CN106434480A - 一种高密度发酵培养副猪嗜血杆菌的方法 - Google Patents

一种高密度发酵培养副猪嗜血杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高密度培养副猪嗜血杆菌的方法。本发明的培养方法通过使用高密度发酵罐培养技术，控制培养过程中的搅拌速度、溶氧量pH值和培养时间，利于副猪嗜血杆菌的生长，使活菌数均不低于109CFU/ml，并将该技术培养的副猪嗜血杆菌菌液制备灭活疫苗，其安全性和免疫效力均良好。

Description

一种高密度发酵培养副猪嗜血杆菌的方法
技术领域
本发明属于病原培养技术领域，具体涉及一种用于高密度培养副猪嗜血杆菌的方法。
背景技术
猪副猪嗜血杆菌病，又称猪革拉斯氏病( disease)，是由副猪嗜血杆菌引起的以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的传染病，是近年来严重危害世界养猪业发展的重要细菌性传染病之一。目前，已经证实副猪嗜血杆菌在我国绝大多数猪场存在和流行，主要影响5～8周龄的仔猪，发病率一般为l0％～15％，严重时死亡率可达50％以上，给我国养猪业造成巨大的经济损失。但目前针对副猪嗜血杆菌的培养技术和方法存在很多问题，比如培养时间长、培养密度低等，均造成培养成本高。这都对该疫苗的研究造成严重影响，因此研制一种副猪嗜血杆菌的高密度培养技术，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的发明目的在于针对现有技术中的不足，提供一种高密度发酵培养副猪嗜血杆菌的方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明的高密度发酵培养副猪嗜血杆菌的方法，是在发酵罐中对接种了种子液的培养基进行发酵，其中发酵温度为36-37℃，搅拌速度为100r/min、pH值为7.2～7.4、溶解氧(DO)为60％～80％、培养时间为12～14h。
本发明的液体培养基，其包含有如下的组分：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、葡萄糖、酵母粉、牛血清和辅酶Ⅰ，其pH值为7.2～7.4。
其组分浓度为胰蛋白胨18～25.0g/L、大豆蛋白胨3.0～5.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾3.0～4.0g/L、葡萄糖2.0～3.0g/L、酵母粉1.0～5.0g/L、灭活牛血清30ml/L～100ml/L、辅酶Ⅰ1.0～30g/L，pH值调至7.2～7.4。
作为优选，其组分浓度为胰蛋白胨22.0g/L、大豆蛋白胨4.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾3.0g/L、葡萄糖2.5g/L、酵母粉3.0g/L、灭活牛血清50ml/L、辅酶Ⅰ0.1g/L，pH值调至7.2～7.4。
上述培养基的制备方法如下：
分别称取胰蛋白胨，大豆蛋白，氯化钠，磷酸氢二钾，葡萄糖，酵母粉，加入去离子水，定容后充分摇匀溶解，调pH值至7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌15min；冷却后，按无菌要求加入灭活牛血清和过滤除菌的1％NAD辅酶Ⅰ。
本发明的培养方法通过使用高密度发酵罐培养技术，控制培养过程中的搅拌速度、溶氧量pH值和培养时间，利于副猪嗜血杆菌的生长，使活菌数均不低于109CFU/ml，并将该技术培养的副猪嗜血杆菌菌液制备灭活疫苗，其安全性和免疫效力均良好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1按照不同配方制备本发明培养基
1培养基制备按不同的培养基配方配制6种不同成分的培养基。具体配方见表1。
表1 液体培养基制备方法
实施例2不同配方液体培养基的筛选：
将副猪嗜血杆菌YBH05株(副猪嗜血杆菌已于2011年11月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.5480)的菌液，分别按5％接种上述6种液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养，培养时间均为24小时，于培养不同时间分别取样进行活菌计数。不同配方液体培养基的筛选试验结果表明，按照配方三、配方四制备的液体培养基培养效果较好，14～16小时活菌数均不低于109CCU/ml，配方五和配方六因为培养基中的血清等辅液成分加入量较高，使培养基营养过于丰富，导致YBH05株生长过快，衰亡也较快，且血清等辅液成分加入量高，也增加了生产成本；配方一和配方二培养菌液密度较低。综合考虑，最终选择配方三制备的液体培养基来验证培养效果。
结果见表2。
表2：6种液体培养基培养不同时间活菌计数结果
实施例3：本发明培养基与胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基培养效果比较
将YBH05株冻干种子复苏纯化后，按3-5％分别接种胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基和本发明的配方三的液体培养基，分别置37℃，150r/min振荡培养24小时，于培养不同时间分别取样进行活菌计数。试验结果表明，应用本发明培养基，不同培养时间的活菌量均高于胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基。不同培养时间的活菌量结果见表3。
表3：培养基的选择试验结果
实施例4：发酵培养条件优化
试验结果表明，当发酵培养温度为36-37℃、搅拌速度为100r/min、pH值为7.2～7.4、溶氧(DO)为60％～80％、培养12～14h时，YBH05株的活菌数最高，结果详见表4～表6。
表4 YBH05株在不同搅拌转速下培养活菌数测定结果
表5 YBH05株在不同pH值下搅拌培养活菌数测定结果
表6 YBH05株在不同溶氧条件下培养活菌数测定结果
实施例5：培养条件验证
本发明培养方法的验证应用本发明培养方法发酵培养3批YBH05株菌液，分别进行活菌计数，以验证培养工艺的可行性。验证结果表明，YBH05株的菌液活菌量为2.5～3.0×109CFU/ml，本发明培养基的培养效果确实可行。结果见表7。
表7 本发明验证结果
实施例6：应用该发明的培养方法培养的菌液制备疫苗
应用发酵培养的3批YBH05株菌液，离心后，用生理盐水稀释至4.0×109CFU/ml，灭活后，和201佐剂按质量比1:1乳化后，制备单价灭活疫苗。进行安全性检验，颈部肌肉注射21日龄仔猪4.0ml.头，观察14日后，仔猪未出现全身或局部不良反应。
将单价灭活疫苗颈部肌肉注射21日龄仔猪，2.0ml/头，一免后21日加强免疫，免疫后14日，采血检测5型抗体，并用YBH05株进行腹腔注射攻毒3.0ml/头(6.0×109CFU)，观察14日，观察仔猪的发病或死亡情况。结果表明，免疫组抗体5/5均大于等于1:32，对照组均小于1:4；攻毒后免疫组5/5保护，对照组4/5发病。结果见表8。
表8：3批疫苗的安全性和效力结果
该发明培养技术培养时间短、培养密度大，很适合副猪嗜血杆菌的大规模培养；用该技术培养的菌液制备的疫苗，安全性和效力均良好。

Claims (5)

1.一种发酵培养副猪嗜血杆菌的方法，其特征在于，所述的方法是在发酵罐中的液体培养基接种了种子液，再进行发酵，其中发酵温度为36-37℃，搅拌速度为100r/min、pH值为7.2～7.4、溶解氧(DO)为60％～80％、培养时间为12～14h。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基中包含有如下的组分：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、葡萄糖、酵母粉、牛血清和辅酶Ⅰ，其pH值为7.2～7.4。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组分浓度如下：胰蛋白胨18～25.0g/L、大豆蛋白胨3.0～5.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾3.0～4.0g/L、葡萄糖2.0～3.0g/L、酵母粉1.0～5.0g/L、灭活牛血清30ml/L～100ml/L、辅酶Ⅰ1.0～30g/L，pH值调至7.2～7.4。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的组分浓度如下：胰蛋白胨22.0g/L、大豆蛋白胨4.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾3.0g/L、葡萄糖2.5g/L、酵母粉3.0g/L、灭活牛血清50ml/L、辅酶Ⅰ0.1g/L，pH值调至7.2～7.4。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养基的制备方法如下：
分别称取胰蛋白胨，大豆蛋白，氯化钠，磷酸氢二钾，葡萄糖，酵母粉，加入去离子水，定容后充分摇匀溶解，调pH值至7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌15min；冷却后，按无菌要求加入灭活牛血清和过滤除菌的1％NAD辅酶Ⅰ。
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