KR20190029678A - 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염의 예방 및 치료용 조성물 및 조성물의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

돼지에서 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염을 예방 및 치료하기 위한 조성물이 개시된다. 상기 조성물은 활성 약학적 성분으로서 XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합을 사용한다. 또한, 발현 벡터 및 원핵 생물 발현 시스템을 사용하는 조성물의 활성 약학적 성분을 생산하는 방법이 개시된다.

Description

마이코플라즈마 하이오라이니스 감염의 예방 및 치료용 조성물 및 조성물의 생산 방법

본 발명은 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis) 감염에 대한 조성물, 특히 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 대항하는 서브유닛 백신에 관한 것이다.

마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스는 돼지 유행성 폐렴, SEP를 일으키는 주요 병원체이다. 마이코플라즈마 하이오라이니스는 또한 다발장막염 또는 관절염의 발병에도 관여한다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스에 의한 감염은 사료 효율을 감소시키고 돼지의 성장 지연을 일으킬뿐만 아니라 돼지를 다른 바이러스 또는 박테리아 병원체의 2차 감염에 보다 취약하게 하여, 양돈 산업의 경제적 손실을 가져온다. 비활성화된(사멸된) 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 백신은 전세계의 동물 백신 제조업체에 의해 개발되었고 양돈 산업에서 널리 사용되었다. 그러나, 마이코플라즈마 하이오라이니스 백신은 아직 시장에 나와 있지 않다. 비활성화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 백신의 투여는 단지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염을 예방할 수 있지만 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염으로부터 돼지를 보호할 수는 없다.

현 백신의 보호가 불충분하다는 문제를 해결하기 위해서, 마이코플라즈마 하이오라이니스 백신을 개발할 필요가 있다. 이 분야의 통상적인 백신은 주로 비활성화된(사멸된) 백신이다. 마이코플라즈마 spp.는 배양이 쉽지 않고, 배양 배지가 비싸고 이로부터 얻은 마이코플라즈마 spp.의 농도는 충분히 높지 않기 때문에, 비활성화된(사멸된) 마이코플라즈마 하이오라이니스 백신의 제조 비용은 여전히 높다. 따라서, 생산하기 쉽고 안전성이 높은 서브유닛 백신이 백신 개발의 다른 옵션으로 고려된다. 현재까지, 마이코플라즈마 하이오라이니스 백신에 사용하기에 적합한 항원은 이 분야의 잘 정립된 연구 보고서에 의해 아직 제안되지 않았다. 상기와 관련하여, 본 발명의 주요 목적은 저렴하고 효과적인 마이코플라즈마 하이오라이니스 서브유닛 백신을 개발하여 양돈 산업에서 종합적 전염병 예방 작업을 개선하는 것이다.

본 발명의 하나의 목적은 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 대항하는 서브유닛 백신을 제공하여, 양돈 산업에서의 전염병 예방 작업을 개선하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항원 발현 벡터 및 서브유닛 백신을 생산하는 방법을 제공하는 것이며 여기서 상기 발현 벡터의 항원 유전자는 원핵 생물 발현 시스템에서 발현되어, 상기 서브유닛 백신의 생산 비용을 감소시킨다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합을 포함하는 활성 성분 및 항원보강제를 포함하는 조성물을 제공하며; 상기 XylF는 SEQ ID NO: 01을 포함하고, 상기 DnaK는 SEQ ID NO: 02를 포함하고, 상기 P72는 SEQ ID NO: 03을 포함하고; 상기 질환은 복막염, 흉막염, 심낭염 및 관절 부종으로부터 선택되는 적어도 하나이다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개를 포함하며; 보다 바람직하게는, 상기 활성 성분은 XylF, DnaK 및 P72의 조합을 포함한다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 상기 조성물의 총 부피를 기준으로 하여 50 내지 300㎍/mL의 농도를 갖는다.

바람직하게는, 상기 항원보강제는 완전한 프로인트 항원보강제, 불완전 프로인트 항원보강제, 알루미나 겔, 계면활성제, 음이온성 폴리머, 펩타이드, 유성 에멀젼, 또는 이들의 조합을 포함한다.

바람직하게는, 상기 질환은 상기 활성 성분이 XylF인 경우 복막염, 흉막염 또는 이들의 조합이다.

바람직하게는, 상기 질환은 상기 활성 성분이 DnaK인 경우 복막염이다.

바람직하게는, 상기 질환은 상기 활성 성분이 P72인 경우 흉막염이다.

바람직하게는, 상기 질환은 상기 활성 성분이 XylF, DnaK 및 P72의 조합인 경우 복막염, 흉막염, 심낭염 및 관절 부종이다.

또한, 본 발명은 원핵 생물 발현 시스템에서 상기 조성물의 활성 성분의 생산을 위한 발현 벡터를 제공하며, 상기 발현 벡터는:

프로모터 및 리보솜 결합 부위를 포함하는 발현 요소;

상기 XylF, 상기 DnaK, 상기 P72 또는 이들의 조합을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및

융합 파트너를 암호화하는 서열;

상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 또는 SEQ ID NO: 06 또는 이들의 조합을 포함한다.

바람직하게는, 융합 파트너는 대장균의 DsbC, 대장균의 MsyB, 대장균의 FklB 또는 이들의 조합이다. 보다 바람직하게는, 발현 벡터의 경우, 상기 융합 파트너는 상기 뉴클레오타이드 서열이 XylF를 암호화하는 경우 대장균의 DsbC이고; 상기 융합 파트너는 상기 뉴클레오타이드 서열이 DnaK를 암호화하는 경우 대장균의 MsyB이고; 또는 상기 융합 파트너는 상기 뉴클레오타이드 서열이 P72를 암호화하는 경우 대장균의 FklB이다.

바람직하게는, 상기 발현 벡터는 히스티딘-태그(His-태그), 글루타티온 S-트랜스페라제(GST-태그) 또는 이들의 조합을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다.

바람직하게는, 상기 발현 벡터는 SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08 또는 SEQ ID NO: 09를 포함한다.

바람직하게는, 상기 원핵 생물 발현 시스템은 대장균 발현 시스템이다.

본 발명은 또한 가용성 단백질의 생산 방법을 제공하며; 상기 단백질은 XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합이며; 상기 방법은

(1) 원핵 생물 발현 시스템을 제공하는 단계; 및

(2) 상기 원핵 생물 발현 시스템에서 발현 벡터의 상기 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 상기 방법은 상기 단계(2)에서 수득된 생성물을 니켈 이온 친화성 컬럼 또는 글루타티온 친화성 칼럼을 통과시켜 상기 가용성 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.

요약하면, 본 발명은 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 대항하는 조성물을 제공함으로써 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의해 유발된 질환을 예방하는 목적이 달성될 수 있다. 본 발명은 또한 항원 발현 벡터 및 원핵 생물 발현 시스템에서 상기 조성물의 상기 활성 성분의 생산 방법을 개시한다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 재조합 항원의 용해도를 관찰하기 위해 실시예 3에서 수행된 단백질 전기 영동의 결과를 나타낸다(여기서 T는 전체 세포 용해물을 나타내고 S는 전체 세포 용해물에서 가용성 분획을 나타낸다).
도 2는 본 발명의 재조합 항원의 정제를 관측하기 위해 실시예 3에서 수행된 단백질 전기 영동의 결과를 나타낸다.

본 발명자는 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 대항하는 조성물의 부재 측면에서, 본 발명자는 심오한 연구를 수행하여 XylF, DnaK 및 P72는, 단독 또는 조합으로, 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 조성물의 활성 성분으로 사용될 수 있음을 입증하였다. 본문에서 "마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의해 유발된 질환"이라는 용어는 복막염, 흉막염, 심낭염 및 관절 부종에서 선택된 적어도 하나의 질환을 의미한다. 한 실시태양에서, "마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의해 유발된 상기 질환"은 마그누슨 등에 의해 제안된 방법에 의해 평가될 수 있다(Vet. Immunol. Immunopathol., 61:83-96, 1998).

한 실시예에서, 본 발명의 실험의 결과는 XylF가 본 발명의 조성물의 활성 성분으로 사용될 때, 복막염, 흉막염 또는 이들의 조합의 완화에 특히 유용함을 보여 주었다. 본 발명의 다른 실시예에서, 실험의 결과는 DnaK가 본 발명의 조성물의 활성 성분으로 사용될 때, 복막염의 완화에 특히 유용함을 보여 주었다. 본 발명의 추가 실시예에서, 실험의 결과는 P72가 본 발명의 조성물의 활성 성분으로 사용될 때, 흉막염의 완화에 특히 유용함을 보여 주었다. 본 발명의 추가 실시예에서, 실험 결과는 XylF, DnaK 및 P72의 조합이, 활성 성분으로 사용될 때, 완화되는 질환이 복막염, 흉막염, 심낭염 및 관절 부종인 경우에 특히 유용함을 나타내었다.

한 양태에서, 본 발명은 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 활성 성분 및 항원보강제를 포함한다. "활성 성분"이란 용어는 상기 조성물을 사용하는 목적을 달성할 수 있는 성분을 의미한다. 상기 활성 성분은 XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합을 포함하고; 상기 XylF는 SEQ ID NO: 01을 포함하고, 상기 DnaK는 SEQ ID NO: 02를 포함하고, 상기 P72는 SEQ ID NO: 03을 포함한다.

한 실시태양에서, 상기 활성 성분은 XylF, DnaK 및 P72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나이다. 다른 실시태양에서, 상기 활성 성분은 XylF, DnaK 및 P72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 활성 성분은 XylF, DnaK 및 P72의 조합이다. 당업자는 XylF, DnaK 및 P72의 각각의 에피토프의 구조가 영향을 받지 않는 경우에 상기 활성 성분은 XylF, DnaK 및 P72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있는 재조합 단백질이 될 수 있음을 이해할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 조성물은 XylF, DnaK 및 P72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질을 혼합하여 수득한, 상기 활성 성분의 혼합물을 포함할 수 있다.

당업자는 백신이 둘 이상의 활성 성분을 함유하는 경우, 특히 상기 둘 이상의 활성 성분이 동일한 병원체 감염에 대항할 때 이의 효과가 예측할 수 없다는 것을 쉽게 이해할 수 있는데, 이는 바람직하지 않은 결과가 상기 둘 이상의 활성 성분들 사이의 충돌 때문에 발생할 수 있기 때문이다. 다른 양태에서, 비록 상기 둘 이상의 활성 성분이 서로 충돌하지 않고 어떠한 원하지 않는 결과가 발생하지는 않더라도, 상기 둘 이상의 활성 성분을 조합하는 것이 더 나은 효과(예를 들어, 높은 면역 반응 유도)를 내지 못하는 경우 경제적 관점에서 하나의 단일 백신에서 상기 둘 이상의 활성 성분을 조합하는 동기는 여전히 없다. 상기의 관점에서, 하나 이상의 단일 백신에서 둘 이상의 활성 성분을 조합하는 것은 상기 둘 이상의 활성 성분의 조합이 더 나은 효과를 낼 수 있는 경우에만 산업상 이점을 가질 수 있다. 그러나, 실험을 수행하지 않고, 어떤 종류의 후보 성분 또는 조성물이 더 나은 효과를 낼 수 있는지는 예측할 수 없다.

한 실시태양에서, 상기 조성물의 상기 활성 성분은 상기 조성물의 총 부피를 기준으로 50 내지 300㎍/mL의 농도를 갖는다. 한 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물의 상기 활성 성분은 XylF, DnaK 및 P72의 조합이며, 여기서 XylF, DnaK 및 P72의 각각은 상기 조성물의 총 부피를 기준으로 100㎍/mL의 농도를 갖는다. 당업자는 상기 농도가 조성물의 응용 목적에 따라 조절될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 조성물의 운송 및 저장을 보다 편리하게 하기 위해, 당업자는 더 높은 농도의 상기 활성 성분(들)을 갖는 상기 조성물을 제조할 수 있고 사용 직전에 상기 조성물을 희석할 수 있다.

용어 "항원보강제"는 약물/백신 분야에서 주지된 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 상기 항원보강제는 상기 활성 성분의 면역원성 효과를 개선시키고 및/또는 상기 활성 성분을 안정화시키는데 사용된다. 상기 항원보강제는 완전 프로인트 항원보강제, 불완전 프로인트 항원보강제, 알루미나 겔, 계면 활성제, 음이온 성 폴리머, 펩타이드, 유성 에멀젼, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시태양에서, 상기 항원보강제는 알루미나 겔이다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 항원 발현 벡터를 제공한다. 상기 항원 발현 벡터를 제조하는 목적은 상기 재조합 항원의 대량 생산이 가능하도록 원핵 생물 발현 시스템에서 상기 조성물의 활성 성분(즉, 재조합 항원)을 발현하는 것이다. 원핵 생물 발현 시스템에서 단백질을 발현하는데 많은 경험이 있었지만, 생물 다양성으로 인해 상이한 단백질에 대해 상이한 발현 조건이 필요할 수 있다. 따라서, 임의의 특정 항원에 대한 발현 조건을 테스트하기 위해 많은 양의 실험을 수행 하는 것이 여전히 필요하다. 본 발명의 연구를 통해, 원핵 생물 발현 시스템에서 재조합 항원을 발현할 수 있는 발현 벡터가 바람직하게는 대장균 발현 시스템을 위해 성공적으로 제작되었다. 대장균 발현 시스템에서 재조합 항원을 발현할 수 있는 본 발명의 발현 벡터는 당업자에 의해 쉽게 변형될 수 있으므로, 본 발명의 발현 벡터가 다른 원핵 생물 발현 시스템에서 재조합 항원을 발현할 수 있게 한다.

다른 양태에서, 상기 활성 성분의 생산에 있어서의 현존하는 기술적 문제 중 하나는 상기 원핵 생물 발현 시스템으로부터 발현된 상기 활성 성분의 정제이다. 원핵 생물 발현 시스템에서 발현된 재조합 단백질은 일반적으로 용해도가 낮아 분리/정제 단계의 어려움과 비용을 증가시킨다. 상기에서, 본 발명의 항원 발현 벡터는 우수한 용해도를 갖는 재조합 단백질을 발현시킬 수 있도록 디자인되어, 재조합 단백질의 분리/정제 단계를 간소화하고 비용을 감소시킨다.

본 발명의 발현 벡터는 발현 요소; 상기 XylF, 상기 DnaK, 상기 P72 또는 이들의 조합을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 융합 파트너를 암호화하는 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 또는 SEQ ID NO: 06 또는 이들의 조합을 포함한다. 당업자는 상기 핵산 서열이 상기 XylF, 상기 DnaK, 상기 P72 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있는 한, 선택된 원핵 생물 발현 시스템의 코돈 선호도에 따라, 상기 뉴클레오타이드 서열을 변형시킬 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 연구는 대장균의 DsbC, 대장균의 MsyB, 대장균의 FklB 또는 이들의 조합이 바람직하게는 XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합의 발현을 위한 융합 파트너로서 사용되어, 원핵 생물 발현 시스템에서 생산된 재조합 단백질이 원하는 용해도를 갖게 한다. 다른 바람직한 실시태양에서, 정제 단계를 용이하게 하기 위하여, 상기 발현 벡터는 His-tag, GST-tag 또는 이들의 조합을 암호화하는 서열을 더 포함할 수 있어서, 수득된 재조합 단백질은 니켈 이온 친화성 칼럼 또는 글루타티온 친화성 칼럼을 통과함으로써 정제될 수 있다.

한 실시태양에서, 상기 발현 요소는 전사 및/또는 번역을 수행하기 위한 프로모터 및 리보솜 결합 부위를 적어도 포함한다. 다른 실시태양에서, 유전자 조작 작업을 용이하게 하기 위해, 상기 발현 벡터는 제한 효소 절단 부위, 선택 가능한 마커 또는 이들의 조합으로 이루어진 다중 복제 부위를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선택 가능한 마커는 항생제 내성 유전자 또는 영양 요구성 유전자일 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 가용성 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 가용성 단백질은 XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 방법은 (1) 원핵 생물 발현 시스템을 제공하는 단계; 및 (2) 상기 원핵 생물 발현 시스템의 발현 벡터에서 항원 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 본 발명에서 용어 "가용성"은 상기 단백질이 수용액에서 용해되는 경향이 있는 특성을 의미한다. 본 발명에서 용어 "발현"은 발현 벡터가 임의의 수단에 의해 상기 원핵 생물 발현 시스템에서 표적 유전자를 전사 및 번역하도록 유도됨을 나타낸다. 상기 수단은 아이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)의 상기 원핵 생물 발현 시스템으로의 첨가일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 본 발명의 조성물의 활성 성분으로서 적합한 단백질의 조사

(1) 불활성화된 마이코플라즈마 하이오라이니스 백신의 제조

마이코플라즈마 하이오라이니스(ATIT-7)를 주지된 프리스 배지에서 배양한 후 대만 발명 특허 제1238721호에 개시된 방법에 따라 비활성화된 마이코플라즈마 하이오라이니스 백신을 제조하는데 사용하였다.

(2) 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 항혈청의 제조

4주령 SPF 돼지 중 3마리를 농업 기술 연구소의 동물 기술 연구소(Animal Technology Laboratories of Agricultural Technology Research Institute)의 2세대 SPF 돼지농장으로부터 구입하였다. 모든 돼지는 실험용 SPF 돼지용 우리에서 같은 조건으로 먹이를 주었다. 돼지를 각각 32일, 46일 및 60일령으로 키우고, 상기 각 시점에서, 2ml의 비활성화된 마이코플라즈마 하이오라이니스 백신을 근육내 주사로 돼지에게 투여하였다. 돼지를 74일령까지 키우면, 혈액 샘플을 돼지의 경정맥에서 채취하여 실온(약 25℃)에 1시간 동안 두었다. 그런 후에 혈액 샘플을 4℃로 유지시켰다. 다음날, 혈액 샘플을 1,107 x g에서 30분 동안 원심 분리하였다. 상청액(즉, 항혈청)을 깨끗한 원심 분리 튜브에 옮기고 후속 단계에서 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.

(3) 마이코플라즈마 하이오라이니스의 총 단백질 추출

총 단백질을 단백질 추출 키트(Ready Prep^TM 단백질 추출 키트; Bio-Rad, USA)를 사용하여 마이코플라즈마 하이오라이니스로부터 추출하였다. 먼저, 프리스 배지에서 배양한 마이코플라즈마 하이오라이니스를 원심 분리(10,000 x g, 20분)하여 박테리아 세포를 수집하였다. 박테리아 세포를 저염 버퍼 용액(100mM 트리스-염기, 250mM 수크로오스, pH 8.0)으로 3회 세척한 후, 10μL의 TBF 환원제(ReadyPrep^TM TBP 환원제), 적절한 양의 Bio-Lyte 3/10 양쪽성 전해질(양쪽성 전해질의 최종 농도는 0.2%) 및 적절한 양의 프로테아제 억제제를 첨가하면서 1mL의 샘플 완충액(완전한 2-D 재수화/샘플 버퍼)에 부유시켰다. 박테리아 세포를 초음파 처리로 파괴하였다. 파괴된 세포를 원심 분리에 의해 제거하고, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 총 단백질을 함유하는 상청액을 저장하여 후속 단계에서 사용하였다.

총 단백질의 농도는 단백질 분석 키트(RC DC^TM Protein Assay Kit; Bio-Rad, USA)로 측정하였다. 총 단백질을 함유하는 100μL의 상기 상청액을 500μL의 RC 시약 I과 완전히 혼합하고, 혼합물을 실온(약 25℃)에 놓고 1분 동안 반응을 진행시켰다. 그런 후에 500μL의 RC 시약 II를 첨가하고 완전히 혼합하고 원심 분리시켰다(15,000 x g, 5분). 침전물을 모은 다음 510μL의 시약 A'와 완전히 혼합하였다. 혼합물을 실온(약 25℃)에 놓고 5분 동안 또는 모든 침전물이 용해될 때까지 반응을 진행시켰다. 그런 후에, 4mL의 시약 B를 첨가하고 혼합물을 다시 실온(약 25℃)에 놓고 15분 동안 반응을 진행시켰다. 750nm의 파장에서의 용액의 흡광도를 분광 광도계로 측정하였다. 소 혈청 알부민(BSA)을 표준 샘플로 사용하여 단백질 농도 대 흡광도의 표준 곡선을 만들었다. 상기 상청액에서 총 단백질 농도는 표준 곡선 상의 상청액 샘플의 흡광도를 보간하고 그 안의 총 단백질 농도를 계산함으로써 얻을 수 있다. 공지된 농도의 총 단백질을 갖는 샘플을 다음 단백질 전기 영동 단계에서 사용할 수 있다.

(4) 단백질의 2차원 전기 영동

단백질의 2차원 전기 영동은 다음 단락에서 기술된 바와 같이, 2 단계: 등전점 초점화(IEF) 전기 영동 및 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 포함한다.

등전점 초점화(IEF) 전기 영동

등전점 초점화(IEF) 전기 영동은 등전점의 차이로 상이한 단백질을 분리하는 기술이다. 먼저, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 총 단백질을 함유하는 1mg의 상청액을 취하여 최종 혼합물의 총 부피가 400μL인 방식으로 적절한 양의 재수화 버퍼와 혼합하였다. 다음으로, 혼합물을 초점화 트레이(Bio-Rad, USA)의 샘플 슬롯에 첨가하였다. 증류-탈이온수로 적셔진 여과지 두 장을 각각 양극 및 음극 상에 놓았다. 상기 여과지는 샘플에 있는 불순물 및 염을 흡착할 수 있어, 이후의 실험에 대한 상기 불순물 및 염의 영향 및 전극의 손상을 피할 수 있다. 그런 후에 IPG 겔 스트립, 즉 ReadyStrip^TM(pH 5-8/17cm)을 초점화 트레이에 천천히 넣었다. 2.5mL의 미네랄 오일을 취하여 IPG 겔 스트립에 골고루 펴서 후속 실험에 영향을 줄 수 있는 샘플의 증발을 막았다. 초점화 트레이를 상부 뚜껑으로 덮고 등전점 초점화 전기 영동 장치(Bio-Rad, USA)의 PROTEAN IEF 셀에 두었다. PROTEAN IEF 세포에 대한 프로그램이 설정된 후, 1차원 전기 영동을 5단계로 수행하였다. 첫 번째 단계는 샘플이 IPG 겔 스트립에 흡수되도록 12시간 동안 50V에서의 재수화이다. 두 번째 단계는 250V에서 15분 동안 염 이온 및 불순물의 제거이다. 세 번째 단계는 전압 상승이며, 전압은 4시간에 걸쳐 10,000 V의 초점화 전압으로 직선적으로 상승된다. 네 번째 단계는 50,000V x hr에서 수행되는 등전점 초점화 단계이었다. 다섯 번째 단계는 과도한 반응을 피하기 위한 500V에서의 전압 유지이다. 1차원 전기 영동의 종료 후에, IPG 겔 스트립은 -80℃에서 보관되거나, 평형 후, 즉시 후속 SDS-PAGE 단계에서 사용될 수 있다.

소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)

소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동은 분자량의 차이에 의해 상이한 단백질을 분리하는 기술이다. 먼저, IPG 겔 스트립을 탈 이온수로 세척한 후, 겔 측의 뒤쪽에 있는 미네랄 오일 및 물을 여과지로 흡수시켰다. 그런 후에, IPG 겔 스트립을 일회용 재수화 트레이에 놓았다. 6mL의 평형 버퍼 I(6M 우레아, 2% SDS, 0.375 M 트리스, 20% 글리세린, 130mM DTT, pH 8.8)을 거기에 첨가하고 생성된 혼합물을 20분 동안 진탕하였다. 그런 후에, IPG 겔 스트립을 꺼내고, 겔 측의 뒤쪽에 남은 평형 버퍼 I를 여과지로 흡수시켰다. IPG 겔 스트립을 다시 일회용 재수화 트레이에 놓았다. 6mL의 평형 버퍼 II(6M 우레아, 2% SDS, 0.375M 트리스, 20% 글리세린, 135mM 요오도아세트아마이드, pH 8.8)을 거기에 첨가하고 생성된 혼합물을 20분 동안 진탕하였다. 상기 평형 처리를 완료한 후, SDS-PAGE를 수행하였다.

먼저, 12.5%의 분리 겔을 제조하였다. IPG 겔 스트립을 분리 겔의 상부 표면 상에 놓았다. 그런 후에 용해된 아가로오스(ReadyPrep^TM Overlay Agarose, Bio-Rad, USA)를 거기에 적당량 첨가하였다. 분자량의 결정을 보다 편리하게 하기 위해, 단백질 분자량 표준이 점재된 여과지를 IPG 겔 스트립 옆에 놓았다. 아가로오스의 응고 후, 겔 스트립 및 단백질 분자량 표준을 갖는 여과지를 분리 겔에 고정시켰다. 전기 영동 겔 조각을 전기 영동 용기(Bio-Rad, USA)에 넣고 전기 영동 버퍼(25mM 트리스, 192mM 글리신, 0.1% SDS, pH 8.3)를 용기에 주입하였다. 전기 영동을 26mA의 전류에서 15시간 동안 수행하여 분자량이 상이한 단백질을 분리하였다.

(5) 웨스턴 블로팅 방법

단백질 전기 영동 후, 상기 겔 조각을 블로팅 버퍼[25mM 트리스 염기, 192mM 글리신, 10%(v/v), 메탄올, pH 8.3]에 침지시켰다. PVDF 필름을 적당한 크기로 절단하고 수 초 동안 메탄올에 담그고, 탈 이온수로 1회 세척한 다음 블로팅 버퍼에 침지시켰다. 겔 조각 및 PVDF 필름을 블로팅 버퍼에 15분 동안 침지시킨 후, 여과지 조각, 겔 조각, PVDF 필름 및 여과지의 다른 조각을 순차적으로 블로팅 전이 장치에 넣고 전이를 1.5시간 동안 1,300mA의 전류에서 수행하였다.

전이 종료 후, 상기 PVDF 필름을 블러킹 버퍼[20mM 트리스-염기, 150mM NaCl, 5%(w/v) 탈지유, pH 7.4]에 실온에서 1시간 동안 침지시켰다. 상기 실험에서 제조된 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대항하는 적절한 양의 항혈청(1,000배 희석)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 진탕시켰다. 블러킹 용액을 쏟아 내고 상기 PVDF 필름을 적절한 양의 TBST 버퍼[20mM 트리스-염기, 150mM NaCl, 0.05%(v/v) 트윈-20, pH 7.4]으로 3회 세척(5분/시간) 후, 알칼린 포스파타제-접합 염소 항-돼지 IgG(H+L)(2000배 희석)를 함유하는 블러킹 버퍼를 첨가하였다. 1시간 동안 암실에서 진탕한 후, 상기 PVDF 필름을 TBST 버퍼로 3회 세척한 후 NBT/BCIP 용액(Thermo Fisher Scientific, USA)을 첨가하여 발색 반응을 유도하였다.

(6) 단백질의 동정

상기 웨스턴 블로팅 방법에서 발색 반응의 결과가 나타내는 바와 같이, 착색 된 점(도면에서 도시되지 않음, 총 17개 점)은 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대항하는 항혈청과 반응할 수 있는 마이코플라즈마 하이오라이니스 단백질을 나타내었다. 상기 발색 반응의 결과를 전기 영동한 겔 조각과 비교하여, 착색된 점의 위치에 대응하는 위치에 있는 겔 조각의 밴드를 마이크로 피펫으로 채취하여 질량 스펙트럼 분석에 사용하였다. 상기에서 수득된 단백질의 동정은 이의 아미노산 서열을 단백질 서열 데이터베이스와 비교함으로써 수행하였다. 그 결과, SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 및 SEQ ID NO: 03으로 나타낸 서열을 각각 갖는 XylF, DnaK 및 P72의 3개의 단백질이 동정되었다. 본 발명은 이 3개 단백질에 대한 후속 연구를 진행하였다.

실시예 2 본 발명의 발현 벡터의 제작

(1) 항원 유전자의 점 돌연변이 및 복제

미국 국립 생명 공학 정보 센터(NCBI)의 데이터에 따르면, 상기 XylF, DnaK 및 P72 유전자의 서열은 각각 4개, 1개 및 8개의 TGA 코돈을 가졌다. TGA 코돈은 대장균 발현 시스템에서 정지 코돈으로 간주되었다. 대장균 발현 시스템이 상기 단백질의 전장을 생성할 수 없도록 하기 위해, 항원 유전자의 서열에서 TGA 코돈을 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 TGG 코돈으로 돌연변이시켰다.

마이코플라즈마 하이오라이니스의 게놈 DNA 추출

마이코플라즈마 하이오라이니스의 게놈 DNA는 DNA 정제 키트(Tissue & Cell Genomic DNA Purification kit; GMbiolab, Taiwan)를 이용하여 추출하였다. 먼저, 4.5mL의 마이코플라즈마 하이오라이니스의 배양액을 취하여 원심 분리 튜브에 넣었다. 원심 분리(5,870 x g, 5분) 후, 상청액을 쏟아 내고 펠릿을 수집하였다. 다음으로, 20μL의 프로테아제 K(10mg/mL) 및 200μL의 추출 시약을 첨가하고 3시간 동안 56℃에서 반응시켰다. 200μL의 결합 용액을 첨가하고 70 ℃에서 10 분 동안 반응시켰다. 반응 완결 후, 200μL의 무수 알코올을 첨가하여 미세 원심 분리 튜브에 옮기고 완전히 혼합한 후, 생성된 용액(침전물 포함)을 스핀 컬럼에 피펫으로 넣고 스핀 컬럼을 수집 튜브에 넣었다. 2분 동안 원심 분리(17,970 x g) 후, 상청액을 쏟아 내고 300μL의 결합 시약을 다시 스핀 컬럼에 첨가하였다. 2분 동안 원심 분리(17,970 x g) 후, 상청액을 쏟아 냈다. 700μL의 세척 용액을 스핀 컬럼에 첨가하고 혼합물을 2분 동안 원심 분리(17,970 x g) 후 상청액을 쏟아 냈다. 상기 세척 단계를 1회 반복하였다. 마침내, 혼합물을 17,970 x g에서 5분 동안 원심 분리하여 잔류 알코올을 제거하였다. 스핀 컬럼을 멸균된 미세 원심 튜브에 넣고 적절한 양의 멸균된 탈 이온수를 가하여 게놈 DNA를 배출시켰다.

XylF 항원 유전자의 점 돌연변이

XylF 항원 유전자에 대한 프라이머 XylF/XylR 및 변이 프라이머 XylM1 내지 XylM8을 디자인하였고, 이들 프라이머의 서열을 표 1에 나타내었다.

SEQ ID NO	프라이머	서열 (5' to 3')
SEQ ID NO: 10	XylF	GATATAGGATCCTCATTTGTAGCTTGTGGAACAACAG
SEQ ID NO: 11	XylR	CAATATGTCGACTTGTGTTACACCATTAGTTGGTACTGTACC
SEQ ID NO: 12	XylM1	GATCCAGATAATCCAAGATGGATTAATGCACAAAAAGATA
SEQ ID NO: 13	XylM2	TATCTTTTTGTGCATTAATCCATCTTGGATTATCTGGATC
SEQ ID NO: 14	XylM3	CAAAATGCACAAAACAACTGGTTAACTCAACAAGCAAACT
SEQ ID NO: 15	XylM4	AGTTTGCTTGTTGAGTTAACCAGTTGTTTTGTGCATTTTG
SEQ ID NO: 16	XylM5	GGTTCAACTTCATATGATTGGTATGTTTCTTACGATAATG
SEQ ID NO: 17	XylM6	CATTATCGTAAGAAACATACCAATCATATGAAGTTGAACC
SEQ ID NO: 18	XylM7	TTATGTTCCAGGATGGAATTACGGAGACGCTG
SEQ ID NO: 19	XylM8	CAGCGTCTCCGTAATTCCATCCTGGAACATAA

마이코플라즈마 하이오라이니스의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, DNA 단편을 프라이머 쌍 XylF/XylM2, XylM1/XylM4, XylM3/XylM6, XylM5/XylM8 및 XylM7/XylR 등을 각각 사용하여 증폭시켰다. 50μL의 PCR의 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 버퍼 B, 200μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP), 증폭용 1μM 프라이머, 200ng의 마이코플라즈마 하이오라이니스의 게놈 DNA 및 1U GDP-HiFi DNA 폴리머라제를 함유하였다. PCR의 반응 조건은 5분 동안 96℃(1 단계); 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 30초 동안 68℃(35주기); 및 5분 동안 68℃(1 단계)이다.

PCR 완료 후, 아가로오스 겔 전기 영동을 수행하여 예측된 크기를 갖는 DNA 단편이 존재하는지 여부를 확인하였다. PCR 생성물은 Gel-M^TM 겔 추출 시스템 키트로 회수하였다. 유전자 증폭은 회수된 PCR 생성물을 주형으로 사용하고 XylF/XylR의 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다. PCR의 반응 조건은 2분 동안 96℃(1 단계); 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 45초 동안 68℃(35주기); 및 5분 동안 68℃(1 단계)이다. 점 돌연변이를 갖는 XylF 유전자를 상기 PCR에 의해 수득하였다. PCR 생성물을 PCR-M^TM 클린 업(Clean Up) 시스템 키트로 회수하였다. 서열 결정의 결과에 따르면, 본 발명의 XylF 유전자는 SEQ ID NO: 4로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 가졌다.

DnaK 항원 유전자의 점 돌연변이

프라이머 DnaKF/DnaKR 및 DnaK 항원 유전자에 대한 돌연변이 프라이머 DnaKM1 내지 DnaKM2를 디자인하고, 이들 프라이머의 서열을 표 2에 나타내었다.

SEQ ID NO	프라이머	서열 (5'to 3')
SEQ ID NO: 20	DnaKF	GATATAGGATCCATGGCAAAAGAAATTATTTTAGGAATAGATTTAG
SEQ ID NO: 21	DnaKR	CAATATGTCGACTTAATTTTCTTTAACTTCAGCTTCAATTGGTTG
SEQ ID NO: 22	DnaKM1	GATGACTGTGATCATGTTATTGTTGATTGGTTAGTTGACAAAATTAAAAAAGAATATG
SEQ ID NO: 23	DnaKM2	CATATTCTTTTTTAATTTTGTCAACTAACCAATCAACAATAACATGATCACAGTCATC

마이코플라즈마 하이오라이니스의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, DNA 단편을 프라이머 쌍 DnaKF/DnaK M2 및 DnaKM1/DnaKR를 각각 사용하여 증폭하였다. 50μL의 PCR의 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 버퍼 B, 200μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP), 증폭용 1μM 프라이머, 200ng의 마이코플라즈마 하이오라이니스의 게놈 DNA 및 1U GDP-HiFi DNA 폴리머라제를 함유하였다. PCR의 반응 조건은 5분 동안 96℃(1 단계); 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 30초 동안 68℃(35주기); 및 5분 동안 68℃(1 단계)이다.

PCR 완료 후, 아가로오스 겔 전기 영동을 수행하여 예측된 크기를 갖는 DNA 단편이 존재하는지 여부를 확인하였다. PCR 생성물은 Gel-M^TM 겔 추출 시스템 키트로 회수하였다. 유전자 증폭은 회수된 PCR 생성물을 주형으로 사용하고 DnaKF/DnaK의 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다. PCR의 반응 조건은 2분 동안 96℃(1 단계); 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 45초 동안 68℃(35주기); 및 5분 동안 68℃(1 단계)이다. 마지막으로, 점 돌연변이를 갖는 DnaK 유전자를 상기 PCR에 의해 수득하였다. PCR 생성물을 PCR-M^TM 클린 업(Clean Up) 시스템 키트로 회수하였다. 서열 결정의 결과에 따르면, 본 발명의 DnaK 유전자는 SEQ ID NO: 5로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 가졌다.

P72 유전자의 점 돌연변이

프라이머 P72F/P72R 및 P72 항원 유전자에 대한 돌연변이 프라이머 P72M1 내지 P72M8을 디자인하고, 이들 프라이머의 서열을 표 3에 나타내었다.

SEQ ID NO	프라이머	서열(5'to 3')
SEQ ID NO: 24	P72F	CAATATGGATCCTCTTGTGGACAACCAACCACAATTAAATTTG
SEQ ID NO: 25	P72R	GTATAAGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGATGAGCTGCAGATTTTTCGGCCATAAAA TC
SEQ ID NO: 26	P72M1	CTTCTCAAGGTTCATATTGGCCAATGATGCTAGGAATG
SEQ ID NO: 27	P72M2	CATTCCTAGCATCATTGGCCAATATGAACCTTGAGAAG
SEQ ID NO: 28	P72M3	ACTAAGCAAAGCTCTGATTGGAATCTTATTTTAGGAAACA
SEQ ID NO: 29	P72M4	TGTTTCCTAAAATAAGATTCCAATCAGAGCTTTGCTTAGT
SEQ ID NO: 30	P72M5	CTTTCTAAAACTAATAAAACTTTTTGGAGTGAAAAAAGTTTACAAAATAACAA
SEQ ID NO: 31	P72M6	TTGTTATTTTGTAAACTTTTTTCACTCCAAAAAGTTTTATTAGTTTTAGAAAG
SEQ ID NO: 32	P72M7	GTTGAAAACCAATATCAAGAATGGGAAAACACTTTAAAACAAACAC
SEQ ID NO: 33	P72M8	GTGTTTGTTTTAAAGTGTTTTCCCATTCTTGATATTGGTTTTCAAC
SEQ ID NO: 34	P72M9	CAAGCAAATACTGAAACTACTTCATGGACAAAAAAAGATATTCAAACTAAATC
SEQ ID NO: 35	P72M10	GATTTAGTTTGAATATCTTTTTTTGTCCATGAAGTAGTTTCAGTATTTGCTTG
SEQ ID NO: 36	P72M11	CTGAATACTTTAAACCTATAAATCAATGGGGATCTTTTGAAATTAGACAATATTTAAC
SEQ ID NO: 37	P72M12	GTTAAATATTGTCTAATTTCAAAAGATCCCCATTGATTTATAGGTTTAAAGTATTCAG
SEQ ID NO: 38	P72M13	CTATTCTGTAGATTCTCCTTGGTCACGTGCATTTTTTAAAAAAG
SEQ ID NO: 39	P72M14	CTTTTTTAAAAAATGCACGTGACCAAGGAGAATCTACAGAATAG
SEQ ID NO: 40	P72M15	GAAAACAAAAAGCTTCAGAATGGACAACAAGAGAAGATGTTTATG
SEQ ID NO: 41	P72M16	CATAAACATCTTCTCTTGTTGTCCATTCTGAAGCTTTTTGTTTTC

마이코플라즈마 하이오라이니스의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, DNA 단편을 프라이머 쌍 P72F/P72M2, P72M1/P72M4, P72M3/P72M6, P72M5/P72M8, P72M7/P72M10, P72M9/P72M12, P72M11/P72M14, P72M13/P72M16, 및 P72M15/P72R을 각각 사용하여 증폭시켰다. 50μL의 PCR의 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 버퍼 B, 200μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP), 증폭용 1μM 프라이머, 200ng의 마이코플라즈마 하이오라이니스의 게놈 DNA 및 1U GDP-HiFi DNA 폴리머라제를 함유하였다. PCR의 반응 조건은 5분 동안 96℃(1 단계); 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 30초 동안 68℃(35주기); 및 5분 동안 68℃(1 단계)이다.

PCR 완료 후, 아가로오스 겔 전기 영동을 수행하여 예측된 크기를 갖는 DNA 단편이 존재하는지 여부를 확인하였다. PCR 생성물은 Gel-M^TM 겔 추출 시스템 키트로 회수하였다. 유전자 증폭은 회수된 PCR 생성물을 주형으로 사용하고 P72F/P72R의 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다. PCR의 반응 조건은 2분 동안 96℃(1 단계); 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 1분 동안 68℃(35주기); 및 5분 동안 68℃(1 단계)이다. 마지막으로, 점 돌연변이를 갖는 P72 유전자를 상기 PCR에 의해 수득하였다. PCR 생성물을 PCR-M^TM 클린 업(Clean Up) 시스템 키트로 회수하였다. 서열 결정의 결과에 따르면, 본 발명의 P72 유전자는 SEQ ID NO: 6으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 가졌다.

(2) 마이코플라즈마 하이오라이니스 항원에 대한 발현 벡터의 제작

마이코플라즈마 하이오라이니스 항원에 대한 발현 벡터는 백본으로 다양한 융합 파트너 유전자를 함유하는 벡터를 사용하여 제작하였다. 융합 파트너 유전자는 각각 대장균의 DsbC, MsyB, FklB의 DNA 서열이었다. 상기 발현 벡터의 제작 일정은 다음과 같았다.

상기 실험에서 제조된 본 발명의 XylF 유전자, DnaK 유전자 및 P72 유전자를 각각 BamHI 및 SalI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 상기에서 얻은 DNA 단편을 각각 DsbC 유전자-융합 발현 벡터, MsyB 유전자-융합 발현 벡터 또는 동일한 제한 효소로 절단된 FklB 유전자-융합 발현 벡터에 결찰하였다. 그런 후에, 결찰된 생성물을 대장균 ECOS 9-5로 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 콜로니 PCR로 선택하였다. DNA 전기 영동을 수행하여 예측된 크기를 갖는 DNA 단편이 존재하는지를 확인하였다. 형질전환된 균주로부터의 재조합 벡터가 삽입된 DNA를 갖고 있는지를 확인한 후, 벡터를 형질전환된 균주로부터 추출하고 이의 DNA 서열을 결정하였다. 올바른 DNA 서열을 갖는 벡터를 각각 pET-DsbC-XylF(SEQ ID NO: 07), pET-MysB-DnaK(SEQ ID NO: 08) 및 pET-FklB-P72(SEQ ID NO: 09)로 명명하였다.

실시예 3 본 발명의 서브유닛 백신의 제조 및 응용

(1) 본 발명의 발현 벡터에 의한 재조합 항원의 발현

마이코플라즈마 하이오라이니스 항원을 발현하기 위한 벡터를 대장균 BL21 (DE3)으로 형질전환시켰다. 항원을 발현하는 균주의 단일 콜로니를 선별하여 카나마이신(최종 농도: 30㎍/mL)을 함유하는 12mL의 LB 배지에 접종하고 37℃에서 배양하고 180rpm의 조건하에 밤새 배양하였다. 그런 후에, 10mL의 대장균의 배양액을 취하여 카나마이신(최종 농도: 30㎍/mL)을 포함하는 1L의 LB 배지에 첨가하고 OD₆₀₀이 약 0.4-0.6을 얻을 때까지 진탕 배양하였다(37℃, 180rpm). 그런 후에, 0.1mM IPTG를 28℃에서 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 4시간 동안 유도 후, 배양 물을 원심 분리(10,000 x g, 10분, 4℃)하여 박테리아 세포를 수집하였다. 박테리아 세포를 10mL의 인산염 버퍼(20mM 인산 나트륨, 500mM NaCl, pH 7.4)에 재현탁하고 초음파 처리로 파쇄한 후, 현탁액을 원심 분리(30,966 x g, 30분)하여 상청액을 수집하였다. 마지막으로, 상청액을 0.22μM 공극 크기의 여과막으로 여과하고 여과액을 수집하였다. 단백질 전기 영동을 수행하여 재조합 항원의 발현 상태 및 용해도를 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1로부터, 본 발명의 재조합 항원은 대장균에서 잘 발현되었음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 항원은 우수한 용해도를 가지며, 이는 본 발명에 의해 선택된 융합 파트너가 적절함을 나타낸다.

이후, 재조합 항원 상의 His 태그와 니켈 이온 또는 코발트 이온 사이의 공유 결합을 통한 단백질 정제에 고정-금속 이온 친화성 크로마토그래피를 사용하였다. 재조합 항원은 5 mL HiTrap^TM Ni 엑셀 칼럼(GE Healthcare, Sweden)이 장착된 AKTA 프라임 플러스(GE Healthcare, Sweden)로 정제하였다. 먼저, 컬럼을 25mL의 인산 버퍼 용액으로 평형시킨 후 상청액을 HiTrap^TM Ni 엑셀 컬럼에 주입하였다. 샘플의 주입을 완료한 후, 30mM 이미다졸(20mM 인산 나트륨, 500mM NaCl, 30mM 이미 다졸, pH 7.4)을 함유하는 100mL의 세척 버퍼 용액을 사용하여 컬럼을 세척하여서 그 위에 부착된 비특이적 단백질이 제거될 수 있다. 마지막으로, 250mM 이미다졸(20mM 인산 나트륨, 500mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 7.4)을 함유하는 150mL의 용출 버퍼 용액을 사용하여 수지로부터 재조합 항원을 씻어 내었고, 고농도의 이미 다졸은 재조합 항원과 수지 상의 결합 부위와 경쟁하여 재조합 항원을 씻어 낸다. 정제된 항원 용액을 Amicon^TM ultra-15 ultracel-30K 원심 분리 튜브(Merck Millipore, USA)에 넣고 4℃ 이하에서 원심 분리(2,600 x g)하고, 적당한 부피로 조절한 후 후속 단계에서 사용하기 위해 4℃에서 보관하였다. 정제 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2로부터, 본 실험에서 얻은 본 발명의 재조합 항원은 높은 순도를 가짐을 알 수 있다.

(2) 본 발명의 서브유닛 백신의 제조 및 이의 방어 면역 반응의 테스트

다음 단락의 표에 제시된 조건하에서, 상기 실험에서 제조된 본 발명의 재조합 항원을 항원보강제(알루미나 겔)와 각각 잘 혼합하여, 단일 항원을 함유하는 다양한 서브유닛 백신 및 여러 항원을 포함하는 칵테일 백신을 제조하였다. 백신의 투여량은 2mL/dose이고 백신에 함유된 각 재조합 항원의 함량은 200μg이었다.

단일 항원 백신의 방어 면역 반응 측정을 위한 실험 1

이 실험은 동물 건강 연구소의 동물 의약품 검사 부서의 유전자 조작 유기체 (GMOs)를 위한 우리에서 수행하였다. 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대항하는 항체에 대해 음성인 3주령 돼지 12마리를 A 그룹 내지 D 그룹으로 무작위로 분리하였다. 각 그룹에 3마리 돼지가 있었고, A 그룹 내지 C 그룹은 실험 그룹이었고 D 그룹은 대조 그룹이었다. 그룹 A 내지 그룹 C의 돼지를 3주령 및 5주령에서 각각 1회, 근육내 주사(2mL/dose)를 통해 본 실험의 백신으로 면역화시켰다. D 그룹의 돼지는 면역화 하지 않았다. 백신의 구성 요소는 표 4에 나타낸 바와 같았다.

그룹	백신	구성 요소/투여량
		XylF (μg)	DnaK (μg)	P72 (μg)
A 그룹	V-001	200	-	-
B 그룹	V-002	-	200	-
C 그룹	V-003	-	-	200
D 그룹	-	-	-	-

돼지가 7주령(즉, 면역화 2주 후)일 때, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 분리된 야생 균주 ATIT-2를 함유하는 배양 배지를 사용하여 복부 면역성 테스트를 수행하였다. 돼지가 10주령(면역성 테스트 3주 후)일 때, 해부학적 병리 검사를 수행하였다. 복막염, 흉막염, 심낭염 및 관절 부종과 같은 병리학적 변화의 백분율을 계산하였다. 보이는 병리학적 변화는 마그누순 등의 방법에 따라 채점하였다(Vet.Immunol. Immunopathol., 61 : 83-96, 1998).

실험 결과를 표 5에 나타내었다. XylF로부터 제조된 서브유닛 백신은 돼지 복막염 및 흉막염의 발병률을 감소시킬 수 있고, 면역화된 돼지의 병리학적 변화의 평균 점수는 면역화되지 않은 돼지(대조 그룹)의 것보다 낮았고, 이는 XylF가 현저한 방어 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. DnaK 및 P72로부터 제조된 서브유닛 백신은 각각 복막염 및 흉막염의 발병률을 감소시킬 수 있다.

표 5의 데이터는 XylF로부터 제조된 서브유닛 백신이 복막염 및 흉막염을 완화시키는데만 유리하며 단지 XylF로부터 제조된 서브유닛 백신이 실험 동안 다른 질환을 완화시키는데 덜 현저한 효과를 갖는 것으로 해석해서는 안 된다는 것을 유의할 가치가 있다. 동일한 이유로, 표 5의 데이터는 DnaK 및 P72로부터 제조된 서브유닛 백신이 각각 복막염 및 흉막염을 완화시키는데 유리하며 단지 DnaK 또는 P72로부터 제조된 서브유닛 백신이 실험 동안 다른 질환을 완화시키는데 있어서 덜 현저한 효과를 갖는 것으로 해석해서는 안 된다.

그룹	병리학적 변화의 점수
	복막염	흉막염	심낭염	관절 부종	총 점수	평균 점수
A	1	0	2	4	7	2.3
B	1	4	3	7	15	5
C	3	0	0	8	11	3.6
D	3	3	0	4	10	3.3

칵테일 백신의 방어 면역 반응 측정을 위한 실험 2

이 실험은 동물 건강 연구소의 동물 의약품 검사 부서의 유전자 조작 유기체 (GMOs)를 위한 우리에서 수행하였다. 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대항하는 항체에 대해 음성인 4주령 돼지 24마리를 선별하여 무작위로 면역화 그룹(그룹 E) 및 대조 그룹(그룹 F)으로 분리하였다. 각 그룹에 12마리 돼지가 있었다. 면역화 그룹의 돼지를 4주령 및 6주령에서 각각 1회, 근육내 주사(2mL/dose)를 통해 본 실험의 백신으로 면역화시켰다. 대조 그룹의 돼지는 면역화 하지 않았다. 백신의 구성 요소는 표 6에 나타낸 바와 같았다.

그룹	백신	구성 요소/투여량
		XylF (μg)	DnaK (μg)	P72 (μg)
E 그룹	V-004	200	200	200
F 그룹	-	-	-	-

실험의 결과를 표 7에 나타내었다. 본 발명의 칵테일 백신(이 실험에서 본 발명의 3개의 재조합 항원의 혼합물을 포함)은 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의해 유발된 복막염, 흉막염, 심낭염 및 관절 부종 등의 임상 증상을 현저히 완화시킬 수 있고 (표 5에 나타낸 바와 같이) 단일 항원을 함유하는 서브유닛 백신의 효과와 비교했을 때 더 나은 효과를 나타내었다.

그룹	병리학적 변화의 점수
	복막염	흉막염	심낭염	관절 부종	총 점수	평균 점수
E	8	10	8	9	35	2.9
F	18	16	12	23	69	5.8

<110> Agricultural Technology Research Institute <120> Composition for Preventing and Treating Mycoplasma hyorhinis Infection, and Method for Producing Said Composition <140> PCT/CN2016/094104 <141> 2016-08-09 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 447 <212> PRT <213> Mycoplasma hyorhinis <400> 1 Met Lys Lys Leu Ile Thr Lys Lys Phe Leu Tyr Leu Ser Thr Ile Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ser Phe Ile Ala Phe Ala Ser Phe Val Ala Cys Gly Thr Thr 20 25 30 Ala Thr Gly Leu Ser Gln Thr Lys Asp His Ala Val Thr Asn Glu Ser 35 40 45 Ile Arg Val Ala Leu Thr Asp Pro Asp Asn Pro Arg Trp Ile Asn Ala 50 55 60 Gln Lys Asp Ile Leu Asn Tyr Ile Asp Lys Thr Glu Gly Ala Ile Ser 65 70 75 80 Thr Ile Thr Lys Asp Gln Asn Ala Gln Asn Asn Trp Leu Thr Gln Gln 85 90 95 Ala Asn Leu Asn Pro Ala Pro Lys Gly Phe Ile Ile Ala Pro Glu Asn 100 105 110 Gly Gly Gly Val Gly Thr Ala Val Asn Ser Ile Ala Glu Lys Asn Ile 115 120 125 Pro Ile Val Ala Tyr Asp Arg Leu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Tyr Asp 130 135 140 Trp Tyr Val Ser Tyr Asp Asn Glu Lys Val Gly Glu Leu Gln Gly Leu 145 150 155 160 Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu Gly Lys Thr Asp Gly Ala Phe Lys Asp 165 170 175 Glu Thr Glu Met Leu Asn Tyr Leu Lys Asp His Met Pro Gln Glu Thr 180 185 190 Val Ser Phe Tyr Ala Val Ala Gly Ser Gln Asp Asp Asn Asn Ser Gln 195 200 205 Tyr Phe Tyr Asn Gly Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Leu Met Glu Asn 210 215 220 Ser Asn Gly Lys Val Val Asp Leu Ser Pro Arg Gly Asn Ala Val Tyr 225 230 235 240 Val Pro Gly Trp Asn Tyr Gly Asp Ala Gly Gln Arg Ile Gln Gln Phe 245 250 255 Phe Thr Gln Tyr Arg Asp Ser Ser Val Pro Asn Gly Val Leu Pro Val 260 265 270 Thr Tyr Asp Asn Val Thr Ile Pro Lys Ser Val Leu Lys Gly Phe Leu 275 280 285 Ala Pro Asn Asp Gly Met Ala Glu Gln Ala Val Asp Lys Leu Lys Ala 290 295 300 Thr Asn Tyr Asp Val Gln Lys Val Phe Ile Thr Gly Gln Asp Tyr Asn 305 310 315 320 Asp Thr Ala Lys Lys Leu Ile Lys Asn Gly Glu Gln Asn Met Thr Ile 325 330 335 Tyr Lys Pro Asp Val Ile Leu Gly Lys Val Ala Val Glu Val Leu Lys 340 345 350 Thr Leu Ile Asn Lys Lys Lys Ala Asn Ala Thr Ala Thr Lys Glu Asp 355 360 365 Val Glu Asn Ala Leu Lys Asn Asn Glu Asn Thr Lys Asp Ile His Phe 370 375 380 Arg Tyr Asp Asp Thr Thr Tyr Lys Ala Gly Ser Val Gly Ala Tyr Lys 385 390 395 400 Asn Ile Lys Ala Ile Leu Val Asn Pro Val Val Val Thr Lys Gln Asn 405 410 415 Val Asp Asn Pro Leu Ala Asn Ala Gln Gln Ser Thr Ser Ala Asn Val 420 425 430 Ser Val Ser Ala Ser Gly Thr Val Pro Thr Asn Gly Val Thr Gln 435 440 445 <210> 2 <211> 597 <212> PRT <213> Mycoplasma hyorhinis <400> 2 Met Ala Lys Glu Ile Ile Leu Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser 1 5 10 15 Val Val Ser Ile Ile Glu Asn Gly Lys Pro Val Val Leu Glu Asn Pro 20 25 30 Asn Gly Lys Asn Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Lys Asn Gly Glu 35 40 45 Glu Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Leu Glu Thr Asn Pro Asp 50 55 60 Ala Ile Ala Ser Ile Lys Arg Leu Met Gly Thr Asp Lys Thr Val Lys 65 70 75 80 Ala Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Pro Glu Glu Ile Ser Ala Lys Ile Leu 85 90 95 Ser Tyr Leu Lys Gln Tyr Ala Glu Lys Lys Ile Gly Asn Lys Val Ser 100 105 110 Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asn Ala Gln Arg Glu 115 120 125 Ala Thr Lys Asn Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile 130 135 140 Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Phe Gly Leu Glu Lys Thr 145 150 155 160 Glu Lys Glu Met Lys Val Leu Val Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe 165 170 175 Asp Val Ser Val Leu Glu Leu Ser Gly Gly Thr Phe Glu Val Leu Ser 180 185 190 Thr Ser Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Cys Asp His Val Ile 195 200 205 Val Asp Trp Leu Val Asp Lys Ile Lys Lys Glu Tyr Glu Phe Asp Pro 210 215 220 Ser Lys Asp Lys Met Ala Leu Ser Arg Leu Lys Glu Glu Ala Glu Lys 225 230 235 240 Thr Lys Ile Ser Leu Ser Asn Gln Ser Val Ala Thr Ile Ser Leu Pro 245 250 255 Phe Leu Gly Ile Gly Pro Lys Gly Pro Ile Asn Val Glu Leu Glu Leu 260 265 270 Lys Arg Ser Glu Phe Glu Lys Met Thr Ala His Leu Val Asp Lys Thr 275 280 285 Arg Lys Pro Ile Met Asp Ala Leu Lys Glu Ala Lys Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Asp Leu Asp Glu Val Leu Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala 305 310 315 320 Val Gln Thr Met Ile Glu His Thr Leu Gly Lys Lys Pro Asn Arg Ser 325 330 335 Ile Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Ile Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly 340 345 350 Val Leu Ala Gly Glu Ile Asn Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro 355 360 365 Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Leu Gly Gly Ile Ala Thr Pro Leu Ile 370 375 380 Pro Arg Asn Thr Thr Ile Pro Val Thr Lys Ser Gln Ile Phe Ser Thr 385 390 395 400 Ala Glu Asn Asn Gln Thr Glu Val Thr Ile Ser Val Val Gln Gly Glu 405 410 415 Arg Gln Leu Ala Ala Asp Asn Lys Leu Leu Gly Arg Phe Asn Leu Ser 420 425 430 Gly Ile Glu Gln Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Ser Phe 435 440 445 Ser Ile Asp Val Asn Gly Ile Thr Thr Val Ser Ala Lys Asp Lys Lys 450 455 460 Thr Asn Lys Glu Gln Thr Ile Thr Ile Lys Asn Thr Thr Ser Leu Ser 465 470 475 480 Glu Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Lys Glu Ala Glu Glu Asn Arg Glu 485 490 495 Ala Asp Ala Lys Lys Lys Glu Lys Ile Glu Val Thr Val Arg Ala Glu 500 505 510 Ala Leu Ile Asn Gln Leu Glu Lys Ser Leu Glu Asp Gln Gly Asp Lys 515 520 525 Val Asp Ala Lys Gln Lys Glu Thr Leu Glu Lys Gln Ile Gln Glu Leu 530 535 540 Lys Asp Leu Val Lys Glu Glu Lys Ile Glu Glu Leu Lys Thr Lys Leu 545 550 555 560 Asp Gln Ile Glu Gln Ala Ala Gln Ala Phe Ala Gln Ala Ala Ala Gln 565 570 575 Gln Ala Asn Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asp Asp Gln Pro Ile Glu Ala 580 585 590 Glu Val Lys Glu Asn 595 <210> 3 <211> 511 <212> PRT <213> Mycoplasma hyorhinis <400> 3 Met Asn Lys Lys His Ile Lys Thr Leu Ile Ser Ser Val Ser Ile Leu 1 5 10 15 Thr Pro Val Ala Ile Leu Ala Ser Cys Gly Gln Pro Thr Thr Ile Lys 20 25 30 Phe Ala Thr Ser Gln Gly Ser Tyr Trp Pro Met Met Leu Gly Met Lys 35 40 45 Glu Ile Ile Lys Ile Tyr Asn Glu Gln His Lys Asn Asp Ala Asp Phe 50 55 60 Ile Pro Val Glu Leu Leu Thr Ser Asp Val Thr His Lys Asn Ser Glu 65 70 75 80 Gly Gln Leu Leu Ser Ser Leu Asp Ser Asp Leu Ser Thr Lys Gln Ser 85 90 95 Ser Asp Trp Asn Leu Ile Leu Gly Asn Lys Ala Thr Ala Tyr Val Ala 100 105 110 Asn Ser Tyr Asp Lys Leu Leu Asp Val Gly Thr Ser Thr Val Asn Pro 115 120 125 Asn Ser Phe Pro Thr Lys Ile Ile Asn Asn Tyr Asn Lys Leu Leu Gly 130 135 140 Val Glu Gly Gln Thr Thr Leu Lys Ser Leu Pro Tyr Asn Ile Asn Asp 145 150 155 160 Thr Asp Gly Ile Val Phe Asn Leu Asp Ile Met Lys Val Leu Phe Asp 165 170 175 Ile Ile Lys Gln Gly Gly Gly Thr Ile Asp Glu Asn Ser Ile Ile Ala 180 185 190 Lys Lys Val Lys Glu Ala Glu Gly Lys Gly Asn His Ile Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Met Phe Ser Ala Ile Lys Ile Lys Glu Ser Ser Lys Asn Thr Gly 210 215 220 Phe Ser Gly Tyr Thr Val Asn Asp Ser Thr Phe Ser Asp Ile Lys Lys 225 230 235 240 Ala Phe Glu Phe Ala Gln Lys Ile Tyr Asp Asn Thr Glu Ile Asp Thr 245 250 255 Thr Lys Leu Ser Lys Asp Val Lys Asp Ser Glu Ile Phe Ala Ile Asp 260 265 270 Tyr Ala Ser Asp Val Phe Arg Lys Glu Ile Leu Ser Lys Thr Asn Lys 275 280 285 Thr Phe Trp Ser Glu Lys Ser Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Leu Asp 290 295 300 Val Asn Leu Asn Thr Asn Gln Ala Leu Lys Thr Glu Val Glu Asn Gln 305 310 315 320 Tyr Gln Glu Trp Glu Asn Thr Leu Lys Gln Thr Gln Phe Ile Pro Thr 325 330 335 Thr Thr Thr Gln Ala Asn Thr Glu Thr Thr Ser Trp Thr Lys Lys Asp 340 345 350 Ile Gln Thr Lys Ser Ala Thr Asp Asp Ser Gln Gln Ser Ile Asn Ser 355 360 365 Lys Thr Phe Tyr Ser Val Lys Phe Thr Glu Tyr Phe Lys Pro Ile Asn 370 375 380 Gln Trp Gly Ser Phe Glu Ile Arg Gln Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Tyr 385 390 395 400 Ala Pro Leu Val Gly Thr Asn Tyr Ser Val Asp Ser Pro Trp Ser Arg 405 410 415 Ala Phe Phe Lys Lys Asp Leu Glu Glu Gly Lys Gln Lys Ala Ser Glu 420 425 430 Trp Thr Thr Arg Glu Asp Val Tyr Ala Thr Asn Gln Ala Met Lys Ala 435 440 445 Asp Asp Asn Ala Gln Tyr Leu Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Phe Ser Leu 450 455 460 Ile Ala Ile Lys Ser Asn Ser Asp Ile Ile Asn Lys Asn Ile Ile Lys 465 470 475 480 Phe Val Asp Phe Leu Tyr Asn Gly Thr Gly Leu Thr Asp Leu Thr Gly 485 490 495 Ala Lys Ile Ser Ala Ala Asp Phe Met Ala Glu Lys Ser Ala Ala 500 505 510 <210> 4 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen <400> 4 atgaaaaagt taattactaa aaaattttta tatttatcaa caatttcaac agcttcattt 60 atagcttttg cttcatttgt agcttgtgga acaacagcaa caggtttatc acaaacaaaa 120 gatcatgctg ttactaatga atccattaga gttgcattaa cagatccaga taatccaaga 180 tggattaatg cacaaaaaga tatattaaat tatatagaca aaacagaagg tgcaatttct 240 actattacta aagaccaaaa tgcacaaaac aactggttaa ctcaacaagc aaacttaaat 300 ccagcaccta aaggatttat tattgctcct gaaaatggag gaggagttgg aaccgctgtt 360 aattcaatag ctgaaaaaaa tattcctatc gttgcttatg atagattaat tactggttca 420 acttcatatg attggtatgt ttcttacgat aatgaaaaag tgggtgaact acaaggtctt 480 tcattagcag ctggattatt aggaaaaact gatggtgcat ttaaagatga aactgaaatg 540 ttaaactatc taaaagatca catgccacaa gaaactgttt cattttatgc agtagctgga 600 tcacaagatg acaacaattc tcaatacttt tacaacggag caatgaaaat tttaaaaaaa 660 ttaatggaaa actccaatgg taaagtagta gatttgtctc caagaggtaa tgcagtttat 720 gttccaggat ggaattacgg agacgctgga caaagaattc aacaattctt cacacaatat 780 cgtgattcat cagtgccaaa tggagtatta ccagttacat atgataatgt aactatccct 840 aaatctgttt taaaaggatt tttagcacca aatgatggaa tggcagaaca agcagtagac 900 aaactaaaag 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cagttattac tgttccagct 360 tacttcaata atgcacaaag agaagcaaca aaaaatgcag gaaaaattgc tggcttagaa 420 gtagaaagaa ttattaatga accaactgca gctgctttag cttttggact agaaaaaact 480 gaaaaagaaa tgaaagtatt agtttacgac ttaggtggag gaacatttga cgtttctgta 540 ttagaacttt caggtggaac tttcgaagtt ttatcaacta gtggagataa caaattagga 600 ggagatgact gtgatcatgt tattgttgat tggttagttg acaaaattaa aaaagaatat 660 gaatttgatc cttctaaaga caaaatggct ttatctcgtt taaaagaaga agcagaaaaa 720 acaaaaattt ctttatccaa ccaatcagtt gctacaattt cattaccatt tttgggtatt 780 ggaccaaaag gacctattaa tgttgagtta gaactaaaaa gatcagaatt tgaaaaaatg 840 acagctcatt tagtagataa aacaagaaaa ccaattatgg atgctttaaa agaagcaaaa 900 ttagaagcaa aagatttaga tgaagtttta ttagttggtg gatcaacaag aattcctgct 960 gttcaaacaa tgattgagca cacattaggt aaaaaaccaa atagatccat taatccagat 1020 gaagttgttg ctattggagc tgcaattcaa ggtggtgttt tagctggaga aattaatgat 1080 gttttattac ttgacgttac acctttaact ttaggtattg aaacattagg tggaattgct 1140 actccattaa ttccaagaaa cacaacaatt cctgttacta aatcacaaat tttctcaact 1200 gctgaaaata accaaacaga agttacaatt tcagttgttc aaggagaaag acaattagct 1260 gctgataata aattattagg tagatttaat ctctcaggaa ttgaacaagc acctagagga 1320 gttcctcaaa ttgaagttag tttctcaatt gatgttaacg gaataacaac tgtatcagca 1380 aaagataaaa aaacaaacaa agaacaaact attactatta aaaatacaac cagcttatct 1440 gaagaagaaa ttgaaagaat ggtaaaagaa gctgaagaaa atcgtgaagc agatgctaag 1500 aaaaaagaaa aaattgaagt aacagttaga gctgaagctt taattaatca attagaaaaa 1560 tctctagaag accaaggtga taaagtagat gctaaacaaa aagaaacttt agaaaaacaa 1620 attcaagaat taaaagactt ggtaaaagaa gaaaaaattg aagaattaaa aacaaaatta 1680 gaccaaattg aacaagctgc acaagctttt gctcaagctg cagcacaaca agcaaatact 1740 tctgatactt cttcagatga tcaaccaatt gaagctgaag ttaaagaaaa ttaa 1794 <210> 6 <211> 1536 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen <400> 6 atgaataaaa aacatataaa aacacttatt tcaagtgtaa gtattttaac tcctgttgcc 60 attttagctt cttgtggaca accaaccaca attaaatttg ctacttctca aggttcatat 120 tggccaatga tgctaggaat gaaagaaatt attaagattt ataatgaaca acacaaaaac 180 gatgctgatt tcattcctgt tgaactttta acatcagatg taactcataa aaatagtgaa 240 ggtcaacttt taagtagttt agatagtgat ttatctacta agcaaagctc tgattggaat 300 cttattttag gaaacaaagc tactgcttat gttgcaaatt cttatgataa attattagac 360 gttggtactt ctacagtaaa tcccaattca ttccctacaa aaataattaa taattacaat 420 aaattattag gtgttgaagg acaaacaaca ttaaaaagtt taccttacaa catcaacgat 480 acagatggta ttgtttttaa tttagacatc atgaaagttc tttttgatat cataaaacaa 540 ggtggcggaa ctattgatga aaactcaata attgctaaaa aagtaaaaga agcagaagga 600 aaaggtaatc atattccatc aagttcaatg ttttctgcaa ttaaaattaa agagtcttca 660 aaaaacactg gattttctgg atatacagta aatgattcta cttttagtga tattaaaaaa 720 gcttttgagt ttgctcaaaa aatttatgat aacacagaaa ttgatacgac caaattatca 780 aaagatgtaa aagattcaga gatttttgca atagattatg cttcagatgt ttttagaaaa 840 gaaattcttt ctaaaactaa taaaactttt tggagtgaaa aaagtttaca aaataacaaa 900 attacattag atgtaaatct caatacaaat caagctctaa aaacagaagt tgaaaaccaa 960 tatcaagaat gggaaaacac tttaaaacaa acacaattta taccaactac aacaactcaa 1020 gcaaatactg aaactacttc atggacaaaa aaagatattc aaactaaatc agcaactgat 1080 gatagtcaac aatccattaa ttctaaaaca ttttattctg ttaaatttac tgaatacttt 1140 aaacctataa atcaatgggg atcttttgaa attagacaat atttaactgc atttacttat 1200 gctcctctag taggaacaaa ctattctgta gattctcctt ggtcacgtgc attttttaaa 1260 aaagatttag aagaaggaaa acaaaaagct tcagaatgga caacaagaga agatgtttat 1320 gctacaaatc aagcaatgaa agcagatgat aatgcacaat atttagcata taacgctggt 1380 ggtttttctt taattgctat caaatccaac agtgatataa taaataaaaa tatcattaaa 1440 tttgtagact ttttatacaa tggaacagga ctaacagatt taactggtgc taaaatttca 1500 gctgctgatt ttatggccga aaaatctgca gcttaa 1536 <210> 7 <211> 7245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector <400> 7 atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60 ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120 tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180 cgacttgtgt tacaccatta gttggtactg tacctgatgc agaaacagaa acatttgcac 240 ttgtagattg ttgtgcatta gctaatgggt tatctacatt ttgtttagtt actacaactg 300 gattaactaa aattgcttta atgtttttgt aagcacctac tgaaccagct ttatatgttg 360 tatcatcata tctaaagtga atatcttttg tattttcgtt gttttttaaa gcattttcaa 420 catcttcttt agttgctgtt gcatttgctt tctttttgtt tattaatgtt tttaatactt 480 ctacagctac tttacctaaa attacatctg gtttgtagat ggtcatattt tgttcaccat 540 ttttaataag tttttttgct gtatcattgt agtcttgacc agtaatgaaa actttttgta 600 catcataatt agtagctttt agtttgtcta ctgcttgttc tgccattcca tcatttggtg 660 ctaaaaatcc ttttaaaaca gatttaggga tagttacatt atcatatgta actggtaata 720 ctccatttgg cactgatgaa tcacgatatt gtgtgaagaa ttgttgaatt ctttgtccag 780 cgtctccgta attccatcct ggaacataaa ctgcattacc tcttggagac aaatctacta 840 ctttaccatt ggagttttcc attaattttt ttaaaatttt cattgctccg ttgtaaaagt 900 attgagaatt gttgtcatct tgtgatccag ctactgcata aaatgaaaca gtttcttgtg 960 gcatgtgatc ttttagatag tttaacattt cagtttcatc tttaaatgca ccatcagttt 1020 ttcctaataa tccagctgct aatgaaagac cttgtagttc acccactttt tcattatcgt 1080 aagaaacata ccaatcatat gaagttgaac cagtaattaa tctatcataa gcaacgatag 1140 gaatattttt ttcagctatt gaattaacag cggttccaac tcctcctcca ttttcaggag 1200 caataataaa tcctttaggt gctggattta agtttgcttg ttgagttaac cagttgtttt 1260 gtgcattttg gtctttagta atagtagaaa ttgcaccttc tgttttgtct atataattta 1320 atatatcttt ttgtgcatta atccatcttg gattatctgg atctgttaat gcaactctaa 1380 tggattcatt agtaacagca tgatcttttg tttgtgataa acctgttgct gttgttccac 1440 aagctacaaa tgaggatcct ttaccgctgg tcattttttg gtgttcgtcg aggaattctt 1500 tcatctcttt cggcggctgg taacccggaa caagtgtgcc attgctcagc acaactgccg 1560 gagtaccgct aacgccaagc tggacgccaa gtgcgtaatg gtcggcaata tccacgtcgc 1620 aactggctgg tgcgacgctt ttacctgcca tcacatcatc aaacgctttg tttttatctt 1680 tcgcacacca gatagctttc atttctttct ctgcatcgct gtccagcccc tggcgcggga 1740 aagcaagata acgcacggtg atccccagcg cgttgtagtc tgccatttgc tcatgcagtt 1800 tgtggcagta accacaggta atatcagtaa acacggtgat gacgtgtttt tcctgcggcg 1860 ctttataaac gatcatctct ttttcaagcg cattcaactg ctttaacagc atcttattgg 1920 tgacattgac cggagccgtg ccactaacgt 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1380 ctaataattt atcataagaa tttgcaacat aagcagtagc tttgtttcct aaaataagat 1440 tccaatcaga gctttgctta gtagataaat cactatctaa actacttaaa agttgacctt 1500 cactattttt atgagttaca tctgatgtta aaagttcaac aggaatgaaa tcagcatcgt 1560 ttttgtgttg ttcattataa atcttaataa tttctttcat tcctagcatc attggccaat 1620 atgaaccttg agaagtagca aatttaattg tggttggttg tccacaagag gatccgagga 1680 tttccagcag ttcgacttca aacaccaggg tgctgaacgg agggatggat gcgcctgcgc 1740 cgcgctcgcc atatgccagt tcctgcggga tagtcagttc ccatttagaa cctaccggca 1800 tcagagtcag tgcttcaatc cagccaggga tcacgccatt aaccgggaat tcagcgggtt 1860 caccacgagc aacggagctg tcaaacacgg tgccgtcgat cagtttaccg gtgtaatgaa 1920 cacgaacgcg gtcggtacgt gccggaattg cgccttcacc ctggttgatc acgcggaatt 1980 gcaggccaga ttcggtgcta ttcacacctt cttttttggc gttttcttcc aggtatttca 2040 caccttcagc agccatcgcc tggaaacgct gacgacgaac ggcatcggcg cgctcgtgga 2100 tttcacgcag cgcgcgatgc accacatcaa ccggaacagc cggatgtttg ccttccagcg 2160 catcggcaat acctgcaacc agtgcttctg gcagcagccc ttccaggcca gattcactca 2220 gttgttgccc tacctgcaaa ccaatgccgt agcttgcttg cgcttcgatg gtgtcaaaag 2280 ttggggtggt catggtaccc agatctgggc tgtccatgtg ctggcgttcg aatttagcag 2340 cagcggtttc tttcatatgt atatctcctt cttaaagtta aacaaaatta tttctagagg 2400 ggaattgtta tccgctcaca attcccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag 2460 atcgatctcg atcctctacg ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc 2520 ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg 2580 gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt 2640 gggcgccatc tccttgcatg caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct 2700 actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc gcataaggga gagcgtcgag atcccggaca 2760 ccatcgaatg gcgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat 2820 tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct 2880 cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg 2940 aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac 3000 tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc 3060 cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg 3120 tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg 3180 cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg 3240 tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca 3300 tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg 3360 cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc 3420 tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac 3480 gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg 3540 gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg 3600 ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggacatctc ggtagtggga tacgacgata 3660 ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc 3720 tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca 3780 atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa 3840 ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 3900 tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccg 3960 ggatctcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg 4020 ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag 4080 gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg 4140 atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact 4200 ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat ggcggcccca 4260 cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt 4320 actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa 4380 acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg 4440 gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc 4500 tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg 4560 atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt 4620 aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt 4680 atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa 4740 aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa 4800 ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct 4860 gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 4920 atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 4980 cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 5040 agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 5100 tgcaccatat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 5160 gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 5220 ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 5280 aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 5340 ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 5400 gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 5460 cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 5520 gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 5580 tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5640 cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5700 cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5760 gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5820 agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 5880 cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 5940 tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 6000 tttggtcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga 6060 gccatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg 6120 atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc 6180 gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 6240 ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 6300 cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 6360 ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg 6420 atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta 6480 acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg 6540 atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 6600 tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 6660 ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 6720 tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 6780 cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 6840 agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagaattaat tcatgagcgg atacatattt 6900 gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 6960 cctgaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 7020 tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 7080 gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 7140 tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 7200 ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg 7260 agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 7320 aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc 7380 accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc a 7431 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gatataggat cctcatttgt agcttgtgga acaacag 37 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 caatatgtcg acttgtgtta caccattagt tggtactgta cc 42 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gatccagata atccaagatg gattaatgca caaaaagata 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tatctttttg tgcattaatc catcttggat tatctggatc 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caaaatgcac aaaacaactg gttaactcaa caagcaaact 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 agtttgcttg ttgagttaac cagttgtttt gtgcattttg 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ggttcaactt catatgattg gtatgtttct tacgataatg 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cattatcgta agaaacatac caatcatatg aagttgaacc 40 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttatgttcca ggatggaatt acggagacgc tg 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cagcgtctcc gtaattccat cctggaacat aa 32 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gatataggat ccatggcaaa agaaattatt ttaggaatag atttag 46 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 caatatgtcg acttaatttt ctttaacttc agcttcaatt ggttg 45 <210> 22 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gatgactgtg atcatgttat tgttgattgg ttagttgaca aaattaaaaa agaatatg 58 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 catattcttt tttaattttg tcaactaacc aatcaacaat aacatgatca cagtcatc 58 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 caatatggat cctcttgtgg acaaccaacc acaattaaat ttg 43 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gtataagtcg acttagtgat ggtgatggtg atgagctgca gatttttcgg ccataaaatc 60 60 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cttctcaagg ttcatattgg ccaatgatgc taggaatg 38 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cattcctagc atcattggcc aatatgaacc ttgagaag 38 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 actaagcaaa gctctgattg gaatcttatt ttaggaaaca 40 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tgtttcctaa aataagattc caatcagagc tttgcttagt 40 <210> 30 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ctttctaaaa ctaataaaac tttttggagt gaaaaaagtt tacaaaataa caa 53 <210> 31 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ttgttatttt gtaaactttt ttcactccaa aaagttttat tagttttaga aag 53 <210> 32 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gttgaaaacc aatatcaaga atgggaaaac actttaaaac aaacac 46 <210> 33 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gtgtttgttt taaagtgttt tcccattctt gatattggtt ttcaac 46 <210> 34 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 caagcaaata ctgaaactac ttcatggaca aaaaaagata ttcaaactaa atc 53 <210> 35 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gatttagttt gaatatcttt ttttgtccat gaagtagttt cagtatttgc ttg 53 <210> 36 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ctgaatactt taaacctata aatcaatggg gatcttttga aattagacaa tatttaac 58 <210> 37 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gttaaatatt gtctaatttc aaaagatccc cattgattta taggtttaaa gtattcag 58 <210> 38 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ctattctgta gattctcctt ggtcacgtgc attttttaaa aaag 44 <210> 39 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 cttttttaaa aaatgcacgt gaccaaggag aatctacaga atag 44 <210> 40 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gaaaacaaaa agcttcagaa tggacaacaa gagaagatgt ttatg 45 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cataaacatc ttctcttgtt gtccattctg aagctttttg ttttc 45

Claims (17)

1. 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 조성물로서,
   XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합을 포함하는 활성 성분; 및
   항원보강제를 포함하며,
   상기 XylF는 SEQ ID NO: 01을 포함하고, 상기 DnaK는 SEQ ID NO: 02를 포함하고, 상기 P72는 SEQ ID NO: 03을 포함하고;
   상기 질환은 복막염, 흉막염, 심낭염 및 관절 부종으로부터 선택되는 적어도 하나인 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis) 감염에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 활성 성분은 XylF, DnaK 및 P72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개를 포함하는 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 활성 성분은 XylF, DnaK 및 P72의 조합을 포함하는 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 활성 성분은 상기 조성물의 총 부피를 기준으로 하여 50 내지 300㎍/mL의 농도를 갖는 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 항원보강제는 완전한 프로인트 항원보강제, 불완전 프로인트 항원보강제, 알루미나 겔, 계면활성제, 음이온성 폴리머, 펩타이드, 유성 에멀젼, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 질환은 상기 활성 성분이 XylF인 경우 복막염, 흉막염 또는 이들의 조합인 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 질환은 상기 활성 성분이 DnaK인 경우 복막염인 조성물.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 질환은 상기 활성 성분이 P72인 경우 흉막염인 조성물.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 질환은 상기 활성 성분이 XylF, DnaK 및 P72의 조합인 경우 복막염, 흉막염, 심낭염 및 관절 부종인 조성물.
10. 원핵 생물 발현 시스템에서 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물의 활성 성분의 생산을 위한 발현 벡터로서,
    프로모터 및 리보솜 결합 부위를 포함하는 발현 요소;
    상기 XylF, 상기 DnaK, 상기 P72 또는 이들의 조합을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    융합 파트너를 암호화하는 서열을 포함하며,
    상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 또는 SEQ ID NO: 06 또는 이들의 조합을 포함하는 원핵 생물 발현 시스템에서 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물의 활성 성분의 생산을 위한 발현 벡터.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 융합 파트너는 대장균의 DsbC, 대장균의 MsyB, 대장균의 FklB 또는 이들의 조합인 발현 벡터.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 융합 파트너는 상기 뉴클레오타이드 서열이 XylF를 암호화하는 경우 대장균의 DsbC이고;
    상기 융합 파트너는 상기 뉴클레오타이드 서열이 DnaK를 암호화하는 경우 대장균의 MsyB이고; 또는
    상기 융합 파트너는 상기 뉴클레오타이드 서열이 P72를 암호화하는 경우 대장균의 FklB인 발현 벡터.
13. 제 10 항에 있어서,
    히스티딘-태그, 글루타티온 S-트랜스페라제 또는 이들의 조합을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
14. 제 10 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08 또는 SEQ ID NO: 09로 나타내어진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터.
15. 제 10 항에 있어서,
    상기 원핵 생물 발현 시스템은 대장균 발현 시스템인 발현 벡터.
16. 가용성 단백질의 생산 방법으로서, 상기 단백질은 XylF, DnaK, P72 또는 이들의 조합이며; 상기 방법은
    원핵 생물 발현 시스템을 제공하는 단계; 및
    상기 원핵 생물 발현 시스템에서 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 발현 벡터의 상기 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 가용성 단백질의 생산 방법.
17. 제 16 항에 있어서,
    상기 단계(2)에서 수득된 생성물을 니켈 이온 친화성 컬럼 또는 글루타티온 친화성 칼럼을 통과시켜 상기 가용성 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

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