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一种鸡滑液囊支原体的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鸡滑液囊支原体的培养方法，包括一级种子繁殖、种子液的制备和菌液制备三个步骤。其中使用的液体培养基，其组分浓度为PPLO肉汤21.0g/L、葡萄糖5.0g/L、灭活马血清200ml/L、25％酵母浸出液200ml/L、1％酚红溶液1.0ml/L、1％辅酶I溶液30ml/L、1％L‑半胱氨酸溶液30ml/L，pH值调至7.6～7.8。本发明的工艺方法不仅缩短了鸡滑液囊支原体的培养时间，而且也降低了中间多次取样检测的程序，减少了培养过程中污染的可能性，并降低了由于人工操作带来的误差，相对于现有技术具有进步性。

Description

一种鸡滑液囊支原体的培养方法
技术领域
本发明属于病原菌培养技术领域，具体涉及一种鸡滑液囊支原体的培养方法。
背景技术
鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)又称鸡传染性滑膜炎，是由鸡滑液囊支原体引起鸡和火鸡等的一种急性或慢性传染病。鸡传染性滑膜炎是Olson等(1964)首先报道的。本病以侵害关节滑液，腱鞘膜为主，其特征为关节、腱鞘和足掌肿胀等。鸡群感染该病可导致明显的跛行、生长发育迟缓及胴体降级等，本病可垂直传播，导致种鸡发病期间所产种蛋孵出的雏鸡发病。鸡滑液囊支原体感染已遍及全球，呈世界性分布，主要侵害商品肉鸡、蛋鸡和种鸡，本病一年四季均可发生，但以冬春季节易发。鸡滑液囊支原体感染一般多见于4～16周龄鸡，发病率一般为5％～15％，死亡率约为1％～10％。由于本病发展缓慢，病程长，一旦在鸡群中感染，根除很困难，因此在鸡群中长期蔓延，导致饲料利用率低、生长发育迟缓、淘汰率增高、产蛋量下降等。鸡群如存在该病原时，易发生混合感染，加剧病情，死亡率增高，造成严重的经济损失。近几年该病在我国的发病有发展及蔓延的趋势，已引起了养殖界专家的关注。国内目前既无预防鸡滑液囊支原体的活疫苗也无灭活疫苗上市，由于鸡滑液囊支原体的培养存在一定的难度，传统静止的培养工艺耗时长，并且活菌含量也不高，不能用于鸡滑液囊支原体疫苗规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡滑液囊支原体的培养方法，从而弥补现有技术的不足。
为了解决目前现有技术中存在的问题，本发明提出了一种新的用于鸡滑液囊支原体的培养工艺，具体包括以下步骤：
1)一级种子繁殖及鉴定将鸡滑液囊支原体冻干种子用液体培养基复原，按10％将种子液接种于鸡滑液囊液体培养基中，置37℃，150r/min振荡培养24～30小时，收获培养物，经纯粹检验合格后，作为一级种子。
2)二级种子和多级种子繁殖取一级种子液按10％接种液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养24～30小时，收获培养物，经镜检合格后，作为二级种子，置2～8℃保存备用。以此方法逐步做种子扩大培养，一直到所需要的种 子量。经镜检纯粹后，作为扩大培养用种子液。
3)菌液制备按照培养瓶容积60％～80％加入鸡滑液囊支原体液体培养基、pH值为7.6～7.8、种子接种量为10％、培养温度为37℃、振荡速度为90～100r/min，培养24～30小时收获菌液，取样进行半成品检验。
其中本发明的液体培养基，其组分浓度为PPLO肉汤21.0g/L、葡萄糖5.0g/L、灭活马血清200ml/L、25％酵母浸出液200ml/L、1％酚红溶液1.0ml/L、1％辅酶I溶液30ml/L、1％L-半胱氨酸溶液30ml/L，pH值调至7.6～7.8。
作为优选，上述的培养基中还添加有青霉素；其添加浓度为80万单位/L。
上述培养基的制备方法如下：
1)基础液配制：
取PPLO肉汤、葡萄糖加水溶液后，再加入酚红溶液，混合溶解后，在116℃高压灭菌30分钟，冷却后置2～8℃保存；
2)培养基配制：
将基础液冷却后，无菌条件下加入灭活马血清、酵母浸出液、青霉素溶液、辅酶I溶液、L-半胱氨酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8，2～8℃保存。
本发明的工艺方法不仅缩短了鸡滑液囊支原体的培养时间，而且也降低了中间多次取样检测的程序，减少了培养过程中污染的可能性，并降低了由于人工操作带来的误差，相对于现有技术具有进步性。
具体实施方式
下面结合具体实施案例来进一步说明本发明。
实施例1按照不同配方制备本发明培养基
1培养基制备
1.1基础液配制取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5.0g、去离子水加至1000ml、1％酚红溶液1.0ml，上述成分混合溶解后，116℃高压灭菌30分钟，冷却后置2～8℃保存。
1.2培养基制备将基础液冷却后无菌加入不同量灭活马血清、25％酵母浸出液、1％辅酶I溶液、1％L-半胱氨酸溶液，80万单位/ml青霉素溶液均加入1.2ml，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6，制备了6种液体培养基。具体配方见表1。
表1：液体培养基制备方法
实施例2不同配方液体培养基的筛选：
将鸡滑液囊支原体菌液，分别按10％接种上述6种液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养，培养时间均为36小时，于培养不同时间分别取样进行活菌计数。不同配方液体培养基的筛选试验结果表明，按照配方二、配方三、配方五、配方六制备的液体培养基培养效果较好，24～30小时活菌数均不低于109CCU/ml，配方三和配方六因为培养基中的血清等辅液成分加入量较高，使培养基营养过于丰富，导致YBF-MS1株生长过快，同时衰老的也快；且血清等辅液成分加入量高，也增加了生产成本，配方二培养时间略长，综合考虑，最终选择配方五制备的液体培养基来验证培养效果。结果见下表。
表2：6种液体培养基培养不同时间活菌计数结果
实施例3：本发明培养基与改良Frey氏液体培养基培养效果比较
将鸡滑液囊支原体YBF-MS1株(YBF-MS1株已保藏于位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年3月3日，保藏号为：CCTCC M 2016080。)冻干种子复苏后，按10％将种子液分别接种改良Frey氏液体培养基和本发明的配方五的液体培养基，分别置37℃，150r/min振荡培养36小时，于培养不同时间分别取样进行活菌计数。试验结果表明，应用本发明培养基，不同培养时间的活菌量均高于应用改良Frey氏液体培养基，不同培养时间的活菌量。结果见表3。
表3：培养基的选择试验结果
实施例4：采用本发明的工艺制备鸡滑液囊支原体
1菌种鸡滑液囊支原体YBF-MS1株。
2鸡滑液囊支原体液体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、去离子水加至1000ml、1％酚红溶液1ml，上述成分混合溶解后，116℃高压灭菌30分钟，基础液冷却后无菌加入灭活马血清200ml、25％酵母浸出液200ml、80万单位/ml青霉素溶液1.2ml、1％辅酶I溶液30ml、1％L-半胱氨酸溶液30ml，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8。2～8℃保存。
3鸡滑液囊支原体YBF-MS1株鉴定鸡滑液囊支原体YBF-MS1株经姬姆萨染色形态为多形态球状菌，将鸡滑液囊支原体菌株接种于上述培养基中培养24～30小时，呈轻度浑浊生长，能发酵葡萄糖产酸，使培养基pH值下降0.7及以上，在固体培养基上生长，菌落呈煎蛋状。在鸡滑液囊支原体液体培养基和固体培养基中加入鸡滑液囊支原体阳性血清，均出现特异性抑制作用。用PCR特异性引物进行鉴定，鸡滑液囊支原体菌株为阳性。
4种子液的制备
4.1一级种子繁殖及鉴定将鸡滑液囊支原体YBF-MS1株冻干种子用液体培养基复原，按10％将种子液接种于鸡滑液囊液体培养基中，置37℃，150r/min振荡培养24～30小时(待培养基颜色由猩红变成橘黄停止培养)，收获培养物，经纯粹检验合格后，作为一级种子。
4.2二级种子和多级种子繁殖取一级种子液按10％接种液体培养基，置置37℃，150r/min振荡培养24～30小时(待培养基颜色由猩红变成橘黄停止培养)，收获培养物，经镜检合格后，作为二级种子，置2～8℃保存备用。以此方法逐步做种子扩大培养，一直到所需要的种子量。经镜检纯粹后，作为扩大培养用种子液。
4.3菌液制备按照培养瓶容积60％～80％加入鸡滑液囊支原体液体培养基、pH值为7.6～7.8、种子接种量为10％、培养温度为37℃、振荡速度为90～100r/min(由于大容量摇床的振荡速度受培养瓶大小和装量体积的影响，振荡速度不宜过高，通过扩大培养条件的选择试验可知，大容量培养瓶扩大培养的振荡速度调节为90～100r/min，培养24～30小时活菌量最高。)培养24～30小时收获菌液，取样进行半成品检验，半成品菌液活菌数均不低于109CCU/ml。
实施例5常用的静止培养工艺制备鸡滑液囊支原体
1菌种鸡滑液囊支原体YBF-MS1株由青岛易邦生物工程有限公司保存。
2液体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、去离子水加至1000ml、1％酚红溶液1ml，上述成分混合溶解后，116℃高压灭菌30分钟，基础液冷却后无菌加入灭活马血清200ml、25％酵母浸出液200ml、80万单位/ml青霉素溶液1.2ml、1％辅酶I溶液30ml、1％L-半胱氨酸溶液30ml，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8，2～8℃保存(与实施例4一致)。
3种子液的制备
3.1一级种子繁殖将YBF-MS1株冻干种子用液体培养基复原，按10％将种子液分别接种于液体培养基中，置37℃，静止培养48小时，收获培养物，经纯粹检验合格后，作为一级种子。
3.2二级种子和多级种子繁殖按10％将一级种子液接种液体培养基，置37℃，静止培养48小时，经镜检合格后，作为二级种子，置2～8℃保存备用。以此方法逐步做种子扩大培养，一直到所需要的种子量。经镜检纯粹后，作为 扩大培养用种子液。
3.3菌液制备以合格的种子液按10％的量接种到pH7.6～7.8的液体培养基，37℃静止培养48小时，半成品菌液活菌数为108CCU/ml。
采用两种工艺方法制备的鸡滑液囊支体菌液活菌量的比较
采用本发明工艺(实施例4)和静止培养工艺(实施例5)进行的不同时间的对比试验结果表明，采用本发明工艺方法培养的鸡滑液囊支原体YBF-MS1株菌液的活菌量均能达到109CCU/ml及以上，根据上述试验结果，我们随后又采用本发明工艺扩大培养了4批鸡滑液囊支原体YBF-MS1株菌液进行验证，验证结果表明，本发明的培养工艺是可行的。试验结果见表4、表5。
表4静止培养工艺与本发明培养工艺的对比试验结果
表5培养工艺验证测定结果
试验结果表明，采用本发明进行的鸡滑液囊支原体的培养工艺，不仅能够缩短鸡滑液囊支原体培养时间，还能提高了半成品菌液的活菌量，并降低中间多次取样检测pH值的程序，减少了培养过程中污染的可能性，降低了操作人员劳动强度。
使用本发明的方法，对其它鸡滑液囊支原体进行培养，效果也类似，表明本发明的方法具有通用性。

Claims (7)

1.一种鸡滑液囊支原体的培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)一级种子繁殖及鉴定将鸡滑液囊支原体冻干种子用液体培养基复原，按10％将种子液接种于鸡滑液液体培养基中，置37℃，150r/min振荡培养24～30小时，收获培养物，经纯粹检验合格后，作为一级种子；
2)二级种子和多级种子繁殖取一级种子液按10％接种液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养24～30小时，收获培养物，经镜检合格后，作为二级种子，置2～8℃保存备用；将二级种子进行逐步扩大培养，得到扩大培养用种子液；
3)菌液制备按照培养瓶容积60％～80％加入鸡滑液囊支原体液体培养基、pH值为7.6～7.8、种子接种量为10％、培养温度为37℃、振荡速度为90～100r/min；培养24～30小时收获菌液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基，其组分浓度为PPLO肉汤21.0g/L、葡萄糖5.0g/L、灭活马血清200ml/L、25％酵母浸出液200ml/L、1％酚红溶液1.0ml/L、1％辅酶I溶液30ml/L、1％L-半胱氨酸溶液30ml/L，pH值调至7.6～7.8。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基中还添加有抗生素。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗生素为青霉素。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的青霉素的添加浓度为80万单位/L。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述的培养基的制备方法包括如下的步骤：
1)基础液配制：
取PPLO肉汤、葡萄糖加水溶液后，再加入酚红溶液，混合溶解后，在116℃高压灭菌30分钟，冷却后置2～8℃保存；
2)培养基配制：
将基础液冷却后，无菌条件下加入灭活马血清、酵母浸出液、辅酶I溶液、L-半胱氨酸溶液，再用氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8完成制备。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中同时添加青霉素溶液。
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