JP7230130B2 - マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物及びその活性成分を生産するための発現ベクター及び方法 - Google Patents
マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物及びその活性成分を生産するための発現ベクター及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7230130B2 JP7230130B2 JP2021129522A JP2021129522A JP7230130B2 JP 7230130 B2 JP7230130 B2 JP 7230130B2 JP 2021129522 A JP2021129522 A JP 2021129522A JP 2021129522 A JP2021129522 A JP 2021129522A JP 7230130 B2 JP7230130 B2 JP 7230130B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- expression vector
- dnak
- combination
- xylf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明のもう1つの目的は、サブユニットワクチンを生産するコストを低下させるために、抗原発現ベクター、及び原核細胞発現系で上記発現ベクター中の抗原遺伝子を発現させることによりサブユニットワクチンを生産する方法を提供することである。
好ましくは、上記アジュバントが、フロイント完全又は不完全アジュバント、アルミゲル、界面活性剤、アニオン性ポリマー、ペプチド、油エマルジョン又はそれらの組み合わせを含む。
好ましくは、上記活性成分がDnaKである場合、上記病徴は腹膜炎である。
好ましくは、上記組成物の制限条件として、上記病徴が腹膜炎、胸膜炎、心膜炎、及び関節腫脹である場合、上記活性成分はXylF、DnaK、及びP72の組み合わせである。
好ましくは、上記原核細胞発現系が大腸菌発現系である。
(1)マイコプラズマ・ヒオリニス不活化ワクチンの調製:
この分野で熟知されているFriis培地でマイコプラズマ・ヒオリニス(ATIT-7)を培養し、中国台湾発明専利第I238721号に開示された方法でマイコプラズマ・ヒオリニス不活化ワクチンを調製した。
農業科学技術研究所の動物科学技術研究所の第2世代SPF豚舎から4週齢のSPF豚を3匹購入した。全ての豚を同じ飼育条件でSPF実験豚舎に飼育して使用に備える。実験豚を32、46及び60日齢飼育した時に、上記マイコプラズマ・ヒオリニス不活化ワクチン2mLを筋肉注射により注射した。その後、実験豚を74日齢まで飼育し続け、更に頚静脈から採血し、採取した血液を室温(約25℃)で1時間置く。次に、上記血液を4℃で置く。翌日に1,107×gの条件で30分間遠心分離し、上澄液(即ち、抗血清)を清潔な遠心管に入れ、-20℃で保存して使用に備える。
タンパク質抽出キット(ReadyPrep(商標)protein extraction kit;Bio-Rad、米国)でマイコプラズマ・ヒオリニスの全タンパク質の抽出を行う。まず、Friis培地で培養したマイコプラズマ・ヒオリニスを遠心分離(10,000×g、20分)することにより菌体部分を収集した。次に、低塩緩衝液(100mM Trisベース、250mMショ糖、pH8.0)で菌体を三回洗浄した後、菌体を1mLのサンプル緩衝液(complete 2-D rehydration/sample buffer 1)に懸濁し、10μLのTBP還元試薬(ReadyPrep(商標)TBP reducing agent)、適量のBio-Lyte 3/10両性電解質(ampholyte;最終濃度0.2%)及び適量のプロテアーゼ阻害剤を加えた。そして、超音波破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離により細胞破砕物を除去し、マイコプラズマ・ヒオリニスの全タンパク質を含有する上澄液を保留する。
タンパク質二次元電気泳動は、等電点電気泳動(isoelectric focusing、IEF)とドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis、SDS-PAGE)の2つの操作工程に分かれる。操作工程は、後述する段落で説明する。
等電点電気泳動は、タンパク質の等電点が異なる特性を利用してタンパク質を分離する技術である。まず、マイコプラズマ・ヒオリニスの全タンパク質を含有する上澄液1mgと適量の水和緩衝液(hydration buffer)とを混合して総体積が400μL混合物となる。次に、この混合物をフォーカシングトレイ(focusing tray)(Bio-Rad、米国)のサンプルセルに入れた。再蒸留水で湿潤された濾紙2枚を正及び負の電極の上方に置いた。上記濾紙は、サンプル中の不純物及び塩類を吸着することができ、これにより不純物及び塩類が後続の実験に影響を及ぼすこと、及び電極を損壊することを回避する。そして、ReadyStrip(商標)IPG stripストリップ(pH5-8/17cm)を緩やかにフォーカシングトレイに入れた。サンプルが蒸発して後続の実験に影響を与えることを回避するように、2.5mLの鉱油を均一にIPGストリップに加えた。フォーカシングトレイの上カバーを覆い、PROTEAN IEF cellなどの電気フォーカシング電気泳動装置(Bio-Rad、米国)に置いた。PROTEAN IEF cell内のプログラムの設定が完了した後、5段階で一次元電気泳動を行った。第1段階は、水和反応(hydration)であり、その目的はサンプルをIPG stripストリップに吸入させることであり、その設定条件は50Vで12時間行うことである。第2段階の目的は塩類イオン及び不純物を除去することであり、その設定条件は250Vで15分間行うことである。第3段階は、電圧上昇の段階であり、その設定条件は4時間であり、リニアモードによって電圧をフォーカシング電圧10,000Vまで上昇させる。第4段階は、等電点フォーカシングの工程であり、その設定条件は50,000V*hrである。第5段階は、電圧維持の段階であり、その設定条件は500Vであり、これにより過剰な反応を回避する。一次元電気泳動が終了した後、IPGストリップを-80℃で保存して使用に備えるか又は平衡処理(equilibration)した後にSDS-PAGEを行うことができる。
ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)は、タンパク質の分子量が異なる特性を利用してタンパク質を分離する技術である。まず、IPGストリップを脱イオン水で洗い流した後、濾紙で接着面の鉱油及び水を吸引除去し、そしてIPGストリップを使い捨て式水和トレイに置いた。次に、6mLの平衡緩衝液I(6M尿素、2% SDS、0.375M Tris、20%グリセロール、130mM DTT、pH8.8)を加え、室温で20分間振とうした。その後、IPGストリップを取り出し、濾紙で接着面の平衡緩衝液Iを吸引除去し、更にIPG stripストリップを使い捨て式水和トレイに置いた。そして、6mLの平衡緩衝液II(6M尿素、2% SDS、0.375M Tris、20%グリセロール、135mMヨードアセトアミド、pH8.8)を加え、室温で20分間振とうした。上記のIPGストリップの平衡処理を完成した後、SDS-PAGEを行うことができる。
タンパク質の電気泳動後の上記フィルムを転写緩衝液[25mM Trisベース、192mM glycine、10%(v/v)methanol、pH8.3]に浸漬した。適切なサイズのPVDF膜を切り出し、メタノールに数秒間浸漬した後、脱イオン水で1回洗い流し、更に転写緩衝液に浸漬した。上記ゲルと上記PVDF膜を転写緩衝液に15分間浸漬した後、濾紙、フィルム、PVDF膜、濾紙をこの順にトランスブロットセルに入れ、1,300mAの電流で1.5時間転写した。
上記ウェスタンブロット法の呈色反応の結果に呈色した点(合計17個の呈色点、図示せず)があり、これらの点は、マイコプラズマ・ヒオリニスにおける上記マイコプラズマ・ヒオリニス抗血清と反応したタンパク質である。上記呈色反応結果とタンパク質電気泳動が行われた上記フィルムの相対位置とを比較すると、マイクロピペットで当該相対位置でのフィルムを切り出して質量分析を行った。そして、得られたアミノ酸配列をタンパク質配列ライブラリーで検索して比較することにより、タンパク質のアイデンティティを同定した。上記17個の呈色点で表されるタンパク質のアミノ酸配列をタンパク質配列ライブラリーで比較した後、そのうちの3つのタンパク質はそれぞれXylF、DnaK及びP72であり、それぞれ配列番号1、配列番号2、及び配列番号3で示される配列を有することが確認された。本発明は、この3つのタンパク質を使用して後続の研究を行う。
(1)部位特異的突然変異及びクローニング:
米・国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information、NCBI)の資料によると、上記XylF、DnaK及びP72の遺伝子配列は、それぞれ4個、1個、及び8個のTGAコドンを有する。TGAコドンは、大腸菌発現系で終止コドン(stop codon)と見なされる。大腸菌発現系で全長タンパク質を生産することができないことを回避するために、更にポリメラーゼ連鎖反応で抗原遺伝子配列中のTGAをTGGに突然変異させる。
DNA精製キット(Tissue&Cell Genomic DNA Purification kit;GMbiolab、台湾)でマイコプラズマ・ヒオリニスゲノムを抽出した。まず、4.5mLの培養菌液を遠心管に取り、遠心分離(5,870×g、5分間)した後、上澄液を除去し、菌体部分を収集した。次に、20μLのプロテイナーゼK(proteinase K;10mg/mL)及び200μLの抽出試薬を加え、56℃で3時間作用させた。その後、200μLの結合試薬(binding solution)を加え、70℃で10分間作用させた。反応終了後、200μLの無水アルコールをマイクロ遠心管に加えて均一に混合し、全ての溶液(沈殿物を含む)をスピンカラム(spin column)に吸い込み、スピンカラムを収集チューブ(collection tube)の中に置いた。2分間遠心分離(17,970×g)した後、流出液を除去し、更に300μLの結合試薬をスピンカラムに加えた。2分間遠心分離(17,970×g)した後、流出液を除去した。その後、700μLの洗浄試薬(wash solution)をスピンカラムに加え、2分間遠心分離(17,970×g)した後、流出液を除去し、上記の工程を1回繰り返した。最後に17,970×gの条件で5分間遠心分離し、残留アルコールを除去した。スピンカラムを滅菌されたマイクロ遠心管に入れ、適量の無菌脱イオン水を加えてゲノムDNAを排出させた。
まず、XylF抗原遺伝子に対して増幅プライマーXylF/XylR及び変異プライマーXylM1~XylM8を設計し、プライマー配列は、以下の表1で示される。
まず、DnaK抗原遺伝子に対して増幅プライマーDnaKF/DnaKR及び変異プライマーDnaKM1~DnaKM2を設計し、プライマー配列は、以下の表2で示される。
まず、P72抗原遺伝子に対して増幅プライマーP72F/P72R及び変異プライマーP72M1~P72M16を設計し、プライマー配列は、以下の表3で示される。
異なる融合パートナー(fusion partner)遺伝子を含有するプラスミドを骨格としてマイコプラズマ・ヒオリニス抗原発現プラスミドの構築を行った。融合パートナー遺伝子は、それぞれ大腸菌DsbC、MsyB及びFklBのDNA配列である。発現プラスミドの構築の流れは、以下のとおりである。
(1)本発明の発現ベクターで組換え抗原を発現させる:
マイコプラズマ・ヒオリニス抗原発現プラスミドをE.coli BL21(DE3)に形質転換した。菌株を発現させる単一のコロニーを選択し、カナマイシン(kanamycin)(最終濃度30μg/mL)を含有するLB培地12mLに接種し、37℃及び180rpmの条件で一晩培養した。そして、この培養菌液10mLを取り出してカナマイシン(最終濃度30μg/mL)を含有するLB培地1Lに加え、OD600が約0.4~0.6程度になるまで振とう培養(37℃、180rpm)した。次に、28℃下で0.1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトシドを加えて発現を誘導した。4時間誘導した後、遠心分離(10,000×g、10分間、4℃)して菌体部分を収集した。更に、菌体を10mLのリン酸緩衝溶液(20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH7.4)に懸濁し、超音波破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離(30,966×g、30分間)して上澄液部分を収集した。最後に、0.22μmの濾過膜で収集した上澄液を濾過した。タンパク質電気泳動によって組換え抗原の発現状況及び可溶性を観察した。実験結果を図1に示す。図1の結果から、本発明の組換え抗原の大腸菌発現系での発現状況が良好であることが観察された。また、本発明の組換え抗原は、いずれも優れた可溶性を有し、本発明が適切な融合パートナーを選択したことを示している。
後続の段落で示される表の調製条件に従って、上記実験で調製された本発明の組換え抗原とアジュバント(アルミゲル)とを均一に混合することで、それぞれ単一抗原を含有する複数種のサブユニットワクチン及び複数種の抗原を含有するカクテルワクチンを調製した。ワクチン1回分の投与量は2mLであり、その含まれる各組換え抗原の含有量は200μgである。
本実験は、家畜衛生試験所動物用薬品検定分所遺伝子改造製品(genetically modified organisms、GMOs)動物舍で行った。マイコプラズマ・ヒオリニス抗体検出結果が陰性である3週齢の豚を12匹選択し、ランダムに群分けし、合計でA~D群に分ける。各群の豚の数は3匹であり、そのうち、A~C群は実験群であり、D群は対照群である。A~C群の豚は、3及び5週齢にそれぞれ筋肉注射によって本実験のワクチン(投与量2mL)を1回注射した。D群には、注射を行っていない。ワクチン成分を以下の表4に示す。
本実験は、家畜衛生試験所動物用薬品検定分所遺伝子改造製品動物舍で行った。マイコプラズマ・ヒオリニス抗体検出結果が陰性である4週齢の豚を24匹選択し、ランダムに群分けし、合計で免疫群(E群)及び対照群(F群)2つの群に分ける。各群の豚の数は12匹である。免疫群の豚は、4及び6週齢にそれぞれ筋肉注射によって本実験のワクチン(投与量2mL)を1回注射した。対照群には、免疫処理が行われていない。ワクチン成分を以下の表6に示す。
Claims (11)
- 原核細胞発現系で、マイコプラズマ・ヒオリニス(Mycoplasma hyorhinis)感染により引き起こされる病徴を回避するための組成物中の活性成分を生産するための発現ベクターであって、前記発現ベクターは、
プロモーター及びリボソーム結合部位を含む発現エレメントと、
P72、XylF、DnaK、又はそれらの組み合わせをコードするヌクレオチド配列と、
融合パートナーをコードする配列とを含み、
前記ヌクレオチド配列は、配列番号6、配列番号4、配列番号5、又はそれらの組み合わせで示される配列を含み、
前記融合パートナーが、大腸菌DsbC、大腸菌MsyB、大腸菌FklB、又はそれらの組み合わせであり、
前記ヌクレオチド配列がXylFをコードする場合、前記融合パートナーは大腸菌DsbCであり、
前記ヌクレオチド配列がDnaKをコードする場合、前記融合パートナーは大腸菌MsyBであり、又は
前記ヌクレオチド配列がP72をコードする場合、前記融合パートナーは大腸菌FklBである、発現ベクター。 - ヒスチジンタグの配列、グルタチオンS-トランスフェラーゼタグの配列、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項1に記載の発現ベクター。
- 原核細胞発現系で、マイコプラズマ・ヒオリニス(Mycoplasma hyorhinis)感染により引き起こされる病徴を回避するための組成物中の活性成分を生産するための発現ベクターであって、前記発現ベクターは、
プロモーター及びリボソーム結合部位を含む発現エレメントと、
P72、XylF、DnaK、又はそれらの組み合わせをコードするヌクレオチド配列と、
融合パートナーをコードする配列とを含み、
前記ヌクレオチド配列は、配列番号6、配列番号4、配列番号5、又はそれらの組み合わせで示される配列を含み、
前記ヌクレオチド配列はさらに、配列番号7、配列番号8、又は配列番号9で示される配列を含む、発現ベクター。 - 前記原核細胞発現系が、大腸菌発現系である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 可溶性タンパク質を生産する方法であって、
前記可溶性タンパク質は、P72、XylF、DnaK、又はそれらの組み合わせであり、
前記方法は、
(1)原核細胞発現系を提供する工程と、
(2)前記原核細胞発現系で請求項1~4のいずれか一項に記載の発現ベクター中の前記ヌクレオチド配列を発現させる工程とを含む、方法。 - 前記工程(2)で得られた生成物をニッケルイオンアフィニティーカラム又はグルタチオンSアフィニティーカラムに通して前記可溶性タンパク質を取得する工程を更に含む、請求項5に記載の方法。
- マイコプラズマ・ヒオリニス(Mycoplasma hyorhinis)感染により引き起こされる病徴を回避するための組成物であって、
P72を含む活性成分と、
アジュバントとを含み、
前記P72が、配列番号3で示される配列を含み、
前記病徴が胸膜炎を含む、組成物。 - 前記活性成分が、DnaKをさらに含み、前記DnaKが、配列番号2で示される配列を含む、請求項7に記載の組成物。
- 前記活性成分の濃度が、前記組成物の総体積を基に、50~300μg/mLである、請求項7又は8に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、フロイント完全又は不完全アジュバント、アルミゲル、界面活性剤、アニオン性ポリマー、ペプチド、油エマルジョン又はそれらの組み合わせを含む、請求項7~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記病徴は腹膜炎をさらに含む、請求項8に記載の組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021129522A JP7230130B2 (ja) | 2016-08-09 | 2021-08-06 | マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物及びその活性成分を生産するための発現ベクター及び方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2016/094104 WO2018027526A1 (zh) | 2016-08-09 | 2016-08-09 | 防治猪鼻霉浆菌感染的组合物及生产该组合物的方法 |
JP2019507081A JP7009445B2 (ja) | 2016-08-09 | 2016-08-09 | マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物 |
JP2021129522A JP7230130B2 (ja) | 2016-08-09 | 2021-08-06 | マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物及びその活性成分を生産するための発現ベクター及び方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019507081A Division JP7009445B2 (ja) | 2016-08-09 | 2016-08-09 | マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021175410A JP2021175410A (ja) | 2021-11-04 |
JP7230130B2 true JP7230130B2 (ja) | 2023-02-28 |
Family
ID=61161130
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019507081A Active JP7009445B2 (ja) | 2016-08-09 | 2016-08-09 | マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物 |
JP2021129522A Active JP7230130B2 (ja) | 2016-08-09 | 2021-08-06 | マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物及びその活性成分を生産するための発現ベクター及び方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019507081A Active JP7009445B2 (ja) | 2016-08-09 | 2016-08-09 | マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10758603B2 (ja) |
EP (2) | EP3778626A1 (ja) |
JP (2) | JP7009445B2 (ja) |
KR (1) | KR102251603B1 (ja) |
CN (1) | CN109476711B (ja) |
BR (1) | BR112019002614A2 (ja) |
CA (1) | CA3033143C (ja) |
PH (1) | PH12019500169A1 (ja) |
RU (1) | RU2724549C1 (ja) |
WO (1) | WO2018027526A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN118236476B (zh) * | 2024-05-27 | 2024-07-19 | 江苏省农业科学院 | 猪肺炎支原体亚单位疫苗、制备方法及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016514086A (ja) | 2013-02-05 | 2016-05-19 | アグリカルチュラル テクノロジー リサーチ インスティテュート | 抗マイコプラズマ属菌種サブユニットワクチン |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI238721B (en) * | 2003-06-20 | 2005-09-01 | Animal Technology Inst Taiwan | Swine enzootic vaccine, its producing method and usage |
CN101031655A (zh) * | 2004-07-26 | 2007-09-05 | 陶氏环球技术公司 | 通过株工程改进蛋白表达的方法 |
US20090104185A1 (en) | 2005-04-07 | 2009-04-23 | Joel Barry Baseman | Methods and Compositions for Mycoplasma Toxins |
US7829274B2 (en) * | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
US20090068231A1 (en) * | 2007-09-11 | 2009-03-12 | Wyeth | Live attenuated mycoplasma strains |
UA114504C2 (uk) * | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs |
ES2738100T3 (es) * | 2012-12-28 | 2020-01-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Método de fabricación de una vacuna contra micoplasma |
CN105792841B (zh) | 2013-11-21 | 2019-07-26 | 财团法人农业科技研究院 | 防治霉浆菌感染的组合物 |
-
2016
- 2016-08-09 WO PCT/CN2016/094104 patent/WO2018027526A1/zh unknown
- 2016-08-09 BR BR112019002614A patent/BR112019002614A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2016-08-09 CN CN201680087339.7A patent/CN109476711B/zh active Active
- 2016-08-09 JP JP2019507081A patent/JP7009445B2/ja active Active
- 2016-08-09 EP EP20195276.9A patent/EP3778626A1/en not_active Withdrawn
- 2016-08-09 EP EP16911981.5A patent/EP3498728A4/en not_active Withdrawn
- 2016-08-09 US US16/320,515 patent/US10758603B2/en active Active
- 2016-08-09 KR KR1020197004486A patent/KR102251603B1/ko active IP Right Grant
- 2016-08-09 CA CA3033143A patent/CA3033143C/en active Active
- 2016-08-09 RU RU2019106158A patent/RU2724549C1/ru active
-
2019
- 2019-01-23 PH PH12019500169A patent/PH12019500169A1/en unknown
-
2021
- 2021-08-06 JP JP2021129522A patent/JP7230130B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016514086A (ja) | 2013-02-05 | 2016-05-19 | アグリカルチュラル テクノロジー リサーチ インスティテュート | 抗マイコプラズマ属菌種サブユニットワクチン |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
46kDa surface antigen [Mycoplasma hyorhinis HUB-1], GenBank:ADM21634, 30-JAN-2014, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ADM21634.1/ |
J Jinling Ins Tech., 2011, Vol.27 No.4, p.79-84 |
Prog Modern Biomed., 2008, Vol.8 No.11, p.2143-2165 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20190029678A (ko) | 2019-03-20 |
US20200023048A1 (en) | 2020-01-23 |
EP3498728A4 (en) | 2020-03-25 |
KR102251603B1 (ko) | 2021-05-14 |
JP2021175410A (ja) | 2021-11-04 |
CN109476711B (zh) | 2023-08-08 |
JP7009445B2 (ja) | 2022-02-10 |
US10758603B2 (en) | 2020-09-01 |
EP3498728A1 (en) | 2019-06-19 |
RU2724549C1 (ru) | 2020-06-23 |
JP2019524800A (ja) | 2019-09-05 |
CA3033143A1 (en) | 2018-02-15 |
EP3778626A1 (en) | 2021-02-17 |
WO2018027526A1 (zh) | 2018-02-15 |
WO2018027526A9 (zh) | 2018-12-20 |
CN109476711A (zh) | 2019-03-15 |
PH12019500169A1 (en) | 2019-10-14 |
BR112019002614A2 (pt) | 2019-07-02 |
CA3033143C (en) | 2021-05-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6113306B2 (ja) | 抗マイコプラズマ属菌種サブユニットワクチン | |
US10059749B2 (en) | Composition for preventing Mycoplasma spp. infection | |
AU2008217189B2 (en) | Method of purification of hydrophobic proteins | |
JP2008067707A (ja) | 分類不可能なハエモフィルスインフルエンザエのlkpピリン構造遺伝子およびオペロン | |
CN111856006B (zh) | 牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用 | |
Pilehchian et al. | Fusion of Clostridium perfringens type D and B epsilon and beta toxin genes and it’s cloning in E. coli | |
JP7230130B2 (ja) | マイコプラズマ・ヒオリニス感染を予防治療する組成物及びその活性成分を生産するための発現ベクター及び方法 | |
CN106589082B (zh) | 活动性结核病诊断分子的筛选与应用 | |
CN113637056A (zh) | 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒 | |
CN109021115B (zh) | 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗 | |
TWI606839B (zh) | 防治豬鼻黴漿菌感染之組合物及生產該組合物的方法 | |
CN110891597B (zh) | 防治家禽滑膜霉浆菌感染的组合物 | |
CN114525287A (zh) | 一种毒害艾美耳球虫sag20抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
JP2019504636A (ja) | Slamポリヌクレオチド及びポリペプチド、ならびにそれらの使用 | |
CN115261391A (zh) | 一种毒害艾美耳球虫sag7抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
CN118255901A (zh) | 诺如病毒P颗粒嵌合LcR7蛋白的重组蛋白及其制备方法和应用 | |
Nasiri et al. | Cloning, Sequencing, and Expression of FanC Antigen of Enterotoxigenic Escherichia Coli | |
CN114621963A (zh) | 一种猪魏氏梭菌a型的亚单位疫苗及其制备 | |
TW201945021A (zh) | 防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物 | |
Li et al. | The omp2 gene of HPS-type bacteria cloning and sequence analysis isolates from Sichuan Province |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210806 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220809 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221102 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230201 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230215 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7230130 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |