TWI606839B - 防治豬鼻黴漿菌感染之組合物及生產該組合物的方法 - Google Patents

Description

防治豬鼻黴漿菌感染之組合物及生產該組合物的方法

本發明關於一種防治豬鼻黴漿菌感染的組合物，尤指一種防治豬鼻黴漿菌感染的次單位疫苗。

豬肺炎黴漿菌(Mycoplasm hyopneumoniae)與豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis)是造成豬黴漿菌性肺炎(swine enzootic pneumonia,SEP)的主要病原。豬鼻黴漿菌亦與多發性漿膜炎(polyserositis)或關節炎(arthritis)之發生有關。豬隻感染豬肺炎黴漿菌或豬鼻黴漿菌後，會使飼料換肉率降低，導致生長遲緩，並會引起其他病毒性或細菌性病原的二次感染，進而造成養豬業者的經濟損失。全球動物用疫苗廠商已開發豬肺炎黴漿菌不活化死菌疫苗供養豬產業使用，但目前尚無豬鼻黴漿菌疫苗問市。豬肺炎黴漿菌不活化死菌疫苗之施打，僅可防範豬肺炎黴漿菌之感染，無法避免豬鼻黴漿菌之感染。

為解決疫苗保護範圍不足之問題，實有必要開發豬鼻黴漿菌疫苗。傳統疫苗之開發主要以不活化死菌疫苗為主，但由於黴漿菌不易培養、使用的培養基昂貴以及培養的菌體濃度不高，可能致使豬鼻黴漿菌不活化死菌疫苗之製造成本較高。因此，易於生產與安全性高之次單位疫苗為疫苗開發之另一選擇。截至今日，領域中仍尚未有研究報告完整地提出適用於豬鼻黴漿菌次單位疫苗的抗原。爰是，本發明之主要目的在於開發低成本與有效之豬鼻黴 漿菌次單位疫苗，以使養豬產業之整體防疫工作更為完善。

爰是，本發明的一個目的為提供一種防治豬鼻黴漿菌感染的次單位疫苗，健全養豬產業的疾病防治。

本發明的又一個目的為提供一種抗原表現載體及透過於原核細胞表現系統中表現前述表現載體中之抗原基因以生產次單位疫苗的方法，以使生產次單位疫苗的成本降低。

為達到上述目的，本發明提供一種用於避免因豬鼻黴漿菌感染所引發之病徵的組合物，其包含：一活性成分，其包含XylF、DnaK、P72、或其組合；及一佐劑；其中前述XylF包含如SEQ ID NO 01所示序列，前述DnaK包含如SEQ ID NO 02所示序列，前述P72包含如SEQ ID NO 03所示序列；其中前述病徵係選自腹膜炎、胸膜炎、心包炎、及關節腫脹之至少一種。

較佳地，前述活性成分係選自XylF、DnaK、及P72所組成之群組中的至少兩種。更佳地，前述活性成分為XylF、DnaK、及P72之組合。

較佳地，前述活性成分的濃度為50至300μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。

較佳地，前述佐劑包含：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。

較佳地，前述組合物的限制條件是：當前述活性成分為XylF，前述病徵為腹膜炎、胸膜炎、或其組合。

較佳地，前述組合物的限制條件是：當前述活性成分為DnaK，前述病徵為腹膜炎。

較佳地，前述組合物的限制條件是：當前述活性成分為P72，前述病徵為胸膜炎。

較佳地，前述組合物的限制條件是：當前述病徵為腹膜炎、胸膜炎、心包炎、及關節腫脹，前述活性成分為XylF、DnaK、及P72之組合。

本發明又提供一種表現載體，其用於一原核細胞表現系統中生產前述組合物中的前述活性成分，其中前述表現載體包含：一表現元件，其包含一啟動子及一核糖體結合部位；一核苷酸序列，其編碼為前述XylF、前述DnaK、前述P72、或其組合；及一融合夥伴序列；其中前述核苷酸序列包含如SEQ ID NO 04、SEQ ID NO 05、SEQ ID NO 06、或其組合所示序列。

較佳地，融合夥伴係大腸桿菌之dsbC、大腸桿菌之msyB、大腸桿菌之fklB、或其組合。更佳地，前述表現載體的限制條件是：當前述核苷酸序列編碼為XylF時，前述融合夥伴是大腸桿菌之dsbC；當前述核苷酸序列編碼為DnaK時，前述融合夥伴是大腸桿菌之msyB；或當前述核苷酸序列編碼為P72時，前述融合夥伴是大腸桿菌之fklB。

較佳地，前述表現載體進一步包含一組胺酸標籤(His-tag)之序列、一麩胺基硫-S-轉移酵素(Glutathione S-transferase,GST)標籤之序列、或其組合。

較佳地，前述表現載體包含如SEQ ID NO 07、SEQ ID NO 08、或SEQ ID NO 09所示序列。

較佳地，前述原核細胞表現系統為大腸桿菌表現系統。

本發明再提供一種生產可溶性蛋白質的方法，其中前述可溶性蛋白質係為XylF、DnaK、P72、或其組合；其中前述方法包含：(1)提供一原核細胞表現系統；及(2)於前述原核細胞表現系統中表現前述表現載體之抗原基因。

較佳地，前述方法進一步包含使前述步驟(2)所得之產物通過一鎳離子親和性管柱或一麩胺基硫親和性管柱以取得前述可溶性蛋白質。

綜上所述，本發明提供一種防治豬鼻黴漿菌感染之組合物，以藉此達到避免因豬鼻黴漿菌感染所引發之病徵的目的。本發明並揭露以原核細胞表現系統生產前述組合物之活性成分所需的抗原表現載體及方法，從而降低前述組合物的生產成本。

第一圖係實驗3中以蛋白質電泳觀察本發明之重組抗原可溶性的結果。T表示全細胞裂解物(total cell lysates)；S表示全細胞裂解物中具可溶性的部分。

第二圖係實驗3中以蛋白質電泳觀察本發明之重組抗原純化的結果。

有鑒於產業中缺乏防治豬鼻黴漿菌(M.hyorhinis)感染之組合物，本發明研究證實XylF、DnaK及P72單獨或其組合可作為避免因豬鼻黴漿菌感染所引發之病徵的組合物的活性成分。本文中所述「因豬鼻黴漿菌感染所引發之病徵」係選自腹膜炎、胸膜炎、心包炎、及關節腫脹之至少一種。在一可行實施態樣中，前述「避免因豬鼻黴漿菌感染所引發之病徵」係以Magnusson等人所提出的方法(Vet.Immunol.Immunopathol.,61：83-96,1998)來進行評估。

在一個實施態樣中，本發明實驗結果顯示以XylF作為本發明組合物的活性成分對於減輕腹膜炎、胸膜炎或其組合之病徵特別有用。在另一個實施態樣中，本發明實驗結果顯示以DnaK作為本發明組合物的活性成分對於減輕腹膜炎之病徵特別有用。在又一個實施態樣中，本發明實驗結果顯示以P72作為本發明組合物的活性成分對於減輕胸膜炎之病徵特別有用。在更一個實施態樣中，本發明實驗結果顯示當欲減輕之病徵為腹膜炎、胸膜炎、心包炎、及關節腫脹時，以XylF、DnaK、及P72之組合作為活性成分將特別有用。

本發明的一個面向提供一種用於避免因豬鼻黴漿菌感染所引發之病徵的組合物。前述組合物包含一活性成份及一佐劑。前述活性成分係指一成分，其主要提供前述組合物的應用目的。前述活性成分包含XylF、DnaK、P72、或其組合，且前述XylF包含如SEQ ID NO 01所示序列，前述DnaK包含如SEQ ID NO 02所示序列，前述P72包含如SEQ ID NO 03所示序列。

在一可行實施態樣中，前述活性成分係選自XylF、DnaK、及P72所組成之群組中的一個。在一可行實施態樣中，前述活性成分係選自XylF、DnaK、及P72所組成之群組中的兩個。在一較佳實施態樣中，前述活性成分係為XylF、DnaK、及P72之組合。所屬領域具有通常知識者應可理解，在不影響前述XylF、DnaK、或P72之抗原決定部位的結構的前提下，前述活性成分可為一種重組蛋白，其同時包含前述XylF、DnaK、及P72所組成之群組中至少兩種蛋白質的胺基酸序列。在另一可行實施態樣中，前述組合物可包含一活性成分混合物，其混合前述XylF、DnaK、及P72所組成之群組中至少兩種蛋白質。

所屬領域具有通常知識者當可理解，當於一疫苗中使用兩種以上的活性成分時，其效果是不可預期的；尤其是當該兩種以上的活性成分是用於防治同一種病原的感染時，因為該兩種以上的活性成分可能會產生互相干擾的不利結果。反過來說，縱使該兩種以上的活性成分之組合並未產生互相干擾的不利結果，如果該兩種以上的活性成分之組合無法提供更佳的效果(例如，提供更好的免疫誘發效果)，則從經濟上的考量，自沒有動機混合該兩種以上的活性成分於一疫苗中。據此，於一疫苗中使用兩種以上的活性成分僅有在該兩種以上的活性成分的組合可提供更佳的效果的前提下，方有產業上之利益。而應組合哪些種類的潛在活性成分或組合後是否可產生更佳的效果皆不是在試驗之前可以預期者。

在一可行實施態樣中，前述組合物中的前述活性成分的濃度為50至300μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。在一較佳實施態樣中，前述組合物中的前述活性成分為XylF、DnaK、及P72之組合，且前述XylF、DnaK、及P72的濃度分別為100μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。惟所屬領域具有通常知識者當可理解，前述濃度可能因使用目的而改變。舉例來說，為了運送及儲存上的方便，所屬領域具有通常知識者可配製具高濃度之活性成分的前述組合物，再於實際使用之前加以稀釋。

本文中所述佐劑係為醫藥領域/疫苗領域中所習知的定義。例如，前 述佐劑是用於提升前述活性成分誘發免疫的效果及/或用於穩定前述活性成分。前述佐劑例如，但不限於：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。在一可行實施態樣中，前述佐劑為鋁膠。

本發明的另一個面向提供一種抗原表現載體。為因應大量產生重組抗原的需求，建構前述抗原表現載體之目的是為了於一原核細胞表現系統中表現本發明之組合物的前述活性成分。雖然領域中已有許多借助原核細胞表現系統表現所欲蛋白質的經驗，但因為生物領域的多變性，不同的蛋白質可能會需要不同的表現條件，而仍需要大量試驗進行抗原表現測試。據此本發明的研究成功建立一可於原核細胞表現系統中表現重組抗原的表現載體，較佳地，其係為一可於大腸桿菌表現系統中表現重組抗原的表現載體。基於本發明之可於大腸桿菌表現系統中表現重組抗原的表現載體，所屬領域具有通常知識者當可進行修飾而使本發明之表現載體於其他原核細胞表現系統中表現重組抗原。

另一方面，於原核細胞表現系統中表現前述活性成分的一個障礙是自前述原核細胞表現系統純化出表現所得的前述活性成分。於一原核細胞表現系統中表現所得的重組蛋白質通常不具可溶性，因此使得純化步驟的難度及成本增加。有鑑於此，本發明之抗原表現載體的一個特點在於可表現出具可溶性的重組抗原，從而簡化純化步驟及其成本。

本發明表現載體包含一表現元件、一核苷酸序列、及一融合夥伴序列；其中前述核苷酸序列可編碼為前述XylF、前述DnaK、前述P72、或其組合之蛋白質。於一可行實施態樣中，前述核苷酸序列包含如SEQ ID NO 04、SEQ ID NO 05、SEQ ID NO 06、或其組合所示序列。基於所選用之原核細胞表現系統的密碼子偏好，所屬領域具有通常知識者亦可改變前述核苷酸序列，只要前述核苷酸序列仍編碼為前述XylF、前述DnaK、前述P72、或其組合之蛋白質。

在一較佳實施態樣中，為了使於一原核細胞表現系統中取得之重組蛋白質具有可溶性，本發明經研究後證實大腸桿菌之DsbC、大腸桿菌之MsyB、大腸桿菌之FklB、或其組合為用於表現本發明之前述XylF、前 述DnaK、前述P72、或其組合之蛋白質的較佳融合夥伴。在一較佳實施態樣中，為有利於純化步驟的進行，前述表現載體可進一步包含一組胺酸標籤(His-tag)之序列、一麩胺基硫-S-轉移酵素標籤(GST-tag)之序列、或其組合，從而可藉由一鎳離子親和性管柱或一麩胺基硫親和性管柱純化所得之重組蛋白質。

在一可行實施態樣中，前述表現元件至少包含一啟動子及一核糖體結合部位，以供轉錄及/或轉譯之進行。在另一可行實施態樣中，為有利於基因工程上的操作，前述表現載體可進一步包含一由限制酶切位所構成之多重選殖部位、一篩選標誌、或其組合。前述篩選標誌可為一抗生素抗性基因或一營養缺陷型篩選基因。

本發明又一個面向提供一種生產可溶性蛋白質的方法，其中前述可溶性蛋白質係指前述XylF、DnaK、P72、或其組合。本發明方法包含：(1)提供一原核細胞表現系統；及(2)於前述原核細胞表現系統中表現本發明表現載體之抗原基因。本文中所述「可溶性」係指前述蛋白質傾向於溶解於水溶液中的特性。本文中所述「表現」係指在前述原核細胞表現系統中，透過任一手段誘發前述表現載體中欲表現之基因的轉錄及轉譯。前述手段例如，但不限於添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)至前述原核細胞表現系統中。

實驗1：搜尋合適作為本發明組合物之活性成分的蛋白質。

(1)豬鼻黴漿菌不活化疫苗之製備：

以領域中習知的Friis培養基培養豬鼻黴漿菌(ATIT-7)，並以中華民國發明專利第I238721號案揭露的方法製得豬鼻黴漿菌不活化疫苗。

(2)豬鼻黴漿菌抗血清之製備：

由農業科技研究院動物科技研究所二代SPF豬舍購入3頭4週齡SPF豬。將所有豬隻以相同飼養條件飼養於SPF實驗豬舍待用。將實驗豬隻飼養到32、46及60日齡時，以肌肉注射的方式注射2mL的前述豬鼻黴漿菌不活化疫苗。其後繼續將實驗豬隻飼養至74日齡時，再進行頸 靜脈採血，並將收集的血液置於室溫(約25℃)下1小時。接著，將前述血液放置於4℃中。隔日以1,107×g的條件離心30分鐘，取上清液(即，抗血清)置入乾淨的離心管中，並保存於-20℃待用。

(3)萃取豬鼻黴漿菌全蛋白質：

利用蛋白質萃取套組(ReadyPrep^TM protein extraction kit；Bio-Rad,USA)進行豬鼻黴漿菌全蛋白質之萃取。首先，將培養於Friis培養基之豬鼻黴漿菌以離心的方式(10,000×g,20分鐘)收集菌體部分。接著以低鹽緩衝液(100mM Tris-base,250mM蔗糖，pH 8.0)清洗菌體三次後，將菌體懸浮於1mL的樣品緩衝液(complete 2-D rehydration/sample buffer 1)中，並加入10μL的TBP還原試劑(ReadyPrep^TM TBP reducing agent)、適量之Bio-Lyte 3/10兩性電解質(ampholyte；最終濃度為0.2%)及適量的蛋白酶抑制劑。然後以超音波破碎儀進行菌體之破碎後，以離心方式去除細胞破碎物並保留上清液，其中即含有豬鼻黴漿菌的全蛋白質。

接著，利用蛋白質分析套組(RC DC ^TM Protein Assay Kit；Bio-Rad,USA)進行菌體全蛋白質濃度之測定。將100μL的前述含有全蛋白質的上清夜與500μL的RC試劑I(RC reagent I)混合均勻後，放置於室溫(約25℃)下反應1分鐘。接著加入500μL的RC試劑II(RC reagent II)混合均勻後，離心(15,000×g,5分鐘)收集沉澱物部分。然後將沉澱物與510μL的試劑A’混合均勻後，放置於室溫(約25℃)下反應5分鐘或直至沉澱物完全溶解。之後，加入4mL的試劑B，再放置於室溫(約25℃)下反應15分鐘。然後利用分光光度計測定溶液於波長750nm下的吸光值。以小牛血清蛋白質(bovine serum albumin,BSA)作為標準品製作蛋白質濃度標準曲線。將樣品之吸光值對照標準曲線，即可換算得到前述中上清液中全蛋白質的濃度，以供後續蛋白質電泳所需。

(4)蛋白質二維電泳：

蛋白質二維電泳分為兩個操作步驟，分別為等電點焦集電泳(isoelectric focusing,IEF)與硫酸十二酯鈉聚丙醯烯胺膠體電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。操作步驟如後述段落中所述。

等電點焦集電泳

等電點焦集電泳是利用蛋白質等電點不同的特性將蛋白質進行分離之技術。首先取1mg之含有豬鼻黴漿菌全蛋白質的上清液與適量之水合緩衝液(rehydration buffer)混合為總體積為400μL的混合物。接著將該混合物置入聚焦盤(focusing tray)(Bio-Rad,USA)的樣品槽中。取兩片經二次水潤濕的濾紙置於正負電極上方。該濾紙可吸附樣品中之雜質與鹽類，避免雜質與鹽類影響後續實驗與損壞電極。然後將ReadyStrip^TM IPG strip膠條(pH 5-8/17cm)緩慢放入聚焦盤中。取2.5mL礦物油均勻地加在IPG膠條上，以避免樣品蒸發而影響後續實驗。將聚焦盤的上蓋蓋好並置於PROTEAN IEF cell等電聚焦電泳儀(Bio-Rad,USA)上。待PROTEAN IEF cell內的程式設定完畢後，以五個階段的方式進行一維電泳。第一階段為水合反應(rehydration)，其目的在於使樣品被吸入IPG strip膠條中，設定條件為50V下進行12小時。第二階段之目的在於移去鹽類離子與雜質，設定條件為250V下進行15分鐘。第三階段為電壓上升之階段，設定條件為4小時，使用線性模式將電壓提升至焦集電壓10,000V。第四階段為等電點焦集之步驟，設定條件為50,000V*hr。第五階段為電壓維持之階段，設定條件為500V，以避免過度反應。一維電泳結束後，將IPG膠條保存於-80℃中備用或經平衡處理(equilibration)後即可進行SDS-PAGE。

硫酸十二酯鈉聚丙醯烯胺膠體電泳

硫酸十二酯鈉聚丙醯烯胺膠體電泳(SDS-PAGE)是利用蛋白質分子量不同之特性，將蛋白質進行分離之技術。首先將IPG膠條以去離子水沖洗後，用濾紙將背膠面的礦物油與水吸除，然後將IPG膠條放置於拋棄式水合盤中。接著加入6mL的平衡緩衝液I(6M尿素，2% SDS,0.375M Tris,20%甘油，130mM DTT,pH 8.8)，於室溫下搖晃20分鐘。之後，取出IPG膠條，用濾紙將背膠面的平衡緩衝液I吸除，再將IPG strip膠條放置於拋棄式水合盤中。然後加入6mL的平衡緩衝液II (6M尿素，2% SDS,0.375M Tris,20%甘油，135mM碘乙醯胺，pH 8.8)，於室溫下搖晃20分鐘。完成上述IPG膠條的平衡處理後，即可進行SDS-PAGE。

首先，先配製12.5%的分離膠體(separation gel)。再將IPG膠條放置於分離膠體上緣，並加入適量已熔解的瓊脂醣(ReadyPrep^TM Overlay Agarose,Bio-Rad,USA)。為方便判定蛋白質的分子量，將滴有蛋白質分子量標準品之濾紙放置於IPG膠條旁。待瓊脂醣凝固後，即可將膠條與帶有蛋白質分子量標準品之濾紙固定於分離膠體上方。然後，將電泳膠片放入電泳槽設備(Bio-Rad,USA)中，並倒入電泳緩衝液(25mM Tris,192mM甘胺酸，0.1% SDS,pH 8.3)。在26mA電流下進行電泳15小時，以分離不同分子量之蛋白質。

(5)西方墨點法：

將蛋白質電泳後的前述膠片浸泡於轉印緩衝液[25mM Tris base,192mM glycine,10%(v/v)methanol,pH 8.3]中。剪取適當大小的PVDF膜，並將其浸潤於甲醇中數秒，然後用去離子水沖洗一遍，再浸泡於轉印緩衝液中。待前述膠體與前述PVDF膜於轉印緩衝液中浸泡15分鐘後，依序將濾紙、膠片、PVDF膜、濾紙放入濕式轉漬器中，於1,300mA電流下進行轉印1小時30分鐘。

待轉印完成後，於室溫下將前述PVDF膜浸泡於遮蔽緩衝液[blocking buffer；20mM Tris-base,150mM NaCl,5%(w/v)skim milk,pH7.4]中1個小時。然後加入適量之前述實驗中所製得的豬鼻黴漿菌抗血清(1,000倍稀釋)，於室溫下震盪1小時。之後，將遮蔽緩衝液倒除，以適量TBST緩衝液[20mM Tris-base,150mM NaCl,0.05%(v/v)Tween-20,pH7.4]洗滌前述PVDF膜三次(5分鐘/次)後，加入含有結合鹼性磷酸酶之山羊抗豬抗體[alkaline phosphatase-conjugated goat anti-pig IgG(H+L),(2,000倍稀釋)]之遮蔽緩衝液。避光震盪一小時後，再以TBST緩衝液洗滌前述PVDF膜三次，即可加入NBT/BCIP溶 液(Thermo Fisher Scientific,USA)進行呈色反應。

(6)蛋白質身份鑑定：

前述西方墨漬法的呈色反應的結果中有呈色的點(共有17個呈色點，圖未示)，即為豬鼻黴漿菌中與前述豬鼻黴漿菌抗血清有反應的蛋白質。比較前述呈色反應結果與經蛋白質電泳的前述膠片上的相對位置，以微量吸管將該相對位置上的膠片裁取下來進行質譜分析。然後再將所得之胺基酸序列於蛋白質序列資料庫進行搜尋比對以鑑定蛋白質之身分。將前述17個呈色點所代表的蛋白質的胺基酸序列於蛋白質序列資料庫進行比對之後，確認出其中3個蛋白質分別為XylF、DnaK及P72，其分別具有SEQ ID NO 01、SEQ ID NO 02、及SEQ ID NO 03所示序列。本發明係以這3個蛋白質進行後續研究。

實驗2：建構本發明之表現載體。

(1)定點突變與選殖：

依據美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的資料，前述XylF、DnaK及P72的基因序列中分別帶有4、1、及8個TGA密碼子。TGA密碼子在大腸桿菌表現系統中被視為停止碼(stop codon)。為避免無法利用大腸桿菌表現系統生產全長蛋白質，進一步利用聚合酶連鎖反應將抗原基因序列中之TGA突變為TGG。

豬鼻黴漿菌基因體之抽取

利用DNA純化套組(Tissue & Cell Genomic DNA Purification kit；GMbiolab,Taiwan)進行豬鼻黴漿菌基因體之抽取。首先取4.5mL之培養菌液至離心管中，經離心(5,870×g，5分鐘)後，倒除上清液，收集菌體部分。接著加入20μL的蛋白酶K(proteinase K；10mg/mL)及200μL的萃取試劑，於56℃下作用3小時。之後，加入200 μL的結合試劑(binding solution)並於70℃下作用10分鐘。反應結束後，加入200μL的無水酒精至微量離心管中並均勻混合，吸取所有溶液(包括沉澱物)至離心分離小管(spin column)，並將離心分離小管放置於收集小管(collection tube)中。經離心2分鐘(17,970×g)後，倒除流出液，再加入300μL的結合試劑至離心分離小管。經離心2分鐘(17,970×g)後，倒除流出液。之後，再加入700μL的清洗試劑(wash solution)至離心分離小管，經離心2分鐘(17,970×g)後，倒除流出液，並重複上述步驟一次。最後以17,970×g之條件離心5分鐘，去除殘留酒精。將離心分離小管放入一滅菌之微量離心管中，加入適量無菌去離子水引流基因體DNA。

XylF抗原基因之定點突變

首先針對XylF抗原基因設計增幅引子XylF/XylR與突變引子XylM1~XylM8，引子序列如下表一所示。

以豬鼻黴漿菌基因體作為模版，利用XylF/XylM2、XylM1/XylM4、XylM3/XylM6、XylM5/XylM8、XylM7/XylR等引子組分別進行DNA片段增幅。50μL的PCR反應混合物中含有：1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP與 dCTP)，1μM擴增引子，200ng豬鼻黴漿菌基因體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為：96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。

PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。以膠體萃取套組(Gel-M^TM gel extraction system kit)回收PCR產物。再以回收的五個PCR產物作為模版，利用XylF/XylR引子組合進行基因增幅。PCR反應條件為：96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應45秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。此PCR反應即可獲得定點突變的XylF基因。最後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。根據定序結果，本發明之XylF基因具有SEQ ID NO 04所示序列。

DnaK抗原基因之定點突變

首先針對DnaK抗原基因設計增幅引子DnaKF/DnaKR與突變引子DnaKM1~DnaKM2，引子序列如下表二所示。

以豬鼻黴漿菌基因體作為模版，利用DnaKF/DnaKM2與DnaKM1/DnaKR等引子組分別進行DNA片段增幅。50μL的PCR反應 混合物中含有：1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP與dCTP)，1μM擴增引子，200ng豬鼻黴漿菌基因體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為：96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。

PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。以Gel-M^TM gel extraction system kit回收PCR產物。之後，以回收的兩個PCR產物作為模版，利用DnaKF/DnaKR引子組合進行基因增幅。PCR反應條件為：96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應45秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。此PCR反應即可獲得定點突變之DnaK基因。最後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。根據定序結果，本發明之DnaK基因具有SEQ ID NO 05所示序列。

P72抗原基因之定點突變

首先針對P72抗原基因設計增幅引子P72F/P72R與突變引子P72M1~P72M16，引子序列如下表三所示。

以豬鼻黴漿菌基因體作為模版，利用P72F/P72M2、P72M1/P72M4、P72M3/P72M6、P72M5/P72M8、P72M7/P72M10、P72M9/P72M12、P72M11/P72M14、P72M13/P72M16、P72M15/P72R等引子組分別進行DNA片段增幅。50μL的PCR反應混合物中含有：1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP與dCTP)，1μM擴增引子，200ng豬鼻黴漿菌基因體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為：96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反 應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。

PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。以Gel-M^TM gel extraction system kit回收PCR產物。之後，以回收的九個PCR產物作為模版，利用P72F/P72R引子組合進行基因增幅。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。此PCR反應即可獲得定點突變之P72基因。最後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。根據定序結果，本發明之P72基因具有SEQ ID NO 06所示序列。

(2)本發明之豬鼻黴漿菌抗原表現質體的建構：

以含有不同融合夥伴(fusion partner)基因之質體為骨架進行豬鼻黴漿菌抗原表現質體之建構。融合夥伴基因分別為大腸桿菌之dsbC、msyB及fklB之DNA序列。表現質體之建構流程如下所述。

以BamHI及SalI分別剪切前述實驗中所製得的本發明的XylF基因、DanK基因、及P72基因，再分別利用T4 DNA ligase將DNA片段接入以相同限制酶剪切之DsbC融合表現質體、MsyB融合表現質體、及FklB融合表現質體中。然後，將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體分別命名為pET-DsbC-XylF(SEQ ID NO 07)、pET-MysB-DnaK(SEQ ID NO 08)、及pET-FklB-P72(SEQ ID NO 09)。

實驗3：本發明之次單位疫苗的製備與應用。

(1)以本發明之表現載體表現重組抗原：

將豬鼻黴漿菌抗原表現質體轉形至E.coli BL21(DE3)中。挑選表現菌株之單一菌落，並將其接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之12mL的LB培養基中，並於37℃與180rpm之條件下培養隔夜。然後，取10mL的該培養菌液加入含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)之1L的LB培養基中，振盪培養(37℃,180rpm)至OD₆₀₀約為0.4~0.6左右。接著於28℃下加入0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表現。誘導4小時後，離心(10,000×g，10分鐘，4℃)收集菌體部份。再將菌體懸浮於10mL的磷酸緩衝溶液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl，pH 7.4)中，並利用超音波破碎儀將菌體破碎後，進行離心(30,966×g，30分鐘)以收集上清液部分。最後再以0.22μm過濾膜過濾所收集到的上清液。以蛋白質電泳觀察重組抗原的表現情形及可溶性。實驗結果如第一圖中所示。由第一圖的結果可觀察到本發明之重組抗原於大腸桿菌表現系統下的表現情形良好。此外，本發明之重組抗原皆具有優異的可溶性，顯示本發明選擇了恰當的融合夥伴。

然後，利用重組抗原帶有His tag能與鎳或鈷離子形成配位共價鍵之特性，採用固定化金屬離子親和性層析法(immobilized-metal ion affinity chromatography)進行蛋白質純化。重組抗原之純化之方式係利用蛋白質液相層析系統ÄKTA prime plus(GE Healthcare,Sweden)搭配5mL HiTrap^TM Ni excel管柱(GE Healthcare,Sweden)進行。首先，以25mL磷酸緩衝溶液平衡管柱後，將前述上清液注入HiTrap^TM Ni excel管柱。待樣品注入完成後，以100mL含30mM咪唑(imidazole)之清洗緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl，30mM咪唑，pH 7.4)洗除非特異性結合之蛋白質。最後以150mL含250mM咪唑之溶離緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.4)沖提樹脂上的重組抗原，其原理係藉助高濃度的咪唑與重組抗原競爭樹脂結合部位，致使重組抗原自樹脂上被沖提下來。將純化之抗原溶液放入Amicon^TM ultra-15 ultracel-30K離心管(Merck Millipore,USA)中，於4℃下以2,600×g離心至適當體積後，貯存於4℃中備用。純化結果如第二圖中所示。從圖中可見本實驗取得純度優異之本發明的重組抗原。

(2)製備本發明之次單位疫苗並測試其免疫保護效果：

依據後續段落中所示表格中的調劑條件，將前述實驗中所製得之本發明的重組抗原與佐劑(鋁膠)均勻混合，以分別製備多種含有單獨抗原的次單位疫苗及含有多種抗原的雞尾酒疫苗。疫苗每劑之劑量為2mL，其中所含每一種重組抗原的含量為200μg。

試驗一：測試單獨抗原之免疫保護效果

本實驗於家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所基因改造產品(genetically modified organisms,GMOs)動物舍中進行。選擇豬鼻黴漿菌抗體檢測為陰性之3週齡豬隻12頭，以隨機方式進行分組，共分為A~D組。每組豬隻數目為3頭；其中A~C組為實驗組，D組為對照組。A~C組豬隻於3與5週齡各透過肌肉注射1次本實驗之疫苗(劑量為2mL)。D組則不進行注射。有關疫苗成分如下表四。

接著，於7週齡(意即免疫後兩週)時，利用豬鼻黴漿菌野外分離株ATIT-2之培養液進行腹腔攻毒試驗。豬隻於10週齡(意即攻毒後3週)時，進行解剖病理學檢查。計算豬隻產生腹膜炎、胸膜炎、心包炎及關節腫脹等病變之百分比。肉眼病變評分依照Magnusson等人所述之方法進行(Vet.Immunol.Immunopathol.,61：83-96,1998)。

實驗結果如下表五中所示。以XylF所製成之次單位疫苗可降低豬隻 腹膜炎與胸膜炎之發生，且免疫豬隻之平均病變分數較未免疫之對照組為低，代表XylF可誘發明顯之免疫保護反應；以DnaK與P72所製成之次單位疫苗則可分別降低腹膜炎與胸膜炎之發生。

值得注意的是，表五中的數據並不能解釋為以XylF所製成之次單位疫苗僅對降低腹膜炎及胸膜炎有利，僅能代表以XylF所製成之次單位疫苗在實驗進行期間中對其他病徵的效果較不顯著。同理，表五中的數據並不能解釋為以DnaK或P72所製成之次單位疫苗僅分別對降低腹膜炎或胸膜炎有利，僅能代表以DnaK或P72所製成之次單位疫苗在實驗進行期間中對其他病徵的效果較不顯著。

試驗二：測試雞尾酒疫苗之免疫保護效果

本實驗於家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所基因改造產品動物舍中進行。選擇豬鼻黴漿菌抗體檢測為陰性之4週齡豬隻24頭，以隨機方式進行分組，共分為免疫組(E組)及對照組(F組)二組。每組豬隻數目為12頭。免疫組豬隻於4與6週齡各透過肌肉注射1次本實驗之疫苗(劑量為2mL)。對照組則不進行免疫處理。有關疫苗成分如下表六。

實驗結果如下表七中所示。本發明之雞尾酒疫苗(於此實驗中混合3種本發明的重組抗原)可顯著降低腹膜炎、胸膜炎、心包炎及關節腫脹等豬鼻黴漿菌感染的臨床症狀，效果較單一抗原次單位疫苗(如前述表五)之效果為佳。

<110> 財團法人農業科技研究院

<120> 防治豬鼻黴漿菌感染之組合物及生產該組合物的方法

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<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> Mycoplasma hyorhinis

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<213> Mycoplasma hyorhinis

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<212> PRT

<213> Mycoplasma hyorhinis

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<212> DNA

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Claims (16)

1. 一種組合物，其包含：一活性成分，其包含XylF；及一佐劑；其中前述XylF包含如SEQ ID NO 01所示序列。
2. 如請求項1所示組合物，其中前述活性成分更包含DnaK及P72中至少一個；其中，前述DnaK包含如SEQ ID NO 02所示序列，前述P72包含如SEQ ID NO 03所示序列。
3. 如請求項2所示組合物，其中前述活性成分為XylF、DnaK、及P72之組合。
4. 如請求項1-3中任一項所示組合物，其中前述活性成分的濃度為50至300μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。
5. 如請求項1-3中任一項所示組合物，其中前述佐劑包含：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
6. 一種表現載體，其用於一原核細胞表現系統中生產如請求項1-5任一項所述之組合物中的前述活性成分，其中前述表現載體包含：一表現元件，其包含一啟動子及一核糖體結合部位；一核苷酸序列，其編碼為前述XylF、前述DnaK、前述P72、或其組合；及一融合夥伴序列；其中前述核苷酸序列包含如SEQ ID NO 04、SEQ ID NO 05、SEQ ID NO 06、或其組合所示序列。
7. 如請求項6所示表現載體，其中前述融合夥伴係大腸桿菌之DsbC、大腸桿菌之MsyB、大腸桿菌之FklB、或其組合。
8. 如請求項7所示表現載體，其限制條件是：當前述核苷酸序列編碼為XylF時，前述融合夥伴是大腸桿菌之DsbC；當前述核苷酸序列編碼為DnaK時，前述融合夥伴是大腸桿菌之MsyB：或當前述核苷酸序列編碼為P72時，前述融合夥伴是大腸桿菌之FklB。
9. 如請求項6所示表現載體，其進一步包含一組胺酸標籤之序列、一麩胺基硫-S-轉移酵素標籤之序列、或其組合。
10. 如請求項6所示表現載體，其包含如SEQ ID NO 07、SEQ ID NO 08、或SEQ ID NO 09所示序列。
11. 如請求項6所示表現載體，其中前述原核細胞表現系統為大腸桿菌表現系統。
12. 一種生產可溶性蛋白質的方法，其中前述可溶性蛋白質係為XylF、DnaK、P72、或其組合；其中前述方法包含：(1)提供一原核細胞表現系統；及(2)於前述原核細胞表現系統中表現如請求項6-11中任一項所述之表現載體中的抗原基因。
13. 如請求項12所述方法，其進一步包含使前述步驟(2)所得之產物通過一鎳離子親和性管柱或一麩胺基硫親和性管柱以取得前述可溶性蛋白質。
14. 一種如請求項1-5中任一項所述之組合物的用途，係用於製備避免因豬鼻黴漿菌感染所引發之病徵的醫藥組合物；其中該病徵係選自腹膜炎、胸膜炎、心包炎、及關節腫脹之至少一種。
15. 如請求項14所述之用途，其中當前述活性成分為XylF，前述病徵為腹膜炎、胸膜炎、或其組合。
16. 如請求項14所述之用途，其中當前述活性成分為XylF、DnaK、及P72之組合，前述病徵為腹膜炎、胸膜炎、心包炎、及關節腫脹。