CN109745555A

CN109745555A - 一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗及其应用

Info

Publication number: CN109745555A
Application number: CN201910131715.3A
Authority: CN
Inventors: 徐引弟; 王治方; 张青娴; 朱文豪; 许峰; 焦文强; 李海利; 郎利敏; 张立宪; 游一; 王克领
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2039-02-22
Also published as: CN109745555B

Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型二联灭活疫苗。该疫苗是由猪肺炎支原体抗原、三种副猪嗜血杆菌血清型抗原以及免疫佐剂制成，其中猪肺炎支原体抗原为已灭活的猪肺炎支原体HNMhy1株抗原，所述猪肺炎支原体HNMhy1株，保藏编号为CGMCC NO：13858，保藏日期：2017年5月26日；所述三种副猪嗜血杆菌血清型抗原分别为已灭活的副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株抗原，其中所述副猪嗜血杆菌2型HN1553株，保藏编号为CGMCC NO：16801；所述副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株，保藏编号为CGMCC NO：16802；所述副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株，保藏编号为CGMCC NO：16803；所述免疫佐剂为氢氧化铝胶佐剂。

Description

一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型二联灭活疫苗制备及应用。

背景技术：

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是猪支原体`肺炎（Mycoplasmalpneumonia of Swine，MPS）的主要病原。猪支原体肺炎是一种慢性、接触性传染病，具有高发病率和低病死率的特点，主要表现为食欲减退、发热、咳嗽、气喘、呼吸困难等症状，患病猪生长缓慢，饲料转化率下降，常诱发其他病原的感染，特别是免疫抑制性病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、猪圆环病毒2型（Porcine cirovirus 2，PCV-2），引起免疫抑制诱导，常因同时继发细菌感染引起死亡，是世界上最主要的猪病之一。本病广泛存在于世界各地，持续感染且难以治愈，同时由于感染猪较高的治疗费用并造成生产性能降低，从而给养猪业造成严重危害。

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是巴氏杆菌科的一种革兰氏阴性多形态小杆菌，为猪副猪嗜血杆菌病的病原菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。本病在全世界范围内广泛存在，德国学者Glsser于1910 年首先报道，又称为革拉氏病（Glsser' s disease）。副猪嗜血杆菌可以感染各种年龄段的猪，主要发生在断奶后和保育阶段，主要感染2周龄到4月龄的猪，发病率一般在 10% ～ 15%，严重时死亡率可达 50%，该病已成为近年来断奶、保育仔猪死亡的主要原因之一，是临床混合感染的主要病原之一，给养猪业造成较大的经济损失，严重影响养猪业的健康发展。

副猪嗜血杆菌临床血清型较多，标准分型有15个血清型，临床上还有20%以上的不可分型菌株，该病原呈世界性分布，各地流行菌株血清型不一，各血清型之间缺乏免疫交叉保护能力。临床防控副猪嗜血杆菌病的两种途径有抗生素使用和疫苗免疫，但由于国内兽用抗生素不规范滥用及长期使用，导致越来越多的细菌对抗生素产生了耐用性，副猪嗜血杆菌临床分离株耐药现象越来越明显，严重影响了抗生素的杀菌作用。疫苗免疫接种是防控副猪嗜血杆菌病的最佳途径，应根据流行的血清型选择对应的单价或多价疫苗。国内副猪嗜血杆菌商品化疫苗多为针对血清4型、5型、13型的二价或三价疫苗，与各地区主要流行菌株血清型差异较大，导致防控效果不佳。副猪嗜血杆菌各血清型之间缺乏免疫交叉保护，副猪嗜血杆菌灭活疫苗只对同一血清型的菌株有抵抗保护作用，一旦流行菌株血清型与疫苗血清型不符，该疫苗对猪群就无保护作用。

猪肺炎支原体在临床上与副猪嗜血杆菌经常混合感染或继发感染，二者症状相似，且药物治疗效果均不佳，2型、5型和7型副猪嗜血杆菌也是临床分离比例较高的血清型，因此，亟需一种新的具有安全、免疫原性好的菌株制备的疫苗对支原体肺炎和副猪嗜血杆菌病进行防治。

发明内容：

针对目前猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌混合感染，副猪嗜血杆菌各血清型之间缺少免疫交叉保护，副猪嗜血杆菌灭活疫苗只对同一血清型的菌株有抵抗保护的问题，本发明提供一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型二联灭活疫苗。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗，包括猪肺炎支原体抗原和三种副猪嗜血杆菌血清型抗原，所述猪肺炎支原体抗原为已灭活的猪肺炎支原体HNMhy1株抗原，所述猪肺炎支原体HNMhy1株，保藏编号为CGMCCNO：13858，保藏日期：2017年5月26日；所述三种副猪嗜血杆菌血清型抗原分别为已灭活的副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株抗原，其中所述副猪嗜血杆菌2型HN1553株，保藏编号为CGMCC NO：16801；所述副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株，保藏编号为CGMCC NO：16802；所述副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株，保藏编号为CGMCC NO：16803；三株副猪嗜血杆菌的保藏日期均为2018年11月9日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述的一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗，所述灭活疫苗中猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌2型、5型和7型血清型抗原比例为1∶1∶1∶1。

上述的一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗，所述猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型抗原的含量均为1×10¹⁰ CFU/mL。

上述的一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗，还包括兽医学可接受的免疫佐剂，所述免疫佐剂为氢氧化铝胶佐剂。

以上任一项所述的二联灭活疫苗在制备预防和治疗肺炎支原体和副猪嗜血杆菌相关病的药物中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明中的猪肺炎支原体菌株HNMhy1分离自发生典型呼吸困难、肺脏发生实变的保育猪，对保育猪具有较强的致病力，能够引起保育猪发生典型的喘气病症状，且具有良好的免疫原性。

2、本发明从临床分离株中筛选出优势流行菌株副猪嗜血杆菌血清2型HN1553株、5型HN1570株、7型HN1565株菌株，其中菌株HN1553株和HN1570株对保育仔猪具有较强的致病力，引起保育猪发病死亡；菌株HN1565株对保育仔猪致病力稍弱，但能引起保育仔猪呼吸道症状，发育迟缓，饲料报酬降低；通过试验发现这三株副猪嗜血杆菌均有良好的免疫原性。

3、利用本发明中的猪肺炎支原体菌株HNMhy1和副猪嗜血杆菌血清2型HN1553株、5型HN1570株、7型HN1565作为菌株抗原制备的灭活疫苗，可以很好的预防临床猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌血清2型、5型和7型的感染，同时该疫苗制备工艺简单，且安全性好，免疫效果好、免疫期长。

附图说明：

图1为菌株HNMhy1菌落4×显微镜下形态；

图2为菌株HNMhy1菌体吉姆萨染色100×显微镜下形态；

图3为菌株HNMhy1的PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000 bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp， 100bp；泳道1为引物MB1，MB2对猪肺炎支原体疫苗株168株的扩增结果；泳道2、3为引物MB1、MB2对菌株HNMhy1的扩增结果；泳道4为阴性对照；从图中可以看出，模板PCR扩增片段约为1502bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小；

图4为菌株HN1553菌落形态；

图5为菌株HN1553菌体革兰氏染色100×显微镜下形态；

图6为菌株HN1553的PCR鉴定及血清型PCR鉴定结果，图中的 Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp，100bp；泳道1为引物P1、P2扩增HN1553株16S rRNA 基因结果；泳道2为引物P3、P4扩增HN1553株WZX基因结果；泳道3为阴性对照；

图7为菌株HN1570菌落形态；

图8为菌株HN1570菌体革兰氏染色100×显微镜下形态；

图9为菌株HN1570的PCR鉴定及血清型PCR鉴定结果，图中的 Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp，100bp；泳道1为引物P1、P2扩增HN1570株16S rRNA 基因结果；泳道2为引物P5、P6扩增HN1570株wciP基因结果；泳道3为阴性对照；

图10为菌株HN1565菌落形态；

图11为菌株HN1565菌体革兰氏染色100×显微镜下形态；

图12为菌株HN1565的PCR鉴定及血清型PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp，100bp；泳道1为引物P1、P2扩增HN1565株16S rRNA基因结果；泳道2为引物P7、P8扩增HN1565株funQ基因结果；泳道3为阴性对照。

生物材料保藏信息

(1)菌株HNMhy1为猪肺炎支原体，于2017年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO：13858；

(2)菌株HN1553为副猪嗜血杆菌Haemophilus parasuis，于2018 年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC NO:16801；

(3)菌株HN1570为副猪嗜血杆菌Haemophilus parasuis，于2018 年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号： CGMCC NO：16802；

(4)菌株HN1565为副猪嗜血杆菌Haemophilus parasuis，于2018 年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号： CGMCC NO：16803。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：猪肺炎支原体的分离和鉴定

本发明的猪肺炎支原体病料来自于2017年4月于河南省濮阳市某大型猪场发生重症肺炎呼吸困难的2月龄保育猪的发生实变的猪的肺脏。

1.1培养基的制备

PPLO液体培养基：PPLO肉汤粉10.5 g，葡萄糖2.5 g，酵母粉2.5 g，溶于440 mL超纯水中，115℃灭菌15 min，加入MEM培养基5 mL、马血清50 mL、青霉素8万单位、无菌10%精氨酸10 mL和1%（w/v）酚红500μL。培养基于115℃灭菌15 min后，于4℃保存备用。

PPLO固体培养基：加入1.5%（w/v）琼脂粉的PPLO液体培养基。培养基于115℃灭菌15 min后，于4℃保存备用。

1.2支原体的分离培养

取适量病变肺组织放入研磨器中剪碎，加入2 mL的灭菌PBS缓冲液，研磨，取上清液于EP管中。然后5000 r/m低速离心5 min后，用针管取上清液，在针管部安装0.22μm滤膜过滤，加入PPLO液体培养基中，在37℃、5% CO₂培养箱中培养。培养近一周后，取1mL转接PPLO液体培养基中进行传代培养，传代3~5代后液体颜色由红色变为黄色，取100μL涂布PPLO固体培养基表面，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

1.3菌株鉴定

1.3.1 形态观察和生化鉴定

菌株经培养5~7 d后，肉眼观察可见有无色透明针尖状菌落，在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，形态为典型的支原体“煎荷包蛋样”（见图1）。吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态，为多形态，呈球菌样、弯曲的丝状、螺旋状（见图2），命名为菌株HNMhy1。

1.3.2 PCR鉴定

根据猪肺炎支原体16S rRNA的序列设计一对通用引物，用于猪肺炎支原体的扩增，引物序列如下：

MB1：5’- ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3’（SEQ ID NO.1）

MB2：5’- CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3’（SEQ ID NO.2）

预期扩增片段大小为1502bp。

将菌株HNMhy1接种PPLO液体培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养3d后，培养基由红色变为黄色，收集菌体，按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HNMhy1的DNA，分光光度计测定浓度为100μg/mL，用引物MB1，MB2扩增进行PCR鉴定；同时，设置猪肺炎支原体疫苗株168株为阳性对照。

PCR扩增反应体系为25 µL：10×缓冲液2.5µL，2.5mM dNTPs 0.5µL，10µM/L通用引物MB1，MB2各1 µL，5U/µL rTaq 1µL，100μg/mL DNA模板1µL，加入ddH₂O至25µL。

反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃ 30 s，57℃30 s，72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min，PCR产物4℃保存。

扩增产物分别进行电泳，每孔加样10 µL，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果（见图3）。由图3可以看出，MB1，MB2扩增出符合预期大小片段，经测序与猪肺炎支原体传代致弱疫苗株168株（Genbank No.CP002274）同源性78%，测序结果如下；证明所分离的菌株HNMhy1为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）。ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAAGCATCTTCGGATGCTTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTAGATAACCTACCTTTAACTCGAGGATAACTCCGGGAAACTGGAGCTAATACTGGATAGGATGTGTGCATGAAAAAAACACATTTAAAGATTTATCGGTTTAAGAGGGGTCTGCGGCGCATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAGAGCCTACCAAGACGATGATGCGTAGCCGGACTGAGAGGTCTACCGGCCACATTGGGACTGAGAACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGGGGAAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGACGAAGTACTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATATGGGAAGAAAAATTAAAAATTGACGGTACCATATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTATAAAAGTTTGTGGTGTAAGTGCAGTGCTTAACGCTGTGAGGCTATGAAAACTATATAACTAGAGTGAGACAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTATACTGACACTGATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGAACTAAGTGTTGGCCATAAGGTCAGTGCTGCAGTTAACGCATTAAGTTCTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGACCCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAGGCTAACAGATGTACAGGTGGTGCACGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGCTAGTTACCATCATTAAGTTGGGGACTCTAGCGAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGGAACAAAGAGAAGCGATAGGGTGACCTGGAGCGAAACTCACAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAAATCAGCATGTTGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCAAACCACGAAAGTGGGCAATACCCAACGCCGGTGGCCTAACCCGAAAGGGAGGGAGCCGTCTAAGGTAGGGTCCATGATTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTAGCGGATCCGCG（SEQ ID NO.3）

实施例2：菌株HN1553的分离和鉴定

2.1 培养基制备

TSB液体培养基：将TSB肉汤粉（Tryptic Soy broth，胰蛋白胨大豆肉汤）30g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15 min，加胎牛血清50 mL、无菌1%NAD（Nicotinamide adeninedinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶Ⅰ）1 mL。

TSA固体培养基：将TSA琼脂粉（Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆琼脂）40g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50mL、无菌1%NAD （根据需要添加）1mL；于4℃保存备用。

2.2菌株HN1553的分离培养

申请人于2018年在无菌条件下采集发生典型多发性浆膜炎的保育猪的心血并接种于含有NAD的TSA固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养36 h，挑取疑似菌落进行传代纯化培养。

2.3 菌株HN1553的鉴定

2.3.1 形态观察和生化鉴定

疑似菌落传代纯化培养24～48小时后观察副猪嗜血杆菌的菌落形态，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1~2毫米的菌落（见图1）；纯化的同时并接种于不含NAD的TSA固体培养基上，在不含NAD的TSA培养基上不能生长；挑取纯化的单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征为革兰氏阴性菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到细长致丝状的菌体（见图2）。

从菌株HN1553形态学与生化特性的测定结果初步判断菌株HN1553属于副猪嗜血杆菌菌属。

2.3.2 PCR鉴定

根据副猪嗜血杆菌16S rRNA基因的序列设计一对通用引物，用于副猪嗜血杆菌的扩增，引物序列如下：

P1：5’- GTGATGAGGAAGGGTGGTGT -3’（SEQ ID NO.4）

P2：5’- GGCTTCGTCACCCTCTGT -3’（SEQ ID NO.5）

扩增片段大小为822bp。

根据副猪嗜血杆菌WZX的序列设计一对副猪嗜血杆菌2型的特异性引物，用于副猪嗜血杆菌2型的扩增，引物序列如下：

P3：5’- CTAACAAGTTAGGTATGGAGGGTTTTGGTG -3’（SEQ ID NO.6）

P4：5’- GGCACTGAATAAGGGATAATTGTACTG-3’（SEQ ID NO.7），扩增片段大小为295bp。

按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HN1553的DNA，分光光度计测定浓度为100ug/mL，进行PCR鉴定。同时，设置副猪嗜血杆菌标准株为阳性对照，设置猪链球菌2型标准株为阴性对照；进行PCR扩增，扩增产物进行电泳，每孔加样10µL，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果（见图6）。由图6可知，本实施例菌株HN1553同副猪嗜血杆菌标准菌株一样均扩增出822bp片段，菌株HN1553测序与副猪嗜血杆菌CL120103株（GenBank NO:CP020085.1）、SW140株（GenBank NO:KC795299.1）100%同源。证明菌株HN1553为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）。

2.3.3 血清型鉴定

参照1.3.2方法，用副猪嗜血杆菌2型的特异性引物P3、P4扩增，结果扩增出295bp大小片段（见图6），测序结果如下所示，测序与2型副猪嗜血杆菌SW140株（GenBank NO:KC795299.1）100%同源，证明菌株HN1553为2型副猪嗜血杆菌。

TCTAACAAGTTAGGTATGGAGGGTTTTGGTGAATTGTCTTATTACCAAATATTGACAACAATATTTGTTGTATTGGTTGGCTTTTGTCAAAGTAATGCAATATCTAGATACTATTATGCTTATGGCCAAAGGTCTGTTAATTTTATTATGTTATCTGGGTATATATATACTTTTAGTATAGGTGTTATCGGTTTTATAACATCGTTATTTTTTGATAACAAAATTATTTCGTACTTGGTACTTTTATCTGTCTTTCAGGTTTTATTATCAGTACAATTATCCCTTATTCAGTGCCA（SEQ ID NO.8）

实施例3：菌株HN1570的分离和鉴定

3.1 培养基制备

参照实施例2中的方法制备TSB液体培养基和TSA固体培养基。

3.2菌株HN1570的分离培养

申请人于2017年在无菌条件下采集发生典型多发性浆膜炎的保育猪的心血接种于含有NAD的TSA固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养36 h，挑取疑似菌落进行传代纯化培养。

3.3 菌株HN1570的鉴定

3.3.1 形态观察和生化鉴定

疑似菌落传代培养24～48小时后观察副猪嗜血杆菌的菌落形态，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1~2毫米的菌落（见图7）；纯化的同时并接种于不含NAD的TSA固体培养基上，在不含NAD的TSA培养基上不能生长；挑取纯化的单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征为革兰氏阴性菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到细长致丝状的菌体（见图8）。

从菌株HN1570形态学与生化特性的测定结果初步判断菌株HN1570属于副猪嗜血杆菌菌属。

3.3.2 PCR鉴定

副猪嗜血杆菌通用引物为P1、P2.

根据副猪嗜血杆菌funQ的序列设计一对副猪嗜血杆菌7型的特异性引物，用于副猪嗜血杆菌7型的扩增，引物序列如下：

P7：5’- CTCCGATTTCATCTTTTCTATGTGG -3’（SEQ ID NO.9）

P8：5’- CGATAAACCATAACAATTCCTGGCAC-3’（SEQ ID NO.10）

扩增片段大小为490bp。

按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HN1570的DNA，对菌株HN1570进行PCR扩增；将扩增产物进行电泳，每孔加样10µL，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果（见图9）。由图9可知，待测菌株即菌株HN1570同副猪嗜血杆菌标准菌株一样均扩增出822bp片段，菌株HN1570测序与副猪嗜血杆菌CLSH0104株（GenBank NO:CP024412.1）、29755株（GenBankNO:CP021644.1）、KL0318株（GenBank NO:CP009237.1）99%同源；证明菌株HN1570为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）。

3.3.3 血清型鉴定

参照1.3.2方法，用副猪嗜血杆菌5型的特异性引物P5、P6扩增，结果扩增出450bp大小片段（见图9），测序结果如下所示，测序与5型副猪嗜血杆菌KL0318株（GenBank NO:CP009237.1）99%同源，证明菌株HN1570为5型副猪嗜血杆菌。

CCTCCATACATTCGAATTCCTAAGCCAAAAATATATTTTATTTCTAGGGAACCAGCCATGACTTAAAAAATCAACTGGTTTATCATGAAAGAAAAAGCGCTCTTTATTGACACCCCTCATAATAATCACATCATCATTTAAATATACAAAATTTTCAGATAGAGCATCTATATTACCCAAATTCATTTCAATTGAACTGGAATTAAAAATAGGAAGGTGTTCTTTCTCATAATAAAGCTGATTATGTGTAATTAAAAATATTTTTTCATTATTTATATCTAACCATTCAGGAAAGTGTCCCTCAGTAATTAAATATATTCTATTATACCAAGGGCAGTTTTTTTCTATAGATCTTAGAACATATCTTAGAGTTCCCATATCTCTATATCTTGATTCAGAATTTGAACTAGTTTCTTTTAAATTTATATTACTATAGAAACTTTTTTTTGCCTGCCACTCTCTTATCCAGTGGA（SEQ ID NO.11）

实施例4：菌株HN1565的分离和鉴定

4.1 培养基制备

参照实施例2中方法制备TSB液体培养基和TSA固体培养基。

4.2菌株HN1565的分离培养

申请人于2018年在无菌条件下采集发生典型呼吸道症状的保育猪的肺脏组织接种于含有NAD的TSA固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养36 h，挑取疑似菌落进行传代纯化培养。

4.3 菌株HN1565的鉴定

4.3.1 形态观察和生化鉴定

疑似菌落传代培养24～48小时后观察副猪嗜血杆菌的菌落形态，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1~2毫米的菌落（见图10）；纯化的同时并接种于不含NAD的TSA固体培养基上，在不含NAD的TSA培养基上不能生长；挑取纯化的单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征为革兰氏阴性菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到细长致丝状的菌体（见图11）。

从菌株HN1565形态学与生化特性的测定结果初步判断菌株HN1565属于副猪嗜血杆菌菌属。

4.3.2 PCR鉴定

副猪嗜血杆菌通用引物为P1、P2；

P7：5’- CTCCGATTTCATCTTTTCTATGTGG -3’（SEQ ID NO.12）

P8：5’- CGATAAACCATAACAATTCCTGGCAC-3’（SEQ ID NO.13）

扩增片段大小为490bp。

按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HN1565的DNA，对菌株HN1565的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳，每孔加样10µL，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果（见图12），由图12可知，待测菌株即菌株HN1565同副猪嗜血杆菌标准菌株一样均扩增出822bp片段，菌株HN1565测序与副猪嗜血杆菌174株（GenBank NO:KC795390.1）、SH03株（GenBankNO:CP0091581）98%同源；证明菌株HN1565为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）。

4.3.3 血清型鉴定

参照1.3.2方法，用副猪嗜血杆菌7型的特异性引物P7、P8扩增，结果扩增出490bp大小片段（见图12），测序结果如下，测序与7型副猪嗜血杆菌SH03株（GenBank NO:CP0091581）98%同源，证明菌株HN1565为7型副猪嗜血杆菌。

TTCCGAAAAATCCTCTCCAAATTTCATCTTTTCTATGAGGATTTTTTTGAAATAAATATTTGAAGTATAACTTTCTATTTTTTATTTTAAGTGTTCCTTTTAGCCTCAATTCTAGAATAATATCCTTAGATTTAATGATGTTTTATATTGGGAGTGTTTTGTGTTTTAAAAGAGGTTTTTTGTATAAATCCATAATTATTTTTAGTGCGATTTTTTTTTCTATATCCTCTCTTATTTTAAGGGGGATGTCAGAGCAAGGTTTTATATATAACATATTAAATTTATCTTACATTTTTGATATTAGCTTAGATGTTTTTTTTAGAGGGGTGAATTATGTGACCAGTTTTTCAGTATATGAAATGGAATATGCTTTAGAACAGAAACTTAGTGGTACAGATGCATTCTTAATAAGTATAAACCCATTGCCTAGTTCTTATTTAAATGTGCAGCCATTATATGACCAGGCAATGGTAAATGCTTTTTCTCCTGTGCCAGGAATTGTTATGGTTTATCGA(SEQ IDNO.14）

实施例5：毒力试验

5.1 猪肺炎支原体的毒力试验

试验猪为15日龄健康的保育猪8头，均为猪肺炎支原体ELISA抗体阴性。试验动物分为两组，对照组4头，试验组4头，两组试验动物随机分组。将HNMhy1接种PPLO液体培养基，37℃、5% CO₂培养箱中培养3 d后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布于PPLO固体培养基，低倍镜下活菌计数，计算培养物原液菌体浓度，调整至10⁸ CFU/mL；

试验组动物通过喉气管接种3 mL猪肺炎支原体液体培养物，对照组动物通过喉气管接种3 mL灭菌的PPLO液体培养基；试验期为15 d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变并采集病料，于15 d试验结束时，剖杀所有试验动物。

观察发现：试验组动物在接种支原体7 d后表现出口鼻流沫、呼吸困难、咳嗽等症状，体温正常，减食，张口伸舌、犬坐式腹式呼吸；对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。

试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀4头对照组动物，采集病料，进行支原体分离；试验组剖检，肺的尖叶、心叶、隔叶部分出现两侧对称性“肉样变”的实变，与周围组织界限明显；对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的4份病料均未分离到支原体，试验组的4份病料中均分离到猪肺炎支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，PCR鉴定结果与HNMhy1一致。

5.2副猪嗜血杆菌的毒力试验

选取9~10周龄断奶健康的保育猪16头为试验动物，将试验动物随机分为4组，对照组4头，试验1组4头、试验2组4头、试验3组4头。将副猪嗜血杆菌菌株HN1553株、HN1570株、HN1565株分别接种TSB液体培养基，37℃摇床培养24 h后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算原液菌体浓度，调整至10⁸ CFU/mL；试验1、2、3组动物分别通过气管内接种3 mLHN1553、HN1570、HN1565副猪嗜血杆菌液体培养物，对照组动物通过气管内接种3 mL灭菌的TSB液体培养基。注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。

观察发现：试验1和2组在接种副猪嗜血杆菌24h后表现出喘气、呼吸困难等症状，体温升高，耳部、腹部及臀部发绀，并出现转圈。试验1组2天后死亡1头，3天后死亡2头；试验2组2天后死亡2头，3天后死亡2头。试验3组在接种后36h出现喘气、咳嗽等呼吸道症状，伴随体温升高，并未出现死亡情况。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。

试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀4头对照组动物，采集病料，进行细菌分离。试验1、2组剖检肺有大量纤素样渗出，与胸膜粘连，心包积液，绒毛心，脑部出血；试验3组胸腔有少量纤维素渗出，肺脏出血等肺炎症状，心包积液；对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的4份病料均未分离到副猪嗜血杆菌，试验1、2、3组的4份病料中均分离到副猪嗜血杆菌，PCR鉴定结果与菌株HN1553、HN1570、HN1565一致。

综合毒力试验结果，确定将猪嗜血杆菌株HN1553、HN1570表现为毒力最强的菌株，副猪嗜血杆菌株HN1565表现为毒力较弱的菌株。

实施例6：疫苗的制备、安全性和效力试验

6.1疫苗的制备

6.1.1菌种及菌种繁殖

一级种子繁殖

将猪肺炎支原体HNMhy1株接种于PPLO固体培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物作为一级种子；

将副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株冻干菌种分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和NAD(终浓度0.01%)的TSA固体培养基上，37℃培养18~24h，挑取符合要求的典型菌落，分别传代接种含新生牛血清(终浓度5％)和NAD(终浓度0.01%)的TSA平板，37℃培养24h，检验合格后，作为一级种子。

二级种子繁殖

将猪肺炎支原体HNMhy1的一级种子接种于PPLO液体培养基中，37℃，摇床振荡培养18~24h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子；

将副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和NAD(终浓度0.01%)的TSB液体培养基中，37℃，摇床振荡培养18~24h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子。

6.1.2抗原菌液培养

将猪肺炎支原体的二级种子按1％接种于PPLO液体培养基中于37℃，5%CO₂摇床振荡培养3d，振荡结束18～24h后收获菌液；

将副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株的二级种子按1％分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和NAD(终浓度0.01%)的TSB液体培养基中，分别于37℃，5%CO₂摇床振荡培养3d，振荡结束18～24h后收获菌液。

6.1.3活菌计数

按现行《中国兽药典》附录方法，使用适宜于猪肺炎支原体生长的PPLO固体培养基对猪肺炎支原体进行活菌计数，活菌含量在1.0×10⁹CFU/mL以上；使用适宜于副猪嗜血杆菌生长的含5％新生牛血清和0.01%NAD的TSA培养基分别对三种副猪嗜血杆菌进行活菌计数，使用摇瓶培养，活菌计数浓度，三种副猪嗜血杆菌菌株培养活菌含量均在1.0×10⁹CFU/mL以上。

6.1.4菌液灭活

分别向猪肺炎支原体和三种副猪嗜血杆菌菌株的培养液添加体积总量的0.2％甲醛溶液，在37℃灭活24h。

6.1.5灭活检验

取猪肺炎支原体的灭活菌液0.2mL接种于PPLO固体培养基，置于37℃培养48h，无细菌生长为合格；

分别取三种副猪嗜血杆菌菌株的灭活菌液0.2mL接种于TSA固体培养基(含5％新生牛血清和0 .01％NAD)，置37℃培养48h，无细菌生长为合格。

6.1.6抗原的浓缩

将灭活检验合格的四种抗原菌液分别通过超滤系统装置浓缩菌液。根据灭活前活菌计数结果，使用无菌生理盐水将四种菌体抗原浓度调整至1.0×10¹⁰CFU/mL，并将四种抗原液按1:1:1:1(体积比)的比例混合均匀。

6.1.7佐剂准备

将氢氧化铝胶佐剂分装成瓶，经121℃高压灭菌30分钟，室温存放备用。

6.1.8疫苗制备

按浓缩混匀的抗原液添加10%的氢氧化铝佐剂，搅拌充分混匀，分装得到氢氧化铝胶佐剂的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗。最终疫苗中含灭活前四种菌株活菌总数为1.0×10¹⁰CFU/mL。

6.2 疫苗的安全性试验

选取14日龄健康仔猪10头，分为疫苗组和对照组，每组5头；疫苗组：颈部肌肉注射4 mL本疫苗；对照组：颈部肌肉注射4 mL灭菌生理盐水。测定动物体温，体温变化结果见表1，观察临床表现，共观察2周。

表1疫苗接种仔猪后的平均体温变化

通过观察发现疫苗组和对照组的保育猪在整个观察期间呼吸、食欲、精神状态都正常，由表1可以看出，平均体温升高不超过1℃，说明本发明的灭活疫苗安全。

6.3疫苗的免疫攻毒试验

选取15日龄健康仔猪100头，均为猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌ELISA抗体阴性。疫苗免疫攻毒试验设立猪肺炎支原体HNMhy1株攻毒试验组、副猪嗜血杆菌HN1553株攻毒试验组、副猪嗜血杆菌HN1570株攻毒试验组和副猪嗜血杆菌HN1565株攻毒试验组4大组。每大组试验选取仔猪25头，分为5小组，每小组5头。具体分组为：疫苗1组、疫苗2组、疫苗3组、疫苗4组，疫苗组每组分别注射该疫苗0.5ml、1ml、1.5ml、2ml；第5组为对照组，注射2mL灭菌生理盐水。疫苗组和对照组3周后二免注射同等剂量的疫苗或灭菌生理盐水。二免后14天各组试验分别用10⁹CFU的猪肺炎支原体HNMhy1、副猪嗜血杆菌HN1553、HN1570、HN1565菌株菌液采取滴鼻攻毒。观察各组仔猪的临床表现，每日测定体温，共观察2周；计算整个观察周期实验仔猪的发病率和死亡率，测定体温，对死亡猪肺脏等器官进行细菌分离培养。

观察发现：疫苗组与未免疫组有明显的差异，猪肺炎支原体 HNMhy1攻毒后，未免疫组第7d开始出现临床症状，流涕，呼吸困难，减食，消瘦；剖检结果：肺脏尖叶、心叶、隔叶部分出现两侧对称性“肉样变”的实变，与周围组织界限明显；而疫苗组中，0.5mL 疫苗组的5头仔猪中有2头出现临床症状和病例变化；1mL疫苗组的5头仔猪中有1头出现临床症状和病例变化；1.5mL和2mL疫苗组的5头仔猪没有发病。

副猪嗜血杆菌攻毒后第二天，未免疫组的仔猪第二天开始出现临床症状，体温升高，呼吸困难，转圈，2天后开始出现死亡，2周后共死亡5头。剖检未免疫组死亡猪胸腔和腹腔有积液，并有纤维素性渗出物，心包积液，心包腔内有纤维素性渗出物，心包粘连，肺脏肿大，两侧肺叶淤血或出血，表面纤维素性渗出物，脑膜充血，脑脊液增加。健康对照组的仔猪均未发病。而疫苗组中，0.5ml疫苗组的5 头仔猪中有1头出现临床症状和病例变化；1ml、1.5ml和2ml疫苗组的5头仔猪没有发病。

猪肺炎支原体HNMhy1、副猪嗜血杆菌HN1553株、HN1570株、 HN1565株的免疫攻毒结果分别见表2、表3、表4、表5。

表2猪肺炎支原体HNMhy1株攻毒试验结果

表3副猪嗜血杆菌HN1553株攻毒试验结果

注：“——”表示不适用。

表4副猪嗜血杆菌HN1570株攻毒试验结果

注：“——”表示不适用。

表5副猪嗜血杆菌HN1565株攻毒试验结果

注：“——”表示不适用。

由上述免疫攻毒试验结果可以看出，本疫苗1ml免疫剂量两次免疫就可以抵抗猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌血清2型、5型和7型的感染，说明本发明的灭活疫苗具有良好的保护效果。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗及其应用

<141> 2019-02-22

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 1

acgcgtcgac agagtttgat cctggct 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 2

cgcggatccg ctaccttgtt acgactt 27

<210> 3

<211> 1483

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 3

acgcgtcgac agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg 60

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cggtaaaatg cgtaaatata tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttg ctgggtctat 720

actgacactg atgcacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

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gttctccgcc tgagtagtac gtacgcaagt atgaaactca aaggaattga cgggaccccg 900

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gtccatgatt ggggttaagt cgtaacaagg tagcggatcc gcg 1483

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<212> DNA

<213> Haemophilus parasuis

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<213> Haemophilus parasuis

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cgataaacca taacaattcc tggcac 26

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<213> Haemophilus parasuis

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tggaatatgc tttagaacag aaacttagtg gtacagatgc attcttaata agtataaacc 420

cattgcctag ttcttattta aatgtgcagc cattatatga ccaggcaatg gtaaatgctt 480

tttctcctgt gccaggaatt gttatggttt atcga 515

Claims

1.一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗，其特征在于：包括猪肺炎支原体抗原和三种副猪嗜血杆菌血清型抗原，所述猪肺炎支原体抗原为已灭活的猪肺炎支原体HNMhy1株抗原，所述猪肺炎支原体HNMhy1株，保藏编号为CGMCC NO：13858，保藏日期：2017年5月26日；所述三种副猪嗜血杆菌血清型抗原分别为已灭活的副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株抗原，其中所述副猪嗜血杆菌2型HN1553株，保藏编号为CGMCC NO：16801；所述副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株，保藏编号为CGMCC NO：16802；所述副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株，保藏编号为CGMCC NO：16803；三株副猪嗜血杆菌的保藏日期均为2018年11月9日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗，其特征在于，所述猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌2型、5型、7型血清型抗原比例为1∶1∶1∶1。

3.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗，其特征在于，所述猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型抗原的含量均为1×10¹⁰ CFU/mL。

4.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗，其特征在于，还包括兽医学可接受的免疫佐剂，所述免疫佐剂为氢氧化铝胶佐剂。

5.根据权利要求1-4任一项权利要求所述的二联灭活疫苗在制备预防和治疗猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌相关病的药物中的应用。