CN105695362A - 一种用于培养鸡滑液囊支原体的液体培养基 - Google Patents

一种用于培养鸡滑液囊支原体的液体培养基 Download PDF

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宋新宇
张志鸿
窦小龙
郭玉广
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朱艳梅
申洪银
刘新文
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Abstract

本发明提供一种鸡滑液囊支原体培养用的液体培养基，其包含有如下的组分：PPLO肉汤、葡萄糖、灭活马血清、酵母浸出液、酚红溶液、辅酶I溶液、L-半胱氨酸溶液，其pH值为7.6～7.8。本发明的培养基通过补充各种微生物所需要的营养成分，并通过氢氧化钠有效控制培养基中的pH值，有利于鸡滑液囊支原体的生长，活菌数均不低于109CCU/ml，并将鸡液囊支原体菌液制备灭活疫苗，其安全性和免疫效力均良好。

Description

一种用于培养鸡滑液囊支原体的液体培养基
技术领域
本发明属于病原培养技术领域，具体涉及一种用于培养鸡滑液囊支原体的液体培养基。
背景技术
鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)又称鸡传染性滑膜炎，是由鸡滑液囊支原体引起鸡和火鸡等的一种急性或慢性传染病。传染性滑膜炎是Olson等(1964)首先报道的。本病以侵害关节滑液，腱鞘膜为主，其特征为关节、腱鞘和足掌肿胀等。鸡群感染该病可导致明显的跛行、生长发育迟缓及胴体降级等。鸡群如存在该病原时，易发生混合感染，加剧病情，死亡率增高，造成严重的经济损失。鸡滑液囊支原体病原为滑液囊支原体，本菌经姬姆萨染色的菌体形态为多形态的球状菌，直径约为0.2μm。不同菌株的致病力有所差异，引起的症状也因病原的趋向性而不同。即发酵葡萄糖，不水解精氨酸，不利用尿素。但目前针对鸡滑液囊支体的培养存在很多问题，比如培养基成本高、营养要求高、pH值要求严格，培养密度低等。
发明内容
本发明的发明目的在于针对现有技术中的不足，提供一种高效能、低成本的鸡滑液囊支原体液体培养基的制备，从而弥补现有技术的不足。
本发明的液体培养基，其包含有如下的组分：PPLO肉汤、葡萄糖、灭活马血清、酵母浸出液、酚红溶液、辅酶I溶液、L-半胱氨酸溶液，其pH值为7.6～7.8。
其组分浓度为PPLO肉汤21.0g/L、葡萄糖5.0g/L、灭活马血清200～300ml/L、25％酵母浸出液200～300ml/L、1％酚红溶液1.0ml/L、1％辅酶I溶液20～30ml/L、1％L-半胱氨酸溶液20～30ml/L，pH值调至7.6～7.8。
作为优选，上述的培养基中还添加有青霉素；其添加浓度为80万单位/L。
上述培养基的制备方法如下：
1)基础液配制：
取PPLO肉汤、葡萄糖加水溶液后，再加入酚红溶液，混合溶解后，在116℃高压灭菌30分钟，冷却后置2～8℃保存；
2)培养基配制：
将基础液冷却后，无菌条件下加入灭活马血清、酵母浸出液、青霉素溶液、辅酶I溶液、L-半胱氨酸溶液，再用氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8完成制备。
本发明的培养基通过补充各种微生物所需要的营养成分，并通过氢氧化钠有效控制培养基中的pH值，有利于鸡滑液囊支原体的生长，活菌数均不低于109CCU/ml，并将鸡滑液囊支原体菌液制备灭活疫苗，其安全性和免疫效力均良好。
具体实施方式
实施例1按照不同配方制备本发明培养基
1培养基制备
1.1基础液配制取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5.0g、去离子水加至1000ml、1％酚红溶液1.0ml，上述成分混合溶解后，116℃高压灭菌30分钟，冷却后置2～8℃保存。
1.2培养基制备将基础液冷却后无菌加入不同量灭活马血清、25％酵母浸出液、1％辅酶I溶液、1％L-半胱氨酸溶液，80万单位/ml青霉素溶液均加入1.2ml，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6，制备了6种液体培养基。具体配方见表1。
表1：液体培养基制备方法
实施例2不同配方液体培养基的筛选：
将鸡滑液囊支原体YBF-MS1株(MycoplasmasynoviaeYBF-MS1)(鸡滑液囊支原体已保藏于位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年3月3日，保藏号为：CCTCCNO:M2016080。)的菌液，分别按10％接种上述6种液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养，培养时间均为36小时，于培养不同时间分别取样进行活菌计数。不同配方液体培养基的筛选试验结果表明，按照配方二、配方三、配方五、配方六制备的液体培养基培养效果较好，24～30小时活菌数均不低于109CCU/ml，配方三和配方六因为培养基中的血清等辅液成分加入量较高，使培养基营养过于丰富，导致YBF-MS1株生长过快，同时衰老的也快；且血清等辅液成分加入量高，也增加了生产成本，配方二培养时间略长，综合考虑，最终选择配方五制备的液体培养基来验证培养效果。结果见下表。
表26种液体培养基培养不同时间活菌计数结果
实施例3：本发明培养基与改良Frey氏液体培养基培养效果比较
将YBF-MS1株冻干种子复苏后，按10％将种子液分别接种改良Frey氏液体培养基和本发明的配方五的液体培养基，分别置37℃，150r/min振荡培养36小时，于培养不同时间分别取样进行活菌计数。试验结果表明，应用本发明培养基，不同培养时间的活菌量均高于应用改良Frey氏液体培养基，不同培养时间的活菌量。结果见表3。
表3：培养基的选择试验结果
实施例4：
本发明培养基的验证应用本发明配方五的培养基扩大培养4批YBF‐MS1株菌液，分别进行活菌计数，以验证培养工艺的可行性。验证结果表明，本发明的培养效果确实可行。结果见表4。
表4：本发明验证结果
使用其它鸡滑液囊支原体作为种子的培养效果也表明本发明方法具有很好的效果。
由上述试验结果可以看出本发明培养基在培养过程中培养时间短，生长快、活菌量高，非常适合鸡滑液囊支原体的大规模生产培养。

Claims (9)

1.一种液体培养基，其特征在于，所述的液体培养基其包含有如下的组分：PPLO肉汤、葡萄糖、灭活马血清、酵母浸出液、酚红溶液、辅酶I溶液、L-半胱氨酸溶液，其pH值为7.6～7.8。
2.如权利要求1所述的液体培养基，其特征在于，所述的液体培养基，其组分浓度如下：PPLO肉汤21.0g/L、葡萄糖5.0g/L、灭活马血清200～300ml/L、25％酵母浸出液200～300ml/L、1％酚红溶液1.0ml/L、1％辅酶I溶液20～30ml/L、1％L-半胱氨酸溶液20～30ml/L，pH值调至7.6～7.8。
3.如权利要求1或2所述的液体培养基，其特征在于，所述的液体培养基中还添加有抗生素。
4.如权利要求3所述的液体培养基，其特征在于，所述的抗生素为青霉素。
5.如权利要求4所述的液体培养基，其特征在于，所述的青霉素的添加浓度为80万单位/L。
6.权利要求1或2所述的液体培养基的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)基础液配制：
取PPLO肉汤、葡萄糖加水溶液后，再加入酚红溶液，混合溶解后，在116℃高压灭菌30分钟，冷却后置2～8℃保存；
2)培养基配制：
将基础液冷却后，无菌条件下加入灭活马血清、酵母浸出液、辅酶I溶液、L-半胱氨酸溶液，再用氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8完成制备。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中同时添加青霉素溶液。
8.权利要求1或2所述的液体培养基在培养鸡滑液囊支原体中的应用。
9.权利要求3所述的液体培养基在培养鸡滑液囊支原体中的应用。
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