CN106591177A

CN106591177A - 一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基及其制备方法

Info

Publication number: CN106591177A
Application number: CN201611070622.7A
Authority: CN
Inventors: 陈胜利; 储岳峰; 郝华芳; 赵萍; 刘永生
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-11-29
Also published as: CN106591177B

Abstract

本发明公开了一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基，含有以下组分：PPLO肉汤、丙酮酸钠、乳糖、胰蛋白胨、新鲜酵母浸出液、L‑谷氨酰胺、L‑半胱氨酸、水解乳蛋白、马血清、青霉素、酚红、去离子水；并提供了其制备方法。本发明的有益效果为：本发明提供的山羊支原体山羊肺炎亚种培养基血清含量仅为5%，仅为现有技术培养基血清量的1/5～1/4；此外，用本发明方法制备的半成品菌液滴度达10¹⁰ CCU/ml，明显高于现有技术培养基。本发明低血清高效培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种，既有利于减轻异源血清对羊体的过敏应激反应，提高生物安全，又提高了活菌滴度，降低了生产成本。

Description

一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用制剂技术领域，具体涉及一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基及其制备方法。

背景技术

山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp. Capripneumoniae，Mccp）是山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)的病原，主要感染山羊。临床特征主要表现为厌食、发烧、咳嗽和呼吸困难，该病给世界养羊业带来巨大经济损失，是OIE法定报告疫病之一。

疫苗免疫是预防控制山羊传染性胸膜肺炎发生的一个重要手段。目前山羊传染性胸膜肺炎防控主要依赖灭活疫苗。而优质高效疫苗需要以优质培养基作为支撑。目前山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基主要有改良Hayflick’s培养基、改良KM2培养基、Thiaucourt's培养基、改良CCPP培养基等。现有技术培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种仍存在培养时间长、活菌滴度低、繁殖能力差等问题。此外，现有技术培养基中血清含量普遍在20%～25%之间。高血清含量的培养基不仅增加了制苗成本，此外高含量血清制备的疫苗也增加了异源血清对羊体的过敏应激反应，最终影响疫苗的免疫效果。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基，每1000ml低血清高效培养基由基础培养基和辅助培养基组成；

所述基础培养基中含有以下组分：

（1）PPLO肉汤 20.0～21.0 g，

（2）丙酮酸钠 5.0～6.0 g，

（3）质量浓度为1%的酚红 2.0～2.5 ml，

（4）去离子水 650 ml；

所述辅助培养基中含有以下组分：

（5）质量浓度为20%的乳糖 45～60 ml

（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 40～60 ml

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 90～110 ml

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 16～17 ml

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 4.0～6.0 ml

（10）质量浓度为15%的水解乳蛋白 32.0～35.0 ml

（11）20万IU/ml的青霉素 0.25 ml

（12）无菌马血清 50 ml。

本发明的第二个目的是提供了上述一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基的制备方法，包括以下步骤：

1）基础培养基的制备：

取上述的基础培养基组分中的（1）-（3）逐一加入650ml去离子水（4）中，充分混合，115℃高压灭菌20min后冷却至室温备用；

2）辅助培养基的制备：

取经0.22 微米滤膜滤过除菌的上述的（5）-（12）成分，充分混合，即得辅助培养基；

3）混合定容：

无菌条件下，将步骤1）得到的基础培养基和步骤2）得到的辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装后置4℃保存备用。

本发明的第三个目的是提供了上述一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基在培养山羊支原体山羊肺炎亚种中的应用。

本发明的第四个目的是提供了上述一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基在制备山羊支原体山羊肺炎亚种疫苗抗原中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明的山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基是根据山羊支原体山羊肺炎亚种的生长特性，通过对不同的碳源、氮源、蛋白质、无机盐和胆固醇等诸多营养组分的组合进行了筛选，对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行比较分析，研究出了适合培养山羊支原体山羊肺炎亚种的低血清高效培养基。该培养基中PPLO肉汤是支原体生长基础液；培养基中的乳糖为山羊支原体山羊肺炎亚种生长提供碳源；丙酮酸钠可作为支原体生长的替代碳源；通过添加胰蛋白胨，为山羊支原体山羊肺炎亚种提供生长所需氮源和丰富的氨基酸；通过添加新鲜酵母浸出液，为山羊支原体山羊肺炎亚种生长提供所需的氮源、维生素及微量元素等营养成分；添加L-谷氨酰胺可促进微生物代谢、促进蛋白质合成；添加L-半胱氨酸和水解乳蛋白为山羊支原体山羊肺炎亚种生长提供合适的氨基酸和生长因子；通过添加马血清，向山羊支原体山羊肺炎亚种提供生长所需的胆固醇和必需的饱和或不饱和脂肪酸；通过添加青霉素可抑制杂菌生长，对支原体无抑制效果，可避免培养基污染和延长培养基保存时间；添加酚红作为pH值指示剂，可判断支原体的生长状况。该培养基的配方中除基本成份外，在培养基中还添加了胰蛋白胨、新鲜酵母浸出液、L-谷氨酰胺、L-半胱氨酸和水解乳蛋白等成分，上述成分的添加能明显提高山羊支原体山羊肺炎亚种的活菌滴度；经反复实验证实，未添加之前活菌滴度为10⁷-10⁸ CCU/ml，添加之后活菌滴度可达10¹⁰ CCU/ml。而本发明最大的优势在于培养基中低血清含量和培养山羊支原体山羊肺炎亚种活菌滴度高。本发明培养基血清用量仅为5%，仅为现有技术培养基血清量的1/5～1/4；此外，用本发明方法制备的半成品菌液滴度达10¹⁰ CCU/ml，明显高于改良Hayflick’s培养基（10⁷CCU/ml）、改良KM2培养基（10⁸CCU/ml）,Thiaucourt's培养基和改良CCPP培养基（10⁸～10⁹CCU/ml）。低血清高效培养基大大减轻了疫苗中异源体血清对羊体的过敏应激反应，同时提高了活菌滴度，为山羊支原体山羊肺炎亚种优质疫苗的研制奠定了基础。

附图说明

图1显示为山羊支原体山羊肺炎亚种在本发明低血清高效培养基的生长情况。

具体实施方式

本发明所用制剂来源：

PPLO肉汤：美国BD公司产品，货号为2625084。

丙酮酸钠：AMRESCO公司产品，货号为0342。

乳糖：百灵威科技有限公司产品，货号为307213。

胰蛋白胨：OXOID公司产品，货号为LP0042。

L-谷氨酰胺：sigma公司产品，货号为V900419。

L-半胱氨酸：AMRESCO公司产品，货号为J994。

水解乳蛋白：北京索莱宝科技有限公司产品，货号为L8100。

青霉素：为上海公谊兽药厂产品。

马血清：为Hyclone公司产品，货号为SH30074.03。

酚红：为sigma公司产品，货号为P3532。

质量浓度为1%的酚红的配制：称取酚红1.0 g，置玻璃研钵中，逐滴加入0.1M NaOH（0.4 g溶于10 ml去离子水），研磨至完全溶解。将溶解的酚红吸入100 ml量瓶中，用去离子水小心洗下研钵中残留酚红液至量瓶中，最后补加去离子水至100 ml。

质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液的制备：取鲜酵母500 g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用浓盐酸：去离子水以=1:1（体积比）调pH值至4.5-5.0，80℃水浴（瓶内温度）30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液。将上清液用1 M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值至7.8-8.0，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补去离子水至2000 ml，-20℃保存备用。

实施例1：

1、本发明培养基的制备：

基础培养基：

（1）PPLO肉汤 21.0 g

（2）丙酮酸钠 5.0 g

（3）质量浓度为1%的酚红 2.0 ml

（4）去离子水 650 ml。

辅助培养基：

（5）质量浓度为20%的乳糖 60ml

（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 60 ml

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 110 ml

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 17 ml

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 6.0 ml

（10）质量浓度为15%的水解乳蛋白 34.0 ml

（11）青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml

（12）无菌马血清 50 ml

将基础培养基中（1）-（3）成分逐一溶入650ml去离子水（4）中，115℃高压灭菌20min后冷却至室温；取经0.22 微米滤膜滤过除菌的辅助培养基（5）-（12）成分，充分混合；无菌条件下将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，充分摇匀后分装，置4℃保存备用。

实施例2：

本发明培养基的制备（500ml）：

基础培养基：

（1）PPLO肉汤 10.5 g

（2）丙酮酸钠 2.5g

（3）质量浓度为1%的酚红 1.0 ml

（4）去离子水 325 ml。

辅助培养基：

（5）质量浓度为20%的乳糖 23ml

（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 22 ml

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 50 ml

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 8.5 ml

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 3.0 ml

（10）质量浓度为15%的水解乳蛋白 16.5 ml

（11）青霉素 (20万IU/ml) 0.125 ml

（12）无菌马血清 25 ml

将基础培养基中（1）-（3）成分逐一溶入325ml去离子水（4）中，115℃高压灭菌20min后冷却至室温；取经0.22 微米滤膜滤过除菌的辅助培养基（5）-（12）成分，充分混合；无菌条件下将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至500ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，充分摇匀后分装，置4℃保存备用。

实施例3：

应用本发明培养基、改良Hayflick’s培养基、改良KM2培养基、Thiaucourt's培养基和改良CCPP培养基对山羊支原体山羊肺炎亚种模式株F38株进行比较试验：

1、本发明培养基的制备（500 ml）

基础培养基：

（1）PPLO肉汤 10.5 g

（2）丙酮酸钠 2.5 g

（3）质量浓度为1%的酚红 1.25 ml

（4）去离子水 325 ml。

辅助培养基：

（5）质量浓度为20%的乳糖 25 ml

（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 30 ml

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 50 ml

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 8.5 ml

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 2.5 ml

（10）质量浓度为15%的水解乳蛋白 16.5 ml

（11）青霉素 (20万IU/ml) 0.125 ml

（12）无菌马血清 25 ml

2、Thiaucourt's培养基的配制（500 ml）

基础液：

PPLO肉汤 10.5 g

去离子水 350 ml。

115℃高压灭菌 20 min；

培养基：

基础液 350 ml

50%丙酮酸钠 4.0 ml

50%葡萄糖 1.0 ml

0.5%酚红 2.0 ml

25%新鲜酵母浸出液 50 ml

青霉素（20万IU/ml） 0.5 ml

10%醋酸铊 0.5 ml

无菌马血清 100 ml

用去离子水定容至500ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。

3、改良CCPP培养基的配制（500ml）

基础液：

PPLO肉汤 8.75 g

去离子水 325ml

115℃高压灭菌 20min；

培养基：

基础液 325ml

25%丙酮酸钠 4.0 ml

50%葡萄糖 2.0 ml

0.5%酚红 2.0 ml

25%新鲜酵母浸出液 50 ml

青霉素（20万IU/ml） 0.5 ml

10%醋酸铊 0.5 ml

无菌马血清 125 ml

混合后用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。

4、改良的Hayflick’s培养基的配制（500ml）

基础液：

1％水解乳蛋白Hank’s液 250 ml

培养基：

基础液 250 ml

25%新鲜酵母浸出液 10 ml

牛心汤 150ml

青霉素（20万IU/ml） 0.5ml

1%酚红 1.25ml

10%醋酸铊 0.5 ml

无菌马血清 100 ml

5、改良KM2培养基的配制（500ml）

1.7%水解乳蛋白Hank’s液 150 ml

MEM 2.5 g

葡萄糖 2.0 g

丙酮酸钠 1.0 g

1%酚红 1.25 ml

25%新鲜酵母浸出液 10 ml

青霉素（20万IU/ml） 0.5 ml

10%醋酸铊 0.5 ml

无菌马血清 100 ml

用灭菌去离子水定容至500ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。

6、山羊支原体山羊肺炎亚种的培养将山羊支原体山羊肺炎亚种F38株（法国OIE/FAO CCPP参考实验室Thiaucourt教授馈赠，英国典型菌种保藏中心NCTC，编号NCTC10192）分别接种本发明培养基（血清含量为5%）、改良Hayflick’s培养基（血清含量为20%）、改良KM2培养基（血清含量为20%）、Thiaucourt's培养基（血清含量为20%）和改良CCPP培养基（血清含量为25%），种子继代复壮后，分别按10% (V/V) 的比例接种对应培养基，37℃恒温培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.4降至6.8～7.0时，无菌取出培养物。

7、活菌滴度（CCU）测定。方法如下：取12支试管，每管加对应培养基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生长良好的山羊支原体山羊肺炎亚种培养物，用振荡器充分混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第11管，第11管中弃去0.5 ml培养液；得到培养液的稀释度分别为10^-1-10^-11，第12管为对应培养基对照。试验管设3个重复。将试管置37℃恒温培养箱中静置培养，每天观察颜色变化，连续观察10天，发生颜色变化的最高稀释度即为该培养物的活菌滴度，用颜色变化单位（CCU）表示。试验重复3次。

8、结果：

山羊支原体山羊肺炎亚种接种5种培养基3次生长试验CCU测定结果见表1。

表1

3次试验结果显示，在同样条件下，使用改良Hayflick’s培养基、改良KM2培养基、Thiaucourt's培养基和改良CCPP培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种的生长时间均为48h，而本发明培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种的生长时间为36h，比现有技术培养时间缩短了1/4；使用改良Hayflick’s培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种3次CCU测定结果均为10⁷CCU/ml，改良KM2培养基3次CCU测定结果为10⁸CCU/ml,Thiaucourt's培养基和改良CCPP培养基3次CCU测定结果均为10⁹CCU/ml。山羊支原体山羊肺炎亚种在本发明低血清高效培养基培养的活菌滴度可达10¹⁰CCU/ml（见图1），3次CCU测定结果均为10¹⁰CCU/ml，活菌滴度明显高于现有技术培养基。结果表明，本发明的山羊支原体山羊肺炎亚种培养基具有血清含量低、生长迅速和活菌滴度高的特点。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基，其特征在于，每1000ml低血清高效培养基由基础培养基和辅助培养基组成；

所述基础培养基中含有以下组分：

（1）PPLO肉汤 20.0～21.0 g，

（2）丙酮酸钠 5.0～6.0 g，

（3）质量浓度为1%的酚红 2.0～2.5 ml，

（4）去离子水 650 ml；

所述辅助培养基中含有以下组分：

（5）质量浓度为20%的乳糖 45～60 ml

（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 40～60 ml

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 90～110 ml

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 16～17 ml

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 4.0～6.0 ml

（10）质量浓度为15%的水解乳蛋白 32.0～35.0 ml

（11）20万IU/ml的青霉素 0.25 ml

（12）无菌马血清 50 ml。

2.根据权利要求1所述的一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）基础培养基的制备：

取权利要求1所述的基础培养基组分中的（1）-（3）逐一加入650ml去离子水（4）中，充分混合，115℃高压灭菌20min后冷却至室温备用；

2）辅助培养基的制备：

取经0.22 微米滤膜滤过除菌的权利要求1所述的（5）-（12）成分，充分混合，即得辅助培养基；

3）混合定容：

无菌条件下，将步骤1）得到的基础培养基和步骤2）得到的辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装后置4℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基在培养山羊支原体山羊肺炎亚种中的应用。

4.根据权利要求1所述的一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基在制备山羊支原体山羊肺炎亚种疫苗抗原中的应用。