CN104250623B - 一株猪鼻支原体菌株、疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株支原体属猪鼻支原体LYH株，以及由该猪鼻支原体LYH株制备的疫苗组合物，尤其是一种包括猪鼻支原体、猪肺炎支原体的疫苗组合物。该疫苗组合物可以有效防治猪鼻支原体、猪肺炎支原体单独感染或混合感染引起的猪地方流行性肺炎（SEP），尤其在混合感染情况下，该疫苗组合物的免疫效果明显超过各单苗的免疫效果。

Description

一株猪鼻支原体菌株、疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一株新的猪鼻支原体菌株、疫苗组合物，以及其制备方法和应用，属于兽用疫苗领域。

背景技术

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis，Mhr)是小猪上呼吸道中的常见寄生病原（Ross and Young于1993年检测），在猪群中检出率高，单独并不致病。Switzer于1953、1954、1955年先后分离到该支原体，并对其正式命名为猪鼻支原体（Mhr）。猪鼻支原体（Mhr）的感染主要通过呼吸道传播，通常是由母猪或大猪传给小猪。和猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）一样，猪鼻支原体能够粘附到呼吸道的纤毛上皮细胞，破坏纤毛屏障造成其他细菌继发感染引起猪肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、咽鼓管炎、耳炎、结膜炎等。目前对该病原的预防还未有疫苗产品上市，加之不同地方分离的菌株致病性差异明显，筛选合适的疫苗株变得极其困难。

猪喘气病又称猪支原体肺炎或猪地方流行性肺炎（SEP），是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶、尖叶、膈叶和中间叶出现“胰样变”和“肉样变”为其特征。本病发病率高，死亡率低，主要危害是使猪群生长受阻和饲料转化率大幅下降，并能引起继发感染，是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。在国内养殖场中猪肺炎支原体、猪鼻支原体往往混合感染，某些猪鼻支原体菌株会促进猪地方流行性肺炎的发生。此外，有研究者在一起免疫猪肺炎支原体疫苗后感染猪地方流行性肺炎的病理解剖中仅分离到了猪鼻支原体，通过进一步的人工感染试验证实，意外地发现猪鼻支原体可以单独引发猪地方流行性肺炎。

临床发现，猪鼻支原体的感染率在呈逐年增加趋势。为此，急需开发一种猪鼻支原体疫苗，用来预防猪鼻支原体病原，尤其是预防猪鼻支原体引起的猪地方流行性肺炎。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种支原体属猪鼻支原体分离株，名称为支原体属猪鼻支原体LYH株（Mycoplasma hyorhinis strain LYH），其保藏编号为CCTCCNo.V201334，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2013年8月20日。

本发明中所用术语“支原体属猪鼻支原体”也简称为“猪鼻支原体”。

类似的，本发明中所用术语“支原体属猪鼻支原体LYH株”也简称为“猪鼻支原体LYH株”。

本发明还提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的猪鼻支原体抗原以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括防腐剂、稀释剂、佐剂。

优选地，所述猪鼻支原体抗原为含有猪鼻支原体LYH株或其培养物的减毒全菌抗原、灭活全菌抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。所述疫苗组合物为含有猪鼻支原体LYH株或其培养物的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗或基因工程疫苗。

优选地，所述疫苗组合物包含佐剂，所述佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、蜂胶、ISA206、ISA760VG。更优选地，所述佐剂为卡波姆、Gel01、ISA206、ISA760VG。进一步优选地，所述佐剂为卡波姆、Gel01。最优选地，所述佐剂为Gel01。

优选地，所述佐剂在疫苗组合物中为10～60%（v/v）。

优选地，在所述疫苗组合物中，所述猪鼻支原体含量为10⁸～10¹⁰CCU/ml。更优选地，在所述疫苗组合物中，所述猪鼻支原体含量为4.5×10⁸CCU/ml。

本发明所用的术语“培养物”是猪鼻支原体的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。

本发明所用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”可互换使用，其是指包含至少一种在动物中诱导免疫应答的免疫原性组合物的药物组合物。

本发明所用的术语“活疫苗”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病原体制备的疫苗。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。

本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病原体的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。

本发明所用的术语“亚单位疫苗”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能性小。

本发明所用的术语“合成肽疫苗”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。

本发明的另一个目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪鼻支原体相关疾病的药物中的应用。

本发明所用术语“猪鼻支原体相关疾病”用于指由猪鼻支原体感染引起的疾病。它的例子包括隐性感染、继发感染猪鼻支原体引起的相关症状，包括猪地方流行性肺炎等，但不限于此。

本发明所用术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪鼻支原体感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪鼻支原体感染引起的症状减轻或转好的所有行为。

此外，本发明的疫苗组合物可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪鼻支原体感染在内的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。

本发明所用术语“联合疫苗”用于指从本发明的猪鼻支原体与至少一种不同支原体的支原体混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指的是由本发明的猪鼻支原体与病毒或/和细菌混合或组合制备的疫苗。

本发明的又一主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪鼻支原体抗原、免疫量的猪肺炎支原体抗原和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括防腐剂、稀释剂、佐剂。

优选地，所述猪鼻支原体抗原为猪鼻支原体或其培养物的减毒全菌抗原、灭活全菌抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原；所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体其培养物的减毒全菌抗原、灭活全菌抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。

本发明所用术语“猪鼻支原体抗原”是指由猪鼻支原体分离株制备的抗原，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抗猪鼻支原体感染的免疫应答。优选地，所述猪鼻支原体抗原包括减毒的活的猪鼻支原体抗原、灭活的猪鼻支原体抗原、含猪鼻支原体的免疫原性氨基酸序列的亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。

本发明所用术语“猪肺炎支原体抗原”是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪支原体肺炎的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体抗原、改良的活的或减毒的猪肺炎支原体抗原，含猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的亚单位抗原，或含猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽或基因工程抗原。

优选地，所述疫苗组合物中猪鼻支原体为支原体属猪鼻支原体LYH株；猪肺炎支原体为猪肺炎支原体HN0613。

本发明所述支原体属猪鼻支原体LYH株（Mycoplasma hyorhinis strain LYH），保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：V201334，保藏日期为2013年08月20日。

本发明所述猪肺炎支原体HN0613（Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613），系本实验室分离，保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2012230，保藏日期为2012年6月13日。

本发明所述猪肺炎支原体还可以用以下猪肺炎支原体中的一种或几种：如勃林格殷格翰公司的（J株）；哈药集团公司的Respisure和RespisureOne（P-5722-3株）；美国先灵葆雅的 （J株）；西班牙海博莱生物大药厂的MYPRAVAC SUIS（J株）；美国普泰克公司的MycoGard（P株）；美国辉瑞公司的RespiFend MH（P-5722-3株）；梅里亚动物保健公司的猪克喘（BQ14株）。

优选地，所述疫苗组合物中猪鼻支原体抗原和猪肺炎支原体抗原的比例为1:1（v/v）。

优选地，所述疫苗组合物中猪鼻支原体抗原含量为灭活前10⁸～10¹⁰CCU/ml；猪肺炎支原体抗原含量为灭活前10⁸～10¹⁰CCU/ml。

更优选地，所述疫苗组合物中所述猪鼻支原体抗原为灭活前4.5×10⁸CCU/ml的灭活猪鼻支原体LYH株全菌抗原，所述猪肺炎支原体抗原为灭活前4.5×10⁸CCU/ml的灭活猪肺炎支原体HN0613全菌抗原；或

所述猪鼻支原体抗原为灭活前10¹⁰CCU/ml的灭活猪鼻支原体LYH株全菌抗原，所述猪肺炎支原体抗原为灭活前10¹⁰CCU/ml的灭活猪肺炎支原体HN0613全菌抗原。

优选地，所述疫苗组合物包括佐剂，所述佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、蜂胶、ISA206、ISA760VG。更优选地，所述佐剂为卡波姆、Gel01、ISA206、ISA760VG。进一步优选地，所述佐剂为卡波姆、Gel01。最优选地，所述佐剂为Gel01。

优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中为10～60%(v/v)。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

1）培养增殖所述猪鼻支原体菌液，浓缩、灭活；

2）培养增殖猪肺炎支原体菌液，浓缩、灭活；

3）按比例混合所述两种抗原液，添加药学上可接受的载体，混匀。

本发明又一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪地方流行性肺炎（SEP）的药物中的应用。

本发明提供了一种猪鼻支原体分离株以及由其制备的疫苗组合物。该猪鼻支原体分离株制得的疫苗组合物对引起猪地方流行性肺炎的猪鼻支原体显示出显著的免疫特性。

此外，本发明还提供了一种含猪鼻支原体、猪肺炎支原体的疫苗组合物及其制备方法和应用。该疫苗组合物具有以下优点：

1）本发明研究过程中意外发现猪鼻支原体单独感染可引发猪地方流行性肺炎（SEP），而猪鼻支原体、猪肺炎支原体往往混合感染，具有明显的协同作用，本发明的含有猪鼻支原体抗原、猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物可以有效防治猪鼻支原体、猪肺炎支原体单独感染或混合感染引起的猪地方流行性肺炎；在发生混合感染时，该疫苗组合物的免疫效果明显超过注射猪鼻支原体疫苗单苗或猪肺炎支原体疫苗单苗的免疫效果，可以显著提升SEP的防控效果，更适合于临床应用。

2）本发明的含猪鼻支原体抗原、猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，且为一针剂注射，因此，本发明的疫苗组合物副反应小、安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应；同时具有简化免疫程序、降低免疫成本、更加经济可靠、生产工艺简单等优点。

3）含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与单一疫苗相比，本发明提供的含猪鼻支原体抗原、猪肺炎支原体抗原的联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。

本发明中所述的“TCID₅₀”（50%tissue culture infective dose）是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。

实施例1、猪鼻支原体疫苗组合物的制备

1.菌（毒）株的来源

支原体属猪鼻支原体LYH株，系本实验室分离，保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：V201334，保藏日期为2013年08月20日。

2.猪鼻支原体疫苗半成品的制备及检验

2.1生产用种子的制备

将猪鼻支原体LYH株冻干菌种按10%接种液体培养基，置37℃培养1～3日，待培养基颜色变黄，pH值下降至6.8～7.0时收获菌液作为一级种子。

将一级种子按5%接种液体培养基，置37℃培养1～3日，待培养基颜色变黄，pH值下降至6.8～7.0时收获菌液作为二级种子。

液体培养基的配方（按1065m1计）：牛心浸出液300ml，ddH₂O360ml，校正pH值到7.4,121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，0.25%酚红10ml马血清200ml，5%水解乳蛋白100m1，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1%醋酸铊溶液25m1。

固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar（纯化琼脂，终浓度为1.4%）即可。

2.2制苗用菌液的制备

将猪鼻支原体二级种子液按5%～10%(v/v)接种于液体培养基中。37℃下培养1～3日，待液体培养基颜色变黄，pH值下降至6.8～7.0时收获菌液。

2.3含量测定

将待检猪鼻支原体菌液用Friis培养基进行10倍系列稀释，即0.2ml待检菌液加入装有1.8mlFriis培养基的西林瓶中混匀，然后连续稀释成10^-1至10^-12，并设Friis培养基作为对照。待检样品设2个重复。置37℃培养7日，每日观察Friis培养基颜色变化，在空白对照颜色不变的情况下，稀释培养物颜色变黄并呈轻度均一浑浊的最高稀释度为待测菌液的CCU滴度。取2个重复的平均值。

2.4浓缩和含量测定

将制苗用猪鼻支原体菌液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为100Kda道尔顿）进行浓缩，活菌计数。制备的猪鼻支原体浓缩抗原灭活前含量为10¹¹CCU/ml。

2.5灭活

取合格的猪鼻支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2%（v/v）的甲醛溶液，置37℃灭活24小时，每隔3～4小时搅拌一次。

3疫苗的配制

3.1防腐剂的配制

1%（w/v）的硫柳汞（国药集团化学试剂有限公司20130508）水溶液

3.2稀释剂的配制

无菌的PBS（0.01M，pH=0.02）缓冲溶液：在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0.25g氯化钾、3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，然后定容至1L，121℃高压灭菌30min备用。

3.3佐剂的配制

Gel01（法国SEPPIC公司20130302），121℃高压灭菌30min备用。

3.4配苗

取上述制备的猪鼻支原体浓缩灭活抗原，用无菌PBS（0.01mol/L，pH值7.2～7.4）稀释至所需体积，然后将抗原液与Gel01佐剂按90:10（v/v）混合，以500r/min搅拌30分钟，结束前加入终浓度为0.01%的硫柳汞即可。

各猪鼻支原体疫苗的配比如表1所示。

表1 各猪鼻支原体疫苗的配比

猪鼻支原体疫苗	猪鼻支原体LYH株抗原含量	Gel01佐剂含量
			疫苗L1	108CCU/ml	10%（v/v）
疫苗H1	1010CCU/ml	10%（v/v）
			疫苗S1	4.5×108CCU/ml	10%（v/v）

实施例2猪鼻支原体LYH株感染的致病性试验

本试验建立了人工感染猪鼻支原体LYH株的发病模型，从而证明猪鼻支原体LYH株能够引起猪地方流行性肺炎（SEP）的发生。

1材料：

动物：8～9周龄，猪肺炎支原体、猪鼻支原体血清抗体均为阴性的猪

攻毒菌株：猪鼻支原体LYH株

2方法：

选60～70日龄小猪10头，随机分为2组，每组5头。用猪鼻支原体LYH株攻击第1组猪，第2组不攻毒作为对照。观察28日，剖杀取肺，根据Madec and Kobisch（1982）的28分法对试验猪的SEP肺炎病变进行评分。各组攻毒菌株及剂量具体见表2。

表2 各组攻毒菌株及剂量

组别	头数	攻毒方式	攻毒菌毒株及剂量
				1	5	气管注射	猪鼻支原体LYH株1010CCU
2	5	/	/

3结果

攻毒试验结果如表3所示。

表3 各组临床症状及肺炎病变得分

组别	临床症状	肺炎病变平均得分
			1	2/5咳嗽或气喘	6.2
2	无	0

攻毒试验结果表明，攻击猪鼻支原体LYH株能够引起部分猪的气喘或咳嗽（2/5），且出现了猪地方流行性肺炎（SEP）的典型肺炎病变，肺炎病变平均得分为6.2，与空白对照组的差异具有显著性（P<0.05）。

4小结

试验结果表明，人工感染猪鼻支原体LYH株能够引起一定程度的猪地方流行性肺炎（SEP）临床症状和肺炎病变，证明该菌株具有致病性。

实施例3不同抗原含量的猪鼻支原体疫苗组合物的效力试验

本试验是为了评价不同抗原含量的猪鼻支原体疫苗组合物抵抗致病性猪鼻支原体感染的效力。

1材料

实施例1制备的疫苗L1（猪鼻支原体LYH株抗原含量为10⁸CCU/ml）和疫苗H1（猪鼻支原体LYH株抗原含量为10¹⁰CCU/ml）。

动物：2～3周龄，猪肺炎支原体、猪鼻支原体血清抗体均为阴性的仔猪

攻毒菌株：猪鼻支原体LYH株

2方法：

选2～3周龄仔猪15头，随机分为3组，每组5头。第0日，对第1组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗L1，对第2组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗H1，注射剂量均为2ml/头，第3、4组不注射疫苗作为对照。第1～3组、4组分别置于不同房间饲养。第42日，用猪鼻支原体LYH株攻击第1～3组猪（攻毒剂量为10¹⁰CCU），第3组攻毒不免疫作为攻毒对照组，第4组不攻毒不免疫作为空白对照组。观察28日，剖杀取肺，根据Madec and Kobisch（1982）的28分法对试验猪的SEP肺炎病变进行评分。试验各组免疫、攻毒情况见表4。

表4 试验各组免疫、攻毒情况

3结果

攻毒保护结果见表5。

表5 试验各组临床症状及肺炎病变得分

组别	临床症状	肺炎病变平均得分
			1	0/5咳嗽或气喘	1.0
2	0/5咳嗽或气喘	0.4
			3	2/5咳嗽或气喘	6.4
4	无	0

以上结果表明，疫苗L1、H1免疫组（第1、2组）在猪鼻支原体LYH株攻击后无明显临床症状，肺炎病变平均得分分别为1.0、0.4，与攻毒对照组3（肺炎病变平均得分为6.4）的差异显著（P<0.05），可见疫苗L1、H1均能够减轻和明显减少第1、2组试验猪的临床症状和肺炎病变。

4小结

试验结果表明，猪鼻支原体疫苗组合物在一定的抗原含量范围之内，均能减少猪地方流行性肺炎（SEP）的临床症状和肺炎病变，且抗原含量越大，保护作用越强。

实施例4、含猪鼻支原体抗原、猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物的制备

1猪鼻支原体抗原的制备

使用实施例1制备的猪鼻支原体抗原。

2猪肺炎支原体抗原的制备

2.1菌株的来源

猪肺炎支原体HN0613，系本实验室分离，保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2012230，保藏日期为2012年6月13日。

2.2.疫苗半成品的制备及检验

2.2.1生产用种子的制备

将猪肺炎支原体HN0613冻干菌种按20%接种液体培养基，置37℃培养3～7日，待培养基颜色变黄，pH值下降至6.8～7.0时收获菌液作为一级种子。

将一级种子接种按10%液体培养基，置37℃培养3～7日，待液体培养基颜色变黄，pH值下降至6.8～7.0时收获菌液作为二级种子。

液体培养基的配方（按1065m1计）：牛心浸出液300ml，ddH₂O360ml，校正pH值到7.4,121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，0.25%酚红10ml马血清200ml，5%水解乳蛋白100m1，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1%醋酸铊溶液25m1。

固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar（纯化琼脂，终浓度为1.4%）即可。

2.2.2制苗用菌液的制备

将猪肺炎支原体二级种子液按5%～10%(v/v)接种于液体培养基中。37℃下培养3～7日，待液体培养基颜色变黄，pH值下降至6.8～7.0时收获菌液。

2.2.3含量测定

将猪肺炎支原体待检菌液用Friis培养基进行10倍系列稀释，即0.2ml待检菌液加入装有1.8mlFriis培养基的西林瓶中混匀，然后连续稀释成10^-1至10^-12，并设Friis培养基作为对照。待检样品设2个重复。置37℃培养13日，每日观察Friis培养基颜色变化，在空白对照颜色不变的情况下，稀释培养物颜色变黄并呈轻度均一浑浊的最高稀释度为待测菌液的CCU滴度。取2个重复的平均值。

2.2.4浓缩和含量测定

将制苗用猪肺炎支原体菌液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为100Kda道尔顿）进行浓缩，活菌计数。制备的猪肺炎支原体浓缩抗原灭活前含量为10¹¹CCU/ml。

2.2.5灭活

取合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2%（v/v）的甲醛溶液，置37℃灭活24小时，每隔3～4小时搅拌一次。

3疫苗组合物的配制

1防腐剂、稀释剂、佐剂的配制参照实施例1中的3.1、3.2、3.3。

2配苗

取猪肺炎支原体灭活抗原和实施例1制备的猪鼻支原体灭活抗原，用无菌PBS（0.01mol/L，pH值7.2～7.4）稀释至所需体积，按1:1的比例制成混合抗原，然后将混合抗原与Gel01佐剂按90:10（v/v）混合，以500r/min搅拌30分钟，结束前加入终浓度为0.01%的硫柳汞即可。

各疫苗组合物的配比如表6所示。

表6 各疫苗组合物的配比

实施例5猪肺炎支原体与猪鼻支原体（以下简称“Mhp-Mhr”）混合感染试验

本试验是为了比较猪肺炎支原体单独感染和猪肺炎支原体、猪鼻支原体混合感染所引发的猪地方流行性肺炎（SEP）发病情况，从而证明猪鼻支原体LYH株在猪地方流行性肺炎（SEP）发病中的协同作用。

1材料：

动物：8～9周龄，猪肺炎支原体、猪鼻支原体血清抗体均为阴性的猪

攻毒菌株：猪肺炎支原体CVCC354株（购自中国兽医药品监察所）、猪鼻支原体LYH株

2方法：

选60～70日龄小猪25头，随机分为5组，每组5头。用不同剂量猪肺炎支原体CVCC354株分别攻击第1、2组猪;用猪鼻支原体LYH株和不同剂量猪肺炎支原体CVCC354株联合攻击第3、4组猪，第5组不攻毒作为对照。观察28日，剖杀取肺，根据Madec and Kobisch（1982）的28分法对试验猪的SEP肺炎病变进行评分。试验各组攻毒菌株及剂量见表7。

表7 各组攻毒菌株及剂量

注：MID指最小发病剂量。

3结果

攻毒试验结果如表8所示。

表8 各组临床症状及肺炎病变得分

组别	临床症状	肺炎病变平均得分
			1	4/5咳嗽或气喘	10.0
2	5/5咳嗽或气喘	12.8
			3	5/5咳嗽或气喘	14.2
4	5/5咳嗽或气喘	16.6
			5	无	0

攻毒结果表明单独攻击猪肺炎支原体时，不同发病剂量均能引起SEP临床症状和肺炎病变，且随着攻毒剂量的增加，症状和病变会逐渐加重；然而，当Mhp-Mhr联合攻毒时，SEP的临床症状和肺炎病变明显加重，猪肺炎支原体攻毒剂量为10MID的Mhp-Mhr联合攻毒组发病程度（肺炎平均得分14.2）甚至超过猪肺炎支原体攻毒剂量为100MID的猪肺炎支原体单独攻毒组（肺炎平均得分12.8），猪肺炎支原体攻毒剂量为100MID的Mhp-Mhr联合攻毒组发病程度最严重（肺炎平均得分16.8）。空白对照组与猪肺炎支原体攻毒组（第1、2组）、Mhp-Mhr联合攻毒组（第3、4组）肺炎病变平均得分的差异具有显著性（P<0.05）。

4小结

实施例5试验结果表明，猪肺炎支原体与猪鼻支原体的混合感染对猪地方流行性肺炎（SEP）的发生具有显著的协同作用，会明显促进SEP的发病。

实施例6不同抗原含量的含猪肺炎支原体抗原、猪鼻支原体抗原的疫苗组合物（以下简称“Mhp-Mhr联合疫苗”）的效力试验

本试验是为了评价不同抗原含量的Mhp-Mhr联合疫苗抵抗猪肺炎支原体单独感染或Mhp-Mhr混合感染的效力。

1材料

实施例4制备的疫苗组合物L2（Mhp+Mhr，10⁸CCU/ml+10⁸CCU/ml）和疫苗组合物H2（Mhp+Mhr，10¹⁰CCU/ml+10¹⁰CCU/ml）。

动物：2～3周龄，猪肺炎支原体、猪鼻支原体血清抗体均为阴性的猪

攻毒菌株：猪肺炎支原体CVCC354株（购自中国兽医药品监察所）、猪鼻支原体LYH株

2方法：

选2～3周龄仔猪35头，随机分为7组，每组5头。第0日，对第1、4组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗L2，对第2、5组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗H2，注射剂量均为2ml/头，第3、6、7组不注射疫苗作为对照。第1～3组、4～6组、7组分别置于不同房间饲养。第42日，用猪肺炎支原体CVCC354株攻击1～3组猪，用猪肺炎支原体CVCC354株、猪鼻支原体LYH株同时攻击4～6组猪，第7组作为空白对照。观察28日，剖杀取肺，根据Madec and Kobisch（1982）的28分法对试验猪的SEP肺炎病变进行评分。各组免疫及攻毒情况见表9。

表9 各组免疫、攻毒情况

3结果

攻毒保护试验结果见表10。

表10 各组临床症状及肺炎病变得分

组别	临床症状	肺炎病变平均得分
			1	1/5咳嗽	2.6
2	0/5咳嗽或气喘	0.8
			3	5/5咳嗽或气喘	12.4
4	2/5咳嗽或气喘	4.8
			5	0/5咳嗽或气喘	3.0
6	5/5气喘	15.8
			7	无	0

以上结果表明，疫苗L2、H2免疫组（第1、2组）在猪肺炎支原体单独攻击后肺炎病变平均得分分别为2.6、0.8，与攻毒对照组3（肺炎病变得分12.4）的差异显著（P<0.05），说明疫苗L2、H2均能够明显减少肺炎病变；同样，疫苗L2、H2免疫组（第4、5组）在猪肺炎支原体-猪鼻支原体联合攻击后肺炎病变平均得分分别为4.8、3.0，与攻毒对照组6（肺炎病变得分15.8）的差异显著（P<0.05），也能够明显减少肺炎病变。

4小结

实施例6试验表明，Mhp-Mhr联合疫苗在一定的抗原含量范围之内，无论是单独攻毒还是混合攻毒，均能减少猪地方流行性肺炎（SEP）的病变，且抗原含量越大，保护作用越强。

实施例7猪肺炎支原体（Mhp）单苗、猪鼻支原体（Mhr）单苗和Mhp-Mhr联合疫苗的效力比较

本试验是为了比较Mhp-Mhr联合疫苗和Mhp、Mhr单苗抵抗Mhp-Mhr混合感染的效果。

1材料

实施例1、4制备的疫苗S1（Mhr抗原含量为4.5×10⁸CCU/ml）、疫苗S2（Mhp抗原含量为4.5×10⁸CCU/ml）和疫苗组合物D（Mhp+Mhr,4.5×10⁸CCU/ml+4.5×10⁸CCU/ml）。

动物：2～3周龄，猪肺炎支原体、猪鼻支原体血清抗体均为阴性的猪

攻毒菌株：猪肺炎支原体CVCC354株（购自中国兽医药品监察所）、猪鼻支原体LYH株

2方法

选2～3周龄仔猪25头，随机分为5组，每组5头。第0日，对第1、2、3组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗S1、疫苗S2、疫苗D，剂量均为2ml/头，第4、5组不注射疫苗作为对照。第42日，用Mhp CVCC354株、Mhr LYH株同时攻击1～4组猪，第4组攻毒不免疫作为攻毒对照组，第5组不免疫、不攻毒作为空白对照组。观察28日，剖杀取肺，根据Madec and Kobisch（1982）的28分法对试验猪的SEP肺炎病变进行评分。各组免疫和攻毒情况见表11。

表11 各组免疫、攻毒情况

3结果

攻毒保护试验结果见表12。

表12 各组临床症状及肺炎病变得分

组别	临床症状	肺炎病变平均得分
			1	4/5咳嗽或气喘	11.8

2	3/5咳嗽或气喘	11.0
			3	0/5咳嗽或气喘	3.4
4	5/5咳嗽或气喘	16.2
			5	无	0

以上结果表明，在Mhp-Mhr联合攻击的情况下，疫苗组合物D免疫组（第3组）肺炎病变平均得分为3.4，与攻毒对照组4（肺炎病变得分16.2）差异显著（P<0.05），可见疫苗组合物D能够明显减少肺炎病变；疫苗S1、S2免疫组（第1、2组）肺炎平均得分分别为11.8、11.0，虽然较攻毒对照组4（肺炎病变得分16.2）有所减少，但差异不显著（P>0.05），而与疫苗组合物D免疫组（肺炎病变得分3.4）却差异显著（P<0.05），说明疫苗组合物D比疫苗S1、S2更能减少猪地方流行性肺炎（SEP）的肺炎病变。

4小结

实施例7试验结果表明：Mhr单苗仅能对Mhr单独感染产生保护，Mhp单苗仅能对Mhp单独感染产生保护，但面对Mhp-Mhr的混合感染时，各单苗在减少SEP病变方面的保护作用明显下降；而Mhp-Mhr联合疫苗在抗原含量不变的情况下，面对Mhp-Mhr的混合感染时的保护效果令人满意。因此，针对Mhp、Mhr的混合感染，本发明中的Mhp-Mhr联合疫苗的使用效果明显优于Mhr或Mhp单苗，更适合临床应用。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，在不脱离本发明技术方案的范围内，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)，所述猪鼻支原体为保藏号为CCTCCNo.V201334的支原体属猪鼻支原体LYH株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2013年8月20日。

2.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的根据权利要求1所述的猪鼻支原体抗原以及药学上可接受的载体，所述猪鼻支原体抗原为含有猪鼻支原体LYH株或其培养物的灭活全菌抗原。

3.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的根据权利要求1所述的猪鼻支原体抗原、免疫量的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)抗原和药学上可接受的载体，

其中，所述猪鼻支原体抗原为所述猪鼻支原体LYH株或其培养物的灭活全菌抗原；所述猪肺炎支原体抗原为所述猪肺炎支原体HN0613株及其培养物的灭活全菌抗原，其中所述猪肺炎支原体HN0613株，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M2012230。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体抗原和所述猪肺炎支原体抗原的比例为体积比1:1。

5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体抗原含量为灭活前10⁸～10¹⁰CCU/ml；所述猪肺炎支原体抗原含量为灭活前10⁸～10¹⁰CCU/ml。

6.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体抗原为灭活前4.5×10⁸CCU/ml的灭活猪鼻支原体LYH株全菌抗原，所述猪肺炎支原体抗原为灭活前4.5×10⁸CCU/ml的灭活猪肺炎支原体HN0613全菌抗原；或所述猪鼻支原体抗原为灭活前10¹⁰CCU/ml的灭活猪鼻支原体LYH株全菌抗原，所述猪肺炎支原体抗原为灭活前10¹⁰CCU/ml的灭活猪肺炎支原体HN0613全菌抗原。

7.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel 01、蜂胶、ISA206或ISA760VG。

8.一种制备权利要求3～7任一项所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

1)培养增殖所述猪肺炎支原体菌液，灭活；

2)培养增殖所述猪鼻支原体菌液，灭活；

3)按比例混合所述两种抗原液，添加药学上可接受的载体，混匀。

9.如权利要求3～7任一项所述的疫苗组合物在制备预防猪地方流行性肺炎的药物中的应用。