CN104450556A - 一种血清 12 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血清12型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophi lus parasuis)，菌株名称为SHCM10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2014261，保藏日期：2014年6月15日；还涉及了所述的血清12型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。本发明的血清12型副猪嗜血杆菌SHCM10株生物学稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，具有很好的免疫效力，能够抵抗同型野毒株的攻击。免疫后猪群发病率和死亡率明显降低，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。

Description

一种血清 12 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌灭活疫苗领域，特别是涉及一种血清12型副猪嗜血杆菌疫苗株，还涉及该疫苗株在制备灭活疫苗中的应用以及制备灭活疫苗的方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是一种G-球杆菌，是猪的一种条件性病原菌，可引起副猪嗜血杆菌病。该病于1910年由德国学者Glasser首先报道，现已在全世界范围内广泛分布。目前，副猪嗜血杆菌感染是引起猪场仔猪高死亡率的主要病因之一。该病目前给中国猪群带来很大威胁，随着猪繁殖与呼吸综合征(PRRS，蓝耳病)的流行，副猪嗜血杆菌病给猪群造成的损失比以往更为严重。副猪嗜血杆菌只感染猪，具有很强的宿主特异性，可以影响2周龄～4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，发病率一般为10％～15％，严重时死亡率可达50％。

Hps是一种细小杆菌,在显微镜下呈多形态,非溶血性,不运动,无芽孢,无鞭毛，革兰氏阴性。新分离的菌株多呈球杆状或双球状,有时可呈短链状,在陈旧培养物中多呈多形态,有长杆状和丝状。Hps培养条件严格，生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子),不需要X因子。目前认为胰蛋白胨大豆琼脂(TSA培养基)和胰蛋白胨大豆(TSB)培养基是最适培养基。在添加了NAD和血清的TSA培养基上生长的菌落呈圆形,隆起,表面光滑,边缘整齐，灰白色半透明，针尖大小。

副猪嗜血杆菌至少有15种血清型,但临床分离菌中约20％无法定型。不同血清型的毒力不同，其中血清1、5、10、12、13、14型毒力最强,2、4、8、112型具有中等毒力,3、6、7、9、11型不能引起临床感染。从世界范围内看,血清4、5、12、13型最为流行,日本、德国、美国、西班牙、加拿大和中国以血清4型和12型最常见,澳大利亚和丹麦分离的菌株主要为血清12型和13型,但最新的研究结果表明,危害北美各猪场的Hps流行血清型发生了改变,在美国的猪场中血清型5不再广泛流行,而以血清4型(39％)和不能分型的分离株(27％)最为流行。HPS在我国普遍流行，目前，在河北、河南、湖北、安徽、上海、广东、江西、江苏等省市均有HPS病的发生报道。我国当前Hps流行的优势血清型主要为4、5、12、13型。

目前以副猪嗜血杆菌病为代表的细菌病对养猪业的危害正日益加重，从而导致大量使用抗生素进行治疗，结果导致细菌耐药性不断增强，耐药菌株不断出现，尤其是副猪嗜血杆菌，非常容易耐药，导致治疗效果不好，从而养殖户加大抗生素用量，造成恶性循环。研究表明，用同血清型的菌株制成的灭活疫苗能够有效抵抗野毒株的感染，是预防和控制副猪嗜血杆菌病最有效的措施。近年来，国内也开展了灭活疫苗的研究，显示了很好的防治效果。因此，在了解本我国主要流行菌的血清型的基础上，采用灭活疫苗进行接种，可以有效预防本病的发生。同一血清型的Hps毒力可能不同，免疫原性也不同，所以，筛选一株毒力强、免疫原性好的菌株是制备Hps灭活疫苗的关键，也是预防控制本病的重中之重。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种血清12型副猪嗜血杆菌疫苗株(SHCM10)，该菌株是一株强毒株，具有很好的免疫原性，利用该菌株可以制备出效果良好的副猪嗜血杆菌灭活疫苗。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种血清12型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，菌株名称为SHCM10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2014261，保藏日期：2014年6月15日。

该菌株由2010年5月在上海市崇明区一猪场发病猪分离获得的，具有较强的毒力和很好的免疫原性。经琼脂凝胶扩散试验证明，该菌株为血清12型。

利用该菌株通过常规方法制成不同佐剂的灭活疫苗，佐剂可以是白油佐剂、铝胶佐剂或206佐剂中的一种，分别得到的白油佐剂灭活疫苗含菌量为2.5×109CFU/mL、铝胶佐剂灭活疫苗含菌量为2.0×109CFU/mL、206佐剂灭活疫苗含菌量为2.5×109CFU/mL，可预防由血清12型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病。从而表明，该菌株是一株具有很好免疫原性。

本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种选择血清12型副猪嗜血杆菌分离株SHCM10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2014261，保藏日期：2014年6月15日；

(2)生产种子的制备，取冻干的SHCM10株，加无菌生理盐水溶解后，划线接种于TSA培养基上，37℃培养24h，挑取三个典型菌落，分别接种到3.0mLTSB液体培养基中，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，合格后按1％比例接种到TSB液体培养基中(即加入TSB液体培养基体积1％的液体菌种)，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，检验合格后，作为生产种子，置4℃，保存不超过1日；

(3)疫苗菌液的制备，取新鲜制备的生产种子，按1％比例接种到含有TSB培养基的发酵罐中，37℃振荡培养20～22h，收获并取样，进行纯粹性 检验，并测量菌液OD值，每批疫苗菌液应无杂菌生长，且活菌数达到2.0×10⁹CFU/mL；

(4)菌液的灭活，向检验合格的菌液中加入质量分数为10％的甲醛溶液，使甲醛最终的质量浓度百分比为0.2％，于37℃灭活18h，每3～4h摇动一次；

(5)灭活疫苗的制备，将灭活检验合格的菌液采用常规方法制备成白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。

上述步骤中的纯粹性检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行。

本发明的有益效果是：本发明的血清12型副猪嗜血杆菌SHCM10株生物学稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，具有很好的免疫效力，能够抵抗同型野毒株的攻击。免疫后猪群发病率和死亡率明显降低，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：血清12型副猪嗜血杆菌的分离、鉴定及生物学特性

一、副猪嗜血杆菌的分离

1、培养基的配制

(1)TSA的配制，向1000mL蒸馏水中加入TSA 40g，充分溶解后，经过121℃30min高压灭菌后，放置室温，待温度降至50℃左右，分别向TSA中添加灭活的犊牛血清和NAD(烟酰胺二嘌呤)，使血清和NAD最终的质量浓度百分比分别达到5％和0.01％，然后倒入一次性平皿中，待冷却凝固后，包装放置4℃备用。TSA平皿在4℃中保存最好不要超过30日，以免平皿中 的培养基干固，影响效果。

(2)TSB的配制，向1000mL蒸馏水中加入TSB 30g，充分溶解后，经过121℃30min高压灭菌后，放置室温，待温度降至50℃左右，分别向TSB中添加灭活的犊牛血清和NAD(烟酰胺二嘌呤)，使血清和NAD最终的质量浓度百分比分别达到5％和0.01％，放置4℃备用。TSB平皿在4℃中保存最好不要超过30日，以免影响培养效果。

2、病原菌的分离

2010年5月，在上海崇明区某养猪场出现临床疑似副猪嗜血杆菌污染的病猪，解剖后，表现出胸膜炎、心包炎、关节肿胀。用无菌接种环从疑似病猪新鲜的心包积液、关节液中取样，在TSA培养基(含质量浓度百分比5％血清和0.001％的NAD)上划线接种，37℃培养24h～48h。挑取单个半透明隆起的小菌落，在TSA固体培养基上采取分区划线法，进行2次单菌落纯化培养，直至无任何杂菌为止。

二、副猪嗜血杆菌的鉴定

1、镜检

挑取上述纯化培养的单菌落在事先滴有生理盐水的载玻片上涂菌，按照常规革兰氏染色法进行染色，在光学显微镜观察。在显微镜下可见，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、甚至有细丝状的菌体。

2、NAD依赖性试验

用接种环挑取上述纯化的单菌落，水平划线于无NAD的TSA平皿上，同时挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平划线，37℃培养24h～48h，观察是否出现“卫星生长现象”，即在葡萄球菌苔附近的的菌落较大，远侧的菌落较小甚至没有菌落存在。如果为副猪嗜血杆菌应该出现“卫星生长现象”。

3、生化鉴定试验

挑取分离纯化的疑似副猪嗜血杆菌的单菌落，水平划线于TSA培养基上，于37℃培养14h～16h，然后分别接种含NAD的微量生化管，于37℃培养48h，结果为发酵半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、和木糖，不发酵蔗糖和甘露醇。硝酸盐还原试验、接触酶试验阳性，吲哚试验、脲酶试验、氧化酶试验阴性。生化结果表明该菌符合副猪嗜血杆菌的生化特征。

4、16S rRNA基因序列测定与分析

(1)引物设计，参照Olveira S等发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列设计引物,目的片段为822bp。

上游引物：5′-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3′

下游引物：5′-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3′

PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

(2)细菌DNA模板的制备，将待检菌株菌液12000r/min离心3min，弃去上清液后，用无菌DEPC水悬浮，在振荡器上涡旋1min，于沸水中水浴20min，取出后置于-20℃冰箱中冻结。冻融后12000r/min离心1min，上清液即为模板DNA。

(3)PCR的扩增，以菌液DNA为模板，反应体系(50μl)如表1所示：

表1 PCR扩增反应体系 

rTaq-Mix	25μl
		DEPC水	22μl
上游引物	1.0μl
		下游引物	1.0μl
模板DNA	1.0μl
		总体积	50ul

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40S，60℃退火40S，72℃延伸1min，运行30个循环；72℃再延伸10min，PCR产物4℃保存。以DEPC水为 模板作阴性对照。

用1×TAE电泳缓冲液配制的终浓度1.2％琼脂糖制胶，取上述PCR产物5μl进行电泳，结果在预期位置出现822bp目的条带。

(4)16S rRNA PCR扩增产物测序

利用DNA凝胶回收试剂盒回收扩增的PCR产物(DNA片段)，然后与pMD18-T克隆载体连接，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将测得的序列与GenBank上的相应序列进行比较，结果显示16S rRNA与副猪嗜血杆菌的核苷酸同源性99.2％以上。

5、血清学分型 

根据KeilSteia和Rapp-GabrielSon(1992)所建立的琼脂扩散试验(Gel diffusion，GD)血清学分型的方法对分离的副猪嗜血杆菌进行血清学分型。大致过程如下：将该菌株密集划线接种于TSA培养基，37℃培养24h后，用PBS洗下菌落，将菌液调整为5.0×10⁹CFU/mL，121℃高压2h，然后对菌液8000r/mim进行离心10min，取上清作为分型抗原。用生理盐水配制1％琼脂糖凝胶，置于微波炉10min融解，加入含量0.1g/100ml硫柳汞防腐，倒平板3mm～4mm厚，用打孔器在平板上打孔(孔径3mm，孔间距4mm)；然后在中央孔加分离菌沉淀抗原，周围孔加标准的阳性血清，放入湿盒中，于37℃24h～48h后观察结果。主要观察抗原与抗体孔之间的是否出现清晰的白色沉淀线，若有则判定为阳性，反之则判定为阴性。结果为抗原与12型阳性血清发生反应，出现白色沉淀，证明分离的菌株为血清12型副猪嗜血杆菌，并命名为SHCM10。

三、副猪嗜血杆菌的生物学特性

1、副猪嗜血杆菌SHCM10株外膜蛋白Oapm5序列测定

根据已发表的副猪嗜血杆菌Oamp5的序列，设计引物，扩增SHCM10株Oapm5基因并进行核苷酸序列测定。通过在NCBI网站的BLAST进行搜索，结 果表明该菌种与当前流行的副猪嗜血杆菌相似性高，具有较近的遗传进化关系，对当前流行菌株具有较高的免疫保护。

2、副猪嗜血杆菌SHCM10株保存时间的确定

将新鲜培养的副猪嗜血杆菌SHCM10株分别保存于TSA、TSB、甘油+血清、卵黄液和卵黄液(冻干)，保存在4℃和-80℃。保存不同时间后取出进行复壮，以寻找合适的保存方法。结果见表1。结果表明，副猪嗜血杆菌在不同环境条件的生存时间差异很大，保存于TSA或TSB培养基中的菌在4℃保存时间很短，尤其是在TSB中。甘油+血清、卵黄液中的菌在-80℃可保1.5年，而冻干的菌保存于-70℃冻存，可以存活3年以上。结果如表2所示。

表2 SHCM10株在不同条件下存活时间

3、动物致病性试验

副猪嗜血杆菌SHCM10株接种到含质量浓度百分比5％血清和0.001％的NDA的TSB液体培养基，使活菌数达到1.0×10⁹CFU/mL，经腹腔注射45日龄健康易感猪，5mL/头，另设1组5头作对照，腹腔注射相同剂量的TSB培养液。攻菌后，连续观察14日，每日测体温，并观察临床症状，包括采食和饮水量的变化。14日后剖杀所有猪，根据临床症状和剖检病变计算发病数量。同时取肺组织和肿大的关节液做细菌分离和鉴定。

结果见表3，显示，在连续观察14天期间，攻击SHCM10株的5头均先后发病，并有4头死亡，对照猪表现正常。攻菌猪表现为体温升高1～2日，最高达41.5℃，体温逐渐下降，在猪死亡前，体温低于正常。攻菌后采食量降低，被毛粗乱，喜卧，到后期死亡前呼吸困难。剖检后表现出同样的症状，主要为胸腔积液，有大量纤维性渗出，导致胸膜粘连，肺部淋巴结肿大，肺 有间质水肿，心包积液增多，有大量纤维素性渗出。从发病猪的关节和肺部采样，分离到副猪嗜血杆菌，而对照5头猪全部没有分离到副猪嗜血杆菌。

表3 SHCM10株攻击结果 

组别	动物数量	死亡数	细菌分离数
				攻击组	5	4/5	4/5
对照组	5	0/5	0/5

4、副猪嗜血杆菌SHCM10株的免疫原性试验

(1)副猪嗜血杆菌不同佐剂单价灭活疫苗的制备

a、菌液的制备 

将副猪嗜血杆菌SHCM10株接种在TSA固体培养基上复苏，然后接种于TSB液体培养基中，在摇床内37℃培养14h～16h，再将种子液按培养基总体积的3％接种于TSB液体培养基，37℃，170r/min振荡扩大培养20h～22h，测定菌液OD600值，根据活菌数与OD600值相关性，计算细菌总数。向菌液中加入最终的质量浓度百分比0.2％的甲醛灭活细菌，置于37℃恒温箱灭活18h，灭活期间，每5h摇动一次。到时间后，取灭活的菌液，在TSA固体培养基划线培养，置于37℃培养48h，观察是否有菌落长出以确定灭活效果。将完全灭活的菌液4500r/min离心20min，弃去上清，生理盐水悬浮沉淀，洗涤2次，最后一次加入适当体积的生理盐水，使菌液浓度为1.0×10¹⁰CFU/mL，向其中加入最终的质量浓度百分数为0.01％的硫柳汞溶液，置4℃保存备用。

b、不同佐剂疫苗的配制

白油佐剂灭活疫苗的配制：将灭活检验合格的菌液按体积加入最终的质量浓度百分数为4％的灭菌吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解，制成灭活疫苗水相。向矿物油中加入质量浓度百分数为5％的span80制成油相。将白油佐剂加入到实验室高速分散机搅拌器中，开动分散器进行缓慢搅拌，按油相： 水相3：1的比例，向其中加入水相，再加入最终的质量浓度百分数为0.01％的硫柳汞溶液，水相完全加入后，开动电机乳化5min～10min，直至乳化完全。白油佐剂灭活疫苗成品中细菌的含量为2.5×10⁹CFU/mL，置于4℃保存。

铝胶佐剂灭活疫苗的配制：将灭活检验合格的菌液调整为2.5×10⁹CFU/mL，与等量的质量分数为20％的灭菌氢氧化铝盐水稀释液混合，室温下搅拌20min，在室温下静置24h，吸出总体积1/2的上清液，加入最终的质量浓度百分数为0.01％的硫柳汞溶液。铝胶佐剂灭活疫苗成品中细菌的含量为2.0×10⁹CFU/mL，置于4℃保存。

206佐剂灭活疫苗(w/o/w)的配制：将灭活检验合格的菌液调整为5.0×10⁹CFU/mL。将206佐剂加入到搅拌器中缓慢搅拌，向其中缓慢加入等体积灭菌菌液，再加入最终的质量浓度百分数为0.01％的硫柳汞溶液。按206佐剂的操作说明进行乳化。206佐剂灭活疫苗成品中细菌的含量为2.5×10⁹CFU/mL，置于4℃保存。

c、不同佐剂单价灭活疫苗的免疫原性

取40只5周龄豚鼠，平均分4组，每组10只，1～3组分别接种白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗和206佐剂灭活疫苗，每只颈部皮下注射0.5mL，第4组作对照。第一次接种后14天，重复接种一次，剂量同第一次。第二次接种21天后，采血分离血清。用微量板凝集试验检测各组每头豚鼠的抗体效价。结果见表4，从表中可见，副猪嗜血杆菌SHCM10株与不同类型佐剂混合，匀可引起很高的抗体效价，抗体效价为微量板凝集试验抗体效价(xlog2)，其中铝胶组引起的效价最高，其次是矿物油佐剂组，最低的是206佐剂组。

表4二兔后21日各组抗体效价

实施例2：分离株SHCM10株在副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用

一、菌种选择 

选择血清12型副猪嗜血杆菌分离株SHCM10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2014261，保藏日期：2014年6月15日；

二、生产种子的制备

取冻干的SHCM10株，加无菌生理盐水溶解后，划线接种于TSA培养基上，37℃培养24h，挑取三个典型菌落，分别接种到3.0mLTSB液体培养基中，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验(按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，以下纯粹性检验也是如此)，合格后按1％比例接种到TSB液体培养基中(即加入TSB液体培养基体积1％的液体菌种)，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，检验合格后，作为生产种子，置4℃，保存不超过1日；

三、疫苗菌液的制备

取新鲜制备的生产种子，按1％比例接种到含有TSB培养基的发酵罐中，37℃振荡培养20～22h，收获并取样，进行纯粹性检验，并测量菌液OD值，每批疫苗菌液应无杂菌生长，且活菌数达到2.0×109CFU/mL；

四、菌液的灭活

向检验合格的菌液中加入质量分数为10％的甲醛溶液，使甲醛最终的质量浓度百分比为0.2％，于37℃灭活18h，每3～4h摇动一次；

五、灭活疫苗的制备

将灭活检验合格的菌液采用实施例1中所述的方法制备成白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。

六、疫苗成品检验

1、外观：静置10h，分上下2层，上层为清澈无色，下层为乳白色；摇动疫苗，呈现乳白色均匀的混悬液。

2、无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，无杂菌生长。

3、甲醛含量测定：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，甲醛含量(质量浓度百分数)为0.05％～0.10％，符合兽用生物制品通则的规定。

4:安全性检验：以实验室制备的灭活疫苗单剂量(2.0mL)、单剂量重复和超剂量(2倍单剂量)，分别经颈部肌肉注射2～3周龄健康易感仔猪，每组5头，另设5头注射相同剂量的PBS；同时，2倍单剂量注射妊娠90日的母猪5头，另设5头注射相同剂量的PBS。所有猪连续观察14日，每天在固定时间内测量每头猪的体温，观察注射部位和全身反应，包括采食和饮水量，重点检查注射部位的变化。结果在观察期内，仔猪没有出现任何由疫苗引起的局部和全身不良反应，母猪没有出现流产和死胎。说明制备的疫苗具有很好的安全性。

5、灭活疫苗的效力试验：用2周龄健康仔猪10头，其中5头猪颈部肌肉接种疫苗，剂量为2.0mL/头，14日后，以相同剂量再接种一次；另5头作对照组，接种相同剂量的PBS。二免后21日，用新鲜培养的副猪嗜血杆菌SHCM10株腹腔注射，5.0×10⁹CFU/头，攻菌后连续观察14日，剖检，根据临床症状和剖检病变统计攻毒保护率。在观察期间，主要观察临床症状。动物的发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5天)、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跋行和被毛粗乱等临床症状。死亡的猪进行解剖，可见胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等多发性浆膜和关节炎的病变，各浆膜面出现浆液性或纤维素性渗出物。结果显示，对照组全部发病，并有4头死亡，而免疫组全部保护，没有出现任何临床症状，保护率 为100％(5/5)，说明疫苗对仔猪具有很好的免疫效力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种血清12型副猪嗜血杆菌疫苗株，其特征在于，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，菌株名称为SHCM10，已保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2014261，保藏日期：2014年6月15日。

2.一种如权利要求1所述血清12型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述白油佐剂灭活疫苗中含菌量为2.5×10⁹CFU/mL。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述铝胶佐剂灭活疫苗中含菌量为2.0×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述206佐剂灭活疫苗中含菌量为2.5×10⁹CFU/mL。

7.一种副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种选择血清12型副猪嗜血杆菌分离株SHCM10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2014261，保藏日期：2014年6月15日；

(2)生产种子的制备，取冻干的SHCM10株，加无菌生理盐水溶解后，划线接种于TSA培养基上，37℃培养24h，挑取三个典型菌落，分别接种到3.0mLTSB液体培养基中，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，合格后按1％比例接种到TSB液体培养基中，37℃振荡培养20～22h，收获培养物，进行纯粹性检验，检验合格后，作为生产种子，置4℃，保存不超过1日；

(3)疫苗菌液的制备，取新鲜制备的生产种子，按1％比例接种到含有TSB培养基的发酵罐中，37℃振荡培养20～22h，收获并取样，进行纯粹性检验，并测量菌液OD值，每批疫苗菌液应无杂菌生长，且活菌数达到2.0×10⁹CFU/mL；

(4)菌液的灭活，向检验合格的菌液中加入质量分数为10％的甲醛溶液，使甲醛最终的质量浓度百分比为0.2％，于37℃灭活18h，每3～4h摇动一次；

(5)灭活疫苗的制备，将灭活检验合格的菌液采用常规方法制备成白油佐剂灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。