CN103182077B - 一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌病疫苗领域，公开了一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株的应用，该菌株分类命名为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis），菌株号为FS0307，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2013094，保藏日期：2013年3月21日。本发明的血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株对猪有较强的致病性，具有良好的免疫原性，应用其制备的灭活疫苗安全可靠，对同源菌种攻毒的猪具有非常好的保护效果，免疫后猪群的发病率和死亡率均明显减少。无论是单苗还是联苗，其免疫效果均达到或优于市场上现有的商品化疫苗，能够有效预防副猪嗜血杆菌的流行。

Description

一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株的应用

技术领域

本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌病疫苗领域，特别是涉及一株血清4型副猪嗜血杆菌株的应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs)为巴氏杆菌科嗜血杆菌属中的一种革兰氏阴性球杆菌，是猪的一种条件性病原菌，呈世界性分布，感染仔猪后引起以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的猪格拉泽氏(Glasser’s)病。主要危害2～8周龄的仔猪，发病率一般为10％～15％，死亡率可达50％以上。

副猪嗜血杆菌对营养要求苛刻，生长严格需要V因子(NAD)，目前认为胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基与胰蛋白胨大豆(TSB)培养基是培养副猪嗜血杆菌的最适培养基。在添加NAD的TSA平板培养基上培养24h可见针尖大小灰白色菌落，呈隆起圆形，表面光滑、湿润、边缘整齐。HPs在巧克力琼脂平板上生长困难，有报道显示，巧克力平板上HPs不能进行传代培养，不适用于体外传代培养，但巧克力琼脂平板可以用于分离该菌，初次分离培养时供给5％～10％的二氧化碳(CO₂)可促进生长。液体培养时需要在肉汤或TSB培养基中添加血清与V因子(NAD)，但添加V因子浓度不断增加细菌浓度不会随之升高。由于葡萄球菌生长过程中会将自身代谢产物V因子释放到培养基中，所以HPs与金黄色葡萄球菌共同接种于鲜血琼脂平板培养，HPs在金黄色葡萄球菌两侧生长良好，随着与金黄色葡萄球菌距离增加，菌落逐渐变小，该现象被称为卫星现象。HPs对外界环境抵抗力极弱，体外培养极易死亡。

HPs菌株间抗原性和毒力差异很大，血清学分型是区别不同菌株的重要方法之一。目前，由Kielstein等1992年提出的基于热稳定抗原免疫扩散试验的血清学分型方法(KRG)已在世界范围内被接受，该方法将HPs分成15个血清型，然而有15.2％～41％的分离株血清型不能确定。根据日本、德国、美国和西班牙等国的血清流行病学调查，以血清型4、5和13最为流行。HPs在我国普遍流行，目前，在河北、河南、湖北、湖南、安徽、上海、广东、江西等12个省市均有副猪嗜血杆菌病发生和分离出HPs的报道。

由于兽医临床上常常大量甚至不合理使用抗菌药，致使猪场细菌在药物压力下选择出耐药菌群。因此，用药物防控副猪嗜血杆菌病的难度越来越大，而且随着人们对食品安全问题的担忧，抗生素在防控动物疾病方面的应用会更少，而将发挥更大作用的是相应的疫苗。HPs血清型较多，且不同血清型菌株的毒力与致病力差异较大，各个血清型之间免疫交叉保护力很低，所以，现有国内外商品化的副猪嗜血杆菌病疫苗均不能对该病提供完全有效的保护。因此，分离筛选免疫原性强的通用型HPs菌株，并利用其制备高效疫苗是防控副猪嗜血杆菌病的重中之重。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株(FS0307株)的应用，该疫苗株具有较强的毒力和很高的免疫原性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)，菌株号为FS0307，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO:M 2013094，保藏日期：2013年3月21日。该菌株是发明人于2003年4月于河北省衡水市自行采集筛选获得一株具有较强的毒力和很高的免疫原性的菌株。

上述血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备治疗猪副猪嗜血杆菌病药物中的应用。

其中，所述的药物为疫苗，优选油包水型疫苗、或水包油型疫苗、或水包油包水型疫苗。

其中，血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株与药学上可接受的载体或辅料组合构成药物，如单价苗、多价苗或联苗等等。

其中，所述血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株在疫苗中含菌量为2×10⁹CFU/mL以上。

有益效果：本发明的血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株具有稳定的生物学特性，对仔猪有较强的致病性，且具有良好的免疫原性。应用其制备的油佐剂灭活疫苗安全可靠，能够产生较高水平的抗体，持续期长，并且对同源菌种攻毒的猪具有非常好的保护效果，免疫后猪群的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果均达到或优于市场上现有的商品化疫苗，能够有效预防副猪嗜血杆菌的流行。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株的分离纯化和鉴定。

1.生产用培养基

TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50～60℃时，加入过滤除菌的牛血清50mL、10mL过滤除菌的0.01％NAD，混合均匀后倒板备用。

TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末30g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，临用前加入过滤除菌的牛血清50mL、10mL过滤除菌的0.01％NAD即可。

2.副猪嗜血杆菌分离纯化及鉴定

2.1分离纯化

2003年，我国河北地区的某规模化猪场大量出现疑似副猪嗜血杆菌感染的病猪，以持续发热、胸膜炎、腹膜炎、关节炎等为特征，选取病猪的肺、胸水、心包液、关节液接种TSA/NAD固体培养基，置37℃、5％CO₂条件下培养24～48小时，挑取半透明隆起的小菌落涂片，革兰氏染色镜检，选取革兰氏阴性小杆状或多形性小杆菌，再进行两次TSA/NAD固体培养基亚克隆培养。同时接种鲜血琼脂固体培养基和普通琼脂固体培养基，结果TSA/NAD固体培养基上生长良好，鲜血琼脂固体培养基和普通琼脂固体培养基没有菌落生成。

2.2生化鉴定

取纯培养菌液接种TSA/NAD固体培养基，置37℃、5％CO₂条件下培养24～48小时。观察菌落形态，可见针尖大小，圆形，边缘整齐，扁平，灰白色半透明隆起的小菌落。取单个菌落涂片革兰氏染色，为革兰氏染色阴性，呈多形性，为单个小球杆菌或细长的丝状杆菌。

将纯培养菌液在脱纤绵羊鲜血琼脂固体培养基上与金黄色葡萄球菌作交叉划线，置37℃、5％CO₂条件下培养24～48小时后，呈小而透明的菌落，越靠近葡萄球菌附近生长越好，呈现出典型的卫星生长现象，并且鲜血琼脂平板上的副猪嗜血杆菌菌落周围不出现溶血现象。

将纯培养菌液接种于TSA/NAD固体培养基，再分别贴上浸渍有X、V、X+V因子的圆形滤纸片。置37℃、5％CO₂条件下培养24～48小时，结果只有在含V、X+V因子的纸片周围有菌落生长，表明该菌株只依赖V因子，而不依赖X因子。

将纯培养菌液接种微量生化反应管，分别补充终浓度0.01％的NAD，置37℃静置培养，48h后判定生化特性结果。结果表明分离菌株对葡萄糖、蔗糖和果糖发酵，对麦芽糖、半乳糖、木糖和果糖不发酵，吲哚试验、氧化酶试验和脲酶试验呈阴性，硝酸盐还原试验和接触酶试验阳性，符合副猪嗜血杆菌的生化特性。根据该菌株的来源地将其命名为FS0307株。

2.316S rRNA基因序列测定与分析

2.3.1引物设计根据GenBank中副猪嗜血杆菌P5基因序列设计两条引物，引物序列为：P1:5’-gctccacaagctaacactttc-3’,P2:5’-catagaaacttcttttgaacc-3’，由上海生工生物工程有限公司合成，该引物扩增片段大小为1038bp。

2.3.2菌体DNA模板的制备取FS0307株培养物1.5mL，10000r/min离心5min，弃上清，沉淀用200μL双蒸水重悬，100℃水浴10min后，12000r/min离心5min收集上清，即为PCR模板，-20℃保存备用。

2.3.3PCR扩增及测序用提取的菌体DNA作为PCR模板。PCR扩增体系为：10×PCRBuffer 5.0μL，MgCl₂(25mM)2.5μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，引物P1(50μM)0.5μL，引物P2(50μM)0.5μL，模板DNA 3.0μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL加双蒸水至50μL。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃终延伸10min。取10μL PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳鉴定，同时以标准株作为阳性对照，结果出现了与标准株相同的1038bp大小的特异性条带，说明分离到的FS0307株为副猪嗜血杆菌。

经过回收鉴定为阳性的PCR扩增产物交由上海生工生物工程有限公司测序。副猪嗜血杆菌FS0307株P5基因测序结果如SEQ ID No.1所示，该序列与GenBank中公布的序列进行BLAST比对，与国内外已有的副猪嗜血杆菌相应序列的同源性达95％以上。

2.4副猪嗜血杆菌FS0307株血清学鉴定

按Kleletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法对副猪嗜血杆菌FS0307株的血清型作鉴定。将副猪嗜血杆菌FS0307株按5％的比例接种于TSB培养基，37℃培养18～24小时后，将菌液浓缩至含菌量为1×10¹⁰CFU/mL，菌液5000r/min离心10min，取上清用于琼脂扩散试验的分型抗原。配制1％琼脂平板，打孔(中间1个孔周边6个)，孔径5.0mm，孔距3.0mm。。在周边的6个孔内加入6μl副猪嗜血杆菌标准株兔抗高免血清(正上方孔标记为1，加1型高免血清，其余各个血清型的血清依次按血清型递增顺序以顺时针的方向加样)，中间孔加待检菌株的热处理分型抗原6μl，湿盒37℃孵育，分别在24h、48h、72h观察并记录结果，同时设标准菌株的对照。琼脂扩散试验表明，副猪嗜血杆菌FS0307株的高压提取抗原只与4型副猪嗜血杆菌标准株的阳性血清有沉淀线，与其它型标准株的血清型无沉淀线，说明副猪嗜血杆菌FS0307株为血清4型。

2.5动物攻毒试验

血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株经TSB/NAD液体培养基培养，进行活菌计数，浓缩后，使感染滴度达到1×10⁹CFU/ml，经腹腔注射50～60日龄健康易感猪5头，5ml/头。另设1组对照组，5头，腹腔注射TSB/NAD培养基，5ml/头。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。观察14日，每日测体温，观察临床症状。攻毒14日后剖检，根据临床症状与剖检病变计算发病数。同时，取发病猪的组织病料做细菌分离和鉴定。

攻毒结果显示，连续观察14日后，血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株攻毒组的5头实验猪均先后发病；对照猪表现正常。临床症状表现为，实验猪感染副猪嗜血杆菌分离株1日后体温升高，随后逐渐出现食欲降低，被毛粗乱，耳朵及全身皮肤发红，鼻液增多，后期出现呼吸困难，关节肿胀，卧地不起。剖检发现，发病猪和病死猪出现胸腔、腹腔积液，有不同程度的胸膜、腹膜粘连，关节肿胀、关节腔粘液增多，肺脏出血，淋巴结肿胀等病变。结果见表1。

利用分离菌株攻毒的组织病料进行细菌分离。结果从FS0307株攻毒组中的4头发病猪中分离到菌落和菌体形态与副猪嗜血杆菌标准株相似的细菌。同时对所有分离到的细菌进行PCR鉴定，结果在1038bp处出现特异性条带，证明分离病原为副猪嗜血杆菌。

表1 副猪嗜血杆菌FS0307株的毒力试验结果

“－”表示未免疫或不适用。

2.6免疫原性的测定

用TSB/NAD液体培养基培养血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株，活菌计数后，活菌培养物分别用终浓度0.3％甲醛溶液灭活12h，菌数浓缩成4×10⁹CFU/ml，经灭活检验合格后，按水油相之比1︰3乳化制备疫苗。选取2周龄左右健康易感猪25头，随机分为5组，每组5头。第1～3组每组分别免疫FS0307株疫苗0.5ml、1ml、2ml，第4组为攻毒对照组，第5组为健康对照组。各组疫苗免疫组首次免疫3周后用同等剂量疫苗加强免疫一次。首免后42日，除健康对照组5头，所有免疫组和攻毒对照组的猪转到攻毒动物房。第1～3组和第4组每组分别腹腔内注射经浓缩的FS0307株活菌培养物(菌数为(1×10⁹CFU/ml)，5ml/头4；第5组腹腔内注射TSB/NAD培养基，5ml/头。攻毒后观察14日，剖检。根据临床症状与剖检病变计算发病数与攻毒保护率。免疫攻毒保护试验结果显示，攻毒对照组5头猪均发病(其中死亡2头)，出现典型的副猪嗜血杆菌病临床症状和明显的病理变化。健康对照组的实验猪均未发病。FS0307株0.5mL免疫组的5头猪中有2头出现临床症状和病理变化，1mL免疫组的5头猪中只有1头出现剖检病变，攻毒保护率分别达3/5和4/5；而2mL免疫组的实验猪均没有发病，攻毒保护率达5/5。免疫攻毒保护情况详见表2。

表2 副猪嗜血杆菌FS0307株的免疫原性测定试验结果

“－”表示不适用。

由表2结果可见，副猪嗜血杆菌FS0307株的最小免疫保护剂量均为1mL含活菌数为1×10⁹CFU/mL。

实施例2：血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株在副猪嗜血杆菌病疫苗中的应用。

1菌种

制苗用菌种为血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株，其保藏编号为CCTCC NO:M2013094菌体、菌落形态符合副猪嗜血杆菌标准株形态，生化特性和培养特性稳定，对仔猪有较强的毒力，且有良好的免疫原性。

2生产用菌种制备

2.1一级生产种子培养取4型副猪嗜杆菌基础种子冻干物溶解后，接种于TSA/NAD固体培养基，在37℃下培养24小时，每株挑选5个以上典型菌落，分别接种于TSB/NAD液体培养基中，37℃振荡180r/min培养18～24小时。然后收获培养物，进行纯粹检验合格后，作为一级生产种子，置2～8℃下保存，保存不超过2日。

2.2二级生产种子的繁殖取一级生产种子培养物，按体积比1∶100接种TSB/NAD液体培养基，37℃振荡180r/min培养18～24小时。培养基经纯粹检验合格后，作为二级生产种子，置2～8℃下保存，保存不超过2日。

2.3制苗菌液的制备取二级生产种子培养液，按体积比1∶100接种于盛有TSB/NAD液体培养基的培养罐中，37℃振荡培养24小时，收获并取样，按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验和活菌计数。每批制苗菌液均无杂菌生长，且活菌数达4.5×10⁹CFU/ml。

3菌液的灭活

取副猪嗜血杆菌培养物300mL加入到500mL瓶中，分3瓶。每瓶滴加10％甲醛溶液，边加边混匀，使3瓶培养物的甲醛终浓度分别为0.1％、0.2％、0.3％和0.4％，然后转移到另一瓶中，置37℃灭活，每2h振摇一次。以容器内液体温度达到37℃开始计时，分别于灭活开始后的第6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h抽取样品，进行纯粹和灭活检验。四个甲醛浓度的各个时间点取样时，均无菌生长。终浓度为0.3％和0.4％的甲醛溶液灭活副猪嗜血杆菌FS0307株菌液分别在18h和12h时均未检测出活菌，如表3所示。因此，菌液的灭活方法选用终浓度为0.3％的甲醛溶液灭活18h，每2h振摇一次。灭活菌液经检验无菌生长为合格，以该灭活菌液作为制苗用抗原。

表3 不同浓度甲醛灭活副猪嗜血杆菌FS0307株培养液的结果

“+”阳性，表示有副猪嗜血杆菌生长；“－”阴性，表示无副猪嗜血杆菌生长。

4疫苗的制备

4.1副猪嗜血杆菌油佐剂灭活疫苗的制备

4.1.1佐剂制备取注射用白油94份，司本-806份，搅拌均匀，经121℃灭菌30分钟，冷却至室温备用。

4.1.2抗原准备取灭活检验合格的副猪嗜血杆菌FS0307株菌液96份，吐温-804份，搅拌混匀备用。

4.1.3制苗及分装取2.5份油相加入到无菌烧杯内，启动均质器，10000r/min，均质30～60s后，缓慢加入水相1份，继续乳化，12000～13000r/min，5～8分钟，在乳化结束前加入终浓度为0.005％的硫柳汞溶液，制成油包水型乳液。取10ml疫苗以3000r/min离心15min，试管下层析出水相少于0.5ml，乳化合格。对乳化合格的疫苗进行定量分装，加盖密封，贴标签，置2～8℃下保存.

4.2副猪嗜血杆菌水佐剂灭活疫苗的制备

4.2.1佐剂制备取Seppic ISA 201VG佐剂，加热至31℃，备用。

4.2.2抗原准备取灭活检验合格的副猪嗜血杆菌FS0307株菌液，加热至31℃，备用。

4.2.3制苗及分装按ISA 201VG佐剂和抗原质量比为1:1配比(如副猪嗜血杆菌FS0307株菌液10g，ISA 201VG佐剂10g)。每一相在混合前都需加热至31℃。将该水相抗原介质加入ISA 201VG中，保持温度在30℃，以低剪切力混合，得到稳定制剂。对乳化合格的疫苗混合均匀后定量分装，加盖密封，贴标签，置2～8℃下保存。

5疫苗成品检验

5.1外观副猪嗜血杆菌油佐剂灭活疫苗外观为乳白色均匀乳液。副猪嗜血杆菌水佐剂灭活疫苗外观为乳白色乳液，底部无明显的水液析出。

5.2剂型副猪嗜血杆菌油佐剂灭活疫苗为油包水型；取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴呈云雾状扩散外，以后各滴均不扩散，说明为油包水型。副猪嗜血杆菌水佐剂灭活疫苗为水包油包水型；取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，液滴部分自我稀释，并使水呈现出乳白色外国，说明为水包油包水型。

5.3稳定性吸取疫苗10ml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相未超过0.5ml的规定。

5.4黏度现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

5.5无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，制备的疫苗均无菌生长。

5.6硫柳汞残留量按现行《中国兽药典》附录进行检验，疫苗中硫柳汞残留量为0.006～0.007％，符合兽用生物制品通则的规定。

5.7甲醛含量测定按现行《中国兽药典》附录进行检验，疫苗中甲醛含量为0.03～0.11％，符合兽用生物制品通则的规定。

5.8安全性检验以实验室制备的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗单剂量(2mL/头)、单剂量重复(2mL/头，2次)和大剂量重复(4mL/头)颈部肌肉注射2周龄健康易感仔猪，以及大剂量(4mL/头)颈部肌肉注射妊娠90日的母猪，各组均为6头。免疫后观察仔猪和母猪的临床表现，记录仔猪和母猪的局部、全身反应，以及母猪的产仔情况；分别在接种前、接种后14日内，每日测直肠体温，大剂量接种安全试验组在免疫后30、60和90日，分别抽取2头猪，剖杀，对注射部位进行局部组织切片检查。结果表明，实验猪食欲正常、精神状况良好；母猪产仔100％健活，且无死胎和流产；疫苗免疫后24-48小时仔猪和母猪体温升高均不超过1℃，但呈明显一过性、出现时间短暂，对猪只并不产生不良影响。说明制备的疫苗安全可靠。

5.9效力试验选取2周龄健康易感仔猪，每种疫苗各颈部肌注1头份(2mL)，5头/组，21日后以同等剂量加强免疫一次。同时设立条件相同的猪作攻毒对照组、健康对照组各5头，首免后42日攻毒，攻毒后观察14日，剖检，根据临床症状与剖检病变计算发病数与攻毒保护率。结果显示，两攻毒对照组试验猪全部发病，疫苗免疫组攻毒保护率均为100％(5/5)。健康对照组猪无一发病。效力试验全部合格，说明制备的疫苗对仔猪有非常好的免疫保护力。

Claims (5)

1.一种血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备治疗猪副猪嗜血杆菌病药物中的应用；

其中，所述的血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，菌株号为FS0307，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2013094，保藏日期：2013年3月21日。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为疫苗。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为油包水型疫苗、或水包油型疫苗、或水包油包水型疫苗。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株与药学上可接受的辅料制成药物。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的应用，其特征在于，所述血清4型副猪嗜血杆菌疫苗株在药物中含菌量为2×10⁹CFU/mL以上。