CN107245459A

CN107245459A - 一株副猪嗜血杆菌及其应用

Info

Publication number: CN107245459A
Application number: CN201710231040.0A
Authority: CN
Inventors: 徐引弟; 王治方; 张青娴; 李海利; 朱文豪; 郎利敏; 焦文强; 张立宪; 游; 游一; 王克领
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2017-10-13

Abstract

本发明公开了一株副猪嗜血杆菌及其应用，所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)HNHPS1，保藏编号：CGMCC NO：13335，保藏日期：2016年11月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明中的菌株HNHPS1分离自发生典型呼吸道症状及神经症状死亡的保育猪的脑组织，在TSA固体培养基上分离时无其它细菌生长，只有副猪嗜血杆菌生长，在TSB液体培养基中增殖滴度高，达10⁹CFU/mL以上。本发明中的菌株HNHPS1对保育猪具有较强的致病力，引起保育猪发病死亡，具有良好的免疫原性。

Description

一株副猪嗜血杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一株副猪嗜血杆菌及其应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是一种存在于常规饲养猪群上呼吸道中的一种常在菌，但是在特定条件下，例如在猪场的猪群免疫力下降时候，副猪嗜血杆菌可以侵入健康的猪群机体，并引发严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主。主要临诊症状为发热，咳嗽，呼吸困难，共济失调等。除此之外，副猪嗜血杆菌还能引发败血症，并留下后遗症。

副猪嗜血杆菌具有多种血清型，按照KRG琼脂扩散的血清型分类办法，至少可以将该菌分为15个不同的血清型。副猪嗜血杆菌病呈世界分布，是一种对养猪业具有严重危害的新发细菌性传染病，往往给发病猪场造成巨大的经济损失，目前副猪嗜血杆菌病在我国的大部分地区的猪场都存在发生和流行的现象，该病是当前危害养猪业发展的最为重要的病原菌之一，因此副猪嗜血杆菌的防治对于养猪业的健康发展具有重大的意义。目前，亟需一种新的具有较好免疫原性的菌株制备的疫苗对该病进行防治。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株副猪嗜血杆菌及其应用，该菌株毒力强，制备的疫苗免疫性好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株副猪嗜血杆菌，所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)HNHPS1，保藏编号：CGMCC NO：13335，保藏日期：2016年11月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌4型。

一种副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗方面的应用。

所述的副猪嗜血杆菌灭活疫苗中，副猪嗜血杆菌菌量为1×10⁹CFU/mL。

所述的副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将所述的副猪嗜血杆菌依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

所述的副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将副猪嗜血杆菌接种到TSB液体培养基，置于37℃摇床中培养，24h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×10⁹CFU/mL，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活12h；灭活后的培养物按体积比1:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得副猪嗜血杆菌灭活疫苗。

本发明的有益效果：

1、本发明中的菌株HNHPS1分离自发生典型呼吸道症状及神经症状死亡的保育猪的脑组织，在TSA固体培养基上分离时无其它细菌生长，只有副猪嗜血杆菌生长，在TSB液体培养基中增殖滴度高，达10⁹CFU/mL以上。

2、本发明中的菌株HNHPS1对保育猪具有较强的致病力，引起保育猪发病死亡，具有良好的免疫原性。

3、根据本发明中的菌株HNHPS1制备的疫苗对猪的副猪嗜血杆菌病具有较好的保护效果。

附图说明

图1为菌株HNHPS1菌落形态。

图2为菌株HNHPS1菌体革兰氏染色100×显微镜下形态。

图3为菌株HNHPS1的PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1为引物HPS1，HPS2对4型副猪嗜血杆菌标准株的扩增结果；2为引物HPS1，HPS2对菌株HNHPS1的扩增结果；4为引物HPS3，HPS4对4型副猪嗜血杆菌标准株，5为引物HPS3，HPS4对菌株HNHPS1的扩增结果；3，6为阴性对照。从图中可以看出，1，2为副猪嗜血杆菌通用引物扩增，片段为276bp，4，5为副猪嗜血杆菌4型引物扩增片段，大小为349bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小。

图4为菌株HNHPS1的琼扩分型试验结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、副猪嗜血杆菌的分离和鉴定

1.1病料采集

病料来自于2016年11月在河南省汝阳县某大型养猪场发生重症肺炎呼吸困难及神经症状死亡的2月龄保育猪。

1.2培养基的制备

TSB液体培养基：将TSB肉汤粉(Tryptic Soy broth，胰蛋白胨大豆肉汤)30g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50mL、无菌1％NAD(Nicotinamide adeninedinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶Ⅰ)1mL；

TSA固体培养基：将TSA琼脂粉(Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆琼脂)40g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50mL、无菌1％NAD(根据需要添加)1mL；于4℃保存备用。

1.3细菌的分离培养

无菌采集病死猪的脑组织接种于含有NAD的TSA固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养36h，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1～2毫米的菌落(见图1)。纯化并接种于不含NAD的TSA固体培养基上，在不含NAD的TSA培养基上不能生长。革兰氏染色(见图2)，该菌为革兰氏阴性菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到细长致丝状的菌体，命名为菌株HNHPS1。

1.4菌株的鉴定

1.4.1设计引物

根据副猪嗜血杆菌vanY基因的序列设计一对通用引物，用于副猪嗜血杆菌的扩增，引物序列如下：

HPS1：5’-ACAACCTGCAAGTACTTATCGGGAT-3’(SEQ ID NO.1)

HPS2：5’-TAGCCTCCTGTCTGATATTCCCACG-3’(SEQ ID NO.2)

扩增片段大小为276bp。

同时根据副猪嗜血杆菌wciP的序列设计一对副猪嗜血杆菌4型的特异性引物，用于副猪嗜血杆菌4型的扩增，引物序列如下：

HPS3：5’-GGTTAAGAGGTAGAGCTAAGAATAGAGG-3’(SEQ ID NO.3)

HPS4：5’-CTTTCCACAACAGCTCTAGAAACC-3’(SEQ ID NO.4)

扩增片段大小为349bp。

1.4.2PCR鉴定

按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HNHPS1的DNA，分光光度计测定浓度为100μg/mL，进行PCR鉴定。同时，设置4型副猪嗜血杆菌标准株为阳性对照，设置猪链球菌2型标准株为阴性对照。

PCR扩增反应体系为25μL：10×缓冲液2.5μL，2.5mM(each)dNTPs Mix0.5μL，10μM/L通用引物HPS1，HPS2各1μL，5U/μL rTaq 1μL，100μg/mL DNA模板1μL，加入ddH₂O至25μL。

反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃1min，57℃1min，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

扩增产物分别进行电泳，每孔加样10μL，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果(见图3)。结果扩增出276bp片段，测序与副猪嗜血杆菌SH0165株(GenBank NO:CP001321)、ZJ0906株(GenBank NO:CP005384)、KL0318株(GenBank NO:CP009237)100％同源，与SC1401株(GenBank NO:CP015099)99.6％同源，测序结果如下，证明菌株HNHPS1为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)。

ACAACCTGCAAGTACTTATCGGGATTTTGAACGACAAAAATGGATTTGGAATACAAAATTCAATGGTGAAAATAAAGTTCATGATGATCATGGTAAAGCTATCATATTAACTGGCTTAGATGATTGGGACAAATGTCAAGCTATCCTGCGTTGGTCCGCAGTGCCAGGGGCTAGCCGTCACCATTGGGGAACAGAAATTGATATTTTTGATCCTACTTTACTTCCTGAAGGAAAAAAGCTCATGTTGGAACCGTGGGAATATCAGACAGGAGGCTA(SEQ ID NO.5)

1.4.3血清型鉴定

1.4.3.1琼扩分型试验

将分离出的菌株HNHPS1接种在TSA固体培养基之上，37℃培养36h，在无菌操作台中用pH7.2PBS缓冲液洗下菌苔，室温条件下7 000r/min离心2min之后弃去上清，估计出沉淀的体积大小之后，加入相当于沉淀物体积9倍的pH7.2PBS缓冲液并充分混匀，121℃高压蒸汽处理2h，再7 000r/min离心10min，所得的上清液即为分型抗原，用于后续的琼脂扩散试验。

称取1g琼脂糖和8.5g氯化钠，溶于100mL pH7.2PBS缓冲液中并充分混匀，放入微波炉中加热溶解。倒平板3～4mm厚，4℃保存。利用打孔器在平板上打出6个孔径为3mm，孔间距4mm的小孔并封底。

在中央孔加入已经制备好的待检菌株的琼扩抗原，周围孔加入1～15型的标准阳性血清和阴性血清，湿盒中，37℃静置24～48h观察结果。结果在4型标准血清(编号20)与抗原孔之间出现明显的沉淀线，与其它型血清之间无(见图4)。

1.4.3.2PCR分型

参照1.4.2方法，用副猪嗜血杆菌4型的特异性引物HPS3，HPS4扩增，结果扩增出349bp大小片段(见图3)，测序与4型副猪嗜血杆菌SW124株(GenBank NO:KC795356)100％同源，证明菌株HNHPS1为4型副猪嗜血杆菌。

1.5毒力试验

试验动物为9～10周龄断奶健康的保育猪8头。试验动物分为两组，对照组4头，试验组4头。将HNHPS1接种TSB液体培养基，37℃摇床培养24h后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算原液菌体浓度，为3.2×10⁹CFU/mL，再调整至10⁸CFU/mL，试验组动物通过气管内接种3mL副猪嗜血杆菌液体培养物，对照组动物通过气管内接种3mL灭菌的TSB液体培养基。注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。

试验组动物在接种副猪嗜血杆菌24h后表现出咳嗽、呼吸困难等症状，体温升高，耳部、腹部及臀部发绀，并出现转圈。2天后死亡1头，3天后死亡2头。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀4头对照组动物。采集病料，进行副猪嗜血杆菌分离。试验组剖检肺有大量纤素样渗出，与胸膜粘连，心包积液，绒毛心，脑部出血。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的4份病料均未分离到副猪嗜血杆菌，试验组的4份病料中均分离到副猪嗜血杆菌，PCR鉴定结果与HNHPS1一致。

实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验

2.1疫苗的制备

将副猪嗜血杆菌菌株HNHPS1接种到TSB液体培养基，置于37℃摇床中培养，24h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×10⁹CFU/mL，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活12h。灭活后的培养物按体积比1:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得副猪嗜血杆菌灭活疫苗。

2.2疫苗的安全性试验：

选取14日龄健康保育猪10头，分为2组，每组5头。疫苗组：颈部肌肉注射4mL本疫苗；对照组：颈部肌肉注射4mL灭菌生理盐水。测定动物体温，观察临床表现，共观察2周。观察期间，疫苗组和对照组的保育猪在整个观察期间呼吸、食欲、精神状态都正常，平均体温升高不超过1℃，说明本发明的灭活疫苗安全。

表1疫苗接种仔猪后的平均体温变化

2.3疫苗的效力试验

选取2周龄健康仔猪30头，分为6组，每组5头。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.5ml、1ml、1.5ml和2ml，第5组为未免疫组，第6组为健康对照组，注射2mL灭菌生理盐水。疫苗组和健康对照组3周后二免注射同等剂量的疫苗或灭菌生理盐水。二免后14天各组用10⁹CFU的HNHPS1菌液采取滴鼻攻毒。观察仔猪的临床表现，并每日测定体温，共观察2周。

计算整个观察周期实验仔猪的发病率和死亡率，测定体温，对死亡猪肺脏等器官进行传染性胸膜肺炎放线杆菌分离培养。

观察结果：疫苗组与未免疫组有明显的差异，攻毒后第二天，未免疫组的仔猪开始出现临床症状，体温升高，呼吸困难，转圈，第三天开始出现死亡，2周后共死亡5头。剖检未免疫组死亡猪胸腔和腹腔有积液，并有纤维素性渗出物，心包积液，心包腔内有纤维素性渗出物，心包粘连。肺脏肿大，两侧肺叶淤血或出血，表面纤维素性渗出物。脑膜充血，脑脊液增加。健康对照组的仔猪均未发病。而疫苗组中，0.5ml疫苗组的5头仔猪中有2头出现临床症状和病例变化；1ml疫苗组的5头仔猪中有1头出现临床症状和病例变化；1.5ml和2ml疫苗组的5头仔猪没有发病。

表1免疫攻毒保护情况

注：“—”表示不适用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.5ml含菌量为1×10⁹CFU/mL。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株副猪嗜血杆菌及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaacctgca agtacttatc gggat 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagcctcctg tctgatattc ccacg 25

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaagagg tagagctaag aatagagg 28

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttccacaa cagctctaga aacc 24

<210> 5

<211> 276

<212> DNA

<213> 副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）

<400> 5

acaacctgca agtacttatc gggattttga acgacaaaaa tggatttgga atacaaaatt 60

caatggtgaa aataaagttc atgatgatca tggtaaagct atcatattaa ctggcttaga 120

tgattgggac aaatgtcaag ctatcctgcg ttggtccgca gtgccagggg ctagccgtca 180

ccattgggga acagaaattg atatttttga tcctacttta cttcctgaag gaaaaaagct 240

catgttggaa ccgtgggaat atcagacagg aggcta 276

Claims

1.一株副猪嗜血杆菌，其特征在于：所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)HNHPS1，保藏编号：CGMCC NO：13335，保藏日期：2016年11月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌，其特征在于：所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌4型。

3.一种副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌灭活疫苗中，副猪嗜血杆菌菌量为1×10⁹CFU/mL。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将所述的副猪嗜血杆菌依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法为：将副猪嗜血杆菌接种到TSB液体培养基，置于37℃摇床中培养，24h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×10⁹CFU/mL，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活12h；灭活后的培养物按体积比1:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得副猪嗜血杆菌灭活疫苗。