CN106967651A - 一种鸡毒支原体培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于兽用生物制品技术领域，提供了一种鸡毒支原体培养基，包括基础培养基和辅助培养基，主要由葡萄糖、乳蛋白水解物、酵母粉、醋酸铊、氯化钠、猪血清、SPF胚尿囊液和SPF胚羊水组成；同时还提供了上述培养基的制备方法。本发明既简化了传统培养基的复杂成分物质、降低了企业的生产成本，又减少了猪血清的使用量，降低了猪血清对鸡只的过敏反应。同时，使用本发明培养基可使鸡毒支原体的活菌滴度高达10²³CCU/mL以上，活菌滴度和分离的敏感性均远远高于现有技术的培养基，更适于鸡毒支原体的分离鉴定和疫苗生产。

Description

一种鸡毒支原体培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种鸡毒支原体培养基及其制备方法。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma galliseptium，MG)感染又称鸡慢性呼吸道病(chronicrespiratory disease，CRD)，广泛流行于世界上所有的养禽国家。鸡场感染MG后，雏鸡的弱雏率升高、蛋鸡的产蛋率、肉鸡的体重及饲料转化率均下降，且易继发病毒或细菌感染，造成鸡只死亡率升高，对养鸡业的发展造成严重危害，疫苗接种是防制本病的最根本措施。

MG由于其基因组较小，造成基因组中编码氨基酸和辅助因子生物合成的基因就少，从而导致能量代谢能力有限，属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，需要从外界摄取多种营养物质促进繁殖，因此对体外培养基的要求相当苛刻。目前，临床已有的分离培养MG和生产MG疫苗使用的传统培养基一般均由Frey或PPLO培养基改良而来。

但已有的传统培养基所培养的MG活菌滴度低(在1.0×10^9～12CCU/mL)，制苗用菌液(半成品)生产灭活疫苗时不能直接使用，需对半成品进行一定浓缩后方可制备成品疫苗，而半成品的浓缩操作繁琐、浓缩过程损失较大，最终影响成品疫苗的保护效力，并且使疫苗生产成本提高；已有的传统培养基其制苗添加的血清量普遍为10～30％之间，过量的血清制备的疫苗无疑给鸡只增加异源体对鸡体的过敏应激反应，最终影响疫苗的免疫效力，且增加生产成本；已有的传统培养基进行MG临床分离时，病原检出率低且生长缓慢(初次分离所需时间平均为7～12d)，不利于诊断及临床药物筛选。

因此，本领域亟需低血清高效快速分离培养MG的培养基，进而开展MG感染的诊断与防控研究。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种鸡毒支原体培养基及其制备方法，其既简化了传统培养基的复杂成分物质、降低了企业的生产成本，又减少了猪血清的使用量，降低了猪血清对鸡只的过敏反应。同时，使用本发明培养基可使鸡毒支原体的活菌滴度高达10²³CCU/mL以上，活菌滴度和分离的敏感性均远远高于现有技术的培养基，更适于鸡毒支原体的分离鉴定和疫苗生产。

为了实现上述目的，本发明提供一种鸡毒支原体培养基，包括基础培养基和辅助培养基，

所述基础培养基包括：

所述辅助培养基包括：

根据本发明的鸡毒支原体培养基，包括基础培养基和辅助培养基，所述基础培养基包括：

所述辅助培养基包括：

猪血清30mL/L

SPF胚尿囊液70mL/L

10万单位/ml青霉素10mL/L。

根据本发明的鸡毒支原体培养基，包括基础培养基和辅助培养基，所述基础培养基包括：

所述辅助培养基包括：

根据本发明的鸡毒支原体培养基，所述SPF胚尿囊液为12-14日龄SPF胚尿囊液。

根据本发明的鸡毒支原体培养基，所述SPF胚羊水为12-14日龄SPF胚羊水。

本发明还提供上述鸡毒支原体培养基的制备方法，包括以下步骤：

A、配制基础培养基：

将基础培养基的各成分混合后充分搅拌，使之完全溶解，在116℃下灭菌20min，置2～8℃下保存；

B、配制辅助培养基：

将辅助培养基的各成分混合后搅拌均匀，利用过滤除菌装置进行杀菌处理；

C、于基础培养基中加入辅助培养基，混合均匀后，用过滤除菌的1mol/L NaOH调节pH值至7.6-7.8，定量分装。

本发明通过SPF胚尿囊液和SPF胚羊水改善了现有技术中用于鸡毒支原体的培养基，得到一种新的培养基配方，该培养基包括由氯化钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、醋酸铊乳蛋白水解物与酵母粉等组成的基础培养基和由猪血清、SPF胚尿囊液、SPF胚羊水和青霉素组成的辅助培养基；同时本发明还提供上述培养基的制备方法。本发明所得培养基在已有培养MG培养基的基础上，降低了猪血清用量，去掉了氨基酸(L-半胱氨酸和精氨酸)，增加了12-14日龄SPF胚尿囊液和胚羊水，并对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行了比较，研究出了一种生长周期短、活菌滴度高、血清含量及成本低的MG高效液体培养基。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售；如无特殊说明，文中的“％”为质量百分比。

本发明提供了一种鸡毒支原体培养基。该培养基包括基础培养基和辅助培养基。

其中，基础培养基包括：

辅助培养基包括：

为了使MG的生长周期短、活菌滴度高，上述辅助培养基中的SPF胚尿囊液与SPF胚羊水分别优选12-14日龄SPF胚尿囊液、12-14日龄SPF胚羊水。

另外还需说明，为了更好的体现本技术方案的优越性，上述基础培养基中醋酸铊与葡萄糖优选美国sigma公司所产；乳蛋白水解物与酵母粉优选英国Oxoid公司所产；猪血清优选北京鼎国生物公司所产。

同时，本发明还提供了上述鸡毒支原体培养基的制备方法。该制备方法包括以下步骤：

步骤一、配制基础培养基。

将基础培养基的各成分混合后充分搅拌，使之完全溶解，在116℃下灭菌20min，置2-8℃下保存。

步骤二、配制辅助培养基。

将辅助培养基的各成分混合后搅拌均匀，利用过滤除菌装置进行杀菌处理。

步骤三、于基础培养基中加入辅助培养基，混合均匀后，用过滤除菌的1mol/LNaOH调节pH值至7.6-7.8，定量分装。

本发明技术方案具体实施例1：

步骤一、配制基础培养基。

基础培养基配方如下：

将基础培养基的各成分混合后充分搅拌，使之完全溶解，在116℃下灭菌20min，置2-8℃下保存。

步骤二、配制辅助培养基。

辅助培养基配方如下：

猪血清 30mL/L

SPF胚尿囊液 70mL/L

10万单位/ml青霉素 10mL/L

将辅助培养基的各成分混合后搅拌均匀，利用过滤除菌装置进行杀菌处理。

步骤三、于基础培养基中加入辅助培养基，混合均匀后，用过滤除菌的1mol/LNaOH调节pH值至7.6-7.8，定量分装。

所得鸡毒支原体培养基呈粉红色，将其置于-20℃下保存备用。

本发明技术方案具体实施例2：

步骤一、配制基础培养基。

基础培养基配方如下：

将基础培养基的各成分混合后充分搅拌，使之完全溶解，在116℃下灭菌20min，置2-8℃下保存。

步骤二、配制辅助培养基。

辅助培养基配方如下：

将辅助培养基的各成分混合后搅拌均匀，利用过滤除菌装置进行杀菌处理。

步骤三、于基础培养基中加入辅助培养基，混合均匀后，用过滤除菌的1mol/LNaOH调节pH值至7.6-7.8，定量分装。

所得鸡毒支原体培养基呈粉红色，将其置于-20℃下保存备用。。

为了更好的体现本发明技术方案的优越性和技术效果，现将实施例1、实施例2所得培养基与改良Frey氏培养基分别进行活菌滴度和对MG分离敏感性的对比试验。

试验一：本发明培养基与改良Frey氏培养基活菌滴度的对比试验

1方法

1.1 MG质控菌株及培养条件

质控菌株为MG疫苗6/85株(购自英特威国际有限公司)、MG S6株(购自中国兽医药品监察所)、MG临床分离LJ株(由本实验室分离鉴定并保存)。将MG疫苗6/85株、MG S6株及MG临床分离LJ株分别接种本发明培养基(实施例1)、本发明培养基(实施例2)、改良Frey氏培养基，种子继代复壮后，分别按10％(V/V)的比例接种，37℃培养，当培养液的颜色变黄、PH由7.7降至6.5时，无菌取出培养物。

1.2活菌滴度(CCU)测定

每个菌株取24支5ml灭菌试管，每管装1.8mL(含MG培养基)，在第1支管中加入0.2mL生长良好的培养物，混合均匀后，吸取0.2mL加入第2支管，如此进行10倍系列稀释至第23支管，第24支管不加菌液作为阴性对照。试验试管设三个重复。之后，将试管放置在37℃恒温箱中静止培养，每日观察1次，主要观察培养基的颜色变化，连续观察时间为10天，最后发生颜色变化的试管稀释度即为该培养物的CCU滴度。此试验共进行了3次。

2结果

2.1 MG疫苗6/85株接种3种培养基3次生长试验的(颜色变化单位)测定结果见表1。

表1 MG疫苗6/85株接种3种培养基3次生长试验CCU测定结果

2.2 MG S6株接种3种培养基3次生长试验的(颜色变化单位)测定结果见表2。

表2 MG S6株接种3种培养基3次生长试验CCU测定结果

2.3 MG临床分离LJ株接种3种培养基3次生长试验的(颜色变化单位)测定结果见表3。

表3 MG临床分离LJ株接种3种培养基3次生长试验CCU测定结果

试验二：本发明培养基与改良Frey氏培养基对MG分离敏感性的对比试验

从疑似MG感染的发病养殖场收集发病典型的患病鸡，每个养殖场至少采集3只。每只鸡无菌操作采集肺和气囊，将其充分剪碎后加到2mL支原体液体培养基中，搅拌混匀后取上清液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，取1μL滤液进行MG PCR鉴定，将鉴定为阳性的滤液按1:10的比例分别加到本发明培养基和改良Frey氏液体培养基中，放入37℃恒温箱中振荡培养。每天检查液体培养基的颜色变化，一旦发现培养基颜色变成黄色，立即移植于固体培养基上培养，培养5～7d后，在10倍倒置显微镜下观察到MG典型菌落(“荷包蛋样”菌落)的则鉴定为MG分离阳性。对于液体培养物在14d内未发生颜色变化、固体培养基上14d内无典型菌落生长的，则认为分离结果为阴性；三种培养基对MG分离敏感性的对比试验结果见表4。

表4 3种培养基对MG分离敏感性的对比试验结果

从MG分离敏感性对比试验结果来看，本发明培养基检出率显著高于改良Frey氏培养基，分离培养所需的时间明显短于改良Frey氏培养基。

从本发明培养基与现有技术中改良Frey氏培养基进行MG培养的活菌滴度及分离敏感性对比试验来看，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明可明显提高MG培养的活菌滴度(高达1.0×10²³CCU/mL以上)，简化了传统培养基的复杂成分物质及生产工艺，降低了生产成本。

(2)本发明降低了异源血清的用量，不仅降低了成本，且减少了异源血清对鸡体的过敏应激反应。

(3)本发明所制备的培养基分离敏感性高，能明显缩短鸡毒支原体的生长时间，加快鉴别MG的生长判断，从而利于MG的分离鉴定及临床药物筛选。

由此得出，本发明培养基显著优于改良Frey氏培养基，其具有更广泛的使用性，既适合科学研发，又适合大规模的生产。

综上所述，本发明通过SPF胚尿囊液和SPF胚羊水改善了现有技术中用于鸡毒支原体的培养基，得到一种新的培养基配方，该培养基包括由氯化钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、醋酸铊乳蛋白水解物与酵母粉等组成的基础培养基和由猪血清、SPF胚尿囊液、SPF胚羊水和青霉素组成的辅助培养基；同时本发明还提供上述培养基的制备方法。本发明所得培养基在已有培养MG培养基的基础上，降低了猪血清用量，去掉了氨基酸(L-半胱氨酸和精氨酸)，增加了12-14日龄SPF胚尿囊液和胚羊水，并对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行了比较，研究出了一种生长周期短、活菌滴度高、血清含量及成本低的MG高效液体培养基。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种鸡毒支原体培养基，其特征在于，包括基础培养基和辅助培养基，

所述基础培养基包括：

所述辅助培养基包括：

2.根据权利要求1所述的鸡毒支原体培养基，其特征在于，包括基础培养基和辅助培养基，

所述基础培养基包括：

所述辅助培养基包括：

猪血清 30mL/L

SPF胚尿囊液 70mL/L

10万单位/ml青霉素 10mL/L。

3.根据权利要求1所述的鸡毒支原体培养基，其特征在于，包括基础培养基和辅助培养基，

所述基础培养基包括：

所述辅助培养基包括：

4.根据权利要求1～3任一项所述的鸡毒支原体培养基，其特征在于，所述SPF胚尿囊液为12-14日龄SPF胚尿囊液。

5.根据权利要求1或3所述的鸡毒支原体培养基，其特征在于，所述SPF胚羊水为12-14日龄SPF胚羊水。

6.制备如权利要求1～3任一项所述鸡毒支原体培养基的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、配制基础培养基：

将基础培养基的各成分混合后充分搅拌，使之完全溶解，在116℃下灭菌20min，置2-8℃下保存；

B、配制辅助培养基：

将辅助培养基的各成分混合后搅拌均匀，利用过滤除菌装置进行杀菌处理；

C、于基础培养基中加入辅助培养基，混合均匀后，用过滤除菌的1mol/LNaOH调节pH值至7.6-7.8，定量分装。