CN103013892A - 一种猪肺炎支原体的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪肺炎支原体的培养方法，包括种子液的制备和菌液的制备，与传统方法的不同在于菌液制备过程中，本发明每12h加入1mol/LNaOH将含有4ml/L酚红的PPLO培养基pH调至8.0。采用本发明的方法缩短了猪肺炎支原体的培养时间，降低了中间多次取样检测的程序，减少了培养过程中污染的可能性，并降低了由于人工操作带来的误差。
Description
技术领域
本发明涉及支原体培养的技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体的培养方法。
背景技术
猪肺炎支原体可以引起猪气喘病，该病是一种接触性慢性呼吸道传染病。猪感染后会降低饲料转化率，影响生长发育，并引起其他病毒及细菌的继发感染。由猪肺炎支原体所引起的猪气喘病普遍存在于养殖业发达的国家，该病一直以来是困扰我国养殖业发展的重要疾病。据统计，2010年我国生猪出栏近6亿头，90％以上养殖基地和规模化养猪场都存在着感染猪肺炎支原体的风险，国内该病的感染率可高达80%，是造成我国养猪业经济损失的重要传染病之一。目前疫苗免疫是预防本病的最主要手段。据资料报道，在发达国家，猪支原体肺炎的免疫率达70%，而我国由于进口疫苗价格昂贵，猪群免疫率不足10％，年经济损失达300多亿元人民币，严重影响了养猪业的经济效益。目前，我国在动物疫苗技术研发与世界先进水平相比还存在较大差距，猪肺炎支原体的培养难度很大，传统的培养方式耗时长，并且滴度不高，是目前支原体疫苗规模化生产的技术瓶颈。
针对猪支原体肺炎疫苗生产现状，我们开展了改进猪支原体肺炎疫苗制备方法的研究，从生产工艺方面做了大量的探索、研究试验，最终获得了重大突破。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪肺炎支原体的培养方法。
目前，培养猪肺炎支原体是按照以下步骤进行的：
1．培养基配方：种子液和制苗用菌液均用此培养基。
PPLO培养基
灭活猪血清（200ｍＬ／Ｌ）
酵母浸出液（10ｍＬ／Ｌ）
青霉素20万单位
葡萄糖（4ｇ／Ｌ）
用ＮａＯＨ调ｐＨ至8.0。
2.猪肺炎支原体菌株鉴定标准
猪肺炎支原体种子培养物及生产培养物均用显微镜检查其形态，镜下体积小，呈现多形性，在制备一个新生产种子时，需要检验培养物特有的生化及免疫化学特性，典型的反应为葡萄糖反应阳性、甘露糖反应阳性、精氨酸反应阴性、尿素酶反应阴性、猪肺炎支原体抗血清一致生长实验阳性。用免疫荧光标记的猪肺炎支原体抗体作直接荧光抗体实验为阳性。
3.种子液的制备：
3.1一级种子繁殖及鉴定
启封冷冻菌种，用培养基将其融化复原，然后以10%（v/v）的量接种于培养基中，37℃培养15-96h，纯检合格后作为一级种子备用。
3.2二级种子繁殖及鉴定
取一级种子按接种量10%（v/v）接种于培养基中，37±2℃培养15-96h，纯检合格后作为二级种子备用。
3.3种子罐制备
取二级种子按接种量10%（v/v）接种于培养基中，温度控制37±2℃，通气培养15-96h，纯检合格后备用。
4、菌液制备
以合格的种子液按5%-20%（v/v）的量接种到培养基，PH值8.0±0.5，温度控制37±2℃，纯检和活菌计数，一直到所需的量。
按此方法生产，一般需要培养70-96个小时后才能达到109CCU/ml，并需要经过不定时的对培养液进行测定PH值，这样操作在大规模生产猪支原体肺炎疫苗时会带来较高风险的污染，并耗时较长，并对操作人员要求较高，生产难度大，产量低、成本高。
为了解决目前现有技术中存在的问题，本发明提出了一种新的用于猪肺炎支原体的培养方法，具体包括以下步骤：
（1）种子液的制备：
①一级种子繁殖及鉴定
启封冷冻菌种，用培养基将其融化复原，然后以10%（v/v）的量接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，37℃培养15-96h，纯度检验合格后作为一级种子备用；
②二级种子繁殖及鉴定
取一级种子按接种量10%（v/v）接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，37±2℃培养15-96h，纯度检验合格后作为二级种子备用；
③种子罐制备
取二级种子按接种量10%（v/v）接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，温度控制37±2℃，通气培养15-96h，纯度检验合格后备用；
（2）菌液制备
以合格的种子液按5%-20%（V/V）的量接种到含有4ml/L酚红的PPLO培养基，pH值8.0±0.5，温度控制37±2℃，通气培养，并每12h加入1mol/L NaOH将PPLO培养基pH调至8.0，纯度检验和活菌计数，至所需支原体浓度的量。
在本发明中，优选的所述的含有4ml/L酚红的PPLO培养基的组分为：
灭活猪血清：200ml/L
酵母浸出液：10ml/L
青霉素：20万单位
葡萄糖：4g/L
酚红：4ml/L
1mol/L NaOH用于调节pH至8.0。
采用本发明的方法缩短了猪肺炎支原体的培养时间，降低了中间多次取样检测的程序，减少了培养过程中污染的可能性，并降低了由于人工操作带来的误差，相较于现有技术具有进步性。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：采用本发明的方法制备猪肺炎支原体
1、菌种：猪肺炎支原体P-5722-3株由哈药集团生物疫苗有限公司保存。
2、猪肺炎支原体的制备
2.1．新培养基配方：种子液和制苗用菌液均用此培养基。
PPLO培养基
灭活猪血清（200ｍＬ／Ｌ），
酵母浸出液（10ｍＬ／Ｌ）
青霉素20万单位
葡萄糖（4ｇ／Ｌ），
4ｍＬ／Ｌ酚红（4ｍＬ／Ｌ）
用ＮａＯＨ调ｐＨ至8.0
2.2.猪肺炎支原体P-5722-3菌株鉴定标准
猪肺炎支原体种子培养物及生产培养物均用显微镜检查其形态，镜下体积小，呈现多形性，在制备一个新生产种子时，需要检验培养物特有的生化及免疫化学特性，典型的反应为葡萄糖反应阳性、甘露糖反应阳性、精氨酸反应阴性、尿素酶反应阴性、猪肺炎支原体抗血清一致生长实验阳性。用免疫荧光标记的猪肺炎支原体抗体作直接荧光抗体实验为阳性。
2.3.种子液的制备：
2.3.1一级种子繁殖及鉴定
启封冷冻菌种，用培养基将其融化复原，然后以10%（v/v）的量接种于培养基中，37℃培养15-96h，纯检合格后作为一级种子备用。
2.3.2二级种子繁殖及鉴定
取一级种子按接种量10%（v/v）接种于培养基中，37±2℃培养15-96h，纯检合格后作为二级种子备用。
2.3.3种子罐制备
取二级种子按接种量10%（v/v）接种于培养基中，温度控制37±2℃，通气培养15-96h，纯检合格后备用。
2.4、菌液制备
以合格的种子液按5%-20%的量接种到培养基，PH值8.0±0.5，温度控制37±2℃，通气培养，并每12小时加入1mol/L NaOH将培养基PH调整至8.0，纯检和活菌计数，一直到所含抗原浓度至少为108ccu/ml。
试验例1采用传统方法制备猪肺炎支原体
1、菌种：猪肺炎支原体P-5722-3株由哈药集团生物疫苗有限公司保存。
2、猪肺炎支原体的制备
2.1．培养基配方：种子液和制苗用菌液均用此培养基。
PPLO培养基
灭活猪血清（200ｍＬ／Ｌ）
酵母浸出液（10ｍＬ／Ｌ）
青霉素20万单位
葡萄糖（4ｇ／Ｌ）
用ＮａＯＨ调ｐＨ至8.0。
2.2.猪肺炎支原体菌株鉴定标准
猪肺炎支原体种子培养物及生产培养物均用显微镜检查其形态，镜下体积小，呈现多形性，在制备一个新生产种子时，需要检验培养物特有的生化及免疫化学特性，典型的反应为葡萄糖反应阳性、甘露糖反应阳性、精氨酸反应阴性、尿素酶反应阴性、猪肺炎支原体抗血清一致生长实验阳性。用免疫荧光标记的猪肺炎支原体抗体作直接荧光抗体实验为阳性。
2.3.种子液的制备：
2.3.1一级种子繁殖及鉴定
启封冷冻菌种，用培养基将其融化复原，然后以10%（v/v）的量接种于培养基中，37℃培养15-96h，纯检合格后作为一级种子备用。
2.3.2二级种子繁殖及鉴定
取一级种子按接种量10%（v/v）接种于培养基中，37±2℃培养15-96h，纯检合格后作为二级种子备用。
2.3.3种子罐制备
取二级种子按接种量10%（v/v）接种于培养基中，温度控制37±2℃，通气培养15-9Oh，纯检合格后备用。
2.4、菌液制备
以合格的种子液按5%-20%（v/v）的量接种到培养基，PH值8.0±0.5，温度控制37±2℃，通气培养15-96h，纯检和活菌计数，一直到所含抗原浓度至少为108ccu/ml。
试验例2采用两种方法制备的猪肺炎支原体抗原含量的比较
采用本发明方法（实施例1）和传统方法（试验例1）在进行了六次平行实验后，结果发现采用本发明方法，使得培养物在培养50-60小时后均能达到109CCU/ml以上，根据以上结果在随后继续做了四组平行试验并从48小时开始计数，发现结果与预期相符。采用传统培养方法与本发明培养方法所得到的猪肺炎支原体抗原含量的对比结果如表1所示。
表1传统培养方法与本发明培养方法对比单位：CCU/ml
实验证明，采用本发明的一种改进的猪肺炎支原体的培养工艺，能够缩短了支原体培养时间，并降低中间多次取样检测的程序，减少了培养过程中污染的可能性，也降低了由于人工操作带来的误差。
Claims (2)
1.一种猪肺炎支原体的培养方法，其特征在于培养步骤如下：
（1）种子液的制备：
①一级种子繁殖及鉴定
启封冷冻菌种，用培养基将其融化复原，然后以10%（v/v）的量接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，37℃培养15-96h，纯度检验合格后作为一级种子备用；
②二级种子繁殖及鉴定
取一级种子按接种量10%（v/v）接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，37±2℃培养15-96h，纯度检验合格后作为二级种子备用；
③种子罐制备
取二级种子按接种量10%（v/v）接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，温度控制37±2℃，通气培养15-96h，纯度检验合格后备用；
（2）菌液制备
以合格的种子液按5%-20%（V/V）的量接种到含有4ml/L酚红的PPLO培养基，pH值8.0±0.5，温度控制37±2℃，通气培养，并每12h加入1mol/L NaOH将PPLO培养基pH调至8.0，纯度检验和活菌计数，至所需支原体浓度的量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的含有4ml/L酚红的PPLO培养基的组分为：
灭活猪血清：200ml/L
酵母浸出液：10ml/L
青霉素：20万单位
葡萄糖：4g/L
酚红：4ml/L
1mol/L NaOH用于调节pH至8.0。
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