CN103479995A

CN103479995A - 鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN103479995A
Application number: CN201310462976.6A
Authority: CN
Inventors: 丁美娟; 张海涛; 徐静
Original assignee: NANJING TIANBANG BIO-INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: Zhaofenghua Biotechnology (Nanjing) Co., Ltd
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-10-08
Also published as: CN103479995B

Abstract

本发明涉及一种鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备方法。本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好的鸡毒支原体强毒CR株及鸡滑液囊支原体HN01株接种于适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂混合乳化制成。用于预防鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体病。本发明的鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗免疫接种，可同时预防两种病原，减轻免疫接种的工作量，制备出的疫苗性能稳定，免疫效果好，更适合我国生产实际。

Description

鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品制备与禽病防治技术领域。

背景技术

鸡毒支原体病（MG）是鸡的一种慢性呼吸道传染病，以呼吸道发生啰音、流鼻液和气囊炎为特征。鸡滑液囊支原体病（MS），主要特征为关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎。鸡毒支原体病、鸡滑液囊支原体病，常与其它细菌或病毒混合感染致使鸡群发病率死亡率均很高，对养鸡业带来了巨大的经济损失。

鸡毒支原体病和鸡滑液囊支原体病的共同特点是造成雏鸡的弱雏率升高，蛋鸡的产蛋率、肉鸡的体重及饲料转化率均下降，使用药物治疗时，易产生耐药性，效果也不理想。目前鸡滑液囊支原体灭活疫苗在国内报道是空白，而国内养殖场，鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体这两种病原体常常混合感染，致使鸡群饲料利用率和产蛋率低下，加之昂贵的药物治疗费用，使这两种病原成为制约养鸡业快速发展的瓶颈。因此研制鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗具有重大现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备方法，用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体病的免疫预防。

本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。

一种鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备方法按照下述步骤和方法制备：

1、鸡毒支原体制苗用培养基及其制备方法：

(1)基础培养基成分：PPLO肉汤20.0-25.5g、酵母浸出粉3-7g、葡萄糖7-9g、质量浓度为0.4%的酚红溶液2ml、去离子水700—800ml。

(2)成品培养基制备方法：将上述（1）培养基成分121℃高压灭菌15分钟，冷却后加入滤过除菌的150-200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%NaOH调PH7.6～7.8，无菌分装，2～8℃保存备用。

2、鸡滑液囊支原体制苗用培养基及其制备方法：

(1)基础培养基成分：PPLO肉汤20.0～25.5g、水解乳蛋白5～8 g、酵母浸出粉3～7g、烟酰胺0.3 g、质量浓度为0.4%的酚红溶液2ml、去离子水700～800ml。

3、鸡毒支原体菌液和鸡滑液囊支原体菌液的培养及灭活疫苗的制备：

(1)将鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体按1：10的比例接种于鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体成品培养基中，在36～37℃培养24～48h收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1：10的比例再接种传代1次收获作为二级种子液；

（2）采用机械搅拌发酵罐连续增菌培养鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体菌液：先将发酵罐中鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体基础培养基成分进行灭菌，待温度降至37～38℃时，按1：5～1：10的比例接种鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体二级种子液。调节PH、补料，采用连续增菌培养方式，PH为7.6～7.8，37℃恒温培养，罐压为0.03～0.05Pa，溶氧量为40%，待PH下降至6.5左右，添加基础培养基为原培养体积的30%，用20%NaOH调PH7.6～7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养PH下降到6.4时，加甲醛溶液灭活，连续增菌培养结束，留样检验，置2～8℃保存，不超过2日。

（3）根据活菌计数结果，鸡毒支原体菌液浓度达到10⁸～10⁹CCU/mL，鸡滑液囊支原体菌液浓度达到10⁸～10⁹CCU/mL;

（4）灭活疫苗的配制与疫苗乳化：将鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体灭活菌液按体积比1:1等比例混合后，取96份混合灭活菌液，加入4份吐温-80，混匀后作为水相溶液备用；取96份注射用白油，加入4份司本-80，混匀后作为油相溶液备用；将油相溶液和水相溶液按照体积比2.8～3.5:1混和均匀，即获得鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗。

4、有益效果

本发明首次将鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体这两种优势病原联合制备二联灭活疫苗，其中鸡毒支原体CR株购自中国兽医药品监察所，鸡滑液囊支原体HN01株，是发明人自行分离、筛选、鉴定的，该菌株免疫原性好，本发明可以有效地预防鸡毒支原体病和鸡滑液囊支原体病的感染。

具体实施方式

实施例1 鸡滑液囊支原体HN01株的分离与鉴定

1. 病料

病料为无菌采集疑似鸡滑液囊支原体感染病鸡肿胀跗关节腔内的关节液及内容物。

2 分离培养及形态观察

对采集样品进行支原体的分离培养，置37℃温箱培养，待培养液变为橙色或黄色时，接种到新的培养液中传代，取培养物涂片，瑞氏染色，油镜下观察菌体形态。液体培养基培养1d后颜色变黄，分离菌菌落经瑞氏染色，在油镜下呈球形或椭圆形。普通血平板上无细菌生长。菌落在固体培养基上表现为细小、光滑、致密的小菌落，半凹陷于培养基内，在低倍镜下观察到菌落形态为特征性的“煎蛋状”。

3 L型细菌检验

分离菌在不含青霉素和醋酸铊的鸡滑液囊支原体液体培养基上连续传10代，菌体仍保持原有形态，且可通过0.45μm的滤器，说明分离株不是细菌和病毒。

4 鸡红细胞吸附试验

分离菌与鸡红细胞液作用一段时间后，在低倍显微镜下可见菌落表面吸附红细胞。

5 生化试验

该分离菌能够分解葡萄糖和麦芽糖，但不能水解精氨酸和尿素。

6 鸡胚感染试验

5枚SPF鸡胚接种该分离菌后于120~144h全部死亡，对照组正常。死亡鸡胚主要表现为胚体萎缩，从卵黄液中可以重新分离到该菌株。

7 血清学试验

液体培养物37℃培养3代后，离心收集沉淀做平板凝集试验，结果该分离菌能够与鸡滑液囊支原体标准阳性血清呈凝集反应，而与鸡毒支原体标准阳性血清不产生凝集反应。血清学试验结果表明该菌体为鸡滑液囊支原体。

8 鸡人工感染试验

取纯化的分离菌接种5只30日龄SPF鸡，连续观察10天，食欲减退，鸡冠苍白，不愿站立，羽毛蓬乱，跗关节、趾关节肿胀，爪垫肿胀突出，病鸡滑膜组织有淡黄色粘性渗出物，渗出液呈脓稠状。而用鸡滑液囊支原体液体培养基接种5只30日龄SPF鸡做对照组，食欲正常，关节处均未见明显肿胀。从人工感染的鸡肿胀关节处的关节液中能再次分离到鸡滑液囊支原体。

9 鸡滑液囊支原体活菌浓度测定

将鸡滑液囊支原体分离菌液进行10倍倍比稀释，首先用改良Frey氏液体培养基分装干烤灭菌玻璃试管，4.5ml/管，12支/株，用灭菌移液器取培养液0.5ml加入一支内含4.5ml改良Frey氏液体培养基的灭菌玻璃试管中，将混合液在无菌超净台内的振荡器上混匀，重新取一支新的灭菌移液器按上述操作从振荡好的第一管吸取0.5ml混匀液，加入到第二管，依次类推，一直稀释至第12管，盖好试管塞，于37℃恒温CO2培养箱中培养10天，每天观察试管的变色情况。若培养基颜色由红色变为黄色，第10天变色至稀释最高的试管数就作为待测菌液的颜色改变单位(colour change unit，CCU)，用CCU/ml来表示支原体的活菌浓度。结果表明：鸡滑液囊支原体HN01株F5代种毒的活菌浓度为10⁹CCU/ml。

10 免疫原性测定

将鸡滑液囊支原体HN01株F5代种毒按常规方法制成含量为10⁸CCU/0.3ml的灭活疫苗。按0.2ml/羽份免疫1月龄SPF鸡10只，另取10只不免疫，作为空白对照。30天后，免疫鸡和对照鸡同时各爪垫接种鸡滑液囊支原体培养物0.1 ml（10⁸CCU/ml），观察14日，观察爪垫肿胀情况。结果对照鸡全部（10/10）发病（爪垫肿胀），免疫鸡8/10保护。

鸡滑液囊支原体HN01株生物学特性研究结果表明，该菌株可在鸡滑液囊支原体液体培养基中繁殖，培养滴度较高，为10⁹CCU/mL，免疫原性好，免疫鸡和未免疫对照鸡的攻毒效果有明显的差异，未免疫对照鸡经强毒攻击后100%发病（爪垫肿胀），而免疫鸡80%能抵抗强毒的攻击。因此可作为鸡滑液囊支原体疫苗候选菌株，用于制备灭活疫苗。

实施例2 鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备

1、鸡毒支原体制苗用培养基及其制备方法：

(1)基础培养基成分：PPLO肉汤44g、酵母浸出粉8g、葡萄糖16g、质量浓度为0.4%的酚红溶液4ml、去离子水1460ml。

(2)成品培养基制备方法：将上述（1）培养基成分121℃高压灭菌15分钟，冷却后加入滤过除菌的22%猪血清和1000单位/ml青霉素，20%NaOH调PH7.7，无菌分装，4℃保存备用。

2、鸡滑液囊支原体制苗用培养基及其制备方法：

(1)基础培养基成分：PPLO肉汤42g、水解乳蛋白12g、酵母浸出粉6g、烟酰胺0.6g、质量浓度为0.4%的酚红溶液4ml、去离子水1500ml。

(2)成品培养基制备方法：将上述（1）培养基成分121℃高压灭菌15分钟，冷却后加入滤过除菌的21%猪血清和1000单位/ml青霉素，20%NaOH调PH7.8，无菌分装，2～8℃保存备用。

(1)将鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体按1：10的比例接种于鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体成品培养基中，在36～37℃培养44h收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1：10的比例再接种传代1次收获作为二级种子液；

（2）采用机械搅拌发酵罐连续增菌培养鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体菌液：先将发酵罐中鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体基础培养基成分进行灭菌，待温度降至37～38℃时，按1：10的比例接种鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体二级种子液。调节PH、补料，采用连续增菌培养方式，PH为7.7，37℃恒温培养，罐压为0.04Pa，溶氧量为40%，待PH下降至6.5左右，添加基础培养基为原培养体积的30%，用20%NaOH调PH7.7，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养PH下降到6.4时，加甲醛溶液灭活，连续增菌培养结束，留样检验，置4℃保存1天。

（3）根据活菌计数结果，鸡毒支原体菌液浓度达到10⁹CCU/ml，鸡滑液囊支原体菌液浓度达到10⁹CCU/ml;

（4）灭活疫苗的配制与疫苗乳化：将鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体灭活菌液按体积比1:1等比例混合后，取96份混合灭活菌液，加入4份吐温-80，混匀后作为水相溶液备用；取96份注射用白油，加入4份司本-80，混匀后作为油相溶液备用；将油相溶液和水相溶液按照体积比2.8:1混和均匀，即获得鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗。

4、疫苗检验

（1）物理性状检验：该疫苗为矿物油油包水型，外观应呈乳白色的均匀乳剂。3000r/min离心15分钟不分层。用lml吸管（上口内径2.7mm、下口内径1.2mm），吸取25℃左右的疫苗lml，令其垂直自然流出，流出0.4ml所需时间为4秒。

（2）无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，均无细菌生长。

（3）安全检验：取7日龄SPF鸡10只，各颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，无减食、精神沉郁、体温反应、注射局部炎症等不良反应，且全部健活。

（4）效力检验：用1月龄SPF鸡40只，其中20只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另20只不接种，作为对照。30天后，分别取10只免疫鸡和10只对照鸡进行鸡毒支原体攻毒试验和鸡滑液囊支原体攻毒试验。

1）鸡毒支原体攻毒试验方法：在2-3m³的密室（室内温度为15℃-30℃，相对湿度为50%-70%）内喷雾攻击鸡毒支原体R株培养物500-600ml[每1.0ml含活菌数10^8-9CCU颜色变化单位]，喷雾持续时间应不少于5分钟，雾滴在2.0μm左右，观察14日，剖检，观察气囊病变，并进行病变记分。对照组应至少有4只鸡的气囊出现2分以上的病变，免疫鸡的平均气囊保护率应在60%以上，计算免疫攻毒保护率，结果此次鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗中鸡毒支原体免疫攻毒保护率为81.8%。结果见表1

表1 二联灭活疫苗鸡毒支原体攻毒效力检验具体攻毒判分结果

鸡毒支原体免疫攻毒保护率=（对照组攻毒均分—免疫组攻毒均分）/对照组攻毒均分

=(22/10—4/10)/(22/10)

=(2.2—0.4)/2.2

=81.8%

附注：鸡毒支原体保护率计算方法及公式

以气囊病变程序来计算保护率，将试验鸡每侧气囊病变程度分为五个等级：

0分——正常的气囊，清洁透明而薄；

1分——气囊稍有增厚和轻度浑浊，局部有少数灰色或黄色渗出物斑点；

2分——部分气囊区域有可见的灰色和黄色渗出物，同时伴有气囊中度浑浊；

3分——大片气囊布满黄色干酪样渗出物；

4分——整个气囊布满黄色干酪样渗出物，气囊失去弹性。

气囊保护率计算公式：

保护率=[(对照鸡气囊损伤分/只—试验鸡气囊损伤分/只)／对照鸡气囊损伤分/只]×100％

2）鸡滑液囊支原体攻毒试验方法：免疫鸡和对照鸡同时各爪垫接种鸡滑液囊支原体培养物0.1 ml（10⁸CCU/ml），观察14日，观察爪垫肿胀情况。结果对照鸡全部（10/10）发病，免疫鸡9/10保护。结果见表2。

表2 二联灭活疫苗鸡滑液囊支原体攻毒效力检验结果

Figure 2013104629766100002DEST_PATH_IMAGE003

Claims

1.一种鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的鸡毒支原体含量为10^8.5CCU/羽，鸡滑液囊支原体含量为10^8.5CCU/羽。

2.根据权利要求1所述的鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种：鸡毒支原体强毒CR株、鸡滑液囊支原体HN01株，冻干保存；

(2)生产菌种的制备：取冻干菌种，分别用液体培养基溶解后，接种于液体培养基获得一级种子；取一级种子接种于液体培养基上获得二级种子；

(3)制苗用菌液的制备：分别采用机械搅拌发酵罐连续增菌培养鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体。

3.先将发酵罐中鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体基础培养基成分进行灭菌，待温度降至37～38℃时，按1：5～1：10的分别比例接种鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体二级种子液。

4.调节PH、补料，采用连续增菌培养方式，PH为7.6～7.8，37℃恒温培养，罐压为0.03～0.05Pa，溶氧量为40%，待PH下降至6.5左右，添加基础培养基为原培养体积的30%，用20%NaOH调PH7.6～7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养PH下降到6.4时，加甲醛溶液灭活，连续增菌培养结束，留样检验，置2～8℃保存，不超过2日。

5.（4）配苗：鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体灭活抗原按体积比1:1等比例混合后，取96份灭活菌液，加入4份吐温-80，混匀后作为水相溶液备用；取96份注射用白油，加入4份司本-80，混匀后作为油相溶液备用；将油相溶液和水相溶液按照体积比2.8～3.5:1混和均匀，即获得所述鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗。