗组合物免疫组间平均日增生无显著差异。说明本发明的疫苗组合物在抗原含量范围内均有良好的免疫保护效果。
实施例7、猪肺炎支原体HN0613株的分离鉴定
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1病料来源2006年从河南省各地采集疑似猪支原体肺炎病变肺脏，共16份。
1.1.2培养基猪肺炎支原体Friis培养基购自BD公司；猪血清购自GIBCO公司；酚红指示剂购自美国AMRESCO公司。
1.1.3生化试剂化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，狄氏染色试剂盒购自于重庆庞通医疗器械有限公司。生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.4阴、阳性血清兔抗猪肺炎支原体J株特异性血清，按参考文献方法制备（Meens,J.,Selke,M.,Gerlach,G.F.,2006.Identification and immunological characterization of conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 and Mhp651.Vet.Microbiol.116:85–95.）。未免兔血清作为阴性血清。
1.2方法
1.2.1病料处理
取疑似支原体肺炎病变肺脏，在超净台内用无菌手术剪刀剪取发病部位边缘组织，放入无菌平皿，将病肺组织剪成1-2mm3碎块，接种Friis肉汤，37℃培养，每日观察培养液的pH值变化。培养液变色时，取第一代经0.45μm过滤器过滤的培养物0.5ml接种到1.5ml含青霉素2000U/ml的Frris肉汤培养基中，37℃继续培养，培养基变黄后直接取培养物进行移植传代，如培养物变色，进行涂片，分别进行革 兰氏染色和瑞氏染色，镜检。如革兰氏染色未发现细菌，同时瑞氏染色发现支原体样菌体时，取0.2m1培养物涂布于Frris平板固体培养基表面，置37℃，5%CO2条件下培养，每日观察是否有支原体样菌落。取支原体样单个菌落接种于Friis肉汤，培养基颜色变黄后取0.2m1培养物涂布于Frris平板固体培养基表面置37℃，5%CO2条件下进行纯化培养，如此进行纯化培养2次。将最后一次纯化培养生长的支原体样菌落接种Frris液体培养基所得的颜色变黄培养物保存于-70℃备用。
1.2.2菌落狄氏染色
按参考文献进行（曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社.1992.49~50，126~129，371~373.），采用无菌方法从固体培养基上切下菌落，放到载玻片上，在两边垫上竹签，滴上狄氏染色液后再盖上一块玻片，置于4℃染色30min后低倍镜下观察结果。
1.2.3PCR鉴定及测序分析
用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA模板。PCR引物参考文献进行合成（J.Caron,M.Ouardani,and S.Dea.Diagnosis and Differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplification of the p36 and p46Genes[J].Journal of clinical microbiology,2000,38(4):1390~1396）。FSp36，5’-GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3’Rsp36，5’-GCCGCGAAATTAAATATTTTTAATTGCATCCTG-3’，上海生工合成。PCR反应体系：超纯水34.5μl、10×PCR Buffer 5μl、dNTP 4μl、引物各2μl、模板2μl、TaqDNA聚合酶0.5μl。按下列参数进行PCR反应:预变性94℃3min；94℃ 30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后；72℃终延伸10min。扩增结束后取上述产物琼脂糖凝胶电泳检测。直接将有特异性条带的PCR产物及引物提交至上海生工进行测序分析。
1.2.4生化试验：
生化试验参考文献进行（曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社.1992.49~50，126~129，371~373.）。主要进行洋地黄皂甙敏感性试验、尿素酶试验、葡萄糖分解试验、精氨酸水解试验、三苯基氯化四氮唑(TTC)还原试验、七叶甙水解试验、甘露醇分解试验、薄膜和斑点形成试验。
1.2.5生长抑制试验（GIT）
Friis平板接种0.1ml对数生长期的猪肺炎支原体培养物，将未稀释的抗血清25μl吸附于灭菌的6mm滤纸片，将吸有血清的滤纸片贴附于平板表面，培养至菌落可见。正常兔血清处理的纸片作为阴性对照。培养观察圆纸片周围有无菌落抑制环的产生。抑制宽度达2mm以上时判为猪肺炎支原体阳性。
1.2.6分离菌株的致病性
将分离菌株培养物经气管注射1～2周龄健康易感猪3头，每头5ml(HN0613，108CCU/ml)。另设3头条件相同的对照猪，各气管注射培养基5ml，作为对照。试验猪、对照猪隔离饲养。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。观察28日，每日测体温。注射28日后剖检，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。试验组与对照组进行肺病变指数差异分析。对试验猪及对照猪按1.2.4进行猪肺炎支原体的分离，对分离株按1.2.3方法进行PCR鉴定。
2.结果
2.1培养结果
16份病料中仅有1份病料接种的培养基7日后变黄色，过滤接种后5日培养液变黄，培养液均匀混浊，转接于含青霉素的Friis培养基变色后，革兰氏染色未发现细菌，瑞氏染色发现支原体样菌体。转接于固体培养基后，菌落生长入培养基内部。菌落呈典型煎荷包蛋状，与支原体菌落形态相符，命名为HN0613株猪肺炎支原体。
2.2狄氏染色结果
在低倍镜下观察到，在Friis固体培养基的猪肺炎支原体的菌落 被染成不褪色的中心深蓝色菌落(参见附图1)，与支原体菌落染色特性相符。
2.3PCR鉴定
所提取的分离培养物模板经PCR扩增后，再经琼脂糖凝胶电泳检测，待检病料或培养物均在750bp~1000bp之间接近1000bp的位置有一条带，与预期948bp相符(参见附图2，其中1.Marker DL 2000;2.病料分离株HN0613;3.致病性试验分离株;4.阴性对照)。
2.4序列测定与分析
将所分离菌株PCR扩增产物测序与GenBank中进行blast比较。结果显示，HN0613分离菌株P36基因序列与NCBI中公布的Mhp P36基因序列相应序列同源性为98%以上。测序结果见SEQ No.3。
2.5生化及血清学鉴定
分离菌株生化反应与猪肺炎支原体生化特性相符(表26)。
表26HN0613分离株生化及生长抑制试验结果表
注:+阳性，-阴性；洋地黄皂苷敏感试验出现1mm以上抑制带者为支原体；TTC还原试验猪肺炎支原体阴性，猪鼻支原体阳性；生长抑制试验抑制宽度达2mm以上时判为猪肺炎支原体（曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社.1992.49~50，126~129，371~373.）。
2.6分离菌株的致病性试验
将菌株培养物经气管内注射10日龄健康易感猪(IHA抗体<1:5)，10日后均相继出现咳嗽和气喘等猪支原体肺炎症状。28日后剖检可见轻度肺病变，病变指数在9～15之间。而对照组均未出现上述症状及病变，剖检猪肺部未见异常。临床观察和肺部病变结果见表27。
表27HN0613分离株对仔猪感染情况
注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）。
对试验组3头猪进行猪肺炎支原体分离，对其变色液体培养物按1.2.3步骤进行PCR检测，结果在略小于1000bp处出现特异性条带(见图1泳道3)，目的条带大小为948bp，证明分离病原为猪肺炎支原体。
3结论
从猪支原体肺炎典型病例的病肺中分离到了疑似猪肺炎支原体的微生物，经各项鉴定具有猪肺炎支原体的特性，生长抑制试验、PCR及测序鉴定结果表明该微生物属于猪肺炎支原体，命名为猪肺炎支原体HN0613株。猪肺炎支原体HN0613在Friis培养基中培养含量可达108~109CCU，对健康易感猪具有一定的毒力，可致其产生运动后咳嗽、气喘、呼吸困难等支原体肺炎典型的临床症状及肺部肉变。
实施例8：副猪嗜血杆菌的鉴定
（1）PCR鉴定
将备检JS株菌液ZJ株菌液和10，000r/min离心5min，弃上清液用无菌水悬浮或将分离纯化的菌株用接种环刮取2个菌落洗脱于含100μl无菌水的离心管中，涡旋，于沸水中水浴10min后，再放置－20℃冻结。冻融后10，000r/min离心5min，取上清液作模板。
参照文献（Oliveira S,Galina L，Pijoan C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections.Vet Diagn Invest.一种用于诊断副猪嗜血杆菌感染的PCR方法建立）由英潍捷基（上海）贸易有限公 司合成，序列分别为上游引物：5’－GGC TTC GTC ACC CTC TGT－3’；下游引物：5’－GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT－3’。该引物扩增片段为编码16S rRNA的DNA片段，长度约为822bp。
反应体系（25μl)∶10×PCR Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl2 1.5μl，2.5m mol/L dNTPs 2.0μl，10μmol/L上游和下游引物各0.8μl，5U/μl Ex－Taq 0.1μl，无菌水15.3μl，模板2μl。
反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，共30个循环，最后72℃延伸l0min。扩增后的PCR样品于1.0%琼脂糖凝胶电泳。凝胶用GelRed染色，紫外线透射观察分析。副猪嗜血杆菌标准菌株购自华中农业大学，根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物经PCR扩增的产物为822bp大小的片段。产物经琼脂糖凝胶电泳证实其大小均与阳性对照一致。
（2）血清型鉴定
参照Kielstein-Rapp-Gabrielson（KRG）（KIELSTEIN P,RAPP-GABR IELSON V J,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Apr.1992,30:862-865）中的方法，4型和5型副猪嗜血杆菌标准抗原及标准阳性血清购自武汉科前动物生物制品有限公司，结果JS株为血清4型，ZJ株为血清5型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换例如换用其它基因相似的毒株或者两种商业化的疫苗临用前稀释合并等以及其它改进等，均应包含在本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌以及猪肺炎支原体感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含：猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原；其中，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的猪圆环病毒2型SH株，其含量为灭活前3×105.0～108.0TCID50/头份；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株和血清5型ZJ株，所述灭活的副猪嗜血杆菌4型JS株含量为灭活前5×108～4×109CFU/头份，副猪嗜血杆菌5型ZJ株含量为灭活前5×108～4×109CFU/头份；所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株，所述灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原含量为灭活前107～109CCU/头份，其中，所述疫苗组合物还包括佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述灭活的猪圆环病毒2型含量为灭活前5×105.0TCID50/头份；所述灭活的副猪嗜血杆菌4型含量为灭活前1×109CFU/头份，副猪嗜血杆菌5型含量为1×109CFU/头份；所述灭活的猪肺炎支原体含量为灭活前1×108CCU/头份。
3.一种预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌以及猪肺炎支原体感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含：猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原；其中，所述的猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型SH株ORF2蛋白，所述猪圆环病毒2型SH株ORF2蛋白含量为5-20μg/头份疫苗；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株和血清5型ZJ株，所述灭活的副猪嗜血杆菌4型JS株含量为灭活前5×108～4×109CFU/头份，副猪嗜血杆菌5型ZJ株含量为灭活前5×108～4×109CFU/头份；所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株，所述灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原含量为灭活前107～109CCU/头份，其中，所述疫苗组合物还包括佐剂。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物还包括疫苗佐剂，其中所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel 01、蜂胶、ISA206、ISA760VG的一种或任意几种的组合。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述的疫苗组合物中，相对于疫苗组合物的总重量，疫苗佐剂的用量为5％～20％重量，抗原成份的用量为80％～95％重量。
6.一种预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌以及猪肺炎支原体感染的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将猪圆环病毒2型SH株病毒液、副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌液、猪肺炎支原体HN0613株菌液浓缩、灭活处理并混合，然后将混合液与疫苗佐剂搅拌，即获得疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的，其含量为灭活前3×105.0～108.0TCID50/头份；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型，所述灭活的副猪嗜血杆菌4型含量为灭活前5×108～4×109CFU/头份，副猪嗜血杆菌5型含量为灭活前5×108～4×109CFU/头份；以及所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体，所述灭活的猪肺炎支原体抗原含量为灭活前107～109CCU/头份。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型病毒液浓缩、灭活后至含量为灭活前5×105.0TCID50/头份，所述的副猪嗜血杆菌4型菌液浓缩、灭活后至含量为灭活前1×109CFU/头份，所述的副猪嗜血杆菌5型菌液浓缩、灭活后至含量为灭活前1×109CFU/头份，所述的猪肺炎支原体菌液浓缩、灭活后至含量为灭活前1×108CCU/头份。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210221969.2A CN103083655B (zh) | 2011-11-02 | 2012-06-29 | 预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110344797.3 | 2011-11-02 | ||
| CN201110344797 | 2011-11-02 | ||
| CN2011103447973 | 2011-11-02 | ||
| CN201210221969.2A CN103083655B (zh) | 2011-11-02 | 2012-06-29 | 预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103083655A CN103083655A (zh) | 2013-05-08 |
| CN103083655B true CN103083655B (zh) | 2015-08-26 |
Family
ID=48197130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210221969.2A Active CN103083655B (zh) | 2011-11-02 | 2012-06-29 | 预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103083655B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103409374A (zh) * | 2013-07-23 | 2013-11-27 | 武汉科前动物生物制品有限责任公司 | 猪圆环病毒病、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病三联灭活疫苗及制备方法和应用 |
| CN104248755A (zh) * | 2013-10-30 | 2014-12-31 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种副猪嗜血杆菌病疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN104248760B (zh) * | 2013-12-16 | 2021-07-23 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN105214082A (zh) * | 2014-07-04 | 2016-01-06 | 乾元浩生物股份有限公司 | 鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗及其制备方法 |
| CN107513506B (zh) * | 2016-06-17 | 2021-11-09 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用 |
| CN109022368B (zh) * | 2017-06-09 | 2022-05-24 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪圆环病毒2型毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN109010814B (zh) * | 2018-08-31 | 2021-11-16 | 武汉科前生物股份有限公司 | 副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产方法 |
| CN110812474A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-02-21 | 山东滨州沃华生物工程有限公司 | 猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法 |
| CN112386685A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-02-23 | 北京科牧丰生物制药有限公司 | 一种pcv2型杆状病毒、猪肺炎支原体、猪流感病毒、副猪嗜血杆菌四联灭活疫苗 |
| CN112294953A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-02-02 | 北京科牧丰生物制药有限公司 | 一种pcv2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及制备方法 |
| CN113730563A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-12-03 | 龙岩学院 | 一种副猪嗜血杆菌佐剂疫苗及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1942204A (zh) * | 2004-04-26 | 2007-04-04 | 株式会社中央疫苗研究所 | 用于猪呼吸病的灭活混合疫苗及其制备方法 |
| CN101389350A (zh) * | 2005-12-29 | 2009-03-18 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 多价pcv2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法 |
| KR20100005453A (ko) * | 2008-07-07 | 2010-01-15 | 주식회사 중앙백신연구소 | 돼지 써코바이러스 관련 질환을 예방하기 위한 ｐｃｖ-2의전체 바이러스를 포함하는 혼합백신 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2225367A1 (en) * | 2007-12-21 | 2010-09-08 | Wyeth LLC | Methods and compositions for immunizing pigs against porcine circovirus |
-
2012
- 2012-06-29 CN CN201210221969.2A patent/CN103083655B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1942204A (zh) * | 2004-04-26 | 2007-04-04 | 株式会社中央疫苗研究所 | 用于猪呼吸病的灭活混合疫苗及其制备方法 |
| CN101389350A (zh) * | 2005-12-29 | 2009-03-18 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 多价pcv2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法 |
| KR20100005453A (ko) * | 2008-07-07 | 2010-01-15 | 주식회사 중앙백신연구소 | 돼지 써코바이러스 관련 질환을 예방하기 위한 ｐｃｖ-2의전체 바이러스를 포함하는 혼합백신 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103083655A (zh) | 2013-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103083655B (zh) | 预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物及其制备方法 | |
| CN103031258B (zh) | 新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物 | |
| CN102988978B (zh) | 含有猪圆环病毒2型抗原与副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物及其制备方法与应用 | |
| CN101240264A (zh) | 猪圆环病毒2型灭活疫苗 | |
| CN102399724B (zh) | 一种副猪嗜血杆菌lc株及其应用 | |
| CN104450559B (zh) | 新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物 | |
| CN107513506A (zh) | 猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用 | |
| CN102352347A (zh) | Pcv2重组杆状病毒构建及其亚单位疫苗制备方法 | |
| CN106929451A (zh) | 一株猪链球菌及其应用 | |
| CN102851249A (zh) | 一种副猪嗜血杆菌lz-20100109株及其应用 | |
| CN103908665B (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN103602637B (zh) | 猪支原体肺炎疫苗株 | |
| CN103127497B (zh) | 猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN109745555B (zh) | 一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗及其应用 | |
| CN106190988B (zh) | 猫嵌杯病毒ch-jl5株灭活疫苗 | |
| CN104611274A (zh) | 一种副猪嗜血杆菌及其应用 | |
| CN104250636A (zh) | 一种猪圆环病毒的培养方法及其应用 | |
| CN103656634B (zh) | 抗猪圆环病毒和猪传染性胸膜肺炎感染疫苗组合物及制备 | |
| CN104288762B (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN103920146A (zh) | 猪圆环病毒ⅱ型与猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN106929480A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用 | |
| CN110075289A (zh) | 一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌与胸膜肺炎放线杆菌三联灭活疫苗及其应用 | |
| CN103623400B (zh) | 抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及制备方法 | |
| CN101829321A (zh) | 一种预防黄颡鱼红头病的疫苗 | |
| CN103409374A (zh) | 猪圆环病毒病、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病三联灭活疫苗及制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |