CN104611274A

CN104611274A - 一种副猪嗜血杆菌及其应用

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Publication number: CN104611274A
Application number: CN201510073545.XA
Authority: CN
Inventors: 单虎; 段笑笑; 秦志华; 张洪亮; 宋杰; 韩先杰
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-05-13

Abstract

本发明的目的是提供一种副猪嗜血杆菌及其应用，本发明的副猪嗜血杆菌的保藏编号为CGMCC No.10230。所述的副猪嗜血杆菌用于制备治疗猪副猪嗜血杆菌病的药物。本发明的副猪嗜血杆菌血清5型疫苗株LX-5具有稳定的生物学特性，对仔猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性，应用其制备的蜂胶灭活疫苗安全可靠，能够产生较高水平的抗体，持续期长，并且对同源菌种攻毒的猪具有非常好的保护效果，免疫后猪群的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果达到或优于市场上现有的商品化疫苗，能够有效的预防副猪嗜血杆菌病的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

Description

一种副猪嗜血杆菌及其应用

技术领域

本发明属于兽医生物制品制备技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌及其应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuas,简称HPs)是一种条件性致病菌，又称革拉瑟氏菌病(Glasser’s disease)，是猪群上呼吸道的一种常在菌，属于巴氏杆菌科，嗜血杆菌属，在特定条件下可以侵入机体并导致严重的全身性疾病,如多发性浆膜炎和关节炎，以发热、咳嗽、消瘦、呼吸困难、跛行、共济失调和被毛粗乱等主要临床症状。该病只感染猪，从2周龄到4月龄的猪均易感，通常见于5～8周龄的猪，主要在断奶后和保育阶段发病。本病是Glasser于1910年首次描述了浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎以及脑膜炎患猪的浆液性分泌物中存在的一种革兰氏阴性杆菌，1922年由Schermer和Ehrlich首次分离到该菌，直到1992年才通过SPF(Specific Pathogen Free，无特定病原体)猪证实了副猪嗜血杆菌的致病性以及不同血清型菌株之间的毒力差异。通常情况下，在正常猪的鼻腔、扁桃体中可分离到该菌，但不引起猪发病。一些导致机体抵抗力下降的因素，如应激、恶劣环境及其他病原感染会造成副猪嗜血杆菌病的暴发和流行。临床实践表明，当猪群感染猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)后，容易继发感染副猪嗜血杆菌。目前，该病在集约化猪场内发病率呈明显上升趋势，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％，主要引起哺乳和断奶仔猪死亡率升高、生长发育不良、饲料利用率降低，给养猪业造成严重的经济损失。

副猪嗜血杆菌对营养要求苛刻，生长严格需要V因子(NAD，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，不需要X因子(血红素和其他卟啉类物质)。该菌在添加有胎牛血清和NAD的TSA固体培养基上培养24h可见针尖大小灰白色菌落，呈表面光滑湿润、边缘整齐、中间隆起、针尖大小的圆形菌落。该菌在巧克力琼脂平板上生长困难，据报道也不适合于体外传代培养。液体培养时需要在肉汤或TSB培养基中添加NAD和胎牛血清。由于葡萄球菌生长过程中会将自身代谢产物V因子释放到培养基中，所以两菌共培养时，随着与金黄色葡萄球菌距离增加，菌落逐渐变小，该现象被称为卫星现象。细菌分离鉴定时应采集处于疾病急性期的猪并没有应用抗生素的病料，最好选择心脏血液及浆膜表面物质或渗出的脑脊髓液，以减少杂菌的污染并能增加分离到致病菌的机会。

HPs感染的大多数流行病学研究是根据血清学分型，传统的血清学分型方法是根据热稳定可溶性抗原和琼脂扩散试验(GD)，已有15种血清型得到证实，另有20％以上的分离株血清型不可定型，各血清型菌株之间的致病力有极大的差异，其中血清1、5、10、12、13、14型毒力最强，其次是血清2、4、8、15型，血清3、6、7、9、11型的毒力较弱，并且副猪嗜血杆菌还具有明显的地方性特征，相同血清型的不同地方分离株可能毒力不同。虽然有研究表明相同血清型的不同菌株可能没有交叉保护，但血清分型信息依然可以用于对交叉保护的预测。HPs最近已成为猪场保育猪死亡的主要原因之一，导致HPs流行加强的因素仍不清楚。研究表明，抗生素预防或口服药物治疗对严重的HPs暴发可能无效，一旦临床症状出现，应对整个主群进行药物治疗，而将HPs彻底清除以控制该病发生的措施并不可取，因为1周龄前的仔猪鼻黏膜就可能有HPs的定居，因此通过早期断奶来根除该病不可能取得成功。因此研究针对本地区流行的广谱疫苗，是防治副猪嗜血杆菌需要深入研究的重要问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种副猪嗜血杆菌及其应用，即从山东青岛莱西分离的副猪嗜血杆菌血清5型疫苗株LX-5，从而解决副猪嗜血杆菌商品化疫苗各个血清型之间免疫交叉保护力低、免疫原性不强、相同血清型不同地域间免疫交叉保护力低的问题。

本发明的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis)，菌株号为LX-5，已保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年12月19日，保藏编号为CGMCC No.10230。

所述的副猪嗜血杆菌用于制备治疗猪副猪嗜血杆菌病的药物。

其中，所述的药物为疫苗，优选为灭活疫苗，其使用的佐剂优选为蜂胶。

该猪嗜血杆菌与药学上可接受的载体或辅料组合构成药物，如单价苗、多价苗或联苗等。

所述副猪嗜血杆菌在药物中含菌量优选为4×10⁹CFU/mL以上。

本发明的副猪嗜血杆菌血清5型疫苗株LX-5具有稳定的生物学特性，对仔猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性，应用其制备的蜂胶灭活疫苗安全可靠，能够产生较高水平的抗体，持续期长，并且对同源菌种攻毒的猪具有非常好的保护效果，免疫后猪群的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果达到或优于市场上现有的商品化疫苗，能够有效的预防副猪嗜血杆菌病的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。

实施例1：副猪嗜血杆菌血清5型疫苗株LX-5的分离纯化和鉴定。

1.生产用培养基

TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末4g，溶于100mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至50～60℃时，加入5％无支原体胎牛血清和0.005％NAD，混合均匀后倒板，放4℃冰箱保存备用。

TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末3g，溶于100mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至50～60℃时，加入5％无支原体胎牛血清和0.005％NAD，混合均匀后放4℃冰箱保存备用。

2.副猪嗜血杆菌的分离纯化及鉴定

2.1 分离纯化

该菌株是发明人于2012年8月在青岛农业大学山东省重点预防兽医实验室分离来自青岛莱西病猪的肝脏、肺脏、关节液等部位，具有较强的毒力和很高的免疫原性。

2012年8月，分离的病料由青岛农业大学山东省重点预防兽医实验室提供，其具有典型浆膜炎、腹膜炎、心包炎等症状，无菌采集肝脏、肺脏、关节液，接种于TSA平板，放于37℃、5％CO₂培养箱中培养24～48h，并进行连续纯化培养，挑取无色光滑透明、边缘整齐、中间隆起、针尖大小的单菌落，与生理盐水混匀后，进行革兰氏染色，镜下可见红色革兰氏阴性小杆菌。同时接种鲜血琼脂培养基和普通琼脂固体培养基，结果，在添加有胎牛血清和NAD的TSA平板上生长良好，鲜血琼脂固体培养基和普通琼脂固体培养基没有菌落生成。

2.2 生化鉴定

在超净工作台中，用接种环挑取针尖大小、光滑透明的单菌落接种于TSB液体培养基中，180r/min振荡培养12～16h，吸取菌液依次加入到以下含NAD的生化鉴定管中，37℃恒温箱中培养，结果为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、接触酶、硝酸盐还原阳性，乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、氧化酶、吲哚、尿素酶阴性，均与HPs标准菌株的特征相符合。

将纯培养的菌落在脱纤绵羊鲜血琼脂固体培养基上与金黄色葡萄球菌做垂直交叉划线，放37℃、5％CO₂条件下培养24～48h，呈小而透明的菌落，并且越靠近葡萄球菌附近生长越好，呈现出典型的卫星生长现象，而且菌落周围不出现溶血现象。

2.3 16S rRNA基因序列测定与分析

2.3.1 引物设计设计出下列引物：上游引物5'-GTG ATG AGG AAG GGTGGT GT-3'，下游引物5'-GGC TTC GTC ACC CTC TGTA-3'，该引物扩增编码16SrRNA长度约为822bp的特异片段，引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

2.3.2 细菌DNA模板的制备菌液直接煮沸法：取经镜检无杂菌污染的HPS菌液1mL，于10000rpm离心5min，将上清倒掉，沉淀用双蒸水溶解，100℃煮沸15min，12000rpm离心5min，收集上清，-20℃保存备用。菌落直接PCR：将HPS菌落直接加入PCR反应管中，预变性温度为97℃，时间7min。

2.3.3 PCR扩增将细菌DNA模板2μL、10×Buffer 2.5μL、双蒸水16.5μL、dNTP 2.0μL、上下游引物各1μL、rTaq酶0.4μL混合，总体积共25μL，94℃预变性5min(菌落为97℃预变性7min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，循环30次，最后72℃终延伸10min。PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳，可观察到约822bp大小的特异DNA条带。

2.3.4 PCR产物序列分析将PCR产物、PCR引物直接送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序分析。通过与NCBI Blast比较，该分离株序列与已发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA序列同源性最高分别为99％，证明分离株均为副猪嗜血杆菌。

2.4 HPs LX-5株的血清学鉴定将LX-5株密集划线接种于TSA培养基，37℃培养24h后，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗下菌落，将悬液稀释至含菌量为4×10⁹CFU/mL，121℃高压2h，菌液7000rpm离心10min，取上清于琼脂扩散试验的分型抗原。用生理盐水配制1％的琼脂糖凝胶，根据需要在相应的琼脂糖凝胶孔中加抗原和相应的抗血清，以加满孔为宜，放湿盒内37℃24～48h，可见LX-5株于5型血清孔与抗原孔之间出现清晰的白色沉淀先，故判定副猪嗜血杆菌LX-5株为血清5型。

3 仔猪攻毒试验

3.1 副猪嗜血杆菌的菌液制备从实验室分离保存的菌液中，用接种环挑取一环接种到TSA固体培养基中，37℃温箱中培养18～24h，并连续划线培养至第3代，挑取单菌落接种到试管中37℃、180rpm培养12h左右作为种子液，将种子液按照2％的接种量接种到100ml培养基中37℃、180rpm扩大培养12h左右。

3.2 副猪嗜血杆菌平板菌落活菌计数将上述菌液做活菌计数，具体方法为：用1000μl移液枪准确吸取菌液1.0mL，放入盛有灭菌生理盐水稀释液10mL的灭菌试管中，不接触液面，另取一支枪头，将第1管液体混合均匀后，吸取1.0mL菌液放入盛有灭菌生理盐水10mL灭菌离心管中，依次稀释至最后1管。根据对样品含菌数的估计，选择最佳稀释度，吸取最终稀释度的菌液接种TSA固体培养基平板3个，每个滴0.1ml，用无菌玻璃涂棒涂布菌液，使菌液散开，晾干，置37℃温箱培养18-24h，数取每个平皿中的菌落个数，计算每ml菌液中的活菌个数。实验结果用Excel软件处理，求得活菌数与OD600值之间的函数关系为线性关系为：y＝23.043x-1.1223，R²＝0.9715(注：R²值越接近1，表示线性关系越明显)。

3.3 试验动物分组选取21～28日龄的断奶仔猪共12头，买进后，观察3天，无异常情况后，随机分为4组，第1～3组为攻毒组，分别注射浓度为4.0×10⁹CFU/mL菌液1.0mL、3.0mL、5.0mL，采用腹腔接种的方式攻毒，对照组注射3.0mL TSB培养基。攻毒后按常规饲养，饲料中无饲料添加剂和抗生素。隔离饲养观察14d，每天观察临床症状、测量体温，对死亡猪进行解剖、观察病理变化、做细菌分离和鉴定，并分别于攻毒前和试验结束时称量各组猪体重，计算日增重。

攻毒结果显示：攻毒组大部分仔猪的体温在攻毒第2d、3d开始升高，持续3、4后，体温开始恢复正常。对照组体温正常，没有明显变化，亦无发病和死亡。期间攻毒组猪精神沉郁、饮食减少、被毛粗乱、呼吸困难、关节肿大、跛行、卧床不起、甚至死亡等临床症状。剖检可观察到：胸腹腔积液增多、胸腹腔内粘连、心包积液增多，严重者出现胸腹腔内、心包膜纤维素性渗出物，全身淋巴结肿大，后肢关节腔内关节液怎多甚至有胶胨样渗出物。LX-5株的攻毒剂量越大，体温月高、死亡越快，发病率和死亡率越大。攻毒组仔猪的发病率和死亡率如表1所示。

表1 LX-5株不同攻毒剂量仔猪的发病率和死亡率

4 免疫原性的测定

选取21～28日龄的健康易感仔猪12头，随机分成4组，每组3头，前3组为试验组，最后1组为生理盐水对照组。将实验室试制的疫苗，菌液含量为4.0×10⁹CFU/mL，疫苗以1.0ml、1.5ml、2.0ml剂量免疫21～28日龄健康易感仔猪，颈部肌肉注射。间隔2周后加强免疫，二免1周后，免疫组仔猪连同对照仔猪各腹腔接种一个最小致死剂量的LX-5株菌液(5mL浓度为4.0×10⁹CFU/mL的菌液)进行攻毒。观察14日，采血做MSAT(改良试管凝集试验)试验检测HPs抗体水平，记录试验结果。未免疫对照组仔猪的抗体为阴性，攻毒后均发病，其中1头死亡。免疫组中，中高剂量组均产生较好的免疫效果，仔猪抗体效价均在1：32以上，攻毒后仔猪均健活，剖检无明显病理变化，详细结果见表2所示。

表2 LX-5株不同剂量的灭活疫苗对仔猪的免疫效果

由表2结果可见，HPs LX-5株最小免疫保护剂量1.5mL，含活菌数为4×10⁹CFU/mL。

实施例2：HPs LX-5株在副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。

1 菌种

制苗用菌种为副猪嗜血杆菌血清5型LX-5株，其保藏编号为CGMCCNo.10230。LX-5株菌体、菌落形态符合副猪嗜血杆菌标准菌株形态，生态特性和培养特性稳定，对仔猪有较强的毒力，且具有良好的免疫原性。

2 生产用菌种制备

2.1 一级生产种子培养取HPs LX-5株基础种子复苏，接种于添加有NAD和血清的TSA固体培养基，在37℃培养24～48h，连续划线培养3代，挑取光滑湿润、无色透明、中间隆起的针尖大小的单菌落，接种于含NAD和血清的TSB液体培养基，37℃、180rpm振荡培养12h左右，然后收获培养物，进行纯粹检验合格后，作为一级生产种子，放于4℃冰箱保存备用，保存不超过2d。

2.2 二级生产种子的繁殖取一级生产种子培养物，按2％的接种量接种到100mL添加有NAD和血清的TSB培养基中，37℃、180rpm振荡培养12h左右。培养物经纯粹检验合格后，作为二级生产种子，放于4℃冰箱保存备用，保存不超过2d。

2.3 制苗菌液的制备取二级生产种子培养物，按2％的接种量接种于添加有NAD和血清的TSB液体培养基的培养罐中，37℃、180rpm振荡培养12h左右。收获并取样，按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验和活菌计数。每批次制苗菌液均无杂菌生长，且活菌数达4×10⁹CFU/mL。

3 菌液的灭活

将纯化的HPs接种于含0.005％NAD的TSB液体培养基中，37℃振荡培养12h，取上述一级菌种按2％的量接种TSB液体培养基中，37℃振荡培养12h，进行细菌计数和杂菌检验，然后加入终浓度为0.2％的甲醛，灭活14～16h，取菌液接种TSB液体培养基，37℃振荡培养5天，检验灭活效果。

3.1 蜂胶灭活疫苗的制备

将灭活后检验合格的副猪嗜血杆菌菌液作为水相，添加蜂胶佐剂，无菌检验合格的，分装至疫苗瓶中，20mL/瓶，加塞、封蜡制成副猪嗜血杆菌蜂胶灭活疫苗产品，放4℃冰箱保存。

4 疫苗检验主要包括物理性状、安全性检验

4.1 物理性状检验制成的菌苗无杂质、无异物、呈现均质的乳白色。

4.2 安全性检验

4.2.1 无菌检验按照中华人民共和国兽用生物制品规程(二ООО年版)方法进行。取样接种于T.G小管、G.A斜面、TSA培养基各2支，每支0.2mL，一支置于37℃培养，一支置于25℃培养，均观察3～5d，结果应均无菌生长。

4.2.2 纯粹性检验取样直接接种于T.G小管、G.A斜面、TSA培养基各2支，一支置于37℃培养5d，一支置于25℃培养5d。另取0.2mL接种于1支G.P小管，置于25℃培养5d。观察细菌菌落大小和形态是否一致。合格的疫苗应无杂菌生长。

4.2.3 甲醛残留量检测

4.2.3.1 对照品溶液的制备取已标定的甲醛溶液适量，配成每1mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取上述每1mL含甲醛1.0mg的溶液5mL于50mL量瓶中，加20％吐温-80乙醇溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，即得。

4.2.3.2 供试品溶液的制备用5mL刻度吸管量取疫苗5mL，置50mL量瓶中，用20％吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗剂吸管，洗液一并倒入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如不澄清，过滤，弃掉初滤液，即得。

4.2.3.3 检验方法精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10.0mL，乙酰丙酮试液10.0mL，置60℃恒温水浴15min，冷水冷却5min，放置20min后，用分光光度法检测，在410nm的波长处测定吸收度。

4.2.3.4 甲醛溶液含量(％)＝0.25×供试品溶液的吸收度/对照品溶液的吸收度×100％。

4.2.4 一次单剂量接种安全试验灭活疫苗接种途径为颈部肌肉注射。取21～28日龄健康易感仔猪2头，每头颈部肌肉注射疫苗2mL，同时取条件相同的非免疫健康易感仔猪2头做对照，每头颈部肌肉注射生理盐水2mL，观察14d，每日观察仔猪的精神、呼吸状态、采食情况、临床症状、局部炎症、组织病变等。

4.2.5 单剂量重复接种安全试验灭活疫苗接种途径为颈部肌肉注射。取21～28日龄健康易感仔猪2头，每头颈部肌肉注射疫苗2mL，同时取条件相同的非免疫健康易感仔猪2头做对照，每头颈部肌肉注射生理盐水2mL，14d后，按相同的方法和剂量对试验组和对照组重复注射1次，观察14d，每日观察仔猪的精神、呼吸状态、采食情况、临床症状、局部炎症、组织病变等。

4.2.6 一次超剂量接种安全试验灭活疫苗接种途径为颈部肌肉注射。取21～28日龄健康易感仔猪2头，每头颈部肌肉注射疫苗4mL，同时取条件相同的非免疫健康易感仔猪2头做对照，每头颈部肌肉注射生理盐水4mL，观察14d，每日观察仔猪的精神、呼吸状态、采食情况、临床症状、局部炎症、组织病变等。

4.2.7 对非使用日龄仔猪的安全性试验灭活疫苗接种途径为颈部肌肉注射。取14～21日龄健康易感仔猪2头，每头颈部肌肉注射疫苗2mL，同时取条件相同的非免疫健康易感仔猪2头做对照，每头颈部肌肉注射生理盐水2mL，观察14d，每日观察仔猪的精神、呼吸状态、采食情况、临床症状、局部炎症、组织病变等。

以上试验结果表明试验猪饮食正常、精神状况良好，疫苗免疫后24～48h仔猪体温升高不超过1℃，呈明显一过性、出现时间短暂，对猪只并不产生不良影响。

5 效力试验

用实验室试制的灭活疫苗免疫21～28d健康易感仔猪5头，颈部肌肉注射2mL，2周后加强免疫，二免后7d，通过腹腔注射的方式接种最小发病剂量的3mL LX-5株菌液(菌液浓度为4×10⁹CFU/mL)，同时设立相同条件的攻毒对照组5头，观察14日。结果表明，攻毒对照组的猪全部发病，免疫组攻毒暴率均为100％(5/5)。效力试验全部合格，说明制备的疫苗对仔猪有非常好的免疫保护力。

Claims

1.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌的保藏编号为CGMCC No.10230。

2.权利要求1所述的副猪嗜血杆菌在制备治疗猪副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。

3.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为疫苗。

4.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗是用权利要求1所述的副猪嗜血杆菌作为抗原制备的。

5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗，佐剂为蜂胶。

6.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗为多价苗或联苗。

7.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌的含量为4×10⁹CFU/mL或以上。