CN102258776A

CN102258776A - 猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗及其制备方法

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Publication number: CN102258776A
Application number: CN2011101904705A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2011-07-07
Filing date: 2011-07-07
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2031-07-07
Also published as: CN102258776B

Abstract

本发明的猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗，其含有优选含量的猪肺炎支原体和猪鼻支原体，及10％(V/V)卡波姆佐剂。本发明还提供了猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗的制备方法，包括生产菌种的制备，制苗用菌液的制备；灭活、浓缩及配苗等步骤。本发明的二联灭活疫苗，特异性强、免疫性好，不仅可以解决针对目前国内养殖场的特异性的猪肺炎支原体引起的感染，而且提供了目前国内外均处于空白的猪鼻支原体疫苗。本发明的二联疫苗简化了疫苗接种的步骤，避免了多次接种的麻烦和容易产生的副作用，节约了疫苗成本，特别适用于预防和治疗国内养殖场等混合感染的病症。与现有单苗相比，扩大了应用范围，增强了免疫效果。

Description

猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗领域。

背景技术

猪喘气病又称猪支原体肺炎或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。发病率高，死亡率低。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合症病毒和其它病原混合感染，使其感染的重要性进一步提高。到目前为止，该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)是一种能引起猪多发性浆膜炎、关节炎等症状的猪支原体。通常存在于猪呼吸道上皮表面。自从Switzer(1953，1954，1955)分离到该支原体并建议采用猪鼻支原体命名以来，Whittlestone(1958)及L.EcuYer等(1961)曾报导在英国、美国的慢性猪肺炎中50％以上存在有猪鼻支原体。

目前，猪肺炎支原体灭活疫苗仅有国外进口的单价疫苗，而猪肺炎支原体易发生变异，对于国内养猪场的猪肺炎支原体引起的疾病，特异性不强；而猪鼻支原体灭活疫苗在国内外报道都是空白。而在国内养殖场中，猪肺炎支原体、猪鼻支原体两种病原体常常出现混合感染。因此，对于国内的养殖场，迫切需要一种对国内的猪肺炎支原体、猪鼻支原体特异性强，免疫性好的二联灭活疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗，其含有猪肺炎支原体和猪鼻支原体。

优选地，本发明所述的猪肺炎支原体为猪肺炎支原体MR48株，猪鼻支原体为猪鼻支原体CVCC361株。

优选地，本发明所述的猪肺炎支原体含量至少为2×10⁹MHDCE/头份，猪鼻支原体含量至少为2×10⁹MHDCE/头份。

更优地，本发明所述的猪肺炎支原体含量为3×10⁹MHDCE/头份，猪鼻支原体含量为3×10⁹MHDCE/头份。

优选地，本发明所述的二联灭活疫苗中，免疫佐剂选自氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel 01(法国SCIPPIC)、蜂胶、ISA206(法国SCIPPIC)、ISA760VG(法国SCIPPIC)，优选卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SCIPPIC)、ISA206(法国SCIPPIC)、ISA760VG(法国SCIPPIC)，更优选卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SCIPPIC)，优选卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)的一种或几种的组合。

最优地，本发明提供一种疫苗组合物，含有猪肺炎支原体和猪鼻支原体，其中，猪肺炎支原体为3×10⁹MHDCE/头份(2ml)，猪鼻支原体为3×10⁹MHDCE/头份(2ml)，含10％(V/V)卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)佐剂。

本发明的另一目的在于提供一种猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)菌种：猪肺炎支原体为猪肺炎支原体MR48株，于2006年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；猪鼻支原体为猪鼻支原体CVCC361株，购自中国兽药监察所。冻干保存；

2)生产菌种的制备：分别将冻干菌种用液体培养基稀释后，接种于固体培养基获得一级种子，再用一级种子接种于液体培养基获得二级种子；

3)制苗用菌液的制备：分别将猪肺炎支原体与猪鼻支原体的二级种子液接种于液体培养基中并培养4-7日，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)；

4)灭活、浓缩及配苗：分别将检验合格的猪肺炎支原体和猪鼻支原体菌液，加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(V/V)，37℃灭活；浓缩后，加入防腐剂和佐剂，混合搅拌即得二联灭活疫苗；

其中，所用菌种为猪肺炎支原体MR48株，猪鼻支原体CVCC361株。

本发明提供了一种猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗，其特异性强、免疫性好，至少有以下的优点。

首先，本发明的二联疫苗不仅可以解决针对目前国内养殖场的特异性的猪肺炎支原体引起的感染，而且提供了目前国内外均处于空白的猪鼻支原体疫苗。

其次，针对国内养殖场中猪肺炎支原体、猪鼻支原体常常混合感染的状况，提供了二联灭活疫苗，有效地解决上述问题。本发明的二联疫苗简化了疫苗接种的步骤，避免了多次接种的麻烦和容易产生的副作用，节约了疫苗成本，特别适用于预防和治疗国内养殖场等混合感染的病症。

总之，本发明提供的二联灭活疫苗安全性好，试验猪无不良反应。其抵抗猪肺炎支原体的免疫效果与单苗相当，而且可同时产生抵抗猪鼻支原体的免疫效力，可以预防多发性浆膜炎或关节炎的发生，与现有单苗相比，扩大了应用范围，增强了免疫效果。

猪支原体肺炎为MR48株，于2006年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏编号：CGMCC No.1816，分类命名：猪肺炎支原体，英文名称为Mycoplasma hyopneumoniae，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，在专利CN1928076A公开。

猪鼻支原体CVCC361株，购自中国兽药监察所。

附图说明

图1为猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗的制备流程图。

具体实施方式

下面的实施例将进一步具体说明本发明，而不限制本发明的范围。

实施例1、猪支原体肺炎、猪鼻支原体的二联灭活疫苗的制备方法

选用菌种猪支原体肺炎为MR48株，于2006年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏编号：CGMCCNo.1816，分类命名：猪肺炎支原体，英文名称为Mycoplasma hyopneumoniae，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。猪鼻支原体CVCC361株，购自中国兽药监察所。

制备二联疫苗的步骤如下：

1).菌种培养

1.1猪支原体肺炎的培养

选用菌种猪支原体肺炎为MR48株，于2006年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

猪支原体肺炎形态和生化特性：为环状、球状、丝状、杆状和点状多形态微生物，无细胞壁，革兰氏染色阴性。

培养特性：在液体培养基中呈现良好的生长，37℃培养4-10日后培养基下降0.5个pH值以上，呈现轻度混浊。培养物中猪肺炎支原体活菌滴度可以达到10⁸-10⁹CCU/ml(CCU-颜色变化单位，参照王继春，邵国青，等.猪肺炎支原体#168无细胞弱毒疫苗株的变色单位测定试验[J].畜牧与兽医，2001，33(6)：22-23)之间。接种固体培养基，37℃培养7-14日后，可见油煎蛋样菌落。

液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液(BD公司)300ml，ddH2O 360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，0.25％(W/V)酚红10ml马血清200ml，5％(W/V)水解乳蛋白100ml，25％(W/V)酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1％(W/V)醋酸铊溶液25ml。

固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar(BD公司)即可。

血清学特性

1用代谢抑制试验鉴定在加有猪肺炎支原体抗血清的液体培养基中，经37℃恒温培养15日，pH值不下降。

2用生长抑制试验鉴定在加有猪肺炎支原体抗血清的固体培养基表面，经37℃恒温培养10-20日，无菌落出现

免疫原性检验

免疫方式(鼻腔喷雾和肺内注射)等共分为9个组进行免疫，同时设未免疫对照组。免疫后55日，采用猪肺炎支原体强毒F65株连同对照猪共计30头一起进行攻毒，攻毒后30日全部宰杀，检查肺部病变。试验结果显示胸腔肺内注射途径和鼻内喷雾免疫接种猪的保护效分别为90％和55％。

分子生物学鉴定(P97基因序列的测定)

按照丁芳等人的方法(《畜牧兽医学报》2004.Vo1.35 No6.698-701)对该菌株P97基因序列进行测定，结果表明，猪肺炎支原体MR48株保留了猪肺炎支原体R659株的特性，即：MR48株和R659株的P97基因的R1(AAKPV/E)重复序列同样为17个。

1.2猪鼻支原体的培养

猪鼻支原体采用CVCC361株，购自中国兽药监察所。

形态特征：液体培养物，抹片经姬姆萨染色，低代次菌体常以小环形为主。高代次菌体多以小点状为主多形态。固体培养基上，菌落呈大小不一圆球形，直径1.4-7μm，中间有一小突起，表面粗糙。

培养特性：液体培养基中，生长迅速，分离初期pH变化较慢，但到12代后一般2-3天pH即可由7.6下降到6.8。微加振动，可见雾状沉淀。固体培养基上7-8天后生长菌落。在7日龄鸡胚卵黄囊内接种，7-10天后，死胚或活胚均呈现不同程度的出血性心包渗出物抹片，镜检有大量小点状支原体。回归液体培养基可获得原培养物。

液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液300ml，ddH₂O360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，0.25％(W/V)酚红10ml马血清200ml，5％(W/V)水解乳蛋白100ml，25％(W/V)酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1％(W/V)醋酸铊溶液25ml。

固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar即可。

血清学特性：

1用代谢抑制试验鉴定在加有猪鼻支原体抗血清的液体培养基中，经37℃恒温培养15日pH值不下降。

2用生长抑制试验鉴定在加有猪鼻支原体抗血清的固体培养基表面，经37℃恒温培养10-20日，无菌落出现。

2)生产菌种的制备：

1.一级种子的繁殖：分别取猪肺炎支原体MR48株和猪鼻支原体CVCC361株冻干菌种，用液体培养基稀释，接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7-10d，选择生长良好的菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。

2二级种子的繁殖

分别取一级种子接种于液体培养基上，37℃培养4-7d，经纯粹检验合格后，作为二级种子。

3)制苗用菌液的制备

分别将猪肺炎支原体MR48株和猪鼻支原体CVCC361株二级种子液以1∶10(体积比)接种于液体培养基中。存37℃下培养4-7日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养至200,000ml(继代次不超过6代)。

培养结束后，分别从制苗菌液取样，根据《中华人民共和国兽药典(二00五年版)》中细菌类活疫苗纯粹检验方法进行纯粹检验，菌液应纯粹。

4)灭活、浓缩和制苗

1.含量测定

用PCR方法分别对培养物进行计数。10倍体积比稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检出的最低限量为3×10^-3μg(相当于1000左右个菌体)，按稀释的倍数算出菌体数(沈青春，谭青松，王琴，等.PCR方法测定Mhp培养物菌数[J].中国预防兽医学报，2006，28(1)：55-57)。培养物含量应为1-2×10⁹MHDCE/ml。(MHDCE＝猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体)。

2浓缩

将灭活检验合格的猪肺炎支原体培养液和猪鼻支原体培养液分别用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda道尔顿)作10倍浓缩。

3配苗与分装

3.1配苗

3.1.1防腐剂的配制

1％(w/v)的硫柳汞水溶液和7％(w/v)乙二胺四乙酸四钠(EDTA)

3.1.2代谢油混合物配制

在900mL纯化水内溶解10g氯化钠、0.25g氯化钾、2.72磷酸氢二钠、0.25磷酸二氢钾、20mL PluronicL121(BASF Corporation)、40mLSqualane(Kodak)，3.2mLTween80，然后定容到1000ml。混合后，对所述成分进行高压蒸汽灭菌。然后匀浆所述混合物，直到形成稳定的乳浊液。加福尔马林达到0.2％(v/v)的终浓度。

3.1.3稀释剂的配制

无菌的PBS缓冲溶液，pH为7.4

3.1.4佐剂的配制

Carbopol 2％w/v水溶液

3.1.5将上述成分按下表所示比例进行混合，即通过无菌操作，将含量合格的猪肺炎支原体浓缩物与所述佐剂、防腐剂和稀释剂混合加入装备有搅拌器的无菌容器，37℃搅拌30分钟，生产1,000,000个剂量(每个剂量2ml)的二联灭活疫苗量：

其中猪肺炎支原体浓缩物与猪鼻支原体浓缩物的含量应大于1.0×10¹⁰MHDCE/ml，本实施例中使用了1.5×10¹⁰MHDCE/ml，即每头份疫苗中含猪肺炎支原体浓缩物与猪鼻支原体浓缩物为3.0×10¹⁰MHDCE/头份(按每头份疫苗的体积为2ml计算)。

因此，1,000,000个剂量(每个剂量2ml)的二联灭活疫苗中每头份(2ml)疫苗含猪肺炎支原体为3×10⁹MHDCE/头份(2ml)，猪鼻支原体为3×10⁹MHDCE/头份(2ml)，10％(V/V)卡波姆(Carbomer)佐剂，5％v/v代谢油混合物，0.9％v/v的1％w/v的硫柳汞水溶液和7％w/v的EDTA及64.1％v/v无菌PBS缓冲溶液。

3.2二联灭活疫苗的半成品检验

3.2.1无菌检验

取充分搅拌混合后苗样，按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，结果无细菌生长。

3.2.2灭活检验

取灭活后菌液10ml接种于100ml液体培养基中37℃培养4-7d，再移植于上述培养基100ml中37℃培养4-7d；另外，取灭活后菌液0.5ml接种于固体培养基，37℃培养7-10d。上述两种方法培养的结果中无菌生长。

3.3分装

无菌条件下以100ml/瓶，或20ml/瓶分装，盖上瓶塞，并压铝盖。每个2.0mL剂量包含不少于2x10⁹猪肺炎支原体和2x10⁹猪鼻支原体DNA细胞等同物(MHDCE)。

4.安全检验

4.1用小鼠检验

取体重20-25g小鼠8只，各皮下注射疫苗0.5ml，观察7天，结果全部健活。

4.2用猪检验

用2-3周龄健康易感猪4头，各肌肉注射疫苗4ml，观察7天，观察结果，发现无明显的不良反应。

5.效力检验

5.1猪肺炎支原体部分

按竞争酶联免疫吸附试验进行。可接受的阳性血清读数范围为1.0-2.2，阴性血清读数范围为＜0.5。竞争性ELISA反应的结果由USDARelPot 4.0进行分析处理。与参照疫苗(经靶动物免疫与攻毒试验证明了其免疫效力的疫苗)相比，待检疫苗的相对免疫效力值(RP值)应≥1.0。

5.2猪鼻支原体部分

用体重1.5-2.0kg的大耳白兔5只，取3瓶疫苗(2头份/瓶)疫苗用无菌生理盐水稀释成总体积12ml，每只大耳白兔各肌肉注射2ml，第30日采血，用间接血凝方法检查血清凝集抗体，应至少4只为阳性(血凝价≥10)，判为合格。

6.用法与用量

肌肉注射或皮下注射，每头猪接种1头份(2ml)。

7.猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗的制备过程，可参考图1的内容。

实施例2猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗与单独使用猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果比较

1材料实施例1中猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗试制品；美国先灵葆雅猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)(批号为100806)。

2动物试验设计

选21～25日龄断奶仔猪60头，分为6组，每组10头(见下表)；第1、2组每头猪分别颈部肌肉注射猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗2ml；第3组每头猪分别颈部肌肉注射猪肺炎支原体商品化疫苗2ml；第4、5组作为攻毒对照，不接种；第6组作为未攻毒对照，既不接种，也不攻毒，在单独房间饲养。第1、3、4组在接种后四个月用猪肺炎支原体强毒F65株(购自中国兽药监察所)攻毒，第2、5组在接种后四个月用猪鼻支原体CVCC361株攻毒。攻毒后(DPC)30天，无痛苦处死所有猪。取出肺，由不了解试验组的人员统计肺病变。在接种当天(0DPV)、接种后一个月(1MPV)、接种后四个月(4MPV)或攻毒当天(0DPC)、攻毒后30天(30DPC)，从所有猪收集血液样品，使用竞争性ELISA试剂盒(由DAKOCo制造)检测抗猪肺炎支原体的血清杭体。所述血清样品保存在-20℃直到测试。

其中，上表中疫苗1为实施例一中猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗试制品；疫苗2为美国先灵葆雅猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)

3结果与讨论

3.1安全性，见下表

其中，疫苗1为实施例一中猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗试制品；疫苗2为美国先灵葆雅猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)

3.2效力测定

3.2.1血清学评价

使用猪肺炎支原体商业化竞争性ELISA试剂盒测试试验中所有猪体内抗猪肺炎支原体的血清杭体，其中所有测定使用1∶10的血清稀释度。所有猪在接种时都是血清学阴性(抗体滴度＜10)，这表明所有猪都对猪肺炎支原体敏感。对照组的所有猪在攻击前保持血清学阴性。这表明接种猪体内的免疫反应是由所述疫苗引起的，而不是任何环境暴露引起的。接种组内所有的猪和攻击对照组内大部分猪在攻击后都转化为对猪肺炎支原体呈血清学阳性，而所有未受攻击的猪保持血清学阴性。这表明：所述攻击是猪肺炎支原体特异性的。血清学检测见下表。

其中，DPV＝接种后天数；DPC＝攻毒后天数。0DPV表示接种日，30DPV表示接种后第30天，0DPC(120DPV)表示攻毒当日(即接种后第120天)，30DPC表示攻毒后第30天。

3.2.2肺病变评分

对照组的平均肺病变是14.6％，疫苗1接种组的平均肺病变是3.6％，疫苗2接种组的平均肺病变是4.2％。疫苗1接种组和对照组之间差异显著(P＝0.0215)，疫苗2接种组与对照组之间亦差异显著(P＝0.031)，两者相当。这表明：实施例1所述疫苗能有效刺激抵抗猪肺炎支原体的保护性免疫，所述保护性免疫在用单剂量接种三周龄的猪后持续至少四个月，且与国外进口猪肺炎支原体灭活疫苗效力相当。

其中，P值来自于接种组与对照组的比较

3.2.3猪鼻支原体部分

浆膜炎或关节炎病变评分见下表：

其中，疫苗1接种组与对照组平均浆膜炎或关节炎病变差异显著(P＝0.031)，这表明：实施例1所述疫苗能有效刺激抵抗猪鼻支原体的保护性免疫，所述保护性免疫在用单剂量接种三周龄的猪后持续至少四个月。

以上试验结果表明，该二联苗安全性好，试验猪无不良反应。其抵抗猪肺炎支原体的免疫效果与单苗相当，而且可同时产生抵抗猪鼻支原体的免疫效力，预防多发性浆膜炎或关节炎的发生，与现有单苗相比，扩大了应用范围，增强了免疫效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗，其特征在于，含有有效量的猪肺炎支原体和猪鼻支原体，和免疫佐剂。

2.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的猪肺炎支原体为猪肺炎支原体MR48株，保藏号为CGMCC No.1816；所述的猪鼻支原体为猪鼻支原体CVCC361株。

3.根据权利要求2所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的猪肺炎支原体含量至少为2×10⁹MHDCE/头份，所属的猪鼻支原体含量至少为2×10⁹MHDCE/头份。

4.根据权利要求3所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的猪肺炎支原体含量为3×10⁹MHDCE/头份，所述的猪鼻支原体含量为3×10⁹MHDCE/头份。

5.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的二联灭活疫苗中，所述的免疫佐剂选自氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆(Carbomer)、Gel 01(法国SCIPPIC)、蜂胶、ISA206(法国SCIPPIC)、ISA760VG(法国SCIPPIC)的一种或几种的组合。

6.根据权利要求5所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂为卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SCIPPIC)、ISA206(法国SCIPPIC)、ISA760VG(法国SCIPPIC)的一种或几种的组合。

7.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，含有猪肺炎支原体和猪鼻支原体，其中，猪肺炎支原体为3×10⁹MHDCE/头份(2ml)，猪鼻支原体为3×10⁹MHDCE/头份(2ml)，10％(V/V)卡波姆(Carbomer)佐剂，5％v/v代谢油混合物，0.9％v/v的硫柳汞水溶液和EDTA和64.1％v/v无菌PBS缓冲溶液。

8.如权利要求1-7任一项所述的猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)菌种：猪肺炎支原体为猪肺炎支原体MR48株，猪鼻支原体为猪鼻支原体CVCC361株，冻干保存；

2)生产菌种的制备：取冻干菌种，用液体培养基稀释后，接种固体培养基获得获得一级种子；取一级种子接种于液体培养基上获得二级种子；

3)制苗用菌液的制备：将猪肺炎支原体与猪鼻支原体的二级种子液接种于液体培养基中并培养4-7日，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养。一直到制苗所需的量(继代次不超过6代)；

4)浓缩、灭活及配苗：分别将检验合格的猪肺炎支原体和猪鼻支原体菌液，加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(V/V)，37℃灭活；浓缩后，加入防腐剂和佐剂，混合搅拌即得二联灭活疫苗；

9.根据权利要求8所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所用菌种为猪肺炎支原体MR48株，保藏号为CGMCC No.1816；猪鼻支原体CVCC361株。