RU2788349C2 - Одновременное редактирование генов и индукция гаплоидов - Google Patents

Одновременное редактирование генов и индукция гаплоидов Download PDF

Info

Publication number
RU2788349C2
RU2788349C2 RU2019119844A RU2019119844A RU2788349C2 RU 2788349 C2 RU2788349 C2 RU 2788349C2 RU 2019119844 A RU2019119844 A RU 2019119844A RU 2019119844 A RU2019119844 A RU 2019119844A RU 2788349 C2 RU2788349 C2 RU 2788349C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
plant
haploid
editing
maize
sequence
Prior art date
Application number
RU2019119844A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019119844A (ru
RU2019119844A3 (ru
Inventor
Тимоти КЕЛЛИХЕР
Цюдэн ЦЮЭ
Original Assignee
Зингента Партисипейшнс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Зингента Партисипейшнс Аг filed Critical Зингента Партисипейшнс Аг
Priority claimed from PCT/US2017/064512 external-priority patent/WO2018102816A1/en
Publication of RU2019119844A publication Critical patent/RU2019119844A/ru
Publication of RU2019119844A3 publication Critical patent/RU2019119844A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2788349C2 publication Critical patent/RU2788349C2/ru

Links

Images

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу редактирования геномной ДНК растения. Изобретение позволяет эффективно трансформировать линии гаплоидов с тем, чтобы она кодировала клеточный механизм, способный редактировать гены. 17 з.п. ф-лы, 11 табл., 24 ил., 11 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к сельскохозяйственной биотехнологии и редактированию генов, а также к селекции растений. Раскрытый в данном документе объект изобретения относится к применению индуцирующей гаплоиды линии (или существующей, или созданной) и трансформации индуцирующей гаплоиды линии с тем, чтобы она содержала ДНК, кодирующую клеточный механизм, способный к редактированию генов.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка сопровождается перечнем последовательностей под названием 81189_ST25.txt, созданным 4 декабря 2017 г., размером примерно 334 килобайта. Этот перечень последовательностей включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Этот перечень последовательностей подается вместе с настоящей заявкой посредством EFS-Web и соответствует
Figure 00000001
1.824(а)(2)-(6) и (b) разделу 37 C.F.R.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целенаправленный мутагенез (также известный как "редактирование генов") является очень важной технологией для селекции сельскохозяйственных культур. В настоящее время существует множество способов редактирования конкретных генов-мишеней, в том числе CRISPR, TALEN, мегануклеазы и "цинковые пальцы". Одним из способов введения редактирующего механизма в растения является использование Agrobacterium или биолистической трансформации растительной ткани. При трансформации ДНК, кодирующую редактирующий механизм (например, CAS9 и направляющую РНК), вводят в каллюс растения, семя или эмбриональную ткань. Затем стабильно трансформированные растения ("трансгенные объекты") регенерируют, в ряде случаев с помощью селектируемого маркера. Но поскольку тканевая культура является генотип-зависимой, то этот способ не будет функционировать со всеми сельскохозяйственными культурами или даже со всеми сортами сельскохозяйственных культур, с которыми он работает. Они известны как неподдающиеся трансформации сельскохозяйственные культуры или сорта. Эти сельскохозяйственные культуры или сорта могут быть оценены за их эффективность, однако для биотехнологии проблема заключается в том, что они не могут быть трансформированы, а следовательно, не могут быть непосредственно отредактированы посредством трансформации. Для неподатливых сортов можно использовать один из двух альтернативных подходов для введения требуемых мутаций. Во-первых, можно внести изменения посредством интрогрессии признака. Этот способ дорогой, трудоемкий и времязатратный. Это также означает загрязненность конечного продукта из-за генетической связи, т.е. будет связанный блок, окружающий интрогрессированные изменения, содержащий гены и аллели из трансформируемой донорной линии. Эта связь может представлять проблему, если какой-либо из этих генов или аллелей влияет на эффективность неподдающейся трансформации линии (может также называться "элитной линией"). Во-вторых, можно временно ввести редактирующий механизм в растущее растение без тканевой культуры, как, например, погружение цветочных почек для трансформации Arabidopsis. Задача состоит в том, чтобы обеспечить внесение изменений в клетки, которые обеспечивают образование зародышевых линий, чтобы они передавались семенам потомков. Существует несколько общепринятых или рутинных способов проведения этого в сельскохозяйственных культурах.
В данном документе представлен новый способ временного введения редактирующего механизма во время индукции гаплоидов. Индукция гаплоидов ("HI") представляет собой класс явлений у растений, характеризующихся потерей одного родительского набора хромосом (хромосом от родительского растения, являющегося индуктором гаплоидов) из зародыша в какой-либо период времени в ходе или после оплодотворения, часто в ходе раннего развития зародыша. Индукция гаплоидов также известна под название гиногенез, если линия-индуктор используется в качестве мужской при скрещивании, или андрогенез, если линия-индуктор используется в качестве женской при скрещивании. Индукция гаплоидов наблюдалась у многих видов растений, таких как сорго, ячмень, пшеница, маис, Arabidopsis, и у многих других видов.
Как правило, в ходе индукции гаплоидов обе родительские линии, используемые в индуцирующем скрещивании, являются диплоидами, поэтому их гаметы (яйцеклетки и спермии) являются гаплоидами. Индукция гаплоидов часто является признаком средней или низкой проницаемости линии-индуктора, поэтому полученные в результате потомки, в зависимости от вида или ситуации, могут быть или диплоидным (если потеря генома не происходит), или гаплоидным (если потеря генома в действительности происходит). Если родительская линия, которую скрещивают с индуктором гаплоидов, не является диплоидной, а скорее тетраплоидной, гексаплоидной или другим растением с более высокой плоидностью, то термин "индукция гаплоидов" является в некоторой степени неверным, потому что полученное "гаплоидное" потомство будет иметь гаметическое число хромосом, а значит, в действительности они будут не гаплоидами, а диплоидами (если родительский набор тетраплоидный) или триплоидами (если родительский набор гексаплоидный) и т.д. Следовательно, используемые в данном документе "гаплоиды" обладают половиной количества хромосом из любого родительского набора; таким образом, гаплоиды диплоидных организмов (например, маиса) проявляют моноплоидию; гаплоиды тетраплоидных организмов (например, райграса) проявляют диплоидию; гаплоиды гексаплоидных организмов (например, пшеницы) проявляют триплоидию.
Индукция гаплоидов может происходить во время самоопыления или взаимного скрещивания двух линий в пределах одного и того же вида, или она может происходить во время широких скрещиваний, где ее можно рассматривать как барьер гибридизации, предотвращающий образование межвидовых гибридов. У маиса наиболее часто используемым способом индуцирования гаплоидов является использование линии мужских растений, являющейся внутривидовым индуктором гаплоидов, которая в основном вызывается перестройками, мутациями и/или рекомбинациями, вставками или делециями в участке хромосомы 1, в частности гена MATRILINEAL (MATL), также известного под названием NOT LIKE DAD1 (NLD1) и PHOSPHOLIPASE A1 (PLA1) (c заметным исключением индукции гаплоидов ig-типа, которая является результатом мутации в гене INDETERMINATE GAMETOPHYTEI на хромосоме 3). У пшеницы наиболее часто используемым способом индукции гаплоидов является широкое скрещивание с пыльцой маиса, независимо от родительского генотипа или происхождения, причем он работает практически с любой пшеницей, скрещенной почти с любой пыльцой маиса.
Линии маиса HI содержат локус количественного признака ("QTL") на хромосоме 1, отвечающей за по меньшей мере 66% вариации индукции гаплоидов. QTL вызывает индукцию гаплоидов на различных уровнях в том случае, если он интрогрессирован в различные окружения. Все линии-индукторы гаплоидов маиса, используемые в промышленном семеноводстве, являются производными основополагающей линии HI, известной как Stock6, и все имеют мутацию QTL хромосомы 1, являющейся индуктором гаплоидов.
У маиса гаплоидное семя или зародыши, в частности, получают путем скрещивания мужского растения, являющегося индуктором гаплоидов (т.е. "пыльца, являющаяся индуктором гаплоидов") и практически любого выбранного початка, при этом початок может быть из любой инбредной, гибридной или другой зародышевой плазмы. Гаплоиды образуются в том случае, если ДНК пыльцы, являющейся индуктором гаплоидов, не полностью передается и/или сохраняется на протяжении первых клеточных делений зародышей. Полученный в результате фенотип не является полностью пенетрантным, при этом некоторые семязачатки содержат гаплоидные зародыши, а другие содержат диплоидные зародыши, анеуплоидные зародыши, химерные зародыши или недоразвитые зародыши. Гаплоидные ядра имеют зародыши, которые содержат только ДНК материнского растения плюс нормальный триплоидный эндосперм. После индукции гаплоидов гаплоидные зародыши или семя, как правило, отделяют от диплоидных и анеуплоидных сибсов с использованием скрининга по фенотипическому или генетическому маркерам и выращивают или культивируют в гаплоидные растения. Эти растения затем превращают либо естественным путем, либо посредством химической манипуляции (например, с использованием средства, ингибирующего образование микротрубочек, такого как колхицин) в гаплоидные ("DH") растения с удвоенным числом хромосом, которые затем продуцируют инбредные семена.
Селекция растений облегчается посредством использования гаплоидных (DH) растений с удвоенным числом хромосом. Получение DH-растений позволяет селекционерам-растениеводам получать инбредные линии без инбридинга в нескольких поколениях, сокращая таким образом время, необходимое для получения гомозиготных растений. DH-растения обеспечивают бесценный инструмент для селекционеров-растениеводов, в частности для получения инбредных линий, картирования QTL, цитоплазматических превращений, интрогрессии признаков и скрининга F2 в отношении высокопроизводительного улучшения признаков. Экономится большое количество времени, поскольку гомозиготные линии, по сути, образуются в одном поколении, исключая необходимость в одном семени кукурузы для нескольких поколений (общепринятый инбридинг). В частности, поскольку DH-растения являются полностью гомозиготными, то они хорошо поддаются количественным генетическим исследованиям. Получение гаплоидных семян является критически важным для процесса селекции гаплоидов с удвоенным числом хромосом. Гаплоидное семя получают на зародышевой плазме генома материнского растения при оплодотворении пыльцой от гиногенетического индуктора, такого как Stock6 и Stock6-производные линии.
В данном документе авторы изобретения описывают новый способ, в котором процесс индукции гаплоидов in vivo можно использовать для временного введения редактирующего механизма в любую зародышевую плазму путем включения его в родительское растение, являющееся индуктором гаплоидов, или стабильно интегрированный в виде трансгена, или временно экспрессируемый. Одновременное редактирование и индукцию гаплоидов можно осуществлять практически с любой сельскохозяйственной культурой посредством широкого скрещивания или индукции гаплоидов de novo, например, с помощью мутации CENH3 (т.е. CENH3-модифицированный индуктор гаплоидов; см., например, WO 2017/004375, полностью включенный в данный документ посредством ссылки) или посредством липидного спрея (см. заявку согласно РСТ на выдачу патента США №PCT/US2016/62548, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Авторы данного изобретения демонстрируют примеры HI у маиса, как полевой кукурузы, так и сладкой кукурузы, с использованием мужского растения, являющегося индуктором гаплоидов в качестве редактирующей донорской линии. Кроме того, авторы настоящего изобретения демонстрируют примеры HI у Arabidopsis с использованием линий CENH3-модифицированного индуктора гаплоидов.
Авторы настоящего изобретения также демонстрируют примеры HI в пшенице с использованием пыльцы маиса в качестве редактирующей донорной линии в широком скрещивании. У пшеницы, риса, ячменя, капусты и других сельскохозяйственных культур путь к индукции гаплоидов будет заключаться в использовании донора пыльцы, который индуцирует гаплоиды посредством широкого скрещивания. Например, можно использовать пыльцу кукурузы на пшенице, пыльцу проса на пшенице, пыльцу ячменя на других видах ячменя или любой другой способ широкого скрещивания. В таких случаях гиногенетической индукции гаплоидов было бы предпочтительно, чтобы линия мужских растений содержала редактирующий механизм, потому что именно ДНК мужских растений (полученная из пыльцы) удаляется в процессе индукции гаплоидов. В случаях андрогенной индукции гаплоидов, например, в системе ig1 у маиса или посредством измененного CENH3 в любой сельскохозяйственной культуре (которая может работать как у мужских, так и у женских растений), редактирующий механизм мог бы оптимально присутствовать у родительского женского растения, поскольку женские хромосомы удаляются в процессе индукции гаплоидов.
При одновременном редактировании и индукции гаплоидов целью является быстрое и экономически эффективное редактирование сельскохозяйственных культур и элитных линий ("редактирование линий назначения") без использования тканевой культуры. Линия, которая получает изменения, может представлять собой элитную зародышевую плазму, а сам редактирующий механизм может быть удален в процессе индукции гаплоидов. В то же время получают отредактированные гаплоидные линии с удвоенным числом хромосом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Неподатливость тканевых культур является главной проблемой для быстрого редактирования элитных линий в разных сельскохозяйственных культурах. Использование индуцирующих гаплоиды линий для доставки целевого механизма мутагенеза элитным линиям и одновременной индукции гаплоидов представляет собой преодоление этого главного препятствия. От этого процесса могут зависеть программы выращивания следующего поколения.
Редактирующий механизм обеспечивается за счет линии-индуктора. Редактирующий механизм чаще всего представляет собой ДНК-связывающие белки, объединенные в некоторых случаях с РНК, а в некоторых случаях также с ДНК. ДНК, РНК и белки, которые составляют редактирующий механизм, кодируются и присутствуют в линии-индукторе, потому что они стабильно встроены в индуктор, например, посредством бомбардировки или опосредованной агробактериями трансформации. В других примерах редактирующий механизм временно вводится (посредством экзогенного применения) или временно экспрессируется в гаметофите до оплодотворения. После оплодотворения редактирования осуществляются с помощью редактирующего механизма в генах-мишенях, не являющихся индукторами, до или во время удаления хромосом-индукторов. Результатом является гаплоидный зародыш, или растение, или семя, которые содержат набор хромосом только от родительского растения, не являющегося индуктором, где такой набор хромосом содержит последовательности ДНК, которые были отредактированы. Эти отредактированные гаплоиды могут быть идентифицированы, выращены, а число их хромосом удвоено предпочтительно с помощью колхицина или другого ингибитора митоза. Эта линия может затем непосредственно использоваться в последующих программах селекции.
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается способ редактирования геномной ДНК растения. Это осуществляется путем взятия первого растения, которое представляет собой индуцирующее гаплоиды растение, и в котором в его ДНК также закодирован механизм, необходимый для осуществления редактирования (например, фермент Cas9 и направляющая РНК), и использования пыльцы этого первого растения для опыления второго растения. Второе растение представляет собой растение, подлежащее редактированию. В результате этого опыления получают трансгенный объект, потомков (например, зародыши или семена); причем по меньшей мере одно из них будет гаплоидным семенем. Это гаплоидное семя будет содержать только хромосомы второго растения; при этом хромосомы первого растения устраняются (были удалены, утрачены или разрушены), но перед этим хромосомам первого растения дали возможность осуществить экспрессирование механизма для редактирования генов. В качестве альтернативы и не вдаваясь в теорию, первое растение доставляет уже экспрессированный редактирующий механизм после опыления через пыльцевую трубку. Или в том случае, если линия-индуктор гаплоидов представляет собой женское растение при скрещивании, яйцеклетка индуцирующего гаплоиды растения содержит редактирующий механизм, который присутствует, а возможно, уже экспрессируется после оплодотворения пыльцевым зерном "дикого типа" или пыльцевым зерном, не индуцирующим гаплоиды. За счет любого из этих путей у гаплоидных потомков, полученных с помощью скрещивания, также будет отредактирован их геном.
В одном аспекте редактирующий механизм представляет собой любой фермент для модификации ДНК, но предпочтительно представляет собой сайт-направленную нуклеазу. Сайт-направленная нуклеаза предпочтительно основана на CRISPR, но также может представлять собой мегануклеазу, эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN), или нуклеазу типа "цинковых пальцев". Нуклеаза, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой Cas9, Cfp1, dCas9-FokI, химерную FEN1-FokI. В одном аспекте фермент для модификации ДНК представляет собой сайт-направленный фермент для редактирования оснований, такой как Cas9-цитидиндезаминаза или Cas9-адениндезаминаза, где Cas9 может обладать одной или обеими своими инактивированными нуклеазными активностями, т.е. представлять собой химерную никазу Cas9 (nCas9) или инактивированную Cas9 (dCas9), слитые с цитидиндезаминазой или адениндезаминазой. Необязательная направляющая РНК нацеливается на геном в конкретном сайте, подлежащем редактированию. В одном аспекте необязательная направляющая РНК содержит 18-21 нуклеотидную последовательность с гомологией к любой из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21, 23, 25, 29, 32 и 33.
После получения отредактированного гаплоидного потомка число его хромосом может быть удвоено с помощью средства для удвоения числа хромосом (например, колхицина, пронамида, дитипира, трифлуралина или другого известного средства, ингибирующего образование микротрубочек).
В одном варианте осуществления первое растение является однодольным растением или двудольным растением. Аспекты первого растения включают маис, пшеницу, рис, ячмень, овес, тритикале, сорго, жемчужное просо, теосинте, бамбук, сахарный тростник, спаржу, лук и чеснок. В одном варианте осуществления второе растение является однодольным растением или двудольным растением. Аспекты второго растения включают маис, пшеницу, рис, ячмень, овес, тритикале, сорго, жемчужное просо, теосинте, бамбук, сахарный тростник, спаржу, лук и чеснок. В одном варианте осуществления первое растение представляет собой однодольное растение или двудольное растение другого вида в отличие от второго растения. Например, в одном аспекте первое растение представляет собой маис, а второе растение представляет собой пшеницу. В другом аспекте первое растение представляет собой пшеницу, а второе растение представляет собой маис. В другом варианте осуществления первое растение представляет собой растение маиса, выбранное и/или полученное из линий Stock6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222-matl или из любой из нескольких других известных линий HI. В еще одном варианте осуществления первое растение содержит мутацию в гене CENH3, гене ig1, или другую мутацию, обеспечивающую получение систем, индуцирующих гаплоиды, которые содержат геном отцовского растения. В другом варианте осуществления первое растение представляет собой растение риса с модифицированным или нокаутным геном MATL, что делает его линией-индуктором гаплоидов.
В другом варианте осуществления первое растение необязательно представляет собой индуктор гаплоидов, хотя первое растение содержит гены, требующиеся для кодирования редактирующего механизма генов. В данном варианте осуществления индукцию гаплоидов получают путем введения соединения во время, непосредственно перед или непосредственно после опыления. В одном аспекте композиция содержит липид или ингибитор фосфолипазы. В другом аспекте композиция содержит метил-альфа-линоленоилфторфосфонат (MALFP), сложный этиловый эфир линолевой кислоты (LLAEE), линолевую кислоту (LLA), кукурузное масло, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), метиларахидонилфторфосфонат (MAFP), пальмитилтрифторметилкетон (PACOCF3), арахидонилтрифторметилкетон (AACOCF3), маноалид, сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный метиловый эфир олеиновой кислоты (ОАМЕ), сложный этиловый эфир олеиновой кислоты (ОАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитиновой кислоты (РАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитолеиновой кислоты (PLAEE), льняное масло, кукурузное масло, альфа-линоленовую кислоту (aLNA), гамма-линоленовую кислоту (gLNA), олеиновую кислоту, арахидоновую кислоту, стеариновую кислоту, 9(Z)-11(Е)-конъюгированную линолевую кислоту или 2-олеоил-1-пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23396.
SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность gRNA, предназначенную для редактирования VLHP1 у маиса.
SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23399.
SEQ ID NO: 4 представляет собой последовательность gRNA для редактирования GW2-2 у маиса.
SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 22808, содержащего конструкцию TALEN.
SEQ ID NO: 6 представляет собой целевую последовательность для TALEN 22808.
SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23123, содержащего конструкцию Cas9.
SEQ ID NO: 8 представляет собой gRNA для редактирования MATL у маиса.
SEQ ID NO: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в NP2222.
SEQ ID NO: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в Stock6.
SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350333-3 аллеля 1.
SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350333-3 аллеля 2.
SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350344-2 аллеля 1.
SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350344-2 аллеля 2.
SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350343-1 аллеля 1.
SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350328-1 аллеля 1.
SEQ ID NO: 17 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350337-2 аллеля 1.
SEQ ID NO: 18 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350337-2 аллеля 2.
SEQ ID NO: 19 представляет собой нуклеотидную последовательность кДНК дикого типа MATL.
SEQ ID NO: 20 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23397.
SEQ ID NO: 21 представляет собой последовательность gRNA для редактирования VLHP2 у маиса.
SEQ ID NO: 22 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23398.
SEQ ID NO: 23 представляет собой последовательность gRNA для редактирования GW2-1 у маиса.
SEQ ID NO: 24 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23763.
SEQ ID NO: 25 представляет собой последовательность gRNA для VLHP1 у пшеницы.
SEQ ID NO: 26 представляет собой целевую последовательность VLHP пшеницы для TaVLHP2.
SEQ ID NO: 27 представляет собой целевую последовательность VLHP пшеницы для TaVLHP3.
SEQ ID NO: 28 представляет собой целевую последовательность в ZmVLHP2-03 для редактирования.
SEQ ID NO: 29 представляет собой отредактированную последовательность в ZmVLHP2-03.
SEQ ID NO: 30 представляет собой восстановленную донорную матричную последовательность для создания мутации E149L в ZmPYL-D.
SEQ ID NO: 31 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23136.
SEQ ID NO: 32 представляет собой gRNA вектора 23136.
SEQ ID NO: 33 представляет собой нуклеотидную последовательность гена Os03g27610PLA риса.
SEQ ID NO: 34 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24038.
SEQ ID NO: 35 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24039.
SEQ ID NO: 36 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24079.
SEQ ID NO: 37 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24091.
SEQ ID NO: 38 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24094.
SEQ ID NO: 39-97 представляют собой праймеры и зонды, используемые в анализах Taqman для выявления с помощью ПЦР.
SEQ ID NO: 98 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24075.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350334-3: ДИПЛОИД (основной пик при 200, вторичный пик при 400).
На фигуре 2 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350333-3: ГАПЛОИД (основной пик при 100, вторичный пик при 200).
На фигуре 3 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350333-10: ДИПЛОИД (основной пик при 200, вторичный пик при 400).
На фигуре 4 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350344-2: ГАПЛОИД (основной пик при 100, вторичный пик при 200).
На фигуре 5 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350343-1: ГАПЛОИД (основной пик при 100, вторичный пик при 200).
На фигуре 6 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350341-1: ДИПЛОИД (основной пик при 200, вторичный пик при 400).
На фигуре 7 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350328-1: ГАПЛОИД (основной пик при 100, вторичный пик при 200).
На фигуре 8 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350321-3: ДИПЛОИД (основной пик при 200, вторичный пик при 400).
На фигуре 9 представлено схематическое изображение вектора 23396 (SEQ ID NO: 1), используемого для Agrobacterium-опосредованной трансформации незрелых зародышей маиса для создания целевых мутаций в генах ZmVLHP1. xZmVLHP-01: последовательность направляющей РНК (gRNA) (5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3', SEQ ID NO: 2); rsgRNAZmVLHP-01: одиночная направляющая РНК (sgRNA), содержащая последовательности терминации gRNA, tracRNA и PolIII. cPMI: селектируемый маркерный ген PMI; cCas9: ген нуклеазы Cas9; RB: правая граница Т-ДНК; LB: левая граница Т-ДНК; tNOS: терминатор нопалинсинтетазы; cSpec: ген устойчивости к спектиномицину.
На фигуре 10 представлено схематическое изображение вектора 23399 (SEQ ID NO: 3), используемого для Agrobacterium-опосредованной трансформации незрелых зародышей маиса для создания целевых мутаций в генах ZmGW2. xZmGW2-02: последовательность направляющей РНК (gRNA) (5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3', SEQ ID NO: 4); rsgRNAZmGW2-02: одиночная направляющая РНК (sgRNA), содержащая последовательности терминации gRNA, tracrRNA и PolIII. cPMI-09: селектируемый маркерный ген PMI; cCas9-01: ген нуклеазы Cas9; RB: правая граница Т-ДНК; LB: левая граница Т-ДНК; tNOS: терминатор нопалинсинтетазы; cSpec: ген устойчивости к спектиномицину.
На фигуре 11 показан анализ плоидности отредактированной гаплоидной линии сладкой кукурузы JSER82A056, и на фигуре 12 показано то же самое для отредактированной гаплоидной линии сладкой кукурузы JSER82A063. Эти линии были получены путем скрещивания с линией индукции гаплоидов RWKS, несущей трансгенный локус CRISPR-Cas9 вектора экспрессии 23399.
На фигуре 13 показано подтверждение последовательности редактирования сайта-мишени GW2-02 в линии гаплоидной сладкой кукурузы JSER82A063. Одно основание С рядом с предсказанным сайтом расщепления Cas9 было подвергнуто делеции.
На фигуре 14 показан анализ плоидности контроля дикого типа, и на фигуре 15 показан анализ плоидности отредактированной гаплоидной линии пшеницы JSWER30A22.
На фигуре 16 показано подтверждение с помощью секвенирования последовательности для редактирования сайта-мишени TaVLHP1-4B в линии гаплоидной пшеницы JSWER30A22. Нижняя панель, показывающая 97 п.о. последовательности TaVLHP1-4B, была подвергнута делеции непосредственно ниже предсказанного сайта расщепления Cas9. Подвергнутые делеции последовательности размером 97 п.о. были отмечены 2 стрелками.
На фигуре 17 показана экспрессия в пыльце, измеренная по пыльце, собранной от трансгенных растений T0 маиса, несущих T-DNA векторов 24038, 24039, 24079, 24091 и 24094, которые использовали для опыления линии яровой пшеницы AC-Nanda с удаленными несозревшими пестиками. Экспрессия в пыльце была высокой, в среднем в приблизительно 100 раз выше, у растений, несущих T-DNA векторов 24038, 24039 и 24079, по сравнению с промотором убиквитина сахарного тростника, используемым во многих примерах с кукурузой и пшеницей. Экспрессия также была выше в пыльце растений, содержащих векторы 24038, 24039 и 24079, по сравнению с пыльцой, несущей конструкции на основе промотора MATRILINEAL (24094 и 24091).
На фигуре 18 показана гистограмма анализа плоидности диплоидного контроля (родительское растение USR01424135). Первый пик расположен в положении "2" на логарифмической оси X. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.
На фигуре 19 показана гистограмма анализа плоидности диплоидного контроля (родительское растение USR01431603). Первый пик расположен в положении "2" на логарифмической оси X. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.
На фигуре 20 показана гистограмма анализа плоидности диплоидного контроля (родительское растение USR01431609). Первый пик расположен в положении "2" на логарифмической оси X. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.
На фигуре 21 показана гистограмма анализа плоидности отредактированного гаплоида из чашки 1033, лунка C3 (USR01424135 X Ler-427). Первый пик расположен в положении "1" на логарифмической оси X, указывая на то, что это гаплоид. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.
На фигуре 22 показана гистограмма анализа плоидности отредактированного гаплоида из чашки 1033, лунка Е4 (USR01424135 X Ler-437). Первый пик расположен в положении "1" на логарифмической оси X, указывая на то, что это гаплоид. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.
На фигуре 23 показана гистограмма анализа плоидности отредактированного гаплоида из чашки 1046, лунка Н12 (USR01431609 X Ler-123). Первый пик расположен в положении "1" на логарифмической оси X, указывая на то, что это гаплоид. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.
На рисунке 24 показаны мутации в последовательности сайта-мишени GL1 в родительском #USR01424135 и все секвенированные отредактированные гаплоиды от скрещиваний особей из разных линий с помощью пыльцы Landsberg erecta. Ясно, что точное редактирование отличается в разных гаплоидах.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Хотя предполагается, что следующие термины хорошо понятны специалисту в данной области техники, следующие определения приведены для облегчения пояснения раскрытого в данном документе объекта изобретения.
Все используемые в данном документе технические и научные термины, если ниже не указано иначе, предполагаются как имеющие такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники. Ссылки на используемые в данном документе методики предполагаются как относящиеся к методикам, общепринятым в данной области техники, в том числе к изменениям этих методик и/или заменам на эквивалентные методики, которые будут очевидны специалистам в данной области техники. Хотя предполагается, что следующие термины хорошо понятны специалисту в данной области техники, следующие определения приведены для облегчения пояснения раскрытого в данном документе объекта изобретения.
Следуя устоявшемуся договору в патентном праве, формы существительного в единственном числе относятся к "одному или нескольким" при использовании в настоящей заявке, включая формулу изобретения. Например, фраза "клетка" относится к одной или нескольким клеткам и в некоторых вариантах осуществления может относиться к ткани и/или органу. Аналогичным образом, фраза "по меньшей мере один" при использовании в данном документе для обозначения объекта относится, например, к 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 или большему количеству этих объектов, включая без ограничения все целочисленные значения от 1 до 100, а также целые числа больше 100.
Если не указано иное, то все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и т.д., используемые в настоящем описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях с помощью термина "приблизительно". Термин "приблизительно", используемый в данном документе в отношении измеряемого значения, такого как величина массы, веса, времени, объема, концентрации или процентного значения, предназначен для охвата изменений, составляющих в некоторых вариантах осуществления ±20%, в некоторых вариантах осуществления ±10%, в некоторых вариантах осуществления ±5%, в некоторых вариантах осуществления ±1%, в некоторых вариантах осуществления ±0,5% и в некоторых вариантах осуществления ±0,1%, от указанного количества, поскольку такие изменения подходят для осуществления раскрытых способов и/или использования раскрытых композиций, нуклеиновых кислот, полипептидов и т.д. Соответственно, если не указано обратное, числовые параметры, изложенные в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными величинами, которые могут варьироваться в зависимости от требуемых свойств, которых стремятся достичь посредством раскрытого в данном документе объекта изобретения.
Используемый в данном документе термин "аллель" относится к варианту или альтернативной форме последовательности в генетическом локусе. У диплоидов отдельный аллель наследуется индивидуумом-потомком от каждой родительской особи отдельно в каждом локусе. Два аллеля данного локуса, присутствующие в диплоидном организме, занимают соответствующие места в паре гомологичных хромосом, хотя специалист в данной области техники понимает, что аллели в любом конкретном индивидууме необязательно представляют все аллели, которые присутствуют у данного вида.
Применяемый в данном документе термин "и/или", при использовании применительно к перечню объектов, относится к объектам, присутствующим в отдельности или в комбинации. Таким образом, например, фраза "А, В, С и/или D" включает А, В, С и D по отдельности, но также включает все возможные комбинации и подкомбинации А, В, С и D (например, AB, AC, AD, BC, BD, CD, ABC, ABD и BCD). В некоторых вариантах осуществления один или несколько элементов, к которым относится "и/или", могут также отдельно присутствовать в одном или множестве случаев в комбинации (комбинациях) и/или подкомбинации (комбинациях).
Используемая в данном документе фраза "ассоциированный с" относится к распознаваемой и/или анализируемой взаимосвязи между двумя объектами. Например, фраза "ассоциированный с HI" относится к признаку, локусу, гену, аллелю, маркеру, фенотипу и т.д. или их экспрессии, присутствие или отсутствие которых может влиять на меру и/или степень, в которой растение или его потомок проявляют HI. Соответственно, маркер является "связанным с" признаком в том случае, если он сцеплен с ним, и в том случае, если присутствие маркера является индикатором того, будет ли и/или в какой степени будет встречаться требуемый признак или форма признака у растения/в зародышевой плазме, содержащих маркер. Аналогичным образом, маркер является "ассоциированным с" аллелем в том случае, если он сцеплен с ним, и в том случае, если присутствие маркера является индикатором присутствия аллеля у растения/в зародышевой плазме, содержащих маркер. Например, "маркер, ассоциированный с HI", относится к маркеру, присутствие или отсутствие которого можно использовать для предсказания того, будет ли и/или в какой степени растение будет проявлять индукцию гаплоидов.
Термин "содержащий", который является синонимичным для "включающий", "вмещающий" и "характеризующийся", является включающим или открытым и не исключает дополнительных, не упомянутых элементов и/или стадий способа. "Содержащий" представляет собой термин из уровня техники, который означает, что названные элементы и/или стадии присутствуют, но могут быть добавлены другие элементы и/или стадии, которые при этом по-прежнему находятся в пределах объема соответствующего объекта изобретения.
Используемая в данном документе фраза "состоящий из" исключает любой элемент, стадию или ингредиент, конкретно не упомянутые. В том случае, если фраза "состоит из" появляется в основной части пункта формулы изобретения, а не сразу после ограничительной части, то она ограничивает только элемент, изложенный в данной части; при этом другие элементы не исключаются из пункта формулы изобретения в целом.
Используемая в данном документе фраза "по сути состоящий из" ограничивает объем связанного раскрытия или пункта формулы изобретения указанными материалами и/или стадиями, а также материалами и/или стадиями, которые существенно не влияют на основную (основные) и новую (новые) характеристику (характеристики) раскрытого и/или заявленного объекта изобретения.
Что касается терминов "содержащий", "по сути состоящий" и "состоящий из" в том случае, если в данном документе используется один из этих трех терминов, то раскрытый в данном документе и заявленный объект изобретения может включать в некоторых вариантах осуществления использование любого из двух других терминов. Например, справедливо, если объект изобретения относится в некоторых вариантах осуществления к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 95% идентичны SEQ ID NO: 9 или 19. Таким образом, следует понимать, что раскрываемый объект изобретения также охватывает нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые в некоторых вариантах осуществления по сути состоят из аминокислотных последовательностей, которые на по меньшей мере 95% идентичны этим SEQ ID NO: 9 или 19, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые в некоторых вариантах осуществления состоят из аминокислотных последовательностей, на по меньшей мере 95% идентичных этим SEQ ID NO: 9 или 19. Аналогичным образом, также следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления способы согласно раскрываемому объекту изобретения включают стадии, раскрытые в данном документе, в некоторых вариантах осуществления способы согласно раскрываемому в данном документе объекту изобретения по сути состоят из раскрываемых стадий, и в некоторых вариантах осуществления способы согласно раскрываемому в данном документе объекту изобретения состоят из стадий, которые раскрываются в данном документе.
Используемый в данном документе термин "de novo индукция гаплоидов" относится к инициации индукции гаплоидов посредством введения средства, спонтанно индуцирующего гаплоиды. Такое введение можно осуществлять посредством местного опрыскивания, опыления ручным способом, мутагенеза или трансгенных способов. Термины "индукция гаплоидов de novo", "HI de novo" и "de novo индукция гаплоидов" используются взаимозаменяемо по всему настоящему описанию.
Используемый в данном документе термин "ген" относится к единице наследственности, содержащей последовательность ДНК, которая занимает конкретное местоположение в хромосоме и которая содержит генетическую инструкцию для определенной характеристики или признака, свойственных организму.
"Генетическая карта" представляет собой описание взаимосвязей при генетическом сцеплении между локусами на одной или нескольких хромосомах у данного вида, обычно изображаемое в форме схемы или таблицы.
Используемое в данном документе растение, называемое "гаплоидным", имеет уменьшенное количество хромосом (n) в гаплоидном растении, и его набор хромосом равен таковому набору у гаметы. В гаплоидном организме присутствует только половина от нормального числа хромосом. Таким образом, гаплоиды диплоидных организмов (например, маиса) проявляют моноплоидию; гаплоиды тетраплоидных организмов (например, райграссов) проявляют диплоидию; гаплоиды гексаплоидных организмов (например, пшеницы) проявляют триплоидию и т.д. Используемое в данном документе растение, называемое "гаплоидом с удвоенным числом хромосом", получают путем удвоения гаплоидного набора хромосом. Растение или семя, которые получают из гаплоидного растения с удвоенным числом хромосом, самооплодотворямое в течение любого количества поколений, все еще можно идентифицировать как двойное гаплоидное растение. Гаплоидное растение с удвоенным числом хромосом считается гомозиготным растением. Растение считается гаплоидным с удвоенным числом хромосом, если оно является фертильным, даже если целая вегетативная часть растения не состоит из клеток с удвоенным набором хромосом; то есть растение будет считаться гаплоидным с удвоенным числом хромосом, если оно содержит жизнеспособные гаметы, даже если оно является химерным в вегетативных тканях.
Используемый в данном документе термин "индуцированная человеком мутация" относится к любой мутации, появляющейся в результате непосредственного или опосредованного человеком действия. Данный термин включает без ограничения мутации, получаемые посредством любого способа направленного мутагенеза.
Используемый в данном документе "введенный" означает доставляемый, экспрессируемый, применяемый, транспортируемый, переносимый, проникающий или другой подобный термин для обозначения доставки, будь то нуклеиновой кислоты или белка или их комбинации требуемого объекта к объекту. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие сайт-направленную нуклеазу и необязательно по меньшей мере одну направляющую РНК, могут быть введены в гаплоидный зародыш после индукции гаплоидов. Аналогично существующий редактирующий механизм (содержащий сайт-направленный нуклеазный белок и необязательно по меньшей мере одну направляющую РНК) может быть введен в гаплоидный зародыш путем применения соответствующих проникающих в клетку пептидов.
Используемые в данном документе термины "маркерный зонд" и "зонд" относятся к нуклеотидной последовательности или молекуле нуклеиновой кислоты, которые можно использовать для выявления присутствия или отсутствия последовательности в пределах большей последовательности посредством гибридизации нуклеиновых кислот, например, к зонду на основе нуклеиновой кислоты, комплементарному всему маркеру или маркерному локусу или его части. Для гибридизации нуклеиновых кислот можно использовать маркерные зонды, содержащие приблизительно 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше смежных нуклеотидов.
Используемый в данном документе термин "молекулярный маркер" можно использовать для обозначения генетического маркера, определенного выше, или кодируемого им продукта (например, белка), применяемого в качестве исходной точки при идентификации присутствия/отсутствия HI-ассоциированного локуса. Молекулярный маркер может быть получен из геномных нуклеотидных последовательностей или из экспрессируемых нуклеотидных последовательностей (например, из РНК, кДНК и т.д.). Данный термин также относится к нуклеотидным последовательностям, комплементарным маркерным последовательностям или фланкирующим их, таким как нуклеотидные последовательности, используемые в качестве зондов и/или праймеров, способных амплифицировать маркерную последовательность. Нуклеотидные последовательности являются "комплементарными" в том случае, если они специфически гибридизируются в растворе (например, согласно правилам спаривания оснований Уотсона-Крика). Данный термин также относится к генетическим маркерам, которые указывают на признак по отсутствию нуклеотидных последовательностей, комплементарных маркерным последовательностям или фланкирующих их, таких как нуклеотидные последовательности, используемые в качестве зондов и/или праймеров, способных амплифицировать маркерную последовательность.
Используемые в данном документе термины "нуклеотидная последовательность", "полинуклеотид", "последовательность нуклеиновой кислоты", "молекула нуклеиновой кислоты" и "фрагмент нуклеиновой кислоты" относятся к полимеру РНК или ДНК, который является одно- или двухнитевым, необязательно содержащему синтетические, неприродные и/или измененные нуклеотидные основания. "Нуклеотид" представляет собой мономерную единицу, из которой сконструированы полимеры ДНК или РНК и которая состоит из пуринового или пиримидинового основания, пентозы и группы фосфорной кислоты. Нуклеотиды (обычно находящиеся в их форме 5'-монофосфата) называют их однобуквенным обозначением следующим образом: "А" в случае аденилата или дезоксиаденилата (соответственно в случае РНК или ДНК), "С" в случае цитидилата или дезоксицитидилата, "G" в случае гуанилата или дезоксигуанилата, "U" в случае уридилата, "Т" в случае дезокситимидилата, "R" в случае пуринов (А или G), "Y" в случае пиримидинов (С или Т), "K" в случае G или Т, "H" в случае А или С или Т, "I" в случае инозина и "N" в случае любого нуклеотида.
В контексте данного документа термин "идентичность нуклеотидной последовательности" относится к присутствию идентичных нуклеотидов в соответствующих положениях двух полинуклеотидов. Полинуклеотиды имеют "идентичные" последовательности в том случае, если последовательность нуклеотидов в двух полинуклеотидах является одной и той же при выравнивании для максимального соответствия (например, в окне сравнения). Сравнение последовательностей двух или более нуклеотидов обычно осуществляют путем сравнения частей двух последовательностей в окне сравнения для выявления и сравнения локальных участков сходства последовательностей. Как правило, окно сравнения составляет от приблизительно 20 до 200 смежных нуклеотидов. "Процентное значение идентичности последовательности" для полинуклеотидов, как, например, приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100 процентная идентичность последовательности, можно определять с помощью сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать дополнения или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью для оптимального выравнивания двух последовательностей. В некоторых вариантах осуществления процентное значение рассчитывают с помощью (а) определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты встречается в обеих последовательностях; (b) деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и (с) умножения результата на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно также проводить с помощью компьютерных реализаций известных алгоритмов или путем визуального осмотра. Общедоступными алгоритмами сравнения последовательности и множественного выравнивания последовательностей являются соответственно программы Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) и ClustalW/ClustalW2/Clustal Omega, доступные в сети Интернет (например, на веб-сайте EMBL-EBI). Другие подходящие программы включают без ограничения GAP, BestFit, Plot Similarity и FASTA, которые являются частью пакета программ Accelrys GCG Package, доступного от Accelrys, Inc. Сан-Диего, Калифорния, Соединенные Штаты Америки. См. также Smith & Waterman, 1981; Needleman & Wunsch, 1970; Pearson & Lipman, 1988; Ausubel et al., 1988 и Sambrook & Russell, 2001.
Одним примером алгоритма, который подходит для определения процентного значения идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в Altschul et al., 1990. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности последовательности относится к идентичности последовательности по всей длине одной из сравниваемых последовательностей gDNA, кДНК или прогнозируемого белка в самой большой ORF в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления расчет с целью определения процента идентичности последовательности нуклеиновой кислоты не включает в расчет любые положения нуклеотидов, в которых каждая из сравниваемых нуклеиновых кислот включает "N" (т.е. где любой нуклеотид может находиться в данном положении).
Термин "открытая рамка считывания" (ORF) относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. В некоторых вариантах осуществления ORF содержит кодон инициации трансляции (т.е. стартовый кодон), кодон терминации трансляции (т.е. стоп-кодон) и последовательность нуклеиновой кислоты между ними, которая кодирует аминокислоты, присутствующие в полипептиде. Термины "инициирующий кодон" и "кодон терминации" относятся к единице из трех смежных нуклеотидов (т.е. кодону) в кодирующей последовательности, которая определяет соответственно инициацию и терминацию цепи в синтезе белка (трансляция мРНК).
Пататин-подобная фосфолипаза А2α также известна под названием PLA, pPLA, pPLAIIA, pPLAIIα, PLA2альфа или PLA2 или другие аналогичные вариации. Пататин-подобную фосфолипазу AIIα также называют MATRILINEAL (MATL). Данные термины везде используются взаимозаменяемо. Ген MATRILINEAL, содержащий мутацию со сдвигом рамки считывания из четырех пар оснований, называется матрилинейным (matl).
Используемые в данном документе термины "фенотип", "фенотипический признак" или "признак" относятся к одному или нескольким признакам растения или растительной клетки. Фенотип можно наблюдать невооруженным глазом или с помощью любых других средств оценки, известных из уровня техники, например, с помощью микроскопии, биохимического анализа или электромеханического анализа. В некоторых случаях фенотип непосредственно контролируется одним геном или генетическим локусом (т.е. соответствует "признаку, определенному одним геном"). В случае индукции гаплоидов использование маркеров цвета, таких как R-Navajo, и других маркеров, в том числе трансгенов, визуально определяемых по присутствию или отсутствию цвета в семени, свидетельствует о том, является ли семя индуцированным гаплоидным семенем. Использование R-Navajo в качестве маркера цвета и использование трансгенов хорошо известно из уровня техники в качестве способов выявления индукции гаплоидного семени на женском растении. В других случаях фенотип является результатом взаимодействий между несколькими генами, и в некоторых вариантах осуществления он также является результатом взаимодействия растения и/или растительной клетки с их окружающей средой.
Используемый в данном документе термин "растение" может относится к целому растению, любой его части или культуре клеток или тканей, полученным из растения. Таким образом, термин "растение" может относиться к любому из целых растений, компонентов или органов растения (например, листьям, стеблям, корням и т.д.), растительных тканей, семян и/или растительных клеток.
Растительная клетка представляет собой клетку растения, взятую из растения или полученную посредством культивирования из клетки, взятой из растения. Таким образом, термин "растительная клетка" включает без ограничения клетки в семенах, суспензионных культурах, зародышах, участках меристемы, каллюсной ткани, листьях, побегах, гаметофитах, спорофитах, пыльце и микроспорах. Фраза "часть растения" относится к части растения, в том числе к отдельным клеткам и клеточным тканям, таким как растительные клетки, которые являются интактными в растениях, скоплениям клеток и тканевым культурам, из которых можно регенерировать растения. Примеры частей растения включают без ограничения отдельные клетки и ткани из пыльцы, семязачатков, листьев, зародышей, корней, кончиков корней, пыльников, цветков, плодов, стеблей, побегов и семян; а также привоев, подвоев, протопластов, каллюсов и т.п.
Используемый в данном документе термин "праймер" относится к олигонуклеотиду, который способен отжигаться с целевой нуклеиновой кислотой (в некоторых вариантах осуществления отжигаться специфически с целевой нуклеиновой кислотой), обеспечивая присоединение к ней ДНК-полимеразы и/или обратной транскриптазы, выступая таким образом в качестве точки начала синтеза ДНК, будучи помещенным в условия, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера (например, в присутствии нуклеотидов и средства для полимеризации, такого как ДНК-полимераза, и при подходящих температуре и показателе рН). В некоторых вариантах осуществления для амплификации нуклеиновых кислот растения используют одну или несколько совокупностей праймеров (например, с помощью полимеразной цепной реакции; ПЦР).
Используемый в данном документе термин "зонд" относится к нуклеиновой кислоте (например, однонитевой нуклеиновой кислоте или нити двухнитевой нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты более высокого порядка или их подпоследовательности), которая может образовывать стабилизированный водородными связями дуплекс с комплементарной последовательностью в целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Как правило, зонд имеет достаточную длину для образования стабильной и специфической в отношении последовательности дуплексной молекулы с ее комплементарной последовательностью, а следовательно, может применяться в некоторых вариантах осуществления для выявления представляющей интерес последовательности, присутствующей во множестве нуклеиновых кислот.
Используемые в данном документе термины "потомок" и "растение-потомок" относятся к растению, полученному путем вегетативного или полового размножения от одного или нескольких родительских растений. При гиногенез-опосредованной индукции гаплоидов гаплоидный зародыш в женском родительском растении содержит женские хромосомы, исключая мужские хромосомы; таким образом, он не является потомком мужской линии, индуцирующей гаплоиды. Гаплоидное семя кукурузы обычно имеет нормальный триплоидный эндосперм, который содержит геном мужского растения. Отредактированные гаплоидные потомки, и в дальнейшем подвергаемые редактированию растения, являющиеся удвоенным гаплоидом, и будущее семя не являются единственными требуемыми потомками. Существует также семя из собственно линии-индуктора гаплоидов, часто несущее трансген Cas9, и будущее растение и потомство семян индуцирующего гаплоиды растения. Как гаплоидное семя, так и семя-индуктор гаплоидов (полученные самоопылением) могут быть потомком. Растение-потомок может быть получено путем клонирования или самооплодотворения одного родительского растения или путем скрещивания двух или более родительских растений. Например, растение-потомок может быть получено путем клонирования или самооплодотворения одного родительского растения или путем скрещивания двух родительских растений, и оно включает продукты самооплодотворения, а также F1 или F2 или более далекие поколения. F1 представляет собой потомка первого поколения, полученного от родительских особей, по меньшей мере одно из которых впервые используют в качестве донора признака, тогда как потомство второго поколения (F2) или последующих поколений (F3, F4 и т.п.) представляет собой образцы, полученные в результате самооплодотворений, перекрестных опылений, возвратных скрещиваний и/или других скрещиваний F1, F2 и т.п. Таким образом, F1 может представлять собой (и в некоторых вариантах осуществления представляет собой) гибрид, полученный в результате скрещивания двух родительских особей из чистых линий (т.е. каждая из родительских особей из чистых линий является гомозиготной по признаку, представляющему интерес, или его аллелю), тогда как F2 может представлять собой (и в некоторых вариантах осуществления представляет собой) потомка, полученного в результате самоопыления гибридов F1.
Используемая в данном документе фраза "рекомбинация" относится к обмену фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК или хроматидами парных хромосом ("кроссинговер") в участке сходства или идентичности нуклеотидных последовательностей. "Событие рекомбинации" в данном документе понимают как относящееся в некоторых вариантах осуществления к мейотическому кроссинговеру.
Используемый в данном документе термин "эталонная последовательность" относится к определенной нуклеотидной последовательности, используемой в качестве основы для сравнения нуклеотидных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления любая из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21, 23, 25, 29, 32 и 33 могут выступать в качестве эталонной последовательности для сравнения с другими последовательностями, полученными из растений.
Используемый в данном документе термин "регенерировать" и его грамматические варианты относятся к получению растения из тканевой культуры.
Используемая в данном документе фраза "жесткие условия гибридизации" относится к условиям, при которых полинуклеотид гибридизируется со своей подпоследовательностью-мишенью, как правило, в сложной смеси нуклеиновых кислот, но по сути не осуществляет этого с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и могут различаться при разных обстоятельствах.
Как правило, более длинные последовательности специфически гибридизируются при более высоких температурах. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Sambrook & Russell, 2001. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была на приблизительно 5-10°С ниже температуры точки плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и показателе рН. Tm представляет собой температуру (при определенных ионной силе, показателе рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизируются с целевой последовательностью в равновесном состоянии (поскольку целевые последовательности присутствуют в избытке, то при Tm в равновесном состоянии занято 50% зондов). Иллюстративные жесткие условия являются такими, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,0 М ионов натрия, как правило, концентрация ионов натрия (или других солей) составляет приблизительно 0,01-1,0 М при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов).
Жесткие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Дополнительные иллюстративные жесткие условия гибридизации включают инкубирование в 50% формамиде, 5х SSC и 1% SDS при 42°С или инкубирование в SSC, 1% SDS при 65°С; с одной или несколькими стадиями отмывки в 0,2х SSC и 0,1% SDS при 65°С. Для ПЦР температура, составляющая приблизительно 36°С, является типичной для амплификации в условиях низкой жесткости, хотя температуры отжига могут варьироваться от приблизительно 32°С до 48°С (или выше) в зависимости от длины праймера. Дополнительные руководства для определения параметров гибридизации представлены в многочисленных ссылках (см., например, Ausubel et al., 1999).
Используемый в данном документе термин "признак" относится к фенотипу, представляющему интерес, гену, который вносит вклад в фенотип, представляющий интерес, а также к последовательности нуклеиновой кислоты, ассоциированной с геном, который вносит вклад в фенотип, представляющий интерес. Например, "признак HI" относится к фенотипу индукции гаплоидов, а также к гену (например, matl в маисе или Os03g27610 в рисе), который вносит вклад в индукцию гаплоидов, и к последовательности нуклеиновой кислоты (например, HI-ассоциированному продукту гена), что связано с присутствием или отсутствием фенотипа индукции гаплоидов.
Используемый в данном документе термин "трансген" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, введенной в организм или один или несколько его предков, с помощью определенной формы методики искусственного переноса. Таким образом, с помощью методики искусственного переноса создают "трансгенный организм" или "трансгенную клетку". Следует понимать, что методика искусственного переноса может осуществляться в организме-предке (или в его клетке и/или клетке, из которой может развиваться организм-предок), и при этом любой индивидуум-потомок, который содержит искусственно перенесенную молекулу нуклеиновой кислоты или ее фрагмент, все еще считается трансгенным, даже если в результате одного или нескольких природных и/или принудительных скрещиваний искусственно перенесенная молекула нуклеиновой кислоты присутствует в индивидууме-потомке.
Используемый в данном документе термин "направленный мутагенез" или "стратегия мутагенеза" относится к любому способу мутагенеза, который приводит в результате к преднамеренному мутагенезу выбранного гена. Направленный мутагенез включает способы с использованием CRISPR, TILLING, TALEN и другие способы, которые еще не разработаны, но которые можно использовать для достижения такого же результата.
Используемый в данном документе термин "уровень индукции гаплоидов" ("HIR") означает количество выживших гаплоидных зерен по сравнению с общим количеством зерен после опыления початка пыльцой, являющейся индуктором гаплоидов.
Конкретными проблемами, сопровождающими эту индукцию гаплоидов, являются увеличенные уровни недозрелости зародышей и увеличенные частоты неудачного оплодотворения (пониженные уровни завязывания семян). В силу описанных причин существует потребность в успешном определении причины HI и использовании этого знания для определения способов создания гаплоидных растений в стабильном или увеличивающемся объеме при одновременном снижении частоты неудачного оплодотворения и недоразвитости зародышей.
В частности, предполагается, что промотор можно подвергнуть мутагенезу, чтобы потенциально улучшить пригодность элементов для экспрессии трансгенов у растений. Мутагенез этих элементов можно осуществлять случайным образом, и подвергнутые мутагенезу промоторные последовательности можно подвергать скринингу в отношении активности по методу проб и ошибок. В качестве альтернативы можно идентифицировать определенные последовательности, которые придают промотору требуемые характеристики экспрессии или придают промотору активность усиления экспрессии, и эти или сходные последовательности можно вводить в промотор посредством мутации. Дополнительно предполагается, что эти последовательности можно подвергнуть мутагенезу для усиления экспрессии трансгенов с их помощью у определенного вида. Способы осуществления мутагенеза сегмента ДНК, кодирующего промоторную последовательность по настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области техники. Как указано выше, модификации промотора или другого регуляторного элемента можно осуществлять посредством процедур случайного или сайт-специфического мутагенеза. Промотор и другой регуляторный элемент можно модифицировать путем изменения их структуры посредством добавления или делеции одного или нескольких нуклеотидов из последовательности, которая кодирует соответствующие немодифицированные последовательности.
Мутагенез можно осуществлять в соответствии с любыми методиками, известными из уровня техники, такими как без ограничения синтез олигонуклеотида, имеющего одну или несколько мутаций в пределах последовательности в конкретной регуляторной последовательности. В частности, сайт-специфический мутагенез представляет собой методику, применимую в получении мутантных промоторов посредством специфического мутагенеза лежащей в их основе ДНК. Также можно использовать РНК-направляемые эндонуклеазы ("RGEN", например CRISPR/Cas9). Данная методика дополнительно обеспечивает легкодоступную возможность получения и тестирования вариантов последовательностей, например, с учетом одного или нескольких из вышеуказанных соображений, посредством введения одного или нескольких изменений нуклеотидной последовательности в ДНК. Сайт-специфический мутагенез обеспечивает получение мутантных форм посредством использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК с требуемой мутацией, а также достаточного количества смежных нуклеотидов, для обеспечения получения последовательности праймера, имеющей достаточные размер и сложность последовательности для образования стабильного дуплекса по обе стороны от пересекаемой границы делеции. Как правило, предпочтительным является праймер, длина которого составляет от приблизительно 17 до приблизительно 75 нуклеотидов или больше, содержащий от приблизительно 10 до приблизительно 25 или больше остатков по обе стороны от границы в последовательности, подлежащей изменению.
В том случае, если клон, содержащий промотор, был выделен в соответствии с настоящим изобретением, то при желании можно определить границы ключевых участков промотора в пределах клона. Один эффективный направленный способ получения подвергнутых мутагенезу промоторов основан на идентификации предполагаемых регуляторных элементов в пределах промоторной последовательности. Ее можно начать со сравнения с промоторными последовательностями, которые, как известно, характеризуются сходными тканеспецифическими или уникальными для стадии развития профилями экспрессии. Последовательности, которые являются общими среди промоторов со сходными профилями экспрессии, являются перспективными кандидатами для связывания с факторами транскрипции и, таким образом, являются предполагаемыми элементами, обеспечивающими профили экспрессии. Подтверждение этих предполагаемых регуляторных элементов можно осуществлять посредством делеционного анализа каждой предполагаемой регуляторной последовательности с последующим функциональным анализом каждой делеционной конструкции посредством анализа репортерного гена, функционально присоединенного к каждой конструкции. Таким образом, после получения исходной промоторной последовательности можно легко получить любую из ряда различных делеционных мутантных форм исходного промотора.
В настоящем изобретении, раскрываемом в данном документе, предусматриваются молекулы полинуклеотида, содержащие фрагменты регуляторных элементов, которые можно применять в конструировании новых химерных регуляторных элементов. Новые комбинации, содержащие фрагменты этих молекул полинуклеотидов и по меньшей мере один другой регуляторный элемент или фрагмент, можно конструировать и тестировать у растений, при этом они считаются находящимися в пределах объема настоящего изобретения. Таким образом, разработка, конструирование и использование химерных регуляторных элементов составляют один вариант осуществления настоящего изобретения. Промоторы по настоящему изобретению включают гомологи цис-элементов, которые известны тем, что влияют на регуляцию гена, которые демонстрируют гомологию с промоторными последовательностями по настоящему изобретению.
Функциональные эквивалентные фрагменты одной из нуклеиновых кислот, регулирующих транскрипцию, которые описаны в данном документе, содержат по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 пар оснований нуклеиновой кислоты, регулирующей транскрипцию. Из эквивалентных фрагментов регулирующих транскрипцию нуклеиновых кислот, которые получают посредством делеции участка, кодирующего 5'-нетранслируемый участок мРНК, можно затем получить только (нетранскрибируемый) промоторный участок. 5'-Нетранслируемый участок можно легко определить с помощью способов, известных из уровня техники (таких как анализ 5'-RACE). Соответственно, некоторые из нуклеиновых кислот, регулирующих транскрипцию, которые описаны в данном документе, являются эквивалентными фрагментами других последовательностей.
Как указано выше, также можно случайным образом получать, а затем анализировать делеционные мутантные формы промотора по настоящему изобретению. Следуя этой стратегии, получают серию конструкций, каждая из которых содержит отличную от других часть промотора (субклон), а затем эти конструкции подвергают скринингу в отношении активности. Подходящими способами для осуществления скрининга в отношении активности являются присоединение делетированной конструкции промотора или интрона, которая содержит делетированный сегмент, к селектируемому или подвергаемому скринингу маркеру, и выделение только тех клеток, которые экспрессируют маркерный ген. Таким образом идентифицируют несколько различных делетированных конструкций промотора, которые все еще сохраняют требуемую или даже улучшенную активность. Таким образом, посредством сравнения выбранных конструкций, идентифицируют наименьший сегмент, необходимый для активности. Затем этот сегмент можно использовать для конструирования векторов для экспрессии экзогенных генов.
Кассета экспрессии, описанная в данном документе, может содержать дополнительные регуляторные элементы. Этот термин в данном контексте следует понимать в широком значении, включающем все последовательности, которые могут влиять на конструкцию или функцию кассеты экспрессии. Регуляторные элементы могут, например, модифицировать транскрипцию и/или трансляцию у прокариотических или эукариотических организмов. Описанная в данном документе кассета экспрессии может находиться ниже (в 3'-направлении) последовательности нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии, и необязательно может содержать дополнительные регуляторные элементы, такие как транскрипционные или трансляционные энхансеры. Каждый дополнительный регуляторный элемент может быть функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии (или регулирующей транскрипцию нуклеотидной последовательностью). Дополнительные регуляторные элементы могут предусматривать дополнительные промоторы, минимальные промоторы, промоторные элементы или транспозонные элементы, которые могут модифицировать или усиливать свойства, регулирующие экспрессию. Кассета экспрессии может также содержать один или несколько интронов, один или несколько экзонов и один или несколько терминаторов.
Кроме того, предполагается, что применимыми могут являться промоторы, объединяющие элементы из более чем одного промотора. Например, в патенте США №5491288 раскрыто объединение промотора вируса мозаики цветной капусты с гистоновым промотором. Таким образом, элементы из промоторов, раскрытых в данном документе, можно объединять с элементами из других промоторов. Промоторы, используемые для экспрессии трансгенов у растений, включают индуцируемые, вирусные, синтетические, конститутивные (Odell Nature 313: 810-812 (1985)), регулируемые во времени, регулируемые в пространстве, тканеспецифические и регулируемые в пространстве и времени промоторы. Используя регуляторные элементы, описанные в данном документе, можно экспрессировать множество агрономически значимых генов в трансформированных растениях. Более конкретно, растения можно создавать с помощью методик генной инженерии для экспрессии различных фенотипов, представляющих агрономический интерес.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В одном вариант осуществления настоящего изобретения предусматривается способ редактирования геномной ДНК растений, предусматривающий: (i) получение первого растения, где первое растение представляет собой линию-индуктор гаплоидов растения, и где указанное первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательную направляющую нуклеиновую кислоту; (ii) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию; (iii) опыление второго растения пыльцой от первого растения и (iv) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного с помощью опыления на стадии (с), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленных первым растением.
В одном аспекте способа фермент для модификации ДНК представляет собой сайт-направленную нуклеазу, выбранную из группы, состоящей из мегануклеаз (MN), нуклеаз с "цинковыми пальцами" (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), нуклеазы Cas9, нуклеазы Cfp1, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, химерной Cas9-цитидиндеазминазы, химерной Cas9-адениндезаминазы, химерной FEN1-FokI и Mega-TAL, никазы Cas9 (nCas9), химерной нуклеазы dCas9, не содержащей FokI, и нуклеазы dCpf1, не содержащей FokI; и кроме того, где направляющая нуклеиновая кислота представляет собой направляющую РНК.
В другом аспекте способа отредактированного гаплоидного потомка обрабатывают с применением средства для удвоения числа хромосом, за счет чего получают отредактированного потомка, являющегося удвоенным гаплоидом. Например, средство для удвоения числа хромосом представляет собой колхицин, пронамид, дитипир, трифлуралин или другое средство, оказывающее воздействие на микротрубочки.
В другом аспекте способа первое растение является однодольным растением или двудольным растением. Например, первое растение является однодольным растением, выбранным из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока. В другом аспекте второе растение является однодольным растением или двудольным растением. Например, второе растение является однодольным растением, выбранным из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока.
В другом аспекте способа необязательная направляющая РНК представляет собой последовательность из 18-21 нуклеотида и является гомологичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21, 23, 25, 29, 32 и 33. В другом аспекте в первом растении экспрессируется маркерный ген. Например, маркерный ген выбран из группы, состоящей из GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, C1, R-nj, антоциановых пигментов и любого другого маркерного гена.
В другом аспекте способа первое растение представляет собой растение маиса, выбранное и/или полученное из линий Stock6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222-malt или из любой из нескольких других известных линий HI.
В одном варианте осуществления первое растение и второе растение принадлежат к разным видам. В одном аспекте первое растение представляет собой растение пшеницы, а второе растение представляет собой растение маиса. В другом аспекте первое растение представляет собой растение маиса, а второе растение представляет собой растение пшеницы.
Один объект изобретения представляет собой растение с отредактированными генами, полученное с помощью предусмотренного способа.
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается способ редактирования геномной ДНК растений, предусматривающий: (i) получение первого растения, где первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательную направляющую нуклеиновую кислоту; (ii) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию; (iii) опыление второго растения пыльцой от первого растения; (iv) применение композиции, содержащей липид или ингибитор фосфолипазы, непосредственно до, в ходе или после опыления согласно стадии (iii) и (v) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного с помощью опыления на стадии (iii), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленной первым растением. В одном аспекте композиция содержит метил-альфа-линоленоилфторфосфонат (MALFP), сложный этиловый эфир линолевой кислоты (LLAEE), линолевую кислоту (LLA), кукурузное масло, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), метиларахидонилфторфосфонат (MAFP), пальмитилтрифторметилкетон (PACOCF3), арахидонилтрифторметилкетон (AACOCF3), маноалид, сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный метиловый эфир олеиновой кислоты (ОАМЕ), сложный этиловый эфир олеиновой кислоты (ОАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитиновой кислоты (РАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитолеиновой кислоты (PLAEE), льняное масло, кукурузное масло, альфа-линоленовую кислоту (aLNA), гамма-линоленовую кислоту (gLNA), олеиновую кислоту, арахидоновую кислоту, стеариновую кислоту, 9(Z)-11(Е)-конъюгированную линолевую кислоту или 2-олеоил-1-пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин.
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается способ редактирования геномной ДНК растений, предусматривающий: (i) получение первого растения, где указанное первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательно направляющую нуклеиновую кислоту; (ii) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию; (iii) скрещивание первого растения со вторым растением и (iv) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного путем скрещивания на стадии (iii), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленной первым растением. В одном аспекте первое растение действует в качестве женского родительского растения в скрещивании на стадии (iii). В другом аспекте первое растение содержит мутацию в гене CENH3, гене ig1 или другую мутацию, обеспечивающую получение систем, индуцирующих гаплоиды, которые содержат геном отцовского растения.
ПРИМЕРЫ
I. Получение новых линий-индукторов гаплоидов, содержащих редактирующий механизм
Проводили трансформацию поддающейся трансформации линии маиса под названием NP2222 с помощью конструкции TALEN, и отдельно трансформировали эту линию с помощью Cas9 и конструкции направляющей РНК. Конструкцию TALEN (pBSC22808 (SEQ ID NO: 5) с TALEN, осуществляющими целенаправленное расщепление в пределах последовательности-мишени 5'-TCCAGGGTCAACGTGGAGACAGGGAGGTACGAACCGGTGACTGGCGAAGGAAGCA-3', SEQ ID NO: 6; последовательность для распознавания TALEN подчеркнута) и конструкцию Cas9 (pBSC23123 (SEQ ID NO: 7) с последовательностью направляющей РНК xZmPLAIIA, 5'-GGGTCAACGTGGAGACAGGG-3', SEQ ID NO: 8) сконструировали для введения целевых мутаций в четвертый экзон гена маиса под названием MATRILINEAL (MATL; GRAMENE ID: GRMZM2G471240). В том случае, если этот ген подвергают мутации в сайте-мишени с помощью TALEN или с помощью Cas9 и направляющей РНК, он нокаутируется, что приводит к потере функции белкового продукта. Ранее установили, что линии, которые являются гомозиготными по мутациям с потерей функции в MATL, представляют собой линии-индукторы гаплоидов, а это означает, что если их используют в качестве доноров пыльцы при скрещивании, то они индуцируют образование гаплоидов на полученных початках (см. заявку согласно РСТ на выдачу патента США №PCT/US2016/62548, поданную 17 ноября 2016 г., включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
Получали несколько трансгенных объектов и осуществляли их самоопыление с тем, чтобы получить семена Т1. Выращивали отдельные растения Т1 из трансгенного объекта MZET152408A042A. Обнаружили, что пять потомков Т1, которые сохранили две копии Cas9 и редактирующий механизм в виде направляющей РНК, были стабильно трансформированными, а также являлись гомозиготными мутантами по гену MATL. См. таблицу 1.
Figure 00000002
Мутации в MATL выявляли с использованием анализа TaqMan, в ходе которого амплифицируют копию MATL дикого типа (называемую в данном документе MATL или wt-MATL; причем эти термины используются взаимозаменяемо по всему данному документу). В том случае, если обе копии MATL мутировали, тогда этот анализ считают отрицательным (то есть "-"). Редактирующий механизм на основе Cas9 и направляющей РНК были стабильно встроены посредством конструкции 23123 (SEQ ID NO: 7). Проводили секвенирование на предмет мутаций в MATL посредством ПЦР и субклонирования. Проводили секвенирование четырех колоний каждого ПЦР-продукта, и при этом все колонии для данного отдельного растения имели одинаковую последовательность, что указывало на то, что все эти растения являлись гомозиготными мутантами по аллелю MATL (также упоминаемому в данном документе под названием matl при ссылке на вставку 4 пар оснований в MATRILINEAL, выявленную в Stock6 и других линиях, производных от Stock6, или μMATL при ссылке на любую другую индуцированную человеком мутацию в MATRILINEAL). У двух растений имелись делеции размером 8 п.о., а у трех растений делеции размером 13 п.о.
II. Использование новых линий HI в качестве мужского родительского растения и анализ потомков
Проводили скрещивание вышеуказанных новых растений HI в качестве доноров мужской пыльцы с контрольной линией женских растений, которая содержала рецессивный маркер цвета, но представляла собой дикий тип по гену MATL. Линии-индукторы гаплоидов, являющиеся мужскими растениями, представляли собой гомозиготный дикий тип в отношении того же маркера цвета. Таким образом, эта линия женских растений представляла собой негаплоидный индуктор и была гомозиготной по дикому типу в отношении гена MATL, но гомозиготным мутантом по маркеру цвета. Собирали семена, полученные в результате скрещиваний, и проростки, проросшие из них.
С проростками-потомками проводили несколько анализов. Проростки-потомки оценивали как диплоиды, если они не проявляли маркера цвета (потому что рецессивный маркер комплементировался индукторной ДНК мужского растения). Проростки-потомки оценивали как предполагаемые гаплоиды, если они действительно проявляли маркер цвета, потому что рецессивный маркер не комплементировался. Из 2656 высаженных семян авторы данного изобретения использовали анализ цвета и идентифицировали 90 проростков в качестве предполагаемых гаплоидов.
Дополнительно провели анализ 90 предполагаемых гаплоидов на присутствие гена MATL дикого типа с использованием маркерного анализа Taqman. Из них 82 были положительными по MATL, что означало то, что они не подверглись редактированию за счет редактирующего механизма, обеспечиваемым мужским родительским растением. Оставшиеся 8 предполагаемых гаплоидных проростков были отрицательными по MATL дикого типа при использовании маркера Taqman, что указывало на то, что они могли редактироваться за счет редактирующего механизма, обеспечиваемого мужским родительским растением.
Проводили анализ плоидности с помощью проточной цитометрии на этих 8 предполагаемых подвергнутых редактированию гаплоидных проростках с использованием ткани листьев в анализаторе плоидности. См. фигуры 1-8. Обнаружили, что четыре из них были истинными гаплоидами, тогда как остальные были в действительности диплоидами. Как обсуждается ниже, проводили ПЦР и секвенирование на присутствие мутаций в гене MATL в этих четырех истинных гаплоидах, а также в случае растения USR01350337-2, которое, согласно анализу Taqman MATL, не подверглось редактированию за счет механизма для редактирования генома.
Выявление того, что среди 90 предполагаемых гаплоидов были четыре диплоида, не было неожиданным, поскольку анализ проростков не является оптимальным и иногда дает ложнопозитивные результаты. Проводили проверку 90 гаплоидов на присутствие конструкции Cas9 (конструкции 23123) и обнаружили, что она отсутствовала у 86 из 90, включая четырех истинных гаплоидов, упомянутых выше. Напротив, у всех четырех отредактированных диплоидов, которые выявили в ходе анализа плоидности, присутствовала конструкция Cas9, что подтверждало их статус гибридных диплоидов, которые были ошибочно идентифицированы с помощью анализа гаплоидных проростков как являющиеся гаплоидами.
Затем использовали ткань листьев для выделения геномной ДНК и осуществляли реакцию ПЦР для секвенирования гена MATL у этих четырех истинных гаплоидных, предположительно отредактированных индивидуумов, уделив основное внимание последовательности, фланкирующей сайт для целевого мутагенеза направляющей РНК. Это должно было определить природу изменений, которые могли или не могли произойти в том участке. Проводили субклонирование фрагмента ПЦР с использованием коммерчески-доступного набора ТОРО Blunt IV и секвенировали по меньшей мере четыре колонии каждого (прямое и обратное секвенирование). См. таблицу 2 ниже для сравнения отредактированных аллелей и эталонного аллеля wt-MATL.
Figure 00000003
Figure 00000004
Отдельный USR01350333-3 давал отредактированный аллель MATL со вставкой аланина в пару оснований 1143 в последовательности кДНК (подчеркнута в таблице 2). Этого было бы достаточно, чтобы вызвать сдвиг рамки в кодирующей последовательности, что привело бы к преждевременному СТОП-кодону. То, что ранее считали отредактированным аллелем №2 USR01350333-3 (делеция 13 пар оснований из GACAAGGGAGGTAC), в действительности являлось результатом контаминации реакционной смеси для ПЦР. После повторного секвенирования подтвердили, что это растение имеет только один отредактированный аллель, и он был выявлен у 6 из 6 колоний.
Этот аллель являлся новым в том смысле, что он отсутствовал и в мужских, и в женских родительских растениях этого индивидуума. ID мужского родительского растения для этого индивидуума был USR01283391, и было выявлено, что данное растение является гомозиготным по делеции размером 8 п.о.
Отдельный USR01350344-2 предусматривает делецию А (делеция пары оснований 1143 в последовательности кДНК дикого типа). Этой мутации было бы достаточно, чтобы вызвать сдвиг рамки в кодирующей последовательности, что привело бы к преждевременному СТОП-кодону. После повторного секвенирования и выявления контаминации реакционной смеси для ПЦР авторы настоящего изобретения подтвердили, что это было обнаружено в 6 из 6 колоний. Идентифицированный ранее как отредактированный аллель №2 USR01350344-2 впоследствии это было идентифицировано как контаминация реакционной смеси для ПЦР.
Отдельный USR01350343-1 предусматривает вставку А в пару оснований 1143 последовательности кДНК. Этого было бы достаточно, чтобы вызвать сдвиг рамки в кодирующей последовательности, что привело бы к преждевременному СТОП-кодону. Это было обнаружено у 4 из 4 колоний.
Отдельный USR01350328-1 предусматривает делецию А (делеция пары оснований 1143 из последовательности кДНК дикого типа). Этой мутации было бы достаточно, чтобы вызвать сдвиг рамки в кодирующей последовательности, что привело бы к преждевременному СТОП-кодону. Это было обнаружено у 4 из 4 колоний.
Отдельный USR01350337-2 не имел изменений: его последовательность была на 100% идентична последовательности wt-MATL.
В итоге обнаружили, что 4 из 86 подтвержденных гаплоидов содержали мутации в гене MATL. Подтвердили, что эти растения являлись гаплоидами и не содержали ДНК Cas9. Совершенно очевидно, что трансген Cas9 был удален вместе с остальной частью ДНК, происходящей из мужского растения, в ходе эмбриогенеза, и что в процессе эмбриогенеза произошли изменения в геноме женского растения (происходящем из яйцеклетки).
Авторам настоящего изобретения известно, что изменения являются новыми и произошли в геноме женского растения в процессе эмбриогенеза, потому что линия-индуктор гаплоидов обычно производит гаплоиды материнского растения, и авторы подтвердили, что это были действительно гаплоиды. Можно было бы предположить существование вероятности того, что в действительности это отцовские гаплоиды и что изменения, которые авторы настоящего изобретения выявили, на самом деле представляли собой изменения, которые уже присутствовали в ДНК отцовского растения. Однако авторы данного изобретения смогли доказать, что дело обстоит иначе. Во-первых, мутации не совпадают с мутациями отцовского родительского растения. Это можно четко увидеть в таблицах 3 и 4 (показаны ниже). Отредактированное гаплоидное растение USR01350343-1 было гомозиготным по вставке одного нуклеотида ("А"), но мужское родительское растение имело делецию из 13 нуклеотидов. Аналогично растение USR01350328-1 было гомозиготным по делеции А, но мужское родительское растение имело делецию из 13 нуклеотидов. Эти примеры, взятые вместе, доказывают, что в процессе индукции гаплоидов возможно осуществление редактирования генома материнского растения, что приводит к образованию отредактированных гаплоидов материнского растения. В соответствии с этим и на основании анализа, определяющего присутствие MATL, и подтверждения посредством анализа плоидности, и с использованием трансгена Cas9 на стороне мужского растения под контролем промотора убиквитина маиса, показатель редактирования в ходе процесса индукции гаплоидов составлял приблизительно 4/86 или 4,65%.
Кроме того, показатель редактирования в ходе индукции гаплоидов может сильно отличаться в случае использования различных линий-индукторов гаплоидов или использования широких скрещиваний. Очевидно, что и индукция гаплоида у маиса с использованием мутантных линий MATL, и широкие скрещивания у ячменя, пшеницы или других культур действуют посредством схожих механизмов: оплодотворение сопровождается удалением генома. Очевидно также, что промежуток времени между оплодотворением и удалением генома был достаточно длинным для того, чтобы редактирующий механизм мог осуществить редактирование целевого гена в геноме линии, с которой гибридизировалась линия-индуктор (целевая гермоплазма). Следует отметить, что выбор промотора, управляющего экспрессией стабильно трансформированной системы белков редактирования, может оказывать большое влияние на показатель редактирования в гаплоидах. Использовали конститутивный промотор сахарного тростника (prSoUbi4), однако другие промоторы, вызывающие высокую или специфическую экспрессию в зародышевом мешке, яйцеклетке, пыльце или спермиях, могут быть более эффективными, особенно в случае широких скрещиваний, при которых ДНК самцов удаляется гораздо более надежно и быстро, чем во внутривидовых системах с использованием индуктора гаплоидов, таких как система с использованием индуктора гаплоидов маиса или система с использованием индуктора гаплоидов типа CENH3. Другими словами, в ходе широкого скрещивания, например, при скрещивании пыльцы маиса на колосках пшеницы, которое осуществляется для того, чтобы индуцировать гаплоиды материнского растения, лучше всего редактирующий механизм функционирует в пыльце маиса под управлением промотора, который характеризуется сильной экспрессией в пыльце или спермиях, возможно, дополнительно к экспрессии в зиготе, в результате чего присутствующий в избытке редактирующий механизм (РНК и белок) доставляется и присутствует в клетке зиготы и на последующих двух-, четырех- или восьмиклеточных стадиях развития зародыша, даже если ДНК мужского растения удаляется или утрачивается очень быстро.
Figure 00000005
Figure 00000006
III. Одновременные индукция и редактирование гаплоидов в элитных инбредных линиях маиса
Трансформируемую линию-индуктор гаплоидов, NP2222-HI, RWK, RWS или UH400 или Stock6 или любую другую линию-индуктор гаплоидов, у всех из которых уже имелись мутантные версии MATL, стабильно трансформировали с помощью конструкции, экспрессирующей систему модификации генома, такой как Cas9 + направляющая РНК (Cong, L. et al. 2013. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823), dCas9-FokI + направляющая РНК (Tsai, S. Q. et al. 2014, Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnol. 32, 569-576), TALEN (Li et al., 2012, High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. Nature Biotech. 30, 390-392), сконструированная мегануклеаза (Gao et al., 2010, Heritable targeted mutagenesis in maize using a designed endonuclease. Plant Journal. 61: 176-187), нуклеаза типа "цинковых пальцев" (Shukla et al. 2009. Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases. Nature 459, 437-441), dCas9-цитидиндезаминаза (Komor et al. 2016, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature17946) или любая другая система модификации генома. Затем трансгенную линию-индуктор гаплоидов, также экспрессирующую редактирующий механизм, используют в качестве донора пыльцы для создания мутаций и гаплоидов в целевых линиях посредством ауткроссинга. Гаплоидные зародыши или семена затем извлекают, идентифицируют как гаплоиды и тестируют в отношении изменений в сайте-мишени (какой бы целевой сайт не был выбран посредством разработки конструкции TALEN или разработки направляющей РНК Cas9). В гаплоидах, содержащих требуемые изменения, удваивали число хромосом с использованием стандартных процедур, с использованием стандартных средств, таких как колхицин, трифлуралин или другое средство для удвоения числа хромосом. Идентификацию индуцированных гаплоидов можно упростить с помощью маркера цвета, как это обычно проводят при получении гаплоидов кукурузы с удвоенным числом хромосом - этот маркер цвета может проявляться в полученных зародышах, семенах, проростках или во взрослом растении. Присутствие мутаций в сайте-мишени можно проверить с помощью анализа последовательностей (секвенирования ДНК), с помощью анализа маркеров или по фенотипу. Поскольку существует только одна копия ДНК для мутации в гаплоидных растениях, то рецессивные фенотипы должны отображаться так, чтобы это могло представлять собой другой способ идентификации гаплоидов, которые были отредактированы.
А. Мутагенез мишеней VLHP в элитной инбредной линии маиса с трансгенным локусом редактирования, созданным непосредственно в линии-индукторе гаплоидов.
VLHP1 и VLHP2 являются гомеобоксными генами гомеодомена-лейциновой застежки I класса и представителями класса белков, которые являются уникальными для растений. Домен HD вовлечен в связывание ДНК, тогда как домен Zip вовлечен в гомо- и гетеродимеризацию белка. Белки HD-Zip I обычно вовлечены в реакции, связанные с абиотическим стрессом, абсцизовой кислотой (ABA), синим светом, деэтиоляцией и эмбриогенезом (Elhiti and Stasolla, 2009. Structure and function of homodomain-leucine zipper (HD-Zip) proteins. Plant Signal Behav. 4: 86-88). VLHP1 и VLHP2 принадлежат к тому же семейству генов, что и Grassy Tillers1 (GT1). GT1 способствует покою боковых почек и супрессирует удлинение боковых ветвей початков у маиса.
В данном примере вектор 23396 (SEQ ID NO: 1; см. также фигуру 9) для экспрессии Cas9 и одиночной направляющей РНК (sgRNA) был создан для нацеливания на VLHP1 маиса (GRMZM2G104204) и его гомологичный ген VLHP2 (GRMZM2G062244). Вектор 23396 экспрессирует sgRNA с 20-нуклеотидной нацеливающей последовательностью xZmVLHP-01 (5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3', SEQ ID NO: 2). xZmVLHP-01 нацеливается на оба гена VLHP1 и VLHP2 во втором экзоне. Вектор 23396 вводили в трансформируемую линию-индуктор гаплоидов NP2222-HI с использованием Agrobacterium-опосредованной трансформации с отбором по утилизации маннозы. NP2222-HI получали в результате скрещивания трансформируемой инбредной линии NP2222 маиса с производной от Stock6 линией RWKS для интрогрессии в локус индукции гаплоидов (HI). NP2222-HI характеризовался средним показателем индукции гаплоидов, составляющим приблизительно 9,2%.
Трансформанты NP2222-HI из вектора 23396 анализировали в отношении модификации геномных целевых последовательностей VLHP (5'-GCAGGAGGCGTCGAGCA/GCG-3'; SEQ ID NO: 2). Наклонная черта ("/") представляет положение расщепления Cas9. Активность редактирования целевого локуса определяли с использованием способа количественной ПЦР Taqman, как описано ранее (WO 2016106121, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Трансгенные линии с высокими уровнями активностями модификации сайта-мишени, т.е. были модифицированы оба гена VLHP1 и VLHP2, и предпочтительно содержащие одну копию трансгена, отбирали для дальнейших исследований и использовали для скрещивания или получения потомков.
Пыльцу от трансформантов 23396 T0 использовали непосредственно для опыления початков элитной инбредной линии ID5829 или других линий маиса, в том числе линий сладкой кукурузы, для индукции получения гаплоидных зародышей. В качестве альтернативы трансформанты 23396 T0 на фоне NP2222-HI самоопылялись с получением линий потомков, несущих гомозиготный трансген, и при этом пыльцу от растений-потомков использовали для опыления других линий кукурузы, чтобы индуцировать образование гаплоидных зародышей. Индуцированные гаплоидные зародыши извлекали из ядер и помещали в среду для спасения зародышей для непосредственного прорастания или оставляли для созревания с образованием семян. Ткани из индуцированных гаплоидных эмбрионов и полученных в результате растений анализировали с тем, чтобы определить, происходило ли редактирование в целевых последовательностях VLHP. Если индуцированные гаплоидные зародыши или растения содержали требуемые мутации, то задействовали обработку для удвоения числа хромосом, чтобы получить из них линии, являющиеся двойным гаплоидом. Например, с использованием способа спасения зародышей зародыши извлекали из початков элитной линии ID5829, опыленных трансгенной линией-индуктором гаплоидов, несущей локус редактирования 23396, через 18-22 дня после опыления ("DAP", теоретически возможно извлечение между 10-25 DAP). ДНК выделяли из проросших гаплоидных проростков и использовали для анализа. Для удвоения числа хромосом по отношению к проростку использовали обработку колхицином. В качестве альтернативы средство для удвоения числа хромосом можно наносить на выделенные зародыши в ходе прорастания. ДНК извлекали из проросших проростков и использовали чтобы определить, произошла ли мутация в целевой последовательности xZmVLHP-01.
Доступны альтернативные способы. Можно предоставить возможность семени созреть и отобрать гаплоиды позже по другому фенотипу. Можно было бы дать возможность семени высохнуть и в более поздние сроки прорастить семена, чтобы определить гаплоиды без маркера (например, с использованием размера растения, а не гена, обеспечивающего маркер цвета), после чего можно будет проверить присутствие изменений и применять средства для удвоения числа хромосом в том случае, если это необходимо. Этот способ может иметь свои преимущества, заключающиеся в исключении скрининга и/или спасения зародышей.
В. Мутагенез мишеней GW2 в элитной инбредной линии маиса с трансгенным локусом редактирования, введенным непосредственно в линию-индуктор гаплоидов.
Мутация в DA2, гене E3-убиквитинлигазы, у риса приводила к получению более крупных семян (Song et al., 2007). У риса DA2 имелись 2 гомолога маиса, GW2-1 (GRMZM2G170088) и GW2-2 (GRMZM2G007288). Гены маиса на 94% идентичны на уровне белка и на 90% идентичны на уровне ДНК. GRMZM2G170088 содержал большую вставку размером 177 п.о. (59 аа) по сравнению с GRMZM2G007288.
В данном примере вектор 23399 (SEQ ID NO: 3, см. также фигуру 10) был создан для экспрессии Cas9 и sgRNA для нацеливания как на гены маиса GW2-1 (GRMZM2G170088), так и на их гомолог GW2-2 (GRMZM2G007288). Оба гена GW2-1 и GW2-2 содержали целевую последовательность xZmGW2-02 (5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3', SEQ ID NO: 4) в экзоне 1, и эту последовательность использовали для конструирования sgRNA, экспрессируемой из вектора 23399. Бинарный вектор 23399 экспрессировал одиночную направляющую РНК (sgRNA) с 20-нуклеотидной нацеливающей последовательностью xZmGW2-02, слитой с одиночной направляющей каркасной РНК, содержащей crRNA, и из tracrRNA. Вектор 23399 вводили в трансформируемую линию-индуктор гаплоидов NP2222-HI с использованием Agrobacterim-опосредованной трансформации с отбором по утилизации маннозы. NP2222-HI получали в результате скрещивания трансформируемой инбредной линии NP2222 маиса с производной от Stock6 линией RWKS для интрогрессии в локус индукции гаплоидов (HI).
Трансформанты NP2222-HI из вектора 23399 анализировали в отношении модификации геномных целевых последовательностей GW2-2 (5'-AAGCTCGCGCCCTGCTA/CCC-3', SEQ ID NO: 4; наклонная черта ("/") указывает на положение расщепления Cas9). Активность редактирования целевой последовательности определяли с использованием способа количественной ПЦР Taqman, как описано ранее (WO 2016106121). Трансгенные линии с высокими уровнями активностями модификации сайта-мишени, т.е. были модифицированы оба гена GW2-1 и GW2-2, и предпочтительно содержащие одну копию трансгена, отбирали для дальнейших исследований и использовали для скрещивания или получения потомков.
Пыльцу от трансформантов 23399 T0 использовали непосредственно для опыления початков элитной инбредной линии ID5829 или другой линии маиса, в том числе линий сладкой кукурузы, для индукции получения гаплоидных зародышей. В качестве альтернативы трансформанты 23399 T0 на фоне NP2222-HI самоопылялись с получением линий потомков, несущих гомозиготный трансген, и при этом пыльцу от растений-потомков использовали для опыления других линий кукурузы, чтобы индуцировать образование гаплоидных зародышей. Индуцированные гаплоидные зародыши извлекали из ядер и помещали в среду для спасения зародышей для непосредственного прорастания или оставляли для созревания с образованием семян. Ткани из индуцированных гаплоидных эмбрионов и полученных в результате растений анализировали с тем, чтобы определить, происходило ли редактирование в целевых последовательностях GW2 маиса. Если индуцированные гаплоидные зародыши или растения содержали требуемые мутации, то задействовали обработку для удвоения числа хромосом, чтобы получить из них линии, являющиеся двойным гаплоидом. Например, с использованием способа спасения зародышей зародыши извлекали из початков элитной линии ID5829, опыленных трансгенной линией-индуктором гаплоидов, несущей локус редактирования 23396, через 18-22 дня после опыления. ДНК выделяли из проросших гаплоидных проростков и использовали для анализа. Для удвоения числа хромосом по отношению к проростку использовали обработку колхицином. В качестве альтернативы средство для удвоения числа хромосом можно наносить на выделенные зародыши в ходе прорастания. ДНК извлекали из проросших проростков и использовали, чтобы определить, произошла ли мутация в целевой последовательности xZmGW2-02. В качестве альтернативы можно предоставить возможность семени созреть и отбирать гаплоиды позже по другому фенотипу. Семени даже можно предоставить возможность высохнуть, и в более поздние сроки прорастить семена, чтобы определить гаплоиды без маркера (например, с использованием размера растения, а не гена, обеспечивающего маркер цвета), после чего можно будет проверить присутствие изменений и применять средства для удвоения числа хромосом в том случае, если это необходимо. Этот способ может иметь свои преимущества, заключающиеся в исключении скрининга и/или спасения зародышей.
IV. Одновременная индукция гаплоидов и редактирование в кукурузе, рисе, подсолнечнике или любой другой сельскохозяйственной культуре посредством индукции гаплоидов на основе химических методик
Любая линия кукурузы, риса, пшеницы, томата, подсолнечника, ячменя или любой другой сельскохозяйственной культуры может быть трансформирована с помощью конструкции для редактирования (Cas9 с направляющими РНК, сконструированные для введения мутации в конкретный целевой сайт), и кроме того, необязательно можно сделать конструкцию для редактирования гетерозиготной или гомозиготной (посредством самоопыления трансформированного трансгенного объекта), а дальнейшее использование липидов или масел, наносимых в ходе ауткроссинга (опыление на целевые линии), индуцирует гаплоиды de novo и одновременно редактирует сайты-мишени в целевых геномах. Эти наносимые липиды обладали способностью индуцировать гаплоиды в случае применения по отношению к пыльце, кистям нитей рыльца, цветкам или кистям любого растения независимо от мужского родительского растения. В частности, от мужского родительского растения не требуется присутствия каких-либо мутаций в гене MATL (т.е. это может быть гомозиготный дикий тип для гена MATRILINEAL). Эти наносимые липиды индуцировали гаплоиды de novo без каких-либо генетических требований со стороны любого из родительских растений. См. заявку согласно РСТ на выдачу патента США №PCT/US2016/62548, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Механизм индукции гаплоидов de novo посредством липидного спрея, по-видимому, функционировал так же, как и в мутантных линиях matl (генетический индуктор гаплоидов): посредством удаления хромосом после оплодотворения. Гаплоидных потомков отделяли и проверяли на присутствие индуцированных мутаций (вызванных посредством процесса редактирования), а затем удваивали для получения отредактированных растений, являющихся удвоенным гаплоидом.
V. Мутагенез целевых последовательностей в элитной полевой кукурузе и инбредных линиях сладкой кукурузы с трансгенным локусом редактирования, интрогрессированным в линию-индуктор гаплоидов
Механизм для редактирования генома, экспрессирующего трансгенный локус, также может быть создан в обычной трансформируемой линии маиса без индуцирующей гаплоиды активности, как, например, А188, Hi-II или NP2222, а затем интрогрессирован в линию-индуктор гаплоидов, такую как NP2222-HI, RWK, RWKS, RWS, или UH400, или Stock6, или любую другую линия-индуктор гаплоидов.
В данном примере инбредная линия маиса NP2222 трансформирована векторами Cas9-sgRNA VLHP (23396 и 23397) и векторами Cas9-sgRNA GW2 (23398 и 23399). Векторы 23396 и 23399 описали в предыдущих примерах (пример IIIA и пример IIIB). Вектор 23397 (SEQ ID NO: 20) идентичен 23396 за исключением того, что gRNA-кодирующая последовательность xZmVLHP-01 (5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3', SEQ ID NO: 2) заменена на xZmVLHP-02 (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 21). Вектор 23398 (SEQ ID NO: 23) идентичен 23399 за исключением того, что gRNA-кодирующая последовательность xZmGW2-02 (5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3', SEQ ID NO: 4) в 23399 заменена на xZmGW2-01 (5'-GAGCGGTTCACGCGGCCGCA-3', SEQ ID NO: 23). Эти векторы были введены в штамм LBA4404 (pVGW7) Agrobacterium. Полученный в результате штамм Agrobacterium, содержащий векторы 23396, 23397, 23398 или 23399, использовали для трансформации незрелых зародышей трансформируемой элитной инбредной линии NP2222. Каллюсы индуцировали из инфицированных незрелых зародышей и отбирали на маннозной среде для восстановления трансгенных каллюсов. Трансгенные каллюсы помещали в среду для регенерации и укоренения для восстановления трансгенных растений, экспрессирующих редактирующий механизм CRISPR-Cas9. Трансгенные растения анализировали в отношении количества копий трансгена и перемещали в теплицу для получения семян.
Трансформанты с одной копией вектора 23396 (MZET154902A004A, MZET154902B006A), 23397 (MZET154903B009A, MZET154903B012A), 23398 (MZET154904B005A, MZET154904B014A) и 23399 (MZET154905A002A, MZET154905A010A) идентифицировали и подвергали обратному скрещиванию с нетрансгенным NP2222. Початки растений трансгенных потомков, содержащие вставку Т-ДНК каждого из вышеуказанных векторов, опыляли пыльцой линии-индуктора гаплоидов RWKS с получением потомков F1. Потомки F1, содержащие трансгенный локус и локус индукции гаплоидов, идентифицировали с помощью анализов генотипирования и подвергали самоопылению с получением семян потомства F2. Высаживали семена потомков F2, и с помощью анализов qPCR Taqman анализировали прорастающие растения с целью идентификации растений, гомозиготных по трансгенному локусу Cas9-sgRNA (анализ №2540) и по локусу индукции гаплоидов (анализ №2827).
Линии, гомозиготные по локусу индукции гаплоидов, и предпочтительно гомозиготные трансгенные локусы редактирования 23396, 23397, 23398 и 23399 Cas9-sgRNA, использовали для опыления початков целевой элитной линии полевой кукурузы ID5829 и линий сладкой кукурузы (SWC726 или SWC412F) с целью индукции гаплоидов. Индуцированные гаплоидные зародыши выделяли из опыленных початков ID5829, SWC412F, SWC726 и выращивали на средах для спасения зародышей. В качестве альтернативы опыленным початкам давали созреть и проращивали ядра с гаплоидными зародышами. Образцы листьев отбирали и анализировали с помощью анализа Taqman для идентификации растений, содержащих мутации в генах VLHP и GW2, однако отсутствовали генетические компоненты из линии индукции, такие как трансгенная Cas9-sgRNA или другие нетрансгенные последовательности маркерного гена. Идентифицированные гаплоидные растения с целевыми мутациями генов GW2 или VLHP обрабатывали колхицином для удвоения числа хромосом, чтобы восстановить гаплоидные растения с удвоенным числом хромосом для получения семян. В качестве альтернативы извлеченные гаплоидные зародыши можно обрабатывать средством для удвоения числа хромосом, таким как колхицин, и полученные растения анализировали в отношении уровня плоидности и присутствия целевых мутаций в генах GW2 или VLHP. Растения с целевыми мутациями генов GW2 и VLHP выращивали до зрелого состояния с целью получения семян и дальнейшей оценки потомков.
Например, отредактированные гаплоидные линии (JSER82A056 и JSER82A063) идентифицировали из скрещиваний между початками линии сладкой кукурузы SWC412F, опыленными гаплоидным индуктором, содержащим трансген Cas9-sgRNA 23399. Линия JSER82A056 содержала оба мутированных целевых гена: и GW2-01, и GW2-02, тогда как линия JSER82A063 содержала только мутированный ген GW2-02 (см. таблицу 5). Ни одна из этих линий не содержит трансген Cas9 (анализ №2540 для Cas9 или №1750 для селектируемого маркерного гена PMI) или ген индуктора гаплоидов (анализ №2827), поскольку геном мужского растения был удален из гаплоидов. Анализ уровня плоидности подтвердил, что обе линии являлись гаплоидами (фигуры 11 и 12). Обратите внимание, что гены дикого типа ("WT") в гаплоидах имеют номер копии "2", а мутант будет иметь "0", поскольку обозначение копии относится к количеству копий эндогенного гена ADH. Следовательно, гаплоидные линии, несущие неотредактированные гены GW2-01 или GW2-02 WT, будут иметь обозначение копии "2". Локус индуктора гаплоидов WT будет иметь обозначение копии "2" для анализа №2826 и "0" в случае анализа №2827 (вариант индуктора гаплоидов). Если линия растения кукурузы является диплоидом между сладкой кукурузой и трансгенным индуктором, то она будет гетерозиготной по гену индуктора гаплоидов и таким образом будет иметь обозначение копии "1" в случае анализа №2826 и анализа №2827.
Figure 00000007
Для дополнительного подтверждения специфического для мишени редактирования в этих гаплоидных линиях целевой участок GW2-02 амплифицировали из JSER82A063 с помощью ПЦР и проводили секвенирование ПЦР-продукта. Одно основание С было удалено в JSER82A063 по сравнению с последовательностью WT именно в сайте для расщепления с помощью Cas9 (фигура 13). Эти результаты четко продемонстрировали, что редактирующий механизм, внесенный в яйцеклетку от гаметофита мужского растения, способен редактировать геном женского растения до того, как геном мужского растения будет удален после двойного оплодотворения с образованием гаплоидного зародыша. Кандидатные отредактированные гаплоидные линии без трансгена обрабатывали путем введения 0,125% колхицина в 0,5% DMSO или пропитывания проростков в 0,06% растворе колхицина (Eder and Chalyk, 2002, In vivo haploid induction in maize. Theor. Appl. Genetics 104: 703-708). Обработанные линии высаживали в почву и выращивали в теплице для получения семян потомков.
VI. Одновременные индукция гаплоидов и редактирование у пшеницы и других однодольных растений посредством широкого скрещивания
Индукции гаплоидов также достигали с использованием межвидовых или межродовых широких скрещиваний (Kasha and Kao, 1970, High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature 225: 874-886). Например, гаплоиды пшеницы можно получать с помощью опыления с использованием различных межродовых скрещиваний с маисом (Suenaga и Nakajima 1989), жемчужным просом (Inagaki и Mujeeb-Kazi 1995), теосинте (Ushiyama et al. 1991), Н. bulbosum (Barclay 1975) и сорго (Ohkawa et al. 1992). Гаплоиды ячменя получали с помощью опыления пыльцой Hordeum bulbosum. Гаплоиды табака можно получать путем скрещивания с пыльцой N. africana. В других культурах существуют многие другие примеры.
Подобно примерам, приведенным выше, при введении трансгенного локуса редактирования в линию индукции Stock6 в эти линии можно вводить трансгенный локус редактирования, используемый для широких скрещиваний, с целью индуцирования гаплоидов и мутации целевой последовательности. Трансгенные линии, экспрессирующие редактирующие механизмы, могут быть получены в любой линии кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи, жемчужного проса, риса, капусты, салата, помидора или любой другой сельскохозяйственной культуры с помощью непосредственной трансформации или ауткроссинга. Предпочтительно трансгенный локус делали гомозиготным, а затем эту линию использовали в качестве донора пыльцы при широком скрещивании с другими совместимыми реципиентными сельскохозяйственными культурами, чтобы индуцировать гаплоиды для получения требуемых изменений. Процесс удаления генома после оплодотворения при широких скрещиваниях в основном такой же, как и в мутантной системе MATL маиса, хотя в некоторых случаях чужеродная ДНК, полученная из пыльцы, и редактирующий механизм могут быть удалены чуть раньше в ходе развития зародышей, поэтому данный способ предпочтительно применять на практике с использованием промотора, который управляет экспрессией редактирующего механизма в пыльце, спермиях и/или зиготной клетке, в результате чего присутствуют редактирующая РНК и белок, которые способны редактировать целевой геном, даже если ДНК мужского растения удалена достаточно быстро после оплодотворения.
Для демонстрации возможности осуществления одновременной индукции и редактирования гаплоидов посредством широких скрещиваний получали трансгенные линии маиса, экспрессирующие Cas9 и sgRNA, которые целенаправленно воздействуют на последовательности генов VLHP. Вектор 23763 (SEQ ID NO: 24) содержит кассеты экспрессии для Cas9 и sgRNA, содержащие протоспейсерную последовательность xTaVLHP1 (5'-GACGAGCAGGCGCAGTTCC-3', SEQ ID NO: 25) для направления Cas9-опосредованного расщепления сайтов-мишеней TaVLHP1 в пшенице. Геном пшеницы всего содержал три мишени xTaVLHP1 (TaVLHP1-4А, TaVLHP1-4 В и TaVLHP1-4D), каждая из которых имела три субгенома. Направляющая последовательность в 23397 (SEQ ID NO: 20), xZmVLHP (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 21) также будет направлять расщепление целевых последовательностей VLHP пшеницы xTaVLHP2-1A (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 26) или xTaVLHP2-1B (5'-TCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 27). В геноме китайской яровой пшеницы имеется три гена VLHP2A, содержащие xTaVLHP2-1A, и 3 гена VLHP2B, которые содержат последовательности xTaVLHP2-1B. Векторы 23397 и 23763 трансформировали в инбредную линию маиса NP2222 с использованием опосредованной Agrobacterium трансформации с целью получения трансгенных линий, экспрессирующих Cas9 и sgRNA. Линии трансгенного маиса выращивали в теплице и высаживали для получения растений Т1.
Пыльцу, собранную от растений трансгенного маиса Т0 или потомков Т1, несущих Т-ДНК вектора 23397 или 23763, использовали для опыления линии яровой пшеницы AC-Nanda с удаленными несозревшими пестиками. За один-два дня до периода цветения цветки пшеницы подвергали кастрации, а через два дня опыляли свежей пыльцой маиса, несущей редактирующий механизм. Для удобства, колоски из элитной линии пшеницы (16A300292) Syngenta с цитоплазматической стерильностью мужских растений ("CMS") также непосредственно использовали в качестве женских растений-доноров для индуцирования образования гаплоидных зародышей с помощью трансгенной пыльцы маиса, экспрессирующей Cas9-sgRNA 23397 или 23763. Зародыши извлекали из опыленных цветков через 14-20 дней после опыления для спасения зародышей, чтобы восстановить гаплоидные проростки из системы индукции гаплоидов пшеницы и маиса. Вырезанные зародыши культивировали либо на концентрированной MS (Murashige and Skoog 1962), либо на
Figure 00000008
MS или базальной среде В5, содержащей различные органические добавки в различных модификациях, и выращивали in vitro в течение 3-5 недель при 20-25°С и продолжительности дня 16 часов.
Например, пыльцу потомков Т1 от трансгенной линии маиса MZET164902A044A, содержащую вектор 23763, использовали для опыления колосков линии 16А300292 CMS для индукции гаплоидов пшеницы. Гаплоидные зародыши подвергали процедуре спасения, и полученный в результате гаплоидный проросток пшеницы отбирали для qPCR-анализа с целью определения количества копий целевых последовательностей VLHP (см. таблицу 6). Было выявлено, что одна из гаплоидных линий (JSWER30A22) содержала мутацию в гене TaVLHP1-4B, но не в его ортологах TaVLHP1-4A и TaVLHP1-4D в субгеномах А и D. Анализ уровня плоидности подтвердил, что JSWER30A22 являлся истинным гаплоидом (см. фигуры 14 и 15). Мутацию в целевом участке TaVLHP1-4B дополнительно характеризовали с помощью секвенирования, и было обнаружено, что в ней имелась делеция размером 97 п.о., начиная с предсказанного сайта расщепления для Cas9 (фигура 16). Также идентифицировали еще одну линию JSW16A07 с копией "0" в гене TaVLHP1-4A (анализ №3252), что подтвердило нацеленное редактирование в целевой последовательности. Однако делеция в этом гене-мишени, вероятно, была довольно большой при удалении сайта(сайтов) связывания праймеров, поскольку авторы изобретения не смогли восстановить ПЦР-продукт для секвенирования. Гаплоидные проростки с отредактированным сайтом-мишенью были пересажены в почву через 3-5 недель выращивания в культуре in vitro. Пересаженные проростки адаптировали в течение одной недели в ростовой камере при том же режиме условий окружающей среды. После образования побегов добавляли колхицин. Однако обработка, приводящая к удвоению хромосом, может быть выполнена раньше при спасении зародышей на стадии культивирования in vitro или позже после пересадки. В том случае, если сеянцы цельной пшеницы обрабатывают для удвоения числа хромосом, корни гаплоидного проростка обрезают, оставляя зону размером 2-3 см, а затем погружают в 0,1% раствор колхицина с 2% диметилсульфоксидом (DMSO) и прибл. 0,05% Tween-20 при 20°С на 5 часов. После этой обработки корни промывают для удаления остатков колхицина и высаживают в торфяную почву. Образцы растительных тканей могут быть удалены из гаплоидных проростков с целью выявления мутаций, чтобы идентифицировать растения, содержащие мутации в последовательностях генов-мишеней TaVLHP, но с полностью устраненными хромосомами маиса, включая последовательности, кодирующие трансгенный редактирующий механизм. Поскольку JSWER30A22 относится к линии CMS, то растение опыляют восстановителем для получения семян потомков.
Figure 00000009
Figure 00000010
Для дополнительной демонстрации возможности осуществления одновременной индукции и редактирования гаплоидов посредством широких скрещиваний создавали трансгенные линии кукурузы, экспрессирующие Cas9 из пяти промоторов, которые характеризовались высокой и/или специфической экспрессией в пыльце, вместе с sgRNA, целенаправленно воздействующими на последовательности гена VLHP пшеницы. Этими пятью векторами были 24038 (SEQ ID NO: 34), 24039 (SEQ ID NO: 35), 24079 (SEQ ID NO: 36), 24091 (SEQ ID NO: 37) и 24094 (SEQ ID NO: 38). Во всех пяти из этих векторов использовали одну и ту же sgRNA, содержащую протоспейсерную последовательность xTaVLHP2 (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 21) для направления Cas9-опосредованного расщепления сайтов-мишеней TaVLHP2 в пшенице. Геном пшеницы всего содержал три мишени xTaVLHP2 (TaVLHP2-2A, TaVLHP2-2B и TaVLHP2-2D), каждая из которых имела три субгенома. Направляющая последовательность в этих пяти конструкциях также направляет расщепление целевых последовательностей VLHP пшеницы, xTaVLHP2 (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 26) или xTaVLHP3 (5'-TCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 27). В геноме китайской яровой пшеницы имеется три гена TaVLHP2, содержащие xTaVLHP2, и 3 гена TaVLHP3, которые содержат последовательности xTaVLHP2-1B.
Вектор 24038 (SEQ ID NO: 34) содержит кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы высокоэкспрессирующегося промотора prZmGRMZM5G876285 и терминатора tZmGRMZM5G876285 из гена prf3 (гомолог 3 профилина) маиса, который характеризуется чрезвычайно высокой нативной экспрессией на уровне РНК и белка в пыльце, что свидетельствует о высокой экспрессии в спермиях.
Вектор 24039 (SEQ ID NO: 35) содержал кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы высокоэкспрессирующегося промотора prZmGRMZM2G020852 и терминатора tZmGRMZM2G020852 из гена ЕХРВ2 (БЕТА-ЭКСПАНСИН 2) маиса, который характеризовался чрезвычайно высокой нативной экспрессией на уровне РНК и белка в пыльце, что свидетельствует об экспрессии в спермиях.
Вектор 24079 (SEQ ID NO: 36) содержал кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы высокоэкспрессирующегося промотора prZmGRMZM2G146551 и терминатора tZmGRMZM2G146551 из гена ЕХРВ1 (БЕТА-ЭКСПАНСИН 1) маиса, который характеризовался чрезвычайно высокой нативной экспрессией на уровне РНК и белка в пыльце, что свидетельствует об экспрессии в спермиях.
Вектор 24091 (SEQ ID NO: 37) содержал кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы промотора prZmGRMZM2G471240 и терминатора tZmGMRMZM2G471240 из гена MATL (MATRILINEAL) маиса, который демонстрировал экспрессию на уровне РНК и белка в пыльце и, возможно, спермиях.
Вектор 24094 (SEQ ID NO: 38) содержал кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы промотора prZmGRMZM2G471240 и терминатора tZmGMRMZM2G471240 из гена MATL (MATRILINEAL) маиса, который демонстрировал экспрессию на уровне РНК и белка в пыльце и, возможно, спермиях. Эта конструкция дополнительно содержала N-концевое слияние флуоресцентного белка AmCyan на молекуле Cas9 для отображения и визуального контроля локализации Cas9 в пыльце.
Этими пятью векторами (24038, 24039, 24079, 24091 и 24094) трансформировали инбредную линию маиса NP2222 с использованием опосредованной Agrobacterium трансформации для образования трансгенных линий, экспрессирующих Cas9 и sgRNA.
Линии трансгенного маиса выращивали в теплице, и при этом трансгенные растения с одной и двумя копиями подвергали ауткроссингу с яровой пшеницей и линией пшеницы CMS. Пыльцу, собранную от трансгенных растений маиса Т0, несущих Т-ДНК одного из векторов 24038, 24039, 24079, 24091 и 24094, использовали для опыления линии яровой пшеницы AC-Nanda с удаленными несозревшими пестиками. Пыльцу также использовали для эксперимента qRT, в котором экспрессию Cas9 измеряли на уровне РНК и сравнивали с экспрессией Cas9 в образцах листьев в том случае, если Cas9 был под контролем промотора убиквитина сахарного тростника, используемого во многих примерах с кукурузой и пшеницей, приведенных выше. На фигуре 17 видно, что экспрессия была высокой в пыльце, в среднем в приблизительно 100 раз выше у растений, несущих векторы Т-ДНК 24038, 24039 и 24079, по сравнению с промотором убиквитина. Экспрессия также была выше в пыльце растений, содержащих векторы 24038, 24039 и 24079, по сравнению с пыльцой, несущей конструкции промотора MATRILINEAL (24094 и 24091), который, как известно, характеризуется более низкой экспрессией нативного гена. Все пять из этих промоторов имели паттерны экспрессии, которые ограничивались пыльцой. Признаком того, что указанные промоторы функционировали надлежащим образом, было отсутствие какой-либо наблюдаемой экспрессии Cas9 T0 в листьях проростков каллюса и отсутствие какого-либо редактирования сайтов-мишеней VLHP в листьях маиса Т0 (не вдаваясь в теорию, редактирование могло происходить в сайтах-мишенях маиса, по всей вероятности, на стадии зрелой пыльцы, когда Cas9 экспрессировался в первый раз).
За один-два дня до периода цветения из цветков пшеницы удаляли несозревшие пестики линии CMS и линии AC Nanda. Через два дня цветки опыляли свежей пыльцой маиса, несущей редактирующий механизм Cas9-sgRNA из любой конструкции 24038, 24039, 24091 или 24094 (у растений Т0, трансформированных конструкцией 24079, созревание было замедленным, и таким образом они не скрещивались с пшеницей). Зародыши пшеницы извлекали из опыленных цветков через 14-20 дней после опыления для спасения зародышей, чтобы восстановить гаплоидные проростки из системы индукции гаплоидов пшеницы и маиса. Вырезанные зародыши культивировали либо на концентрированной MS (Murashige and Skoog 1962), либо на 1/2 MS или базальной среде В5, содержащей органические добавки в различных модификациях, и выращивали in vitro в течение 1-5 недель при 20-25°С и продолжительности дня 16 часов. Например, пыльцу потомков Т0 от трансгенной линии маиса MZKE172601A100A, содержащую вектор 24039, использовали для опыления колосков линии 16А300292 CMS для индукции гаплоидов пшеницы. Гаплоидные зародыши подвергали процедуре спасения, и полученные в результате гаплоидные проростки пшеницы отбирали для qPCR-анализа с целью определения количества копий целевых последовательностей VLHP (таблица 7). В этом анализе проводили тестирование в отношении трансгена Cas9 с использованием анализа №2540. Все подвергнутые спасению и тестированию зародыши пшеницы не содержали этого трансгена и имели баллы "0" по Cas9, поскольку не имели ДНК кукурузы в развивающемся зародыше, а следовательно, не имели трансген. ДНК кукурузы полностью удалялась, выводилась или не доставлялась полностью прежде всего в ходе процесса индукции гаплоидов, который происходил во время и/или после оплодотворения. Помимо Cas9, проводили тестирование для анализов №3332 и №3333, которые дали неспецифическую амплификацию обоих аллелей VLHP2-2A и -2D. Эти анализы обычно интерпретируются как "2" или ">2" в гаплоидной пшенице, и при этом большинство гаплоидов, которые получили с использованием пыльцы трансгенного маиса, оценивали как 2 или >2 для этих анализов. Эти анализы использовали для поиска предполагаемых отредактированных гаплоидов, осуществляя поиск в отношении баллов 0 или 1. Обозначение "1" может указывать на то, что один из двух аллелей, VLHP2-2A или -2D, был отредактирован. И наконец, проводили тестирование для анализа 3255 на гаплоидах AC Nanda, который специфически выявлял VLHP2-2B. Линия CMS не усиливала этот анализ, даже если она дикого типа, поэтому ее не использовали для гаплоидов CMS. Не отредактированные гаплоиды давали балл "2", тогда как обнаруживались предполагаемые отредактированные гаплоиды, потому что они имеют балл "0". Балл "1" мог бы указывать на ошибочное чтение или химерный частично отредактированный образец.
Например, обнаружили, что одно из гаплоидных растений AC Nanda 440-А5 содержало мутацию в гене TaVLHP2-2B, но не в его ортологах TaVLHP2-2A и TaVLHP2-2D в субгеномах А и D (таблица 7). Данные согласно Taqman также продемонстрировали, что в нем отсутствовал трансген Cas9. Мутацию в пределах целевого участка TaVLHP2-2B дополнительно характеризовали с помощью секвенирования, однако, хотя авторы настоящего изобретения смогли амплифицировать аллели А и D, при этом они уже не смогли амплифицировать аллель В, что свидетельствовало о присутствии редактирования в гораздо большем объеме, очевидно, о большой делеции, приводящей к тому, что ПЦР-продукт уже не амплифицировался.
В качестве другого примера выявили, что одно из гаплоидных растений 450-D11 CMS содержало мутацию либо в гомологе TaVLHP2-2D, либо в гомологе -2А в соответствии с баллом "1" для обоих анализов 3332 и 3333 (Таблица 7). Данные согласно Taqman продемонстрировали, что в растении отсутствовал трансген Cas9. Целевые участки TaVLHP2-2A, -2 В и -2D. дополнительно охарактеризовали с помощью секвенирования, однако, хотя авторы настоящего изобретения смогли амплифицировать аллели А и В, при этом они уже не могли амплифицировать аллель D, что свидетельствовало о присутствии редактирования в гораздо большем объеме, которое привело к ошибке в ходе ПЦР.
При анализе гаплоидов пшеницы 2295, полученных в результате скрещиваний с пыльцой маиса, несущей одну из следующих пяти предпочтительных для пыльцы экспрессионных конструкций (24038, 24039, 24091 и 24094), выявили 15 гаплоидов, для которых получили данные в ходе анализа Taqman, указывающие на возможное редактирование в любом из сайтов-мишеней VLHP2-2A, VLHP2-2D или VLHP2-2B. После секвенирования было выявлено, что семь из этих гаплоидов содержали последовательности дикого типа в сайтах-мишенях и были названы ложно положительными из-за ошибки Taqman. Полагают, что эти ошибки связаны либо с тем фактом, что анализы №3332 и №3333 дали неспецифическую амплификацию обоих аллелей VLHP-2A и -2D, что привело к некоторым пропущенным сигналам, либо с небольшим количеством ДНК.
Среди остальных 8 предполагаемых отредактированных гаплоидов шесть представляли собой AC Nanda (440-B3, 440-D3, 440-A5, 447-G8, 456-G9, 459-A2), где трансген для редактирования был из конструкции 24038. Четыре из них (440-B3, 440-D3, 440-A5 и 456-G9) содержали изменения в VLHP2-2B. Они были выявлены, поскольку согласно анализу Taqman их балл был равен "0" в случае анализа 3255. У этих растений отсутствовал Cas9 (балл "0"), но им присвоили баллы "2" дикого типа в отношении VLHP2-2A или VLHP2-2D (анализы №3332 и №3333), что указывало на то, что по этим сайтам они не были отредактированы. С помощью анализа плоидности эти шесть растений были подтверждены как гаплоиды. Предприняли попытку секвенировать отредактированные аллели, однако, хотя реакции ПЦР и секвенирования работали надлежащим образом в случае с 2А и 2D, авторы настоящего изобретения не смогли получить ПЦР-продукт для 2 В. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомологи 2 В из этих гаплоидных растений. Это может указывать на то, что редактирование вызвало значительное изменение в гене 2 В у этих растений, что может привести к удалению сайта отжига праймера. Предполагали, что многие из растений CMS также имели изменения в сайте-мишени VLHP2-2B, но у авторов настоящего изобретения отсутствовала возможность проведения анализа для выявления аллеля VLHP2-2B из линии CMS.
При анализе только AC Nanda рассчитали, что общий показатель редактирования в этом аллеле составил 0,7% для всех конструкций, но в случае конструкции 24038 он был особенно высоким и составил 1,4%.
В дополнение к этим четырем отредактированным гаплоидам с баллами "0" для 3255 нескольким другим растениям присвоили баллы "0 или 1" или "1" в случае 3255, что указывало на возможный химеризм (частичное редактирование в определенных линиях клеток зародыша или ростка), однако в дальнейшем наблюдения за этими растениями не проводили. В случае гомолога VLHP2-2A AC Nanda растение 447-G8 содержало изменение, которое также не смогли секвенировать из-за ошибки в реакции ПЦР, хотя 2В и 2D действительно амплифицировались и содержали последовательность дикого типа. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомолог 2А. Как и в случае с VLHP2-2D, растение 459-А2 содержало изменение, которое не смогли секвенировать из-за ошибки в реакции ПЦР. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомолог 2D. Также выявили предполагаемые изменения в 447-Н12 и 440-G6, однако после секвенирования обнаружили, что эти результаты были ложноположительными.
В случае гаплоидов CMS растению 450-D11 присвоили баллы "1" в случае обоих анализов №3332 и 3333 (таблица 7). В ходе секвенирования выявили, что гомолог 2А содержал последовательность дикого типа, однако гомолог 2D не смогли амплифицировать с помощью ПЦР, что свидетельствовало о том, что произошло большое редактирование. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомолог 2D. В случае растения 452-В11 согласно анализу Taqman составил "0" для №3332 (VLHP2-2A), и при этом данный аллель не смогли амплифицировать для секвенирования, хотя ПЦР-продукты и последовательности 2D и 2 В были нормальными. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомолог 2А. Также выявили пять растений, у которых имелись предполагаемые изменения в соответствии с данными Taqman для анализов 3332 и 3333, однако ПЦР-секвенирование показало, что эти результаты были ложноположительными; при этом данная последовательность была дикого типа (неотредактированная).
В общей сложности авторы изобретения выявили два отредактированных гаплоида CMS и шесть отредактированных гаплоидов AC Nanda. Могло быть значительное большее количество отредактированных гаплоидов, которые не смогли выявить, поскольку отсутствовала возможность проведения анализов и в отношении гена 2В в случае растений CMS, и в отношении сайтов-мишеней в гене VLHP3 для направляющей РНК в этих пяти конструкциях.
Данные секвенирования для этих отредактированных гаплоидов согласуются с концепцией большой делеции, инверсии или перестройки вблизи сайта-мишени для направляющей РНК и простираются достаточно далеко, чтобы, возможно, включить удаление одного из сайтов связывания для праймера. Такой тип существенных изменений не редкость при редактировании с использованием Cas9, особенно в тех тканях, где репарация ДНК посредством негомологичного соединения концов происходит медленнее или подавляется, что может быть иметь место в случае только что оплодотворенной зиготы или раннего гаплоидного зародыша пшеницы.
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
Таким образом, обнаружили, что частота редактирования (количество идентифицированных отредактированных гаплоидов, деленное на общее количество гаплоидов) для конструкции 24038 составляла 0,79%; для конструкции 24039 составляла 0%; для конструкции 24091 составляла 0% и для конструкции 24094 составляла 0,75%. Тем не менее, эта скорость редактирования, безусловно, являлась заниженной, поскольку отсутствовала возможность проведения анализов для выявления изменений во многих целевых сайтах-мишенях для направляющей РНК. Кроме того, поскольку использовали пыльцу Т0, которая представляла собой либо копию 1, либо 2, то было известно, что при использовании пыльцы с копией 1 только 50% оплодотворяющих пыльцевых зерен будут содержать Cas9, и поэтому возможность редактирования существовала лишь для половины эмбрионов; аналогично для родительских растений копии 2, принимая во внимание случайную сегрегацию трансгенов при мейозе в мужском растении, можно было ожидать, что приблизительно 75% пыльцы содержали Cas9, поэтому 25% эмбрионов невозможно было отредактировать. Разумно предположить, что при попытке использования этой технологии одновременного редактирования с индукцией гаплоидов с помощью редактирующего механизма, переносимого пыльцой, в некоторых случаях более оптимальным может быть использование промотора, который экспрессируется специфически или на высоком уровне в пыльце и в спермиях, чтобы Cas9 мог экспрессироваться на более высоком уровне. В тех случаях, когда ген-мишень может воздействовать на развитие растения-индуктора гаплоидов, полезным может быть использование предпочтительного для пыльцы или спермиев промотора, который не экспрессируется в листьях, поскольку это позволило бы избежать редактирования гена-мишени в растении-индукторе гаплоидов в ходе развития скажем, в первый раз осуществлять редактирование в пыльце.
Поскольку спермии оплодотворяют яйцеклетку, то они способны доставлять РНК и белок Cas9 (а также саму трансгенную ДНК, интегрированную в одну из мужских хромосом, которые будут удалены). В работе с широким скрещиванием в данном примере было продемонстрировано, что может быть эффективным, чтобы Cas9 и/или направляющая РНК находились под контролем промотора, который специфически или на высоком уровне экспрессируется в пыльце и, в частности, в спермиях в случае использования индуктора гаплоидов в качестве мужского растения для редактирования элитных линий. Точно не было известно, экспрессируются ли MATRILINEAL, ЕХРВ1, ЕХРВ2 и PRF3 в вегетативном ядре, спермиях или обоих, и может ли иметь место какая-либо экспрессия в типе зиготных клеток, однако они были выбраны, поскольку предположительно они экспрессировались на высоком уровне и/или специфично в пыльце. Промотор PRF3 содержал мотив связывания DUO1 в промоторе, что могло указывать на то, что он экспрессируется в спермиях. Это согласуется с тем, что данный промотор имел более высокую частоту редактирования. Тот факт, что обнаружили много отредактированных гаплоидов пшеницы после широкого скрещивания, ясно дает понять, что при высокой экспрессии Cas9 в пыльце с использованием этих или любых других промоторов такая экспрессия может привести к редактированию в зародышах пшеницы после широкого скрещивания. Существует большая вероятность того, что эти промоторы, а также другие промоторы, которые управляют экспрессией в пыльце или, в частности, в спермиях, могут повысить эффективность процесса редактирования в ходе индукции гаплоидов кукурузы или индукции гаплоидов риса.
Аналогично в следующем примере ниже продемонстрировали редактирование гаплоидов у двудольного растения с использованием CENH3-модифицированной линии-индуктора гаплоидов, и при этом использовали конститутивный промотор для управления Cas9. Однако в попытке повысить эффективность редактирования гаплоидов авторы настоящего изобретения могут предпочесть промотор, который управляет высокой и/или специфической экспрессией в яйцеклетках, как, например, промотор гена EGG APPARATUS1 ("prEA1") (см., например, Gray-Mitsumune, М. and Matton, D.P., The Egg apparatus 1 gene from maize is a member of a large gene family found in both monocots and dicots, PLANTA 223(3): 618-625 (Feb. 2006)) или EGG CELL1 (EC1) (см., например, Sprunck S, et al., Egg cell-secreted EC1 triggers sperm cell activation during double fertilization. Science 2012; 338: 1093-97; PMID: 23180860; http://dx.doi.org/10.1126/science.1223944).
В качестве примера этого можно использовать промотор, экспрессируемый в спермиях, как, например, специфичный для спермиев Arabidopsis промотор DUO1 (см., например, Engel, et al., Green Sperm. Identification of Male Gamete Promoters in Arabidopsis, PLANT PHYSIOLOGY Aug 2005, 138 (4) 2124-2133; DOI: 10.1104/pp.104.054213) или гомологи DUO1 из других видов (например, оба гена маиса GRMZM2G105137 и GRMZM2G046443 являются гомологами DUO1, которые имеют сходный специфический в отношении пыльцы профиль экспрессии). Если использовать любой из них для управления экспрессией Cas9 в спермиях линии-индуктора гаплоидов, такой как RWK, NP2222-HI или мутантный matl, то он может создавать высокоэффективную линию-редактор гаплоидов для использования в редактировании разнообразной идиоплазмы элитной маиса или пшеницы посредством соответственно внутривидового или широкого скрещиваний.
Другие подходящие промоторы, экспрессируемые в спермиях, для данной концепции управления высокой экспрессией Cas9 в спермиях включают гомологи DUO1 у пшеницы, риса, ячменя, томата, подсолнечника или других однодольных или двудольных растений. Другие подходящие промоторы для данной концепции показаны в таблице 8 ниже. Эти промоторы или их гомологи в видах сельскохозяйственных культур могут быть очень полезными для данной концепции. Принцип работы заключается в том, что экспрессия в клетках гамет редактирующего механизма может улучшать скорость или эффективность согласно настоящему изобретению, поскольку это означает присутствие в избыточном количестве редактирующего белка или РНК, присутствующих в зародыше или доставляемых в зародыш в ходе оплодотворения, поэтому редактирование может происходить быстро.
Figure 00000016
VII. Одновременная индукция гаплоидов и редактирование у двудольных растений посредством широкого скрещивания или посредством скрещивания с CENH3-измененными линиями или другими индуцирующими гаплоиды линиями
Индукция гаплоидов in vivo также может быть достигнута с использованием межвидовых или межродовых широких скрещиваний видов двудольных растений, например, у хлопчатника (Turcotte et al. 1969, Semigametic production of haploids in pima cotton. Crop Sci. 9: 653-655) и табака (Burke et al., 1979, Maternal haploids of Nicotiana tabacum L. Science 206: 585; Wernsman et al. 1989, Androgenetic vs. gynogenetic doubled haploids of tobacco. Crop Sci. 29: 1151-1155). Гаплоидные растения Arabidopsis можно получать путем скрещивания с пыльцой мутантного растения CENH3 или путем скрещивания указанных растений в качестве женских растений с пыльцой дикого типа (Ravi and Chan, 2010, Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature 464: 615-618). Другие кандидатные гены, которые можно модифицировать для создания индуктора гаплоидов и линии редактирования SEDHI, включают KNL2 и CENPC (оба из которых могут действовать за счет опосредованного центромерами удаления генома неродительского растения), а также MSI2 и PLA2 подсолнечника. В данном случае индуцирующий гаплоиды геном (или мужского или женского растения при скрещивании) также содержал редактирующий механизм, поэтому редактирование может быть осуществлено в ходе индукции гаплоидов, результатом чего является отредактированные гаплоидные потомки материнского или отцовского растений без изменения CENH3 или редактирования трансгенов. См., например, патент США №WO 2017/004375, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Трансгенный локус, экспрессирующий редактирующий механизм, может быть введен в любые двудольные сельскохозяйственные культуры или их диких родственников: Brassica, томат, перец, салат, баклажан, сою, подсолнечник, сахарную свеклу, хлопок, люцерну, табак и другие. Трансгенные линии, экспрессирующие редактирующий механизм, затем использовали в качестве доноров пыльцы или в случае CENH3, или доноров пыльцы, или акцепторов в межвидовых или межродовых широких скрещиваниях для индукции гаплоидов и одновременного редактирования генома. Например, трансгенные линии CRISPR-Cas9 N. africana, экспрессирующие sgRNA, нацеливающие на гиббереллин-20-оксидазу табака, создавали посредством опосредованной Agrobacterium трансформации и использовали для опыления цветков табака с удаленными несозревшими пестиками для индуцирования гаплоидных растений с их геномом, отредактированным в локусе гиббереллин-20-оксидазы. Предпочтительно легко трансформируемую линию с большим количеством пыльцы использовали в качестве донора пыльцы для индукции гаплоидов и для временного обеспечения редактирующего механизма. Растение-реципиент для получения гаплоидов имело цветки, в которые легко было кастрировать, или же они являлись мужскими бесплодными растениями. Более предпочтительно, чтобы в линии индукции присутствовал маркер цвета или другой визуальный маркер или он был включен в редактируемый локус, чтобы легко отдифференцировать гаплоидные зародыши или растения от диплоидов, полученных в результате нормального развития зиготы.
Это проиллюстрировали с помощью использования линии-индуктора гаплоидов Arabidopsis в экотипе Columbia и ее трансформации с помощью конструкции, кодирующей экспрессию Cas9, и одиночной направляющей РНК, нацеливающей на ген GLABROUS1 (GL1), который при нокауте давал фенотип без трихом. Скрещивали Т0 в виде женских растений с использованием пыльцы экотипа Landsberg Erecta (Ler) и получали отредактированных по gl1 гаплоидных потомков.
Материалы индуктора гаплоидов получали из лаборатории Comai в Калифорнийском университете в Дэвисе. Эти материалы обычно использовали в качестве линий-индукторов гаплоидов отцовских растений (вызывая андрогенез, когда скрещивали в виде женских растений с мужскими растениями дикого типа), однако они могли также выполнять функцию индукторов гаплоидов материнских растений (вызывая гиногенез, когда скрещивали в виде мужских растений с женскими растениями дикого типа). Эти линии были изменены с тем, чтобы они стали индукторами гаплоидов за счет замены нативного гена CENH3 на трансген CENH3 Zea Mays, о чем упоминают в (Maheshwari, et al, 2017, Centromere location in Arabidopsis is unaltered by extreme divergence in CENH3 protein sequence. Genome Research 27(3)).
В частности, обе копии нативного гена AtCENH3 были нокаутированы и комплементированы с за счет стабильно вставленного трансгена ZmCENH3, который не влиял на нормальное развитие растений и не продуцировал гаплоиды при самоопылении, но давал приблизительно 10% гаплоидов при ауткроссе. Это представляет собой модификацию первоначальной концепции CENH3-tailswap, подробно описанной в (Ravi and Chan, 2010, Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature 464: 615-618) и ряде следующих публикаций.
После того, как получили линии CENH3* от Калифорнийского университета в Дэвисе, их выращивали, подтверждали, что они содержали трансген ZmCENH3 и были "ноль" гомозиготными по нативному гену AtCENH3. Это осуществляли путем разработки анализа qPCR taqman для ZmCENH3 (анализ №2298) и с использованием ПЦР и гель-электрофореза для тестирования 183 проростков на зиготность генотипа AtCENH3, осуществляя ПЦР с использованием прямого и обратного праймеров Xbal (SEQ NO TKX и TKY), и смесь Reddy при температуре отжига 60°С, и разрезание рестриктазой Xbal в течение ночи при 37°С. Аллель дикого типа может быть разрезан этим ферментом и давать две полосы (189 п.о., 25 п.о.), тогда как остается на уровне 215 п.о. Эти тесты показали, что все семена, которые, полученные от Калифорнийский университета в Дэвисе, были гомозиготными по мутантному аллелю Atcenh3-1, и что присутствовало несколько копий трансгена ZmCENH3.
С уверенностью в том, что эти полученные семена в действительности были индукторами гаплоидов, сохранили 100 растений и инициировали трансформацию цветочной почки с помощью бинарного вектора 24075 (SEQ ID NO: 98), содержащего кассету sgRNA, нацеливающую на ген (GL1) Arabidopsis (AT3G27920) в двух сайтах-мишенях. Целевыми последовательностями являлись 5'-GGAAAAGTTGTAGACTGAGA-3' и 5'-GCAGTGATGAACAATGACGG-3' (комплементарная нить). Разрушение гена GL1 приводило к видимым фенотипам частично или полностью голых растений (у голых растений отсутствуют трихомы). Ген Cas9 (cCas9-05) в этом векторе находился под управлением промотора фактора элонгации Arabidopsis thaliana. Вектор также содержал две кассеты селектируемого маркера, обеспечивающие устойчивость к Kan и флуоресценцию AmCyan, управляемые соответственно промотором СМР-02 и промотором Glycine max UBI-01. Вектор переносили в штамм агробактерии ЕНА101, а затем цветочную почку трансформировали в индуктор гаплоидов растений Arabidopsis.
Протокол трансформации был следующим: утром RecA Agrobacterium 24075 ЕНА101, культивированные в планшетах, вносили в планшеты YPSpec100Kan50. Культивирование проводили в темноте при 28°С в течение 24 часов. Готовили инфильтрационную культуральную среду (4 л):
Figure 00000008
соли XMS (8,66 г), 1X витамины Gamborg's В5 (4 мл), 5% (вес/об.) сахароза (200 г), 0,044 мкМ ВАР (12,5 мг - 12,5 мл DMSO) 40 мкл, с последующей стерилизацией фильтрацией. Затем добавляли 250 мкл 40 мг/мл AS (20 мг/л) и 25 мкл SIlwet L-77 (50 мкл/л) в 500 мл инфильтрационной культуральной среды. С помощью петли для сбора Agrobacterium и путем внесения в 50 мл пробирку с ~10 мл среды, стерилизованной фильтрацией, суспендировали Agrobacterium с получением 1 л с оптической плотностью, составляющей 0,54 при 600 нм. Цветоносный побег опускали в суспензионную среду на 20-30 секунд и использовали крышку, чтобы накрыть лоток. Во второй раз это повторяли с другой суспензией с OD, составляющей 0,552 при 600 нм.
Через приблизительно 4 недели после трансформации приблизительно 100000 самоопыленных семян собирали и инкубировали при 4°С в течение двух дней яровизации, а затем семена стерилизовали путем вымачивания в 70% этаноле в течение 1 минуты, а затем путем вымачивания в 50% (об./об.) отбеливателе с 0,05% (об./об.) тритоном Х-100 в течение дополнительных 10 минут, затем промывали семена в стерильной воде при четырех заменах. Затем семена помещали на чашки с канамицином (50 мкг/мл) для скрининга прорастания/отбора в помещении для растительных тканевых культур (день 23°С, ночь 24°С, освещение 16 часов). Путем отбора по устойчивости к канамицину идентифицировали 38 положительных трансформантов, и их выращивали в проростки перед переносом в почву, и отбирали пробы для тестирование на присутствие Т-ДНК Cas9 (анализ №3049), а также в отношении присутствия сайтов вырезания для двух направляющих РНК (анализы №3321 и №3322). Идентифицировали 10 однокопийных и 15 трансгенных объектов с 2 копиями, в которых имелись мутации обоих аллелей GL1 и которые характеризовались фенотипом без трихом. Согласно анализу qPCR эти растения ранжировали, поскольку они продемонстрировали доказательства активности Cas9 (по мутированному GL1 и неопушенному фенотипу), они имели трансген Cas9, и они имели трансген ZmCENH3. У этих растений инициировали цветение в течение длительного периода времени, поддерживая их в следующих условиях для роста: 16 часов свет, дневная температура 23°С, ночная температура 20°С, не >60% относительной влажности.
В то же время, поскольку эти гаплоидные растения-индукторы, которые трансформировали конструкцией Cas9, были идентифицированы, высевали и выращивали популяцию семян Landsberg Erecta (Ler), полученных из Центра биологических ресурсов Arabidopsis в Государственном университете Огайо (линия №CS20). Эти семена были дикого типа, а последовательность сайтов-мишеней для направляющей РНК GL1 в CS20 совпадала с последовательностью направляющей РНК в конструкции по настоящему изобретению. Обеим популяциям предоставили возможность расцвести и произвели приблизительно 2000 контролируемых скрещиваний с использованием растений Ler дикого типа в качестве мужского растения-донора пыльцы, скрещивая их с примерно 25 индукторами гаплоидов с конструкцией Cas9, которые использовали в качестве женского растения. Произвели до 100 скрещиваний на женское растение, маркируя скрещенные цветки черным маркером и удаляя цветки, которые не скрещивали, чтобы ограничить возможность сбора самоопыляемых стручков. В большинстве случаев перед опылением кастрировали цветки женских растений, удаляя пыльники щипцами, опять-таки, чтобы избежать контаминации самоопыляемыми семенами, однако в некоторых случаях это не являлось необходимостью, поскольку пыльники были молодыми или недоразвитыми.
Через приблизительно 15 дней собирали стручки, которые приобрели светло-коричневую окраску. Затем открывали стручки и высаживали семена в почву. Далее помещали их на 4 дня в ростовую камеру при температуре 6°С (день и свет), продолжительности дня 8 часов, при освещении 200 мкмоль/м2⋅с, при относительной влажности 60%. Затем их переносили на 7-10 дней в ростовую камеру: 16 часов света, дневная температура 23°С, ночная температура 20°С, не >60% влажности. Выявили высокую частоту абортированных семян почти во всех стручках, составившую в среднем приблизительно 40-50% от общего количества семян. Это количество абортированных зародышей в значительной степени согласовывалось с показателями для этого материала индуктора гаплоидов в опубликованных докладах. Не вдаваясь в теорию, предполагают, что причина абортирования семени, наиболее вероятно, заключалась в частичном или полном удалении генома в эндосперме, что приводило к дефициту и функциональной неспособности эндосперма. Это было природным явлением в линиях-индукторах гаплоидов типа CENH3 в ходе ауткроссинга и, вероятно, оно не связано с присутствием трансгена Cas9. Эти абортированные зародыши не прорастали. Из-за стабильного и достоверного уровня абортирования зародышей в каждом подвергнутом ауткроссингу стручке, в конечном итоге использовали отсутствие этого фенотипа для отбраковывания стручков, которые были результатом случайного самоопыления. Таким образом, проращивали стручки, которые были подвергнуты ауткроссингу.
В общей сложности выявили примерно 2000 проросших потомков, большинство из которых были подвергнуты ауткроссингу. Идентифицировали отредактированные гаплоиды с помощью комбинации анализа маркеров с помощью qPCR и/или фенотипического скрининга. Маркеры, которые авторы использовали для выявления отредактированных гаплоидов, были следующими.
Во-первых, проводили поиск в отношении "0" в случае теста ZmCENH3. Это указывало на то, что растение являлось гаплоидным, поскольку геном материнского растения был утрачен, и поэтому также был утрачен трансген ZmCENH3, который присутствовал в нескольких копиях материнского растения-индуктора гаплоидов. Диплоиды, напротив, будут представлять собой гибриды между геномами материнского и отцовского растений и будут иметь балл "1" или "2" или более высокий балл согласно Taqman для данного анализа, что зависит от количества копий материнского растения. Ключевым является то, что все диплоиды будут демонстрировать доказательства присутствия этого трансгена, однако гаплоиды отцовского растения, имеющие только геном Ler, не будут демонстрировать и таким образом будут иметь балл "0".
Во-вторых, проводили поиск в отношении балла "0" в случае анализа Cas9, который указывал на то, что оно не являлось трансгенным. Это также можно увидеть визуально с помощью флуоресцентного света и выявления флуоресцентного маркера CFP.
В-третьих, проводили поиск в отношении балла "0" для одного из анализов сайта-мишени GL1, что указывало на то, что растение было отредактировано. Диплоидные растения могли демонстрировать "0", "1" или "2" в случае этих анализов, однако гаплоиды продемонстрировали "2" или "0". Первая из двух направляющих РНК GL1, по-видимому, характеризовалась гораздо более высокой эффективностью редактирования, чем вторая, поскольку анализ 3321 имел высокое преимущество баллов "0" и "1" в индукторе гаплоидов T0, а 3322 имел в основном "2".
С использованием этих анализов смогли идентифицировать неотредактированные гаплоиды (которые имели балл "0" по ZmCENH3 и Cas9, однако имели баллы "2" по обоим целевым сайтам GL1), а также отредактированные гаплоиды (которые имели балл "0" по анализам ZmCENH3, Cas9 и GL1 (3321)). Также смогли идентифицировать диплоидные гибриды, которые содержали Cas9 (и часто редактировались в сайтах GL1), и диплоидные гибриды, которые не содержали Cas9 (и часто содержали одну отредактированную копию GL1 (от материнского родительского растения), но не другую и, таким образом, имели балл "1" в случае анализа GL1. Авторы также смогли идентифицировать несколько предполагаемых отредактированных гаплоидов, поскольку они имели балл "0" в случае анализа сайта-мишени (3321), ZmCENH3 (2298) и Cas9 (3049). См. таблицу 9 ниже для примера данных согласно Taqman для потомков от родительского USR01424136, содержащего три предполагаемых отредактированных гаплоида (растение 254 в лунке F2, растение 260 в лунке D3 и растение 261 в растении E3).
Figure 00000017
Путем лишь проращивания семян и отбора проб для анализа qPCR Taqman идентифицировали 8 предполагаемых отредактированных гаплоидов. Отредактированные гаплоиды также идентифицировали с помощью фенотипического визуального скрининга, а затем подтверждали с помощью анализа Taqman. Проводили скрининг отредактированных гаплоидов на присутствие растений без трихом или неопушенных растений, что указывало на то, что у них отсутствовали аллели дикого типа для гена GL1, и на отсутствие экспрессии голубого флуоресцентного белка ("CFP") в зародыше или корне проростка. Это указывало на то, что в них отсутствовала Т-ДНК Cas9. Выявили несколько таких растений и подвергли их анализу Taqman. У трех таких растений, которые идентифицировали фенотипически, с помощью анализов Taqman подтвердили, что они действительно являлись отредактированными гаплоидами. Также был известен тот факт, что возможно некоторые из этих неопушенных растений, у которых отсутствовал CFP, были ложноположительными, или по той причине, что CFP был молчащим, или из-за самоопыления полностью отредактированного материнского растения и получения нулевого сегреганта, полностью отредактированных (а следовательно, неопушенных) потомков. С помощью анализов Taqman это можно было выявить и отбраковать эти ложноположительные результаты, потому что с их помощью непосредственно тестировали на присутствие не только трансгена Cas9, но также аллеля ZmCENH3, который, несомненно, присутствовал бы в любом самоопыляющемся контаминирующем семени. Обнаружили несколько примеров самоопыляемых семян, которые все происходили из одного материнского растения. Протоколы опыления для данного материнского растения указывали на то, что пыльца была очень многочисленной, что могло привести к некоторому самоопылению. Этих потомков исключили из общего анализа.
Все предполагаемые отредактированные гаплоиды, идентифицированные с помощью анализа Taqman, подвергли секвенированию. Использовали ПЦР для амплификации отредактированных аллелей, а затем субклонировали и секвенировали по меньшей мере 8 колоний для каждого предполагаемого отредактированного аллеля. В таблице 10 приведены изменения в последовательности, которые обнаружили в отредактированных гаплоидах в первом сайте-мишени для направляющей РНК (анализ №3321), а также данные согласно Taqman по родительским растениям T0. В общей сложности обнаружили 19 предполагаемых отредактированных гаплоидов и подтвердили, что у 3321 сайтов-мишеней имелись мутации в 11 из 12 отредактированных гаплоидов, которые попытались секвенировать. Будут ли другие 7 также содержать мутации, будет подтверждено после секвенирования. См. выравнивание последовательностей для этих изменений на фигуре 24.
Figure 00000018
Кроме того, образцы листьев трех отредактированных гаплоидных растений проверяли посредством анализа плоидности наряду с использованием трех диплоидных контролей (ткани, отобранные у материнских родительских растений), которые продемонстрировали, что они были истинными гаплоидами (фигуры 18-23). Это служило подтверждением их статуса отредактированных гаплоидов.
В трех родительских линиях, в отношении которых была уверенность в том, что отсутствовала любая контаминация самоопылением, не проводили какой-либо фенотипический предварительный скрининг, а вместо этого отбирали всех проросших потомков для анализа Taqman (таблица 11). Тремя женскими родительскими растениями для этих потомков являлись USR01431603, USR01431609 и USR01431604. Обнаружили, что показатель индукции гаплоидов составлял приблизительно 9,7%, что рассчитывали путем деления количества потомков, у которых отсутствовали трансгены ZmCENH3 и Cas9 (59), на общее количество отобранных потомков (605). Обнаружили, что из 59 гаплоидов 10 были отредактированы. Это означало то, что в среднем 16,9% гаплоидов были отредактированы с помощью Cas9 материнского растения перед удалением генома материнского растения. Не ограничиваясь этим последним числом, это означало, что при использовании данной системы в качестве процента от общего потомства 9,7% * 16,9% = 1,64% от всего проросшего потомства представляли собой отредактированные гаплоиды.
Figure 00000019
Показатель редактирования гаплоидов типа CENH3* или редактирования гаплоидов другого отцовского растения (с использованием линии-индуктора гаплоидов материнского растения) может быть увеличен за счет использования промотора, который повышает экспрессию Cas9 и/или направляющей РНК до более высокого уровня в яйцеклетке до оплодотворения и/или в зиготе в ходе или после оплодотворения. Примером такого промотора может быть промотор для ЕА1 (EGG APPARATUS1) (GRMZM2G456746), хотя существует множество других примеров. Можно также экспрессировать Cas9 в контексте специфического для аппарата яйцеклетки энхансера (EASE), который представляет собой последовательность размером 77 п.о., стимулирующую экспрессию граничащих генов в яйцеклетке или в очень ранней зиготе (см., например, Yang, et al. An Egg Apparatus-Specific Enhancer of Arabidopsis, Identified by Enhancer Detection, PLANT PHYSIOLOGY Nov 2005, 139 (3) 1421-1432; DOI: https://doi.org/10.1104/pp.105.068262).
VIII. Одновременные индукция и редактирование гаплоидов путем непосредственной модификации целевого основания в последовательности геномной ДНК
Целенаправленный мутагенез последовательности ДНК также может быть достигнут за счет непосредственного превращения одного основания ДНК в другое без необходимости двухнитевых разрывов (DSB). Например, цитидиндезаминаза АРОВЕС1, адениндезаминаза и другие усиливающие компоненты, такие как урацил-ДНК-гликозилаза (UDG), могут быть слиты с никазой Cas9 (А840Н) или с инактивированной нуклеазой "мертвой" Cas9 (dCa9) для непосредственного редактирования последовательности ДНК без введения двухнитевых разрывов в ДНК (Komor et al. 2016. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature17946; Gaudelli et al. 2017. Programmable base editing of A:T to G:C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature24644; Komor et al. 2017. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Science Advances, Vol.3, no. 8, eaao4774, DOI: 10.1126/sciadv.aao4774). Эта разновидность механизма редактирования оснований также может быть доставлена посредством линии индукции гаплоидов с тем, чтобы индуцировать редактирование оснований в целевых последовательностях непосредственно в других сортах. Например, последовательность направляющей РНК xZmVLHP-03 (5'-AGGCGTCGAGCAGCGAGGTG-3', SEQ ID NO: 28) сконструирована для нацеливания на цитидиндезаминазную систему редактирования оснований для преобразования геномной последовательности экзона 2 гена ZmVLHP 5'-AGGCGTCGAGCAGCGAGGTG-3' (SEQ ID NO: 28) в 5'-AGGCGTTGAGCAGCGAGGTG-3' (SEQ ID NO: 29), с заменой таким образом аргининового кодона CGA на стоп-кодон (TGA) в кодирующей последовательности и инициацией преждевременной терминации последовательности белка и нокаута функционального гена. Мутация с заменой С на Т подчеркнута. Аналогично система редактирования оснований на основе химерной nCas9- или dCas9-адениндезаминазы может использоваться для мутации кодирующего участка, участка границы сплайсинга или промоторной последовательности ZmVLHP или других генов для создания вариантов, которые характеризуются измененной активностью генов. Как цитидиндезаминаза, так и адениндезаминаза являются особенно применимыми в изменении сайта сплайсинга транскрипта, поскольку канонический участок границы сплайсинга имеет последовательность 5'-…AG/GT…3' (или 5'-…АС/СТ…3' в противоположной нити).
IX. Одновременные индукция и редактирование гаплоидов путем замены аллеля с использованием матричной ДНК
In vivo систему индукции гаплоидов можно использовать не только для введения белка, РНК или ДНК с целью расщепления или преобразования целевой последовательности, но ее также можно использовать для доставки матричной ДНК с целью репарации путем гомологической рекомбинации для точной замены последовательности в целевом участке в форме трансгенной ДНК. Матричная ДНК может быть вставлена в геном линии-индуктора, несущей механизм для редактирования генома, такой как система CRISPR-Cas9, либо в том же трансгенном локусе, либо в другом локусе. В том случае, если в индуцированных гаплоидных зародышах присутствуют и Cas9-sgRNA, и матричная ДНК, то расщепление целевой последовательности приведет в результате к восстановлению хромосомного разрыва с помощью гомологичной трансгенной последовательности ДНК в качестве матрицы. Например, для создания мутации E149L в гене ZmPYL-D (GRMZM2G048733_P02) (см. WO 16033230, включенный в данное описание посредством ссылки) фрагмент ДНК, содержащий донорную последовательность (5'-CCTTGGTGTTGCCGTCGGGGACGTCGACGACGAATGACAGGATGACGAGCGTCCCTGGCCGGCCGTCGATGACCT-3', SEQ ID NO: 30), использовали в качестве донорной последовательности для репарации. Следует отметить, что дополнительные гомологичные последовательности могут быть добавлены для фланкирования этой основной донорной последовательности для репарации. Одну или несколько копий этой донорной последовательности для репарации встраивают в вектор экспрессии Cas9-sgRNA 23136 (SEQ ID NO: 31), который экспрессирует направляющую РНК 5'-GTCGGGGACGTCGACGACGA-3' (SEQ ID NO: 32), с получением вектора для модификации аллеля pBSC23136-AMD. Следует отметить, что потенциальный сайт РАМ был удален из донорных последовательностей ДНК, поэтому интегрированная донорная последовательность не будет расщепляться комплексом Cas9-sgRNA, экспрессируемым из pBSC23136-AMD. С использованием pBSC23136-AMD трансформировали линию-индуктор гаплоидов NP2222-HI для создания трансгенной редактирующей линии. Трансгенные редактирующие линии индукции гаплоидов самоопылялись с получением гомозиготных локусов редактирования линий потомства. Эти гомозиготные линии использовали для опыления целевых элитных инбредных линий маиса, чтобы индуцировать образование гаплоидов, а также для введения модификаций аллелей с помощью экспрессируемой Cas9-sgRNA с использованием донорной ДНК, временно присутствующей до того, как донорские хромосомы пыльцы будут удалены.
X. Индуцирование гаплоидов и одновременное редактирование генов у риса Получали линию HI риса. Например, ортолог риса MATL, Os03g27610 (SEQ ID NO: 33) подвергали мутации для создания новой линии HI риса. Эту линию трансформировали с использованием вектора, содержащего систему сайт-направленного мутагенеза для редактирования генома риса, например, систему CRISPR/Cas9.
Линию HI риса скрещивали с другой линией риса, предпочтительно элитной линией, для получения по меньшей мере одного гаплоидного зародыша-потомка. В ходе скрещивания для получения по меньшей мере одного гаплоидного зародыша-потомка родительское растение риса HI также инициирует механизм редактирования генома, например Cas9 с направляющей РНК, подлежащий доставке в эмбрион. На этом этапе редактирующий механизм осуществляет манипуляции по редактированию генома гаплоидного зародыша, за счет чего получают отредактированное гаплоидное растение-потомок.
XI. Анализы и условия согласно Taqman
Несколько анализов упоминаются по номеру или по названию мишени. Ниже приведена таблица вышеупомянутых анализов и последовательности соответствующих праймеров и зондов. Условия для ПЦР были стандартными для всех анализов, и они были следующими: денатурация при 98°С в течение 2 минут; затем 35 циклов (i) денатурации при 98°С в течение 30 секунд, (ii) отжиг при 60°С в течение 30 секунд, (iii) удлинение при 72°С в течение 1 минуты с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 10 минут с выдерживанием при 4°С до завершения. Анализы осуществляли при этих же условиях, если иное не указано ниже.
Figure 00000020
Figure 00000021
Figure 00000022
Figure 00000023
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЗИНГЕНТА ПАРТИСИПЕЙШНС АГ
<120> ОДНОВРЕМЕННЫЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ И ИНДУКЦИЯ ГАПЛОИДОВ
<130> 81189-WO-REG-ORG-P-1
<150> US 62/429260
<151> 2016-12-02
<160> 98
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 15722
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 23396
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (304)..(2100)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> ген
<222> (2117)..(6286)
<223> cCas9-01
<220>
<221> мутация
<222> (5606)..(5608)
<223> мутация L на V
<220>
<221> мутация
<222> (5651)..(5653)
<223> мутация I на V
<220>
<221> Терминатор
<222> (6292)..(6544)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (6551)..(6925)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(6946)
<223> xZmVLHP 2
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(7032)
<223> rsgRNAZmVLHP-01
<220>
<221> промотор
<222> (7042)..(9033)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (9050)..(10228)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (10251)..(10503)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (10547)..(10676)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (10956)..(11744)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (11839)..(11969)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (12706)..(13779)
<223> cRepA-01
<400> 1
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360
aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420
gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480
atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540
gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600
acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660 3
ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720
gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780
tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840
gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900
ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960
gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020
gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080
gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140
ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200
tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260
ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320
ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380
cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440
tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500
tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560
acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620
gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680
tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740
ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800
ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860
gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920
ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980
ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040
tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100
gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160
cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220
gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280
cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340
gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400
cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460
gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520 4
ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580
cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640
cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700
gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760
gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820
cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880
cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940
ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000
cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060
cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120
gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180
caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240
catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300
ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360
cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420
caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480
ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540
gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600
gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660
cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720
gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780
caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840
cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900
cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960
cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020
gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080
gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140
cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200
gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260
ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320
gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380
gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440 5
gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500
cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560
cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620
ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680
ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740
ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800
gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860
cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920
ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980
gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040
gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100
cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160
gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220
gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280
cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340
caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400
gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460
cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520
cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580
gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640
gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700
cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760
cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820
cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880
gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940
gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000
caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060
gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120
gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180
gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240
gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300 6
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540
gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600
taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660
acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720
acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780
ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840
gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900
aagagttgtg cagatgatcc gtggcagcag gaggcgtcga gcagcggttt tagagctaga 6960
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020
gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080
ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140
gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200
taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260
catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320
tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380
ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440
acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500
ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560
taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620
cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680
cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740
agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800
gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860
acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920
gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040
cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220 7
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060
gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120
catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180
cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240
cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300
gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360
cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420
caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480
catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540
ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600
cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660
cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720
ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780
cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840
ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900
ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960
gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020
cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080 8
ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140
cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200
ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260
acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320
tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380
ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440
acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500
atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560
aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620
gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680
aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740
gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800
gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860
caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580
ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640
aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700
ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760
cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820
tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880
tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940
tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000 9
cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060
tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120
caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180
cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240
tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300
gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360
gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420
ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480
cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540
tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600
aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660
gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860 10
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220
cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280
ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340
cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400
gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460
aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520
catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580
gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640
gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700
cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760
agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720
ta 15722 11
<210> 2
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность gRNA для редактирования VLHP1
<400> 2
gcaggaggcg tcgagcagcg 20
<210> 3
<211> 15722
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 23399
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (304)..(2100)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> ген
<222> (2117)..(6286)
<223> cCas9-01
<220>
<221> мутация
<222> (5606)..(5608)
<223> мутация L на V
<220>
<221> мутация
<222> (5651)..(5653)
<223> мутация I на V
<220>
<221> Терминатор
<222> (6292)..(6544)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (6551)..(6925)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(6946)
<223> xZmGW2 12
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(7031)
<223> rsgRNAZmGW2-02
<220>
<221> промотор
<222> (7042)..(9033)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (9050)..(10228)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (10251)..(10503)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (10547)..(10676)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (10956)..(11744)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (11839)..(11969)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (12706)..(13779)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (13822)..(14226)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (14904)..(15710)
<223> oCOLE-06
<400> 3
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360 13
aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420
gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480
atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540
gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600
acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660
ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720
gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780
tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840
gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900
ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960
gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020
gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080
gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140
ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200
tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260
ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320
ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380
cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440
tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500
tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560
acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620
gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680
tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740
ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800
ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860
gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920
ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980
ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040
tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100
gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160
cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220
gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280 14
cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340
gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400
cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460
gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520
ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580
cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640
cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700
gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760
gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820
cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880
cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940
ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000
cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060
cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120
gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180
caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240
catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300
ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360
cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420
caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480
ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540
gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600
gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660
cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720
gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780
caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840
cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900
cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960
cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020
gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080
gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140 15
cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200
gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260
ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320
gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380
gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440
gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500
cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560
cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620
ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680
ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740
ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800
gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860
cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920
ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980
gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040
gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100
cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160
gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220
gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280
cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340
caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400
gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460
cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520
cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580
gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640
gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700
cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760
cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820
cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880
gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940
gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000
caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060 16
gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120
gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180
gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240
gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540
gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600
taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660
acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720
acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780
ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840
gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900
aagagttgtg cagatgatcc gtggcaaagc tcgcgccctg ctacccgttt tagagctaga 6960
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020
gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080
ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140
gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200
taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260
catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320
tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380
ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440
acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500
ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560
taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620
cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680
cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740
agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800
gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860
acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920 17
gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040
cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060
gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120
catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180
cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240
cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300
gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360
cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420
caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480
catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540
ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600
cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660
cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720
ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780
cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840 18
ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900
ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960
gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020
cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080
ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140
cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200
ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260
acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320
tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380
ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440
acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500
atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560
aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620
gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680
aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740
gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800
gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860
caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580
ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640
aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700 19
ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760
cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820
tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880
tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940
tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000
cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060
tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120
caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180
cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240
tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300
gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360
gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420
ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480
cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540
tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600
aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660
gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620 20
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220
cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280
ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340
cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400
gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460
aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520
catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580
gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640
gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700
cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760
agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480 21
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720
ta 15722
<210> 4
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> для редактирования GW2-2
<400> 4
aagctcgcgc cctgctaccc 20
<210> 5
<211> 19617
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 22808
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (304)..(2100)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> ген
<222> (2119)..(5193)
<223> cTNPLAIIAFw-01
<220>
<221> Терминатор
<222> (5200)..(5452)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (5486)..(7478)
<223> prUbi1-10
<220>
<221> ген
<222> (7492)..(10566)
<223> cTNPLAIIARv-01
<220> 22
<221> Терминатор
<222> (10573)..(10825)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (10844)..(12835)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (12852)..(14030)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (14053)..(14305)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (14349)..(14478)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (14758)..(15546)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (15641)..(15771)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (15846)..(16571)
<223> cVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (16601)..(17674)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (17717)..(18121)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (18799)..(19605)
<223> oCOLE-06
<400> 5
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240 23
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360
aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420
gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480
atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540
gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600
acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660
ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720
gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780
tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840
gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900
ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960
gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020
gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080
gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140
ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200
tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260
ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320
ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380
cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440
tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500
tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560
acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620
gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680
tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740
ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800
ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860
gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920
ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980
ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040
tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100
gatcgcggcc gcgccaccat gggaaaacct attcctaatc ctctgctggg cctggattct 2160 24
accggaggca tggcccctaa gaaaaagcgg aaggtggacg gcggagtgga cctgagaaca 2220
ctgggatatt ctcagcagca gcaggagaag atcaagccca aggtgagatc tacagtggcc 2280
cagcaccacg aagccctggt gggacacgga tttacacacg cccacattgt ggccctgtct 2340
cagcaccctg ccgccctggg aacagtggcc gtgaaatatc aggatatgat tgccgccctg 2400
cctgaggcca cacacgaagc cattgtggga gtgggaaaac agtggtctgg agccagagcc 2460
ctggaagccc tgctgacagt ggccggagaa ctgagaggac ctcctctgca gctggataca 2520
ggacagctgc tgaagattgc caaaaggggc ggagtgaccg cggtggaagc cgtgcacgcc 2580
tggagaaatg ccctgacagg agcccctctg aacctgaccc ccgaacaggt ggtggccatt 2640
gccagccacg acggcggcaa gcaggccctg gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg 2700
tgccaggccc atggcctgac acctgaacag gtggtggcta tcgcctctca cgacggagga 2760
aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg 2820
actccagaac aggtggtggc tattgcttcc aatattgggg ggaaacaggc cctggaaact 2880
gtgcagcgcc tgctgccagt gctgtgccag gctcacggac tgacccccga acaggtggtg 2940
gccattgcca gcaacaacgg cggcaagcag gccctggaaa ccgtgcagag actgctgccc 3000
gtgctgtgcc aggcccatgg cctgacacct gaacaggtgg tggctatcgc ctctaacaac 3060
ggaggaaaac aggctctgga aacagtgcag cggctgctgc ctgtgctgtg tcaggctcac 3120
ggcttgactc cagaacaggt ggtggctatt gcttccaaca acggggggaa acaggccctg 3180
gaaactgtgc agcgcctgct gccagtgctg tgccaggctc acgggctgac ccccgaacag 3240
gtggtggcca ttgccagcaa cggcggcggc aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg 3300
ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct 3360
cacgacggag gaaaacaggc tctggaaaca gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag 3420
gctcacggct tgactccaga acaggtggtg gctattgctt ccaatattgg ggggaaacag 3480
gccctggaaa ctgtgcagcg cctgctgcca gtgctgtgcc aggctcacgg cctcactccc 3540
gaacaggtgg tggccattgc cagcaacatc ggcggcaagc aggccctgga aaccgtgcag 3600
agactgctgc ccgtgctgtg ccaggcccat ggcctgacac ctgaacaggt ggtggctatc 3660
gcctctcacg acggaggaaa acaggctctg gaaacagtgc agcggctgct gcctgtgctg 3720
tgtcaggctc acggcttgac tccagaacag gtggtggcta ttgcttccaa caacgggggg 3780
aaacaggccc tggaaactgt gcagcgcctg ctgccagtgc tgtgccaggc tcacggactg 3840
acccccgaac aggtggtggc cattgccagc aacggcggcg gcaagcaggc cctggaaacc 3900
gtgcagagac tgctgcccgt gctgtgccag gcccatggcc tgacacctga acaggtggtg 3960
gctatcgcct ctaacaacgg aggaaaacaa gcactcgaga cagtgcagcg gctgctgcct 4020 25
gtgctgtgtc aggctcacgg cttgactcca gaacaggtgg tggctattgc ttccaacaac 4080
ggggggaaac aggccctgga aactgtgcag cgcctgctgc cagtgctgtg ccaggctcac 4140
gggctgaccc ccgaacaggt ggtggccatt gccagcaaca tcggcggcaa gcaggccctg 4200
gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg tgccaggccc atggcctgac acctgaacag 4260
gtggtggcta tcgcctctaa caacggagga aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg 4320
ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg actccacagc aggtcgtggc aattgctagc 4380
aatatcggcg gacggcccgc cctggagagc attgtggccc agctgtctag acctgatcct 4440
gccctggccg ccctgacaaa tgatcacctg gtggccctgg cctgtctggg aggcagacct 4500
gccctggatg ccgtgaaaaa aggactgcct cacgcccctg ccctgattaa aagaacaaat 4560
agaagaatcc ccgagcggac ctctcacaga gtggccggat cccagctggt gaaatctgag 4620
ctggaggaga agaagtctga gctgagacac aagctgaagt acgtgcctca cgagtacatc 4680
gagctgatcg agatcgccag aaatagcacc caggatagaa tcctggagat gaaggtgatg 4740
gagttcttca tgaaagtgta cggctacaga ggaaagcatc tgggaggaag cagaaaacct 4800
gacggagcca tttatacagt gggcagccct atcgattatg gcgtgatcgt ggatacaaag 4860
gcctacagcg gaggctacaa tctgcctatt ggacaggccg atgagatgca gagatacgtg 4920
gaggagaacc aaaccaggaa caagcatatc aaccctaacg agtggtggaa ggtgtaccct 4980
tctagcgtga ccgagttcaa gttcctgttt gtgagcggcc acttcaaggg caattataag 5040
gcccagctga ccaggctgaa ccacatcaca aattgtaatg gcgccgtgct gtctgtggag 5100
gaactgctga ttggaggaga gatgattaag gccggaacac tgacactgga ggaggtgaga 5160
agaaagttca acaacggcga gatcaacttc tgaaagcttg atcgttcaaa catttggcaa 5220
taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 5280
ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 5340
gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 5400
cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcttcgaacc 5460
ctagtcgaag acaaccggtg catgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct 5520
agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac 5580
acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat 5640
aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt 5700
tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt 5760
ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc 5820
cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt 5880
tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta 5940 26
gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa 6000
caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata 6060
atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc 6120
gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct 6180
ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg 6240
cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc 6300
agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata 6360
aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca 6420
cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg 6480
tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc 6540
ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct 6600
gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc 6660
agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt 6720
catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat 6780
atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg 6840
atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg 6900
tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga 6960
agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga 7020
tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt 7080
cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa 7140
ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa 7200
atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg 7260
gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa 7320
gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat 7380
atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt 7440
gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcagcg gccgcgccac catgggaaaa 7500
cctattccta atcctctgct gggcctggat tctaccggag gcatggcccc taagaaaaag 7560
cggaaggtgg acggcggagt ggacctgaga acactgggat attctcagca gcagcaggag 7620
aagatcaagc ccaaggtgag atctacagtg gcccagcacc acgaagccct ggtgggacac 7680
ggatttacac acgcccacat tgtggccctg tctcagcacc ctgccgccct gggaacagtg 7740
gccgtgaaat atcaggatat gattgccgcc ctgcctgagg ccacacacga agccattgtg 7800 27
ggagtgggaa aacagtggtc tggagccaga gccctggaag ccctgctgac agtggccgga 7860
gaactgagag gacctcctct gcagctggat acaggacagc tgctgaagat tgccaaaagg 7920
ggcggagtga ccgcggtgga agccgtgcac gcctggagaa atgccctgac aggagcccct 7980
ctgaacctga cccccgaaca ggtggtggcc attgccagca acaacggcgg caagcaggcc 8040
ctggaaaccg tgcagagact gctgcccgtg ctgtgccagg cccatggcct gacacctgaa 8100
caggtggtgg ctatcgcctc tcacgacgga ggaaaacagg ctctggaaac agtgcagcgg 8160
ctgctgcctg tgctgtgtca ggctcacggc ttgactccag aacaggtggt ggctattgct 8220
tccaacggcg gggggaaaca ggccctggaa actgtgcagc gcctgctgcc agtgctgtgc 8280
caggctcacg gactgacccc cgaacaggtg gtggccattg ccagcaacgg cggcggcaag 8340
caggccctgg aaaccgtgca gagactgctg cccgtgctgt gccaggccca tggcctgaca 8400
cctgaacagg tggtggctat cgcctctcac gacggaggaa aacaggctct ggaaacagtg 8460
cagcggctgc tgcctgtgct gtgtcaggct cacggcttga ctccagaaca ggtggtggct 8520
attgcttccc acgacggggg gaaacaggcc ctggaaactg tgcagcgcct gctgccagtg 8580
ctgtgccagg ctcacgggct gacccccgaa caggtggtgg ccattgccag caacggcggc 8640
ggcaagcagg ccctggaaac cgtgcagaga ctgctgcccg tgctgtgcca ggcccatggc 8700
ctgacacctg aacaggtggt ggctatcgcc tctaacggcg gaggaaaaca ggctctggaa 8760
acagtgcagc ggctgctgcc tgtgctgtgt caggctcacg gcttgactcc agaacaggtg 8820
gtggctattg cttcccacga cggggggaaa caggccctgg aaactgtgca gcgcctgctg 8880
ccagtgctgt gccaggctca cggcctcact cccgaacagg tggtggccat tgccagcaac 8940
aacggcggca agcaggccct ggaaaccgtg cagagactgc tgcccgtgct gtgccaggcc 9000
catggcctga cacctgaaca ggtggtggct atcgcctctc acgacggagg aaaacaggct 9060
ctggaaacag tgcagcggct gctgcctgtg ctgtgtcagg ctcacggctt gactccagaa 9120
caggtggtgg ctattgcttc ccacgacggg gggaaacagg ccctggaaac tgtgcagcgc 9180
ctgctgccag tgctgtgcca ggctcacgga ctgacccccg aacaggtggt ggccattgcc 9240
agcaacatcg gcggcaagca ggccctggaa accgtgcaga gactgctgcc cgtgctgtgc 9300
caggcccatg gcctgacacc tgaacaggtg gtggctatcg cctctaacaa cggaggaaaa 9360
caagcactcg agacagtgca gcggctgctg cctgtgctgt gtcaggctca cggcttgact 9420
ccagaacagg tggtggctat tgcttccaac ggcgggggga aacaggccct ggaaactgtg 9480
cagcgcctgc tgccagtgct gtgccaggct cacgggctga cccccgaaca ggtggtggcc 9540
attgccagcc acgacggcgg caagcaggcc ctggaaaccg tgcagagact gctgcccgtg 9600
ctgtgccagg cccatggcct gacacctgaa caggtggtgg ctatcgcctc taatatcgga 9660
ggaaaacagg ctctggaaac agtgcagcgg ctgctgcctg tgctgtgtca ggctcacggc 9720 28
ttgactccac agcaggtcgt ggcaattgct agccacgacg gcggacggcc cgccctggag 9780
agcattgtgg cccagctgtc tagacctgat cctgccctgg ccgccctgac aaatgatcac 9840
ctggtggccc tggcctgtct gggaggcaga cctgccctgg atgccgtgaa aaaaggactg 9900
cctcacgccc ctgccctgat taaaagaaca aatagaagaa tccccgagcg gacctctcac 9960
agagtggccg gatcccagct ggtgaaatct gagctggagg agaagaagtc tgagctgaga 10020
cacaagctga agtacgtgcc tcacgagtac atcgagctga tcgagatcgc cagaaatagc 10080
acccaggata gaatcctgga gatgaaggtg atggagttct tcatgaaagt gtacggctac 10140
agaggaaagc atctgggagg aagcagaaaa cctgacggag ccatttatac agtgggcagc 10200
cctatcgatt atggcgtgat cgtggataca aaggcctaca gcggaggcta caatctgcct 10260
attggacagg ccgatgagat gcagagatac gtggaggaga accaaaccag gaacaagcat 10320
atcaacccta acgagtggtg gaaggtgtac ccttctagcg tgaccgagtt caagttcctg 10380
tttgtgagcg gccacttcaa gggcaattat aaggcccagc tgaccaggct gaaccacatc 10440
acaaattgta atggcgccgt gctgtctgtg gaggaactgc tgattggagg agagatgatt 10500
aaggccggaa cactgacact ggaggaggtg agaagaaagt tcaacaacgg cgagatcaac 10560
ttctgaaagc ttgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 10620
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 10680
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 10740
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 10800
gcggtgtcat ctatgttact agatcttcga agacggaccg cgcctgcagt gcagcgtgac 10860
ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc 10920
acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt 10980
aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga 11040
atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga 11100
ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca 11160
cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt 11220
tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa 11280
aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata 11340
aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt 11400
tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc 11460
aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt 11520
cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg 11580 29
catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc 11640
tcctctcacg gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct 11700
tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt 11760
gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc 11820
ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc 11880
cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt 11940
tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt 12000
ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc 12060
gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt 12120
ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt 12180
ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc 12240
tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat 12300
tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 12360
gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg 12420
tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta 12480
cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga 12540
gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact 12600
gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta 12660
tctattataa taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg 12720
gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc 12780
ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggatc 12840
cggcagcagc catgcagaag ctgatcaaca gcgtgcagaa ctacgcctgg ggcagcaaga 12900
ccgccctgac cgagctgtac ggcatggaga accccagcag ccagcccatg gccgagctgt 12960
ggatgggcgc ccaccccaag agcagcagcc gcgtgcagaa cgccgccggc gacatcgtga 13020
gcctgcgcga cgtgatcgag agcgacaaga gcaccctgct gggcgaggcc gtggccaagc 13080
gcttcggcga gctgcccttc ctgttcaagg tgctgtgcgc cgcccagccc ctgagcatcc 13140
aggtgcaccc caacaagcac aacagcgaga tcggcttcgc caaggagaac gccgccggca 13200
tccccatgga cgccgccgag cgcaactaca aggaccccaa ccacaagccc gagctggtgt 13260
tcgccctgac ccccttcctg gccatgaacg ccttccgcga gttcagcgag atcgtgagcc 13320
tgctgcagcc cgtggccggc gcccaccccg ccatcgccca cttcctgcag cagcccgacg 13380
ccgagcgcct gagcgagctg ttcgccagcc tgctgaacat gcagggcgag gagaagagcc 13440
gcgccctggc catcctgaag agcgccctgg acagccagca gggcgagccc tggcagacca 13500 30
tccgcctgat cagcgagttc taccccgagg acagcggcct gttcagcccc ctgctgctga 13560
acgtggtgaa gctgaacccc ggcgaggcca tgttcctgtt cgccgagacc ccccacgcct 13620
acctgcaggg cgtggccctg gaggtgatgg ccaacagcga caacgtgctg cgcgccggcc 13680
tgacccccaa gtacatcgac atccccgagc tggtggccaa cgtgaagttc gaggccaagc 13740
ccgccaacca gctgctgacc cagcccgtga agcagggcgc cgagctggac ttccccatcc 13800
ccgtggacga cttcgccttc agcctgcacg acctgagcga caaggagacc accatcagcc 13860
agcagagcgc cgccatcctg ttctgcgtgg agggcgacgc caccctgtgg aagggcagcc 13920
agcagctgca gctgaagccc ggcgagagcg ccttcatcgc cgccaacgag agccccgtga 13980
ccgtgaaggg ccacggccgc ctggcccgcg tgtacaacaa gctgtgatag gagctcgatc 14040
cgtcgacctg cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 14100
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 14160
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 14220
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 14280
gcggtgtcat ctatgttact agatcggcgc gccgcaattg aagtttgggc ggccagcatg 14340
gccgtatccg caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata 14400
tcctgccacc agccagccaa cagctccccg accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg 14460
atacaggcag cccatcagaa ttaattctca tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt 14520
gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt 14580
aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc 14640
gccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc 14700
ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg 14760
agggaagcgt tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag 14820
cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc 14880
ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca 14940
acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag 15000
attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat 15060
ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc 15120
ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat 15180
agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat 15240
ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc 15300
gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa 15360 31
atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag 15420
cccgtcatac ttgaagctag gcaggcttat cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc 15480
gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc 15540
aaataaagct ctagtggatc tccgtacccg gggatctggc tcgcggcgga cgcacgacgc 15600
cggggcgaga ccataggcga tctcctaaat caatagtagc tgtaacctcg aagcgtttca 15660
cttgtaacaa cgattgagaa tttttgtcat aaaattgaaa tacttggttc gcatttttgt 15720
catccgcggt cagccgcaat tctgacgaac tgcccattta gctggagatg attgtacatc 15780
cttcacgtga aaatttctca agcgctgtga acaagggttc agattttaga ttgaaaggtg 15840
agccgttgaa acacgttctt cttgtcgatg acgacgtcgc tatgcggcat cttattattg 15900
aataccttac gatccacgcc ttcaaagtga ccgcggtagc cgacagcacc cagttcacaa 15960
gagtactctc ttccgcgacg gtcgatgtcg tggttgttga tctagattta ggtcgtgaag 16020
atgggctcga gatcgttcgt aatctggcgg caaagtctga tattccaatc ataattatca 16080
gtggcgaccg ccttgaggag acggataaag ttgttgcact cgagctagga gcaagtgatt 16140
ttatcgctaa gccgttcagt atcagagagt ttctagcacg cattcgggtt gccttgcgcg 16200
tgcgccccaa cgttgtccgc tccaaagacc gacggtcttt ttgttttact gactggacac 16260
ttaatctcag gcaacgtcgc ttgatgtccg aagctggcgg tgaggtgaaa cttacggcag 16320
gtgagttcaa tcttctcctc gcgtttttag agaaaccccg cgacgttcta tcgcgcgagc 16380
aacttctcat tgccagtcga gtacgcgacg aggaggttta tgacaggagt atagatgttc 16440
tcattttgag gctgcgccgc aaacttgagg cagatccgtc aagccctcaa ctgataaaaa 16500
cagcaagagg tgccggttat ttctttgacg cggacgtgca ggtttcgcac ggggggacga 16560
tggcagcctg agccaattcc cagatccccg aggaatcggc gtgagcggtc gcaaaccatc 16620
cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc 16680
gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc 16740
ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat 16800
taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc tctatgacgt 16860
gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga 16920
ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc 16980
agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca 17040
tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt 17100
ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa 17160
agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac 17220
gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg 17280 32
ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg agctagctga 17340
ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga 17400
ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc 17460
aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg 17520
agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga 17580
gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa 17640
cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat 17700
tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca cgtacattgg 17760
gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat 17820
tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc 17880
ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc 17940
tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct 18000
acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct 18060
acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg 18120
ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc 18180
atccagccag aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt 18240
ggtgattttg aacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat 18300
ctgatccttc aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc 18360
agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 18420
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 18480
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 18540
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 18600
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 18660
ggcaaaagct ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 18720
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 18780
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 18840
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 18900
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 18960
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 19020
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 19080
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 19140 33
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 19200
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 19260
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 19320
gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 19380
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 19440
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 19500
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 19560
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttgatcc ggaatta 19617
<210> 6
<211> 55
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целевая последовательность для TALEN 22808
<400> 6
tccagggtca acgtggagac agggaggtac gaaccggtga ctggcgaagg aagca 55
<210> 7
<211> 15722
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 23123
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (304)..(2100)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> ген
<222> (2117)..(6286)
<223> cCas9-01
<220>
<221> мутация
<222> (5606)..(5608)
<223> мутация L на V
<220>
<221> мутация
<222> (5651)..(5653)
<223> мутация I на V 34
<220>
<221> Терминатор
<222> (6292)..(6544)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (6551)..(6925)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(6946)
<223> xZmPLAIIA
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(7031)
<223> rsgRNAZmPLAIIA02
<220>
<221> промотор
<222> (7042)..(9033)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (9050)..(10228)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (10251)..(10503)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (10547)..(10676)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (10956)..(11744)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (11839)..(11969)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (12706)..(13779)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (13822)..(14226)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (14904)..(15710) 35
<223> oCOLE-06
<400> 7
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360
aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420
gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480
atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540
gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600
acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660
ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720
gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780
tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840
gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900
ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960
gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020
gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080
gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140
ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200
tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260
ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320
ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380
cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440
tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500
tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560
acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620
gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680
tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740
ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800 36
ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860
gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920
ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980
ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040
tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100
gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160
cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220
gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280
cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340
gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400
cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460
gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520
ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580
cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640
cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700
gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760
gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820
cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880
cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940
ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000
cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060
cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120
gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180
caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240
catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300
ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360
cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420
caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480
ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540
gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600
gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660
cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720 37
gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780
caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840
cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900
cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960
cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020
gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080
gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140
cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200
gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260
ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320
gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380
gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440
gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500
cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560
cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620
ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680
ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740
ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800
gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860
cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920
ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980
gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040
gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100
cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160
gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220
gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280
cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340
caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400
gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460
cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520
cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580 38
gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640
gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700
cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760
cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820
cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880
gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940
gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000
caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060
gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120
gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180
gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240
gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540
gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600
taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660
acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720
acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780
ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840
gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900
aagagttgtg cagatgatcc gtggcagggt caacgtggag acaggggttt tagagctaga 6960
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020
gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080
ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140
gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200
taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260
catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320
tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380
ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440
acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500 39
ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560
taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620
cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680
cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740
agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800
gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860
acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920
gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040
cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060
gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120
catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180
cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240
cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300
gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360 40
cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420
caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480
catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540
ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600
cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660
cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720
ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780
cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840
ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900
ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960
gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020
cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080
ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140
cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200
ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260
acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320
tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380
ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440
acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500
atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560
aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620
gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680
aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740
gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800
gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860
caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280 41
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580
ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640
aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700
ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760
cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820
tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880
tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940
tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000
cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060
tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120
caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180
cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240
tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300
gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360
gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420
ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480
cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540
tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600
aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660
gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140 42
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220
cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280
ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340
cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400
gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460
aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520
catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580
gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640
gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700
cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760
agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060 43
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720
ta 15722
<210> 8
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> для редактирования MTL
<400> 8
gggtcaacgt ggagacaggg 20
<210> 9
<211> 41
<212> ДНК
<213> Zea mays
<400> 9
agggtcaacg tggagacagg gaggtacgaa ccggtgactg g 41
<210> 10
<211> 45
<212> ДНК
<213> Zea mays
<400> 10
agggtcaacg tggagacagg cgaggaggta cgaaccggtg actgg 45
<210> 11
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мутированный MTL 44
<400> 11
agggtcaacg tggagacaag ggaggtacga accggtgact gg 42
<210> 12
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мутированная часть MTL
<400> 12
agggtcaacg tggagaaccg gtgactgg 28
<210> 13
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мутированная часть MTL
<400> 13
agggtcaacg tggagacggg aggtacgaac cggtgactgg 40
<210> 14
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мутированная часть MTL
<400> 14
agggtcaacg tggagaaccg gtgactgg 28
<210> 15
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мутированная часть MTL
<400> 15
agggtcaacg tggagacaag ggaggtacga accggtgact gg 42
<210> 16
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мутированная часть MTL
<400> 16
agggtcaacg tggagacggg aggtacgaac cggtgactgg 40 45
<210> 17
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> немутированная часть MTL
<400> 17
agggtcaacg tggagacagg gaggtacgaa ccggtgactg g 41
<210> 18
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мутированная часть MTL
<400> 18
agggtcaacg tggagaaccg gtgactgg 28
<210> 19
<211> 1371
<212> ДНК
<213> Zea mays
<400> 19
agttcatcac taatcacact tattgttccc tcgacgagta tctagctagc tcattaatcg 60
atcaatcggg gtgtgcggtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120
aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180
cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240
atcctcgcct tcctcgaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300
gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360
gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420
gagaactgcc cgcgcatctt ccctcagaag agcaggcttg cggccgccat gtccgcgctg 480
aggaagccaa agtacaacgg caagtgcatg cgcagcctga ttaggagcat cctcggcgag 540
acgagggcca agagcacgcc tctgaagaac gctctgctct cggacgtgtg cattggcacg 600
tccgccgcgc cgacctacct cccggcgcac tacttccaga ctgaagacgc caacggcaag 660
gagcgcgaat acaacctcat cgacggcggt gtggcggcca acaacccgac gatggttgcg 720
atgacgcaga tcaccaaaaa gatgcttgcc agcaaggaca aggccgagga gctgtaccca 780
gtgaagccgt cgaactgccg caggttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcc 840
gagcagggcc tctacacggc gcggcagtgc tcccggtggg gtatctgccg gtggctccgc 900
aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctcgga cctggtggac 960 46
atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020
gacaactcgc tccgtggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080
acgctcgtcg ggatcgggga gcggatgctg gcacagaggg tgtccagggt caacgtggag 1140
acagggaggt acgaaccggt gactggcgaa ggaagcaatg ccgatgccct cggtgggctc 1200
gctaggcagc tctccgagga gaggagaaca aggctcgcgc gccgcgtgtc tgccatcaac 1260
ccaagaggct ctagatgtgc gtcgtacgat atctaagaca agtggcttta ctgtcagtca 1320
catgcttgta aataagtaga ctttatttta ataaaacata aaaatatata t 1371
<210> 20
<211> 15722
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 23397
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (304)..(2100)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> ген
<222> (2117)..(6286)
<223> cCas9-01
<220>
<221> мутация
<222> (5606)..(5608)
<223> мутация L на V
<220>
<221> мутация
<222> (5651)..(5653)
<223> мутация I на V
<220>
<221> Терминатор
<222> (6292)..(6544)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (6551)..(6925)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(6946) 47
<223> xZmVLHP
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(7031)
<223> rsgRNAZmVLHP-02
<220>
<221> промотор
<222> (7042)..(9033)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (9050)..(10228)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (10251)..(10503)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (10547)..(10676)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (10956)..(11744)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (11839)..(11969)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (12706)..(13779)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (13822)..(14226)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (14904)..(15710)
<223> oCOLE-06
<400> 20
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300 48
taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360
aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420
gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480
atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540
gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600
acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660
ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720
gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780
tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840
gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900
ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960
gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020
gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080
gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140
ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200
tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260
ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320
ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380
cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440
tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500
tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560
acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620
gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680
tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740
ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800
ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860
gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920
ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980
ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040
tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100
gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160
cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220 49
gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280
cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340
gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400
cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460
gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520
ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580
cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640
cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700
gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760
gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820
cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880
cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940
ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000
cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060
cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120
gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180
caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240
catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300
ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360
cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420
caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480
ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540
gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600
gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660
cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720
gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780
caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840
cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900
cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960
cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020
gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080 50
gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140
cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200
gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260
ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320
gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380
gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440
gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500
cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560
cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620
ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680
ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740
ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800
gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860
cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920
ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980
gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040
gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100
cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160
gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220
gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280
cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340
caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400
gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460
cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520
cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580
gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640
gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700
cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760
cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820
cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880
gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940
gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000 51
caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060
gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120
gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180
gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240
gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540
gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600
taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660
acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720
acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780
ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840
gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900
aagagttgtg cagatgatcc gtggcagctg gagctgagct tccggggttt tagagctaga 6960
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020
gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080
ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140
gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200
taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260
catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320
tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380
ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440
acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500
ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560
taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620
cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680
cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740
agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800
gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860 52
acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920
gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040
cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060
gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120
catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180
cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240
cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300
gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360
cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420
caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480
catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540
ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600
cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660
cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720
ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780 53
cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840
ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900
ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960
gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020
cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080
ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140
cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200
ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260
acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320
tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380
ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440
acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500
atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560
aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620
gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680
aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740
gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800
gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860
caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580
ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640 54
aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700
ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760
cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820
tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880
tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940
tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000
cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060
tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120
caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180
cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240
tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300
gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360
gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420
ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480
cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540
tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600
aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660
gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560 55
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220
cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280
ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340
cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400
gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460
aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520
catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580
gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640
gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700
cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760
agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420 56
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720
ta 15722
<210> 21
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> для редактирования VLHP2
<400> 21
gctggagctg agcttccggg 20
<210> 22
<211> 15722
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 23398
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (304)..(2100)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> ген
<222> (2117)..(6286)
<223> cCas9-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (5606)..(5608)
<223> мутация L на V
<220>
<221> другой_признак
<222> (5651)..(5653)
<223> мутация I на V
<220>
<221> Терминатор
<222> (6292)..(6544)
<223> tNOS-05-01 57
<220>
<221> промотор
<222> (6551)..(6925)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(6946)
<223> xZmGW2
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(7031)
<223> rsgRNAZmGW2-01
<220>
<221> промотор
<222> (7042)..(9033)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (9050)..(10228)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (10251)..(10503)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (10547)..(10676)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (10956)..(11744)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (11839)..(11969)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (12706)..(13779)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (13822)..(14226)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (14904)..(15710)
<223> oCOLE-06
<400> 22
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60 58
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360
aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420
gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480
atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540
gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600
acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660
ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720
gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780
tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840
gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900
ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960
gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020
gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080
gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140
ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200
tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260
ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320
ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380
cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440
tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500
tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560
acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620
gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680
tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740
ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800
ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860
gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920 59
ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980
ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040
tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100
gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160
cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220
gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280
cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340
gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400
cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460
gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520
ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580
cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640
cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700
gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760
gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820
cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880
cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940
ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000
cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060
cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120
gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180
caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240
catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300
ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360
cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420
caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480
ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540
gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600
gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660
cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720
gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780
caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840 60
cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900
cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960
cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020
gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080
gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140
cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200
gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260
ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320
gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380
gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440
gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500
cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560
cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620
ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680
ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740
ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800
gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860
cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920
ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980
gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040
gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100
cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160
gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220
gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280
cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340
caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400
gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460
cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520
cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580
gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640
gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700 61
cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760
cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820
cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880
gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940
gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000
caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060
gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120
gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180
gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240
gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540
gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600
taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660
acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720
acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780
ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840
gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900
aagagttgtg cagatgatcc gtggcagagc ggttcacgcg gccgcagttt tagagctaga 6960
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020
gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080
ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140
gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200
taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260
catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320
tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380
ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440
acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500
ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560
taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620 62
cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680
cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740
agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800
gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860
acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920
gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040
cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060
gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120
catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180
cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240
cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300
gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360
cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420
caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480 63
catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540
ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600
cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660
cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720
ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780
cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840
ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900
ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960
gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020
cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080
ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140
cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200
ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260
acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320
tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380
ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440
acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500
atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560
aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620
gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680
aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740
gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800
gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860
caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400 64
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580
ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640
aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700
ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760
cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820
tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880
tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940
tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000
cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060
tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120
caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180
cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240
tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300
gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360
gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420
ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480
cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540
tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600
aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660
gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260 65
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220
cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280
ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340
cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400
gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460
aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520
catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580
gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640
gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700
cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760
agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180 66
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720
ta 15722
<210> 23
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> для редактирования GW2-1
<400> 23
gagcggttca cgcggccgca 20
<210> 24
<211> 15721
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 23763
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (304)..(2100)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> ген
<222> (2117)..(6286)
<223> cCas9-01
<220>
<221> мутация
<222> (5606)..(5608)
<223> мутация L на V 67
<220>
<221> мутация
<222> (5651)..(5653)
<223> мутация I на V
<220>
<221> другой_признак
<222> (6221)..(6283)
<223> xSV40NLS-03
<220>
<221> Терминатор
<222> (6292)..(6544)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (6551)..(6925)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(6945)
<223> xTaVLHP1
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(7030)
<223> rsgRNA TaVLHP1-01
<220>
<221> промотор
<222> (7041)..(9032)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (9049)..(10227)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (10250)..(10502)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (10546)..(10675)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (10955)..(11743)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (11838)..(11968)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (12705)..(13778) 68
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (13821)..(14225)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (14903)..(15709)
<223> oCOLE-06
<400> 24
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360
aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420
gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480
atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540
gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600
acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660
ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720
gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780
tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840
gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900
ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960
gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020
gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080
gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140
ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200
tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260
ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320
ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380
cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440
tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500 69
tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560
acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620
gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680
tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740
ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800
ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860
gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920
ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980
ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040
tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100
gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160
cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220
gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280
cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340
gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400
cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460
gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520
ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580
cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640
cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700
gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760
gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820
cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880
cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940
ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000
cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060
cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120
gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180
caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240
catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300
ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360
cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420 70
caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480
ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540
gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600
gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660
cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720
gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780
caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840
cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900
cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960
cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020
gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080
gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140
cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200
gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260
ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320
gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380
gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440
gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500
cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560
cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620
ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680
ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740
ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800
gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860
cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920
ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980
gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040
gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100
cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160
gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220
gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280 71
cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340
caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400
gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460
cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520
cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580
gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640
gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700
cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760
cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820
cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880
gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940
gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000
caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060
gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120
gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180
gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240
gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540
gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600
taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660
acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720
acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780
ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840
gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900
aagagttgtg cagatgatcc gtggcagacg agcaggcgca gttccgtttt agagctagaa 6960
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 7020
cttttttttt cggaccgcgc ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga 7080
taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg 7140
tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat 7200 72
aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac 7260
atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt 7320
gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt 7380
tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta 7440
catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt 7500
tttatttaat aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat 7560
accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc 7620
agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc 7680
gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga 7740
gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag 7800
cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta 7860
cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag 7920
acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa 7980
ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc 8040
cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 8100
gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 8160
gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt 8220
tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat 8280
tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg 8340
tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg 8400
tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt 8460
tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga 8520
tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata 8580
tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca 8640
ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg 8700
aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg 8760
atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat 8820
gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt 8880
tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg 8940
atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat 9000
gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc agggatccgg cagcagccat gcagaagctg 9060 73
atcaacagcg tgcagaacta cgcctggggc agcaagaccg ccctgaccga gctgtacggc 9120
atggagaacc ccagcagcca gcccatggcc gagctgtgga tgggcgccca ccccaagagc 9180
agcagccgcg tgcagaacgc cgccggcgac atcgtgagcc tgcgcgacgt gatcgagagc 9240
gacaagagca ccctgctggg cgaggccgtg gccaagcgct tcggcgagct gcccttcctg 9300
ttcaaggtgc tgtgcgccgc ccagcccctg agcatccagg tgcaccccaa caagcacaac 9360
agcgagatcg gcttcgccaa ggagaacgcc gccggcatcc ccatggacgc cgccgagcgc 9420
aactacaagg accccaacca caagcccgag ctggtgttcg ccctgacccc cttcctggcc 9480
atgaacgcct tccgcgagtt cagcgagatc gtgagcctgc tgcagcccgt ggccggcgcc 9540
caccccgcca tcgcccactt cctgcagcag cccgacgccg agcgcctgag cgagctgttc 9600
gccagcctgc tgaacatgca gggcgaggag aagagccgcg ccctggccat cctgaagagc 9660
gccctggaca gccagcaggg cgagccctgg cagaccatcc gcctgatcag cgagttctac 9720
cccgaggaca gcggcctgtt cagccccctg ctgctgaacg tggtgaagct gaaccccggc 9780
gaggccatgt tcctgttcgc cgagaccccc cacgcctacc tgcagggcgt ggccctggag 9840
gtgatggcca acagcgacaa cgtgctgcgc gccggcctga cccccaagta catcgacatc 9900
cccgagctgg tggccaacgt gaagttcgag gccaagcccg ccaaccagct gctgacccag 9960
cccgtgaagc agggcgccga gctggacttc cccatccccg tggacgactt cgccttcagc 10020
ctgcacgacc tgagcgacaa ggagaccacc atcagccagc agagcgccgc catcctgttc 10080
tgcgtggagg gcgacgccac cctgtggaag ggcagccagc agctgcagct gaagcccggc 10140
gagagcgcct tcatcgccgc caacgagagc cccgtgaccg tgaagggcca cggccgcctg 10200
gcccgcgtgt acaacaagct gtgataggag ctcgatccgt cgacctgcag atcgttcaaa 10260
catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 10320
ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 10380
tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 10440
caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 10500
tcggcgcgcc gcaattgaag tttgggcggc cagcatggcc gtatccgcaa tgtgttatta 10560
agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag 10620
ctccccgacc ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata caggcagccc atcagaatta 10680
attctcatgt ttgacagctt atcatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg 10740
cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg 10800
ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc 10860
aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg 10920
tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaccatgagg gaagcgttga tcgccgaagt 10980 74
atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc catctcgaac cgacgttgct 11040
ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg aagccacaca gtgatattga 11100
tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg cggcgagctt tgatcaacga 11160
ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt ctccgcgctg tagaagtcac 11220
cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca gctaagcgcg aactgcaatt 11280
tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc gagccagcca cgatcgacat 11340
tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc gttgccttgg taggtccagc 11400
ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta tttgaggcgc taaatgaaac 11460
cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat gagcgaaatg tagtgcttac 11520
gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc gcgccgaagg atgtcgctgc 11580
cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc gtcatacttg aagctaggca 11640
ggcttatctt ggacaagaag atcgcttggc ctcgcgcgca gatcagttgg aagaatttgt 11700
tcactacgtg aaaggcgaga tcaccaaagt agtcggcaaa taaagctcta gtggatctcc 11760
gtacccgggg atctggctcg cggcggacgc acgacgccgg ggcgagacca taggcgatct 11820
cctaaatcaa tagtagctgt aacctcgaag cgtttcactt gtaacaacga ttgagaattt 11880
ttgtcataaa attgaaatac ttggttcgca tttttgtcat ccgcggtcag ccgcaattct 11940
gacgaactgc ccatttagct ggagatgatt gtacatcctt cacgtgaaaa tttctcaagc 12000
gctgtgaaca agggttcaga ttttagattg aaaggtgagc cgttgaaaca cgttcttctt 12060
gtcgatgacg acgtcgctat gcggcatctt attattgaat accttacgat ccacgccttc 12120
aaagtgaccg cggtagccga cagcacccag ttcacaagag tactctcttc cgcgacggtc 12180
gatgtcgtgg ttgttgatct agatttaggt cgtgaagatg ggctcgagct aggagcaagt 12240
gattttatcg ctaagccgtt cagtatcaga gagtttctag cacgcattcg ggttgccttg 12300
cgcgtgcgcc ccaacgttgt ccgctccaaa gaccgacggt ctttttgttt tactgactgg 12360
acacttaatc tcaggcaacg tcgcttgatg tccgaagctg gcggtgaggt gaaacttacg 12420
gcaggtgagt tcaatcttct cctcgcgttt ttagagaaac cccgcgacgt tctatcgcgc 12480
gagcaacttc tcattgccag tcgagtacgc gacgaggagg tttatgacag gagtatagat 12540
gttctcattt tgaggctgcg ccgcaaactt gaggcagatc cgtcaagccc tcaactgata 12600
aaaacagcaa gaggtgccgg ttatttcttt gacgcggacg tgcaggtttc gcacgggggg 12660
acgatggcag cctgagccaa ttcccagatc cccgaggaat cggcgtgagc ggtcgcaaac 12720
catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag aagttgaagg 12780
ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt gaatcgtggc 12840 75
aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc ggtgcgccgt 12900
cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg atgctctatg 12960
acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt ctgtcgaagc 13020
gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac gtagaggttt 13080
ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg atggcggttt 13140
cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag cccggccgcg 13200
tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat ggcggaaagc 13260
agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt gccatgcagc 13320
gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa gccttgatta 13380
gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag atcgagctag 13440
ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg acggttcacc 13500
ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg gcacgccgcg 13560
ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc agtggcagcg 13620
ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca aatgacctgc 13680
cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc atgcgctacc 13740
gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag atgctagggc 13800
aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat agcacgtaca 13860
ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac ccaaagccgt 13920
acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa ggcgattttt 13980
ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc tgtgcataac 14040
tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg tcgctgcgct 14100
ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca aaaatggctg 14160
gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca ctcgaccgcc 14220
ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc 14280
catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc 14340
agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg 14400
tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca 14460
agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc 14520
atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg 14580
aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag 14640
atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc 14700
ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga 14760 76
gaatggcaaa agctctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 14820
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 14880
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 14940
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 15000
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 15060
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 15120
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 15180
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 15240
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 15300
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 15360
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 15420
agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 15480
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 15540
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 15600
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 15660
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg atccggaatt 15720
a 15721
<210> 25
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> для редактирования VLHP1 у пшеницы
<400> 25
gacgagcagg cgcagttcc 19
<210> 26
<211> 20
<212> ДНК
<213> Triticum aestivum
<400> 26
gctggagctg agcttccggg 20
<210> 27
<211> 20
<212> ДНК
<213> Triticum aestivum
<400> 27 77
tctggagctg agcttccggg 20
<210> 28
<211> 20
<212> ДНК
<213> Zea mays
<400> 28
aggcgtcgag cagcgaggtg 20
<210> 29
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> редактированная часть ZmVLHP-03
<400> 29
aggcgttgag cagcgaggtg 20
<210> 30
<211> 75
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> восстановленная донорная матричная последовательность для создания мутации
E149L в ZmPYL-D
<400> 30
ccttggtgtt gccgtcgggg acgtcgacga cgaatgacag gatgacgagc gtccctggcc 60
ggccgtcgat gacct 75
<210> 31
<211> 15722
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 23136
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (304)..(2100)
<223> prSoUbi4-04
<220>
<221> ген
<222> (2117)..(6286)
<223> cCas9-01 78
<220>
<221> мутация
<222> (5606)..(5608)
<223> мутация L на V
<220>
<221> мутация
<222> (5651)..(5653)
<223> мутация I на V
<220>
<221> Терминатор
<222> (6292)..(6544)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (6551)..(6925)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(6946)
<223> xZmPYL-D
<220>
<221> другой_признак
<222> (6927)..(7031)
<223> rsgRBAZmPYLd-02
<220>
<221> промотор
<222> (7042)..(9033)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (9050)..(10228)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (10251)..(10503)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (10547)..(10676)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (10956)..(11744)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (11839)..(11969)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (12706)..(13779) 79
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (13822)..(14226)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (14904)..(15710)
<223> oCOLE-06
<400> 31
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360
aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420
gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480
atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540
gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600
acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660
ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720
gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780
tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840
gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900
ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960
gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020
gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080
gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140
ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200
tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260
ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320
ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380
cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440
tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500 80
tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560
acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620
gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680
tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740
ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800
ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860
gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920
ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980
ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040
tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100
gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160
cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220
gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280
cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340
gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400
cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460
gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520
ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580
cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640
cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700
gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760
gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820
cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880
cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940
ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000
cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060
cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120
gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180
caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240
catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300
ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360
cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420 81
caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480
ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540
gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600
gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660
cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720
gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780
caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840
cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900
cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960
cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020
gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080
gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140
cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200
gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260
ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320
gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380
gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440
gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500
cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560
cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620
ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680
ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740
ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800
gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860
cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920
ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980
gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040
gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100
cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160
gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220
gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280 82
cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340
caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400
gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460
cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520
cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580
gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640
gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700
cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760
cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820
cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880
gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940
gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000
caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060
gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120
gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180
gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240
gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540
gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600
taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660
acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720
acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780
ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840
gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900
aagagttgtg cagatgatcc gtggcagtcg gggacgtcga cgacgagttt tagagctaga 6960
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020
gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080
ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140
gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200 83
taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260
catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320
tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380
ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440
acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500
ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560
taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620
cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680
cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740
agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800
gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860
acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920
gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040
cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060 84
gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120
catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180
cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240
cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300
gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360
cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420
caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480
catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540
ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600
cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660
cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720
ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780
cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840
ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900
ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960
gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020
cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080
ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140
cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200
ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260
acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320
tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380
ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440
acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500
atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560
aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620
gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680
aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740
gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800
gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860
caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980 85
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580
ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640
aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700
ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760
cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820
tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880
tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940
tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000
cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060
tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120
caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180
cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240
tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300
gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360
gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420
ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480
cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540
tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600
aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660
gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840 86
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220
cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280
ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340
cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400
gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460
aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520
catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580
gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640
gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700
cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760 87
agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720
ta 15722
<210> 32
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая gRNA для вектора 23136
<400> 32
gtcggggacg tcgacgacga 20
<210> 33
<211> 1823
<212> ДНК
<213> Oryza sativa
<400> 33
acagtgacta gtgacaaacg atcgatcgat ccctccatcc acaaaccctc ctcgatctca 60
tcttccttcg tctcgtcaat ggcggcgagc tactcgtgcc ggcggacatg cgaggcgtgc 120
agcacgaggg cgatggccgg gtgcgtggtg ggcgagccgg cgtcggcgcc ggggcagcgg 180
gtgacgttgc tggcgatcga cggcggcggc atcaggggcc tcatcccggg caccatcctc 240
gccttcctcg aggccaggct gcaggagctg gatggccccg acgcgcgcct cgccgattac 300 88
ttcgactgca tcgccgggac cagcaccggc ggcctcatca ccgccatgct cgccgcgccc 360
ggcgaccacg gccgcccgct cttcgccgcc agcgacatca accgcttcta cctcgacaac 420
ggcccactca tcttcccaca aaagtaactg atcacctcga attcgatctc ctctcttcga 480
tctctgcatt atttgatttg attggggatt gtgggcggcg tggcgtggcg tccaggaggt 540
gcggcatggc ggcggccatg gcggcgctga cgaggccgag gtacaacggc aagtacctgc 600
aggggaagat caggaagatg ctgggcgaga cgagggtgcg cgacacgctg acgaacgtcg 660
tcatccccac gttcgacgtc aggctgctcc agccaaccat cttctccaca tacgacgtgc 720
gtgcgttgat tccatccgca ttggcgttgg aatcagctga ttgtttgatt gatcgaacaa 780
ttgatcggtt aaaattttgc aggcgaagag catgccgctc aagaacgcgc tcctctccga 840
catctgcatc agcacatccg cggcgccgac ctacctcccc gcgcactgct tccagaccac 900
cgacgacgcc accggcaagg tccgcgagtt cgacctcatc gacggcggcg tcgccgccaa 960
caacccggta actaatcaat caagcaatcc atcaaacgaa gatccacatg tgcattcctg 1020
tggtacaaat gctgatcgat cgatggatgg atcgattttc gcgagaacgt acagacgatg 1080
gtggccatga cgcagatcac caagaagata atggtgaagg acaaggagga gctgtacccg 1140
gtaaagccgt cggactgcgg taagttcctg gtgctgtccg tgggcaccgg gtcgacgtcg 1200
gaccagggga tgtacacggc gaggcagtgc tcgcggtggg ggatcgtccg gtggctgcgc 1260
aacaagggga tggcgcccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctccga cctcgtcgac 1320
atccacgccg ccgtcatgtt ccagtcgctg cacagcgacg gcgactacct ccgcatccag 1380
gacaacacgc tccacggcga cgccgccacg gtggacgccg ccaccaggga caacatgcgg 1440
gcgctcgtcg ggatcggcga gcggatgctg gcgcagcggg tgtcgagggt caacgtcgag 1500
accggcaggt acgtcgaggt gcccggcgcc ggcagcaacg ccgacgcgct gaggggcttc 1560
gccaggcagc tctccgagga gaggagggcg aggctaggtc ggcgaaacgc ctgcggcggc 1620
ggcggcgaag gagagcccag cggcgtggcg tgcaagcgtt agtaactgta cacgcatcat 1680
gctgacgcga tcttttttat ttttcttttt ttttttttac ctttctagcg gacatgggga 1740
ataacaagac gtgacagtag tgcaatcggt ttgtaacgtg cgtataccaa cattgatcca 1800
tttcttcatc acagtttcag ttc 1823
<210> 34
<211> 15921
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 24038 89
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (313)..(1149)
<223> prZmGRMZM5G876285-01
<220>
<221> ген
<222> (1152)..(5412)
<223> cCas9-12
<220>
<221> Терминатор
<222> (5419)..(6736)
<223> tZmGRMZM5G876285-01
<220>
<221> промотор
<222> (6750)..(7124)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (7126)..(7145)
<223> xZmVLHP2
<220>
<221> другой_признак
<222> (7126)..(7230)
<223> rsgRNAZmVLHP-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (7146)..(7157)
<223> rCrRNA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (7146)..(7230)
<223> rsgRNAоснование-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (7162)..(7230)
<223> rTracrRNA-01
<220>
<221> промотор
<222> (7241)..(9232)
<223> prUbi-04
<220>
<221> ген
<222> (9249)..(10427)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (10450)..(10702) 90
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (10746)..(10875)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (11155)..(11943)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (12038)..(12168)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (12243)..(12875)
<223> cVirG-09
<220>
<221> ген
<222> (12905)..(13978)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (14021)..(14425)
<223> oVA1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (15103)..(15909)
<223> oCOLE-06
<400> 34
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccgggacc ctaagtaatc ttgtgctaca aatttatttt tcagacagaa aaatctattt 360
agctaactaa ttaatacaaa ttaataccaa gcaacgatag atgaacatct agttgtctaa 420
ttagctaact aattaataca aattaagtag aatccttacc gtggggagat ggggcgcgac 480
gaagtgctcg agcttggggc gcggcgaccg gcgacgtgaa gcttgggggc gcgggggccg 540
gacggcgctg cgggcggcat ggcgggcggc tgcgggcggc ggcgcgggcg caggaaacaa 600
acgacgggag tgggaggaag gagaaagcgg cgcgccggtt tagtcctagc tcggcgccaa 660
gatctgtggc gccgagctag gtgccacgat ggccgccgcg tcagcaaagc tcggcgccaa 720
ggcatgttgc gccgagccgt gttagctcgg cgtcatagct catggtgccg agttttgggt 780 91
ctaaaattgc gtttaagtat tctagggatc taaacgcaaa tatttttcga aaatagggcc 840
gaaaaacaaa aaaaaatcgg tcgtttcgtc gagcacatcg tccagcctat cttgcatgtc 900
catcctctct atggttcgcg agccgcgcgc atggcgctcc aaaggagggg cgaggttgaa 960
tatagacaga tggaatgggt ggttctctat ttatagcgca tgcagtcgtc ccctggcaca 1020
cctatttata tgtgagcgtt cctggcacta gagagatcga tcgatcgagc ttaattgcgc 1080
cactgctcgt tatcctcctc ttgcattgca ttgcaggtcg tagttgagca gcagcaacca 1140
ctgcacaggc catggacaag aagtacagca tcggcctgga catcggcacc aacagcgtgg 1200
gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg tgataccaat ttgcatgatc cttgttcgtt 1260
ctagctcttg catgccgatc agttgaatca cgcggtttcc ttctgcgcat ttgcatccag 1320
gtgccgagca agaagttcaa ggtgctgggc aacaccgaca ggcacagcat caagaagaac 1380
ctgatcggcg ccctgctgtt cgacagcggc gagaccgccg aggccaccag gctgaagagg 1440
accgccagga ggaggtacac caggaggaag aacaggatct gctacctgca ggagatcttc 1500
agcaacgaga tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca ggctggagga gagcttcctg 1560
gtggaggagg acaagaagca cgagaggcac ccgatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg 1620
gcctaccacg agaagtaccc gaccatctac cacctgagga agaagctggt ggacagcacc 1680
gacaaggccg acctgaggct gatctacctg gccctggccc acatgatcaa gttcaggggc 1740
cacttcctga tcgagggcga cctgaacccg gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc 1800
cagctggtgc agacctacaa ccagctgttc gaggagaacc cgatcaacgc cagcggcgtg 1860
gacgccaagg ccatcctgag cgccaggctg agcaagagca ggaggctgga gaacctgatc 1920
gcccagctgc cgggcgagaa gaagaacggc ctgttcggca acctgatcgc cctgagcctg 1980
ggcctgaccc cgaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggacgccaa gctgcagctg 2040
agcaaggaca cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac 2100
gccgacctgt tcctggccgc caagaacctg agcgacgcca tcctgctgag cgacatcctg 2160
agggtgaaca ccgagatcac caaggccccg ctgagcgcca gcatgatcaa gaggtacgac 2220
gagcaccacc aggacctgac cctgctgaag gccctggtga ggcagcagct gccggagaag 2280
tacaaggaga tcttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat cgacggcggc 2340
gccagccagg aggagttcta caagttcatc aagccgatcc tggagaagat ggacggcacc 2400
gaggagctgc tggtgaagct gaacagggag gacctgctga ggaagcagag gaccttcgac 2460
aacggcagca tcccgcacca gatccacctg ggcgagctgc acgccatcct gaggaggcag 2520
gaggacttct acccgttcct gaaggacaac agggagaaga tcgagaagat cctgaccttc 2580
cgcatcccgt actacgtggg cccgctggcc aggggcaaca gcaggttcgc ctggatgacc 2640 92
aggaagagcg aggagaccat caccccgtgg aacttcgagg aggtggtgga caagggcgcc 2700
agcgcccaga gcttcatcga gaggatgacc aacttcgaca agaacctgcc gaacgagaag 2760
gtgctgccga agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtacaacga gctgaccaag 2820
gtgaagtacg tgaccgaggg catgaggaag ccggccttcc tgagcggcga gcagaagaag 2880
gccatcgtgg acctgctgtt caagaccaac aggaaggtga ccgtgaagca gctgaaggag 2940
gactacttca agaagatcga gtgcttcgac agcgtggaga tcagcggcgt ggaggacagg 3000
ttcaacgcca gcctgggcac ctaccacgac ctgctgaaga tcatcaagga caaggacttc 3060
ctggacaacg aggagaacga ggacatcctg gaggacatcg tgctgaccct gaccctgttc 3120
gaggacaggg agatgatcga ggagaggctg aagacctacg cccacctgtt cgacgacaag 3180
gtgatgaagc agctgaagag gaggaggtac accggctggg gcaggctgag caggaagctg 3240
atcaacggca tcagggacaa gcagagcggc aagaccatcc tggacttcct gaagagcgac 3300
ggcttcgcca acaggaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac cttcaaggag 3360
gacatccaga aggcccaggt gagcggccag ggcgacagcc tgcacgagca catcgccaac 3420
ctggccggca gcccggccat caagaagggc atcctgcaga ccgtgaaggt ggtggacgag 3480
ctggtgaagg tgatgggcag gcacaagccg gagaacatcg tgatcgagat ggccagggag 3540
aaccagacca cccagaaggg ccagaagaac agcagggaga ggatgaagag gatcgaggag 3600
ggcatcaagg agctgggcag ccagatcctg aaggagcacc cggtggagaa cacccagctg 3660
cagaacgaga agctgtacct gtactacctg cagaacggca gggacatgta cgtggaccag 3720
gagctggaca tcaacaggct gagcgactac gacgtggacc acatcgtgcc gcagagcttc 3780
ctgaaggacg acagcatcga caacaaggtg ctgaccagga gcgacaagaa caggggcaag 3840
agcgacaacg tgccgagcga ggaggtggtg aagaagatga aaaactactg gaggcagctg 3900
ctgaacgcca agctgatcac ccagaggaag ttcgacaacc tgaccaaggc cgagaggggc 3960
ggcctgagcg agctggacaa ggccggcttc attaaaaggc agctggtgga gaccaggcag 4020
atcaccaagc acgtggccca gatcctggac agcaggatga acaccaagta cgacgagaac 4080
gacaagctga tcagggaggt gaaggtgatc accctgaaga gcaagctggt gagcgacttc 4140
aggaaggact tccagttcta caaggtgagg gagatcaata attaccacca cgcccacgac 4200
gcctacctga acgccgtggt gggcaccgcc ctgattaaaa agtacccgaa gctggagagc 4260
gagttcgtgt acggcgacta caaggtgtac gacgtgagga agatgatcgc caagagcgag 4320
caggagatcg gcaaggccac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaacttcttc 4380
aagaccgaga tcaccctggc caacggcgag atcaggaaga ggccgctgat cgagaccaac 4440
ggcgagaccg gcgagatcgt gtgggacaag ggcagggact tcgccaccgt gaggaaggtg 4500
ctgtccatgc cgcaggtgaa catcgtgaag aagaccgagg tgcagaccgg cggcttcagc 4560 93
aaggagagca tcctgccgaa gaggaacagc gacaagctga tcgccaggaa gaaggactgg 4620
gacccgaaga agtacggcgg cttcgacagc ccgaccgtgg cctacagcgt gctggtggtg 4680
gccaaggtgg agaagggcaa gagcaagaag ctgaagagcg tgaaggagct ggtgggcatc 4740
accatcatgg agaggagcag cttcgagaag aacccagtgg acttcctgga ggccaagggc 4800
tacaaggagg tgaagaagga cctgatcatt aaactgccga agtacagcct gttcgagctg 4860
gagaacggca ggaagaggat gctggccagc gccggcgagc tgcagaaggg caacgagctg 4920
gccctgccga gcaagtacgt gaacttcctg tacctggcca gccactacga gaagctgaag 4980
ggcagcccgg aggacaacga gcagaagcag ctgttcgtgg agcagcacaa gcactacctg 5040
gacgagatca tcgagcagat cagcgagttc agcaagaggg tgatcctggc cgacgccaac 5100
ctggacaagg tgctgagcgc ctacaacaag cacagggaca agccgatcag ggagcaggcc 5160
gagaacatca tccacctgtt caccctgacc aacctgggcg ccccggccgc cttcaagtac 5220
ttcgacacca ccatcgacag gaagaggtac accagcacca aggaggtgct ggacgccacc 5280
ctgatccacc agagcatcac cggcctgtac gagaccagga tcgacctgag ccagctgggc 5340
ggcgacagca gcccgccgaa gaagaagagg aaggtgagct ggaaggacgc cagcggctgg 5400
agcaggatgt gagctctaat gcatccaaac aacgacacca acgccaacat taattaatta 5460
gtagtctcca tgccctggga ttgtgcgtgg ccgctccgtt gaacaccacc catccttcgt 5520
tcggcatttt ttcccccctt gtttatataa ttttattgta tcgttttggc aaataatttt 5580
gtgattcgac cccaaagcaa gtttggttgt cttacgattt gtaaacctgg aacaatatat 5640
aatgtgattg aactgctttg tctattcttt ttgtagtacg ataatatgta tatgtattcc 5700
atgcgatctc ttctagggcg acgactaatg tgcaagtgtg tgtttgcatg cgctgagcac 5760
ggagtttgta ttcaggggtc aatatctttc gattccttta tctaaaaagg tgttgcatat 5820
atctaaaaaa aagaaaaaaa aggcttacaa ctgttgaaaa aataagcatt tttagtttta 5880
atttaattca gaaaatcata gtgatatatg tgacgatatg catgtgcata tgtatcacta 5940
ctcacataaa cagtaaacaa cagtaaaata tgtataaata caaaaataac aaagtgtacc 6000
ctgcggaggg accgatgttc aaggcatctg tggctccatt cacacgagac atctcgtgtg 6060
tatgttcgat gtagtcatac gcagtcgagg cagtcagatg tacgcagtgc agtccctcga 6120
tcggcgccgg cgacgaggaa cttgatcagt gctggtcgag cggacgaagc gagcagtcgc 6180
gagtacgctc ccgaaaaaca tgatcgctcg cacacccatg caagtgtcgc tctgcggacg 6240
acgatttcgg aagcctacgc gtatgagaat gtttgtatgt gtgttctctc gtaaccagaa 6300
gcctcatctc ctccgtatat atacacgcgc agagggaggc caacagatag taacggtgga 6360
aggaatactc ggaccaaggt ccgatctacc atggccacgg cccggcctgg ccagcggcgc 6420 94
gtgcgtgtgg cagtccttca tccttttatc agcttatcaa tagatgcacc aaagatccac 6480
ctatttaagt tgattgaatt gtctcttgta cttccggtat gttactaaag taataataca 6540
ccgtagcatt aaattgggcc tttagcattg gctattattg aatattaatt tgagccagac 6600
ccaccaccag atgctaagtc acaccaaaat gctctcatca tctcaaacat ttcatatact 6660
ggtgtttcga tggagactat taagttgaac atccacctag aatctagatt acacttgacc 6720
acaactacat aatggacgga ccgttcgaag ggatctttaa acatacgaac agatcactta 6780
aagttcttct gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg 6840
tgcagtcagg gaccatagca caggacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg 6900
gaagccggga acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt ggagtaagat aaactgtagg 6960
agaaaagcat ttcgtagtgg gccatgaagc ctttcaggac atgtattgca gtatgggccg 7020
gcccattacg caattggacg acaacaaaga ctagtattag taccacctcg gctatccaca 7080
tagatcaaag ctggtttaaa agagttgtgc agatgatccg tggcagctgg agctgagctt 7140
ccggggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa 7200
aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttt cggaccgcgc ctgcagtgca gcgtgacccg 7260
gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 7320
tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 7380
ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 7440
atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc 7500
tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct 7560
atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt 7620
atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac 7680
taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata taaaatagaa taaaataaag 7740
tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct 7800
tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac 7860
cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc 7920
tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat 7980
ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc 8040
tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc 8100
tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt 8160
cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc 8220
aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg 8280
tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt 8340 95
gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg 8400
attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca 8460
gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc 8520
ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg 8580
tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt 8640
ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca 8700
tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 8760
gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg 8820
tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct 8880
ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt 8940
taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat 9000
gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct 9060
attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca 9120
tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg 9180
gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc agggatccgg 9240
cagcagccat gcagaagctg atcaacagcg tgcagaacta cgcctggggc agcaagaccg 9300
ccctgaccga gctgtacggc atggagaacc ccagcagcca gcccatggcc gagctgtgga 9360
tgggcgccca ccccaagagc agcagccgcg tgcagaacgc cgccggcgac atcgtgagcc 9420
tgcgcgacgt gatcgagagc gacaagagca ccctgctggg cgaggccgtg gccaagcgct 9480
tcggcgagct gcccttcctg ttcaaggtgc tgtgcgccgc ccagcccctg agcatccagg 9540
tgcaccccaa caagcacaac agcgagatcg gcttcgccaa ggagaacgcc gccggcatcc 9600
ccatggacgc cgccgagcgc aactacaagg accccaacca caagcccgag ctggtgttcg 9660
ccctgacccc cttcctggcc atgaacgcct tccgcgagtt cagcgagatc gtgagcctgc 9720
tgcagcccgt ggccggcgcc caccccgcca tcgcccactt cctgcagcag cccgacgccg 9780
agcgcctgag cgagctgttc gccagcctgc tgaacatgca gggcgaggag aagagccgcg 9840
ccctggccat cctgaagagc gccctggaca gccagcaggg cgagccctgg cagaccatcc 9900
gcctgatcag cgagttctac cccgaggaca gcggcctgtt cagccccctg ctgctgaacg 9960
tggtgaagct gaaccccggc gaggccatgt tcctgttcgc cgagaccccc cacgcctacc 10020
tgcagggcgt ggccctggag gtgatggcca acagcgacaa cgtgctgcgc gccggcctga 10080
cccccaagta catcgacatc cccgagctgg tggccaacgt gaagttcgag gccaagcccg 10140
ccaaccagct gctgacccag cccgtgaagc agggcgccga gctggacttc cccatccccg 10200 96
tggacgactt cgccttcagc ctgcacgacc tgagcgacaa ggagaccacc atcagccagc 10260
agagcgccgc catcctgttc tgcgtggagg gcgacgccac cctgtggaag ggcagccagc 10320
agctgcagct gaagcccggc gagagcgcct tcatcgccgc caacgagagc cccgtgaccg 10380
tgaagggcca cggccgcctg gcccgcgtgt acaacaagct gtgataggag ctcgatccgt 10440
cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc 10500
ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac 10560
atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac 10620
atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg 10680
gtgtcatcta tgttactaga tcggcgcgcc gcaattgaag tttgggcggc cagcatggcc 10740
gtatccgcaa tgtgttatta agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc 10800
tgccaccagc cagccaacag ctccccgacc ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata 10860
caggcagccc atcagaatta attctcatgt ttgacagctt atcatcgact gcacggtgca 10920
ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa 10980
tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc 11040
gacatcataa cggttctggc aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatccggc 11100
tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaccatgagg 11160
gaagcgttga tcgccgaagt atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc 11220
catctcgaac cgacgttgct ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg 11280
aagccacaca gtgatattga tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg 11340
cggcgagctt tgatcaacga ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt 11400
ctccgcgctg tagaagtcac cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca 11460
gctaagcgcg aactgcaatt tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc 11520
gagccagcca cgatcgacat tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc 11580
gttgccttgg taggtccagc ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta 11640
tttgaggcgc taaatgaaac cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat 11700
gagcgaaatg tagtgcttac gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc 11760
gcgccgaagg atgtcgctgc cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc 11820
gtcatacttg aagctaggca ggcttatctt ggacaagaag atcgcttggc ctcgcgcgca 11880
gatcagttgg aagaatttgt tcactacgtg aaaggcgaga tcaccaaagt agtcggcaaa 11940
taaagctcta gtggatctcc gtacccgggg atctggctcg cggcggacgc acgacgccgg 12000
ggcgagacca taggcgatct cctaaatcaa tagtagctgt aacctcgaag cgtttcactt 12060
gtaacaacga ttgagaattt ttgtcataaa attgaaatac ttggttcgca tttttgtcat 12120 97
ccgcggtcag ccgcaattct gacgaactgc ccatttagct ggagatgatt gtacatcctt 12180
cacgtgaaaa tttctcaagc gctgtgaaca agggttcaga ttttagattg aaaggtgagc 12240
cgttgaaaca cgttcttctt gtcgatgacg acgtcgctat gcggcatctt attattgaat 12300
accttacgat ccacgccttc aaagtgaccg cggtagccga cagcacccag ttcacaagag 12360
tactctcttc cgcgacggtc gatgtcgtgg ttgttgatct agatttaggt cgtgaagatg 12420
ggctcgagct aggagcaagt gattttatcg ctaagccgtt cagtatcaga gagtttctag 12480
cacgcattcg ggttgccttg cgcgtgcgcc ccaacgttgt ccgctccaaa gaccgacggt 12540
ctttttgttt tactgactgg acacttaatc tcaggcaacg tcgcttgatg tccgaagctg 12600
gcggtgaggt gaaacttacg gcaggtgagt tcaatcttct cctcgcgttt ttagagaaac 12660
cccgcgacgt tctatcgcgc gagcaacttc tcattgccag tcgagtacgc gacgaggagg 12720
tttatgacag gagtatagat gttctcattt tgaggctgcg ccgcaaactt gaggcagatc 12780
cgtcaagccc tcaactgata aaaacagcaa gaggtgccgg ttatttcttt gacgcggacg 12840
tgcaggtttc gcacgggggg acgatggcag cctgagccaa ttcccagatc cccgaggaat 12900
cggcgtgagc ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga 12960
cctggtggag aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc 13020
acgccccggt gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc 13080
gccggcagcc ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt 13140
tttcgttccg atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc 13200
cgttttccgt ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc 13260
agacgggcac gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga 13320
cctggtactg atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa 13380
gggagacaag cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg 13440
gcgagccgat ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac 13500
cacgcacgtt gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc 13560
cgagggtgaa gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga 13620
gtacatcgag atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc 13680
ggacgtgctg acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct 13740
ctaccgcctg gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat 13800
ctacgaacgc agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct 13860
gatcgggtca aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc 13920
gatcctagtc atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg 13980 98
tacggagcag atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt 14040
tcctgtggat agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta 14100
cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa 14160
agagaaaaaa ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac 14220
ccgcctggcc tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc 14280
tacccttcgg tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc 14340
tggccgctca aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc 14400
gccgtcgcca ctcgaccgcc ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc 14460
ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag 14520
agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc 14580
tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca 14640
acaaagccgc cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc 14700
aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga 14760
ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg 14820
cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca 14880
atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga 14940
gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agctctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 15000
ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 15060
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 15120
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 15180
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 15240
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 15300
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 15360
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 15420
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 15480
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 15540
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 15600
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 15660
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 15720
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 15780
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 15840
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 15900 99
gatccttttg atccggaatt a 15921
<210> 35
<211> 17954
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 24039
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (315)..(1729)
<223> prZmGRMZM2G020852-01
<220>
<221> ген
<222> (1731)..(5979)
<223> cCas9-13
<220>
<221> Терминатор
<222> (5989)..(8769)
<223> tZmGRMZM2G020852-01
<220>
<221> промотор
<222> (8783)..(9157)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (9159)..(9178)
<223> xZmVLHP2
<220>
<221> другой_признак
<222> (9159)..(9263)
<223> rsgRNAZmVLHP-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (9179)..(9190)
<223> rCrRNA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (9195)..(9263)
<223> rTracrRNA-01
<220>
<221> промотор
<222> (9274)..(11265)
<223> prUbi1-04 100
<220>
<221> ген
<222> (11282)..(12460)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (12483)..(12735)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (12779)..(12908)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (13188)..(13976)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (14071)..(14201)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (14276)..(14908)
<223> cVirG-09
<220>
<221> ген
<222> (14938)..(16011)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (16054)..(16458)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (17136)..(17942)
<223> oCOLE-o6
<400> 35
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccggaccg ttataacagt gaatacaaaa atgacattcg tgttatttag cacaagttac 360
gatctatttc aggaacatgc cggaattttc gaacaccatt ctcacaaaac atgaccttga 420
acttgcgatc cagttgtttt aaaattatat aaaacaaaaa caaagtcaga aaatcatgaa 480
acttgtcgac atgtcatgat atcatatgta gagactctaa taaaaagttg agattgtttc 540 101
atgaaagttg tcacacacta tgtgtagaaa cttagcccgt ctacattgaa gttctatgat 600
ttcatgtgaa ggacacctag gcatcgatgt ttatgataat atcttatgtt tgtttggaca 660
aaatattaaa aacaaataaa aggggtccct gatcactttg acgagcattg cattcagcaa 720
agggtgcctt tgttgagtgc aatggtcata gaactcggta gaaaagacat acataaacat 780
cgggaaactt gctttaccgc acgctatggc caagacactc ggcaaactag gctcctttgt 840
tgagtgccat ctcaagcact cgacattgga actacgacta ggcctcacgg aagctttctt 900
tgccgagtgc cactaagcga ggaactcgga cactcagcaa cagctctgtc atcgtcacga 960
tgtcttttct ttgtcgtgta ccagttggca ctcggttaag actttactga gtgcccgata 1020
gaaagtactc ggcaaagaga ccgttgccga cgtttggttc actgagggct ctttgctgcc 1080
ttttggactt gacaaagaag tcatctccag tactgtctcc taggacgcag gatttatgtt 1140
ttttcccgga gctcgatctg tgggacatca cagatggtcc aatctggtga tctaaaatgg 1200
acggtttgcc aagcccacag agaagtcttt aagatcttcc acgatgcacg catgctttaa 1260
ggttagatag tgtttggtcc aaaaaagcgt caacaatcag gaaattagaa ctaaaattat 1320
taaaggacag atcaaaaggc atgcatgttc ttcttctata gtgtgtgttg agcctgagtt 1380
ttgattttag gctttattag gggactcgca gtctagctaa ggagttgtat tgatgttctg 1440
acaaatatta tgttcgatcg tcacagtggt cttgtgcgga tcgattaggc ccgatcatgg 1500
tgaaataaac taaccaccgg taagcccggg cagccctaga gcatgcagcg gcctacgtga 1560
agcccgcgtg tcgcatcgtc gtccgtcaga cgctaacggc aggccgctgc atgcgttgcc 1620
ggcgaactct ctcctgagcc actcgtcatc catataagta gacatcccat cactgtcgtc 1680
tatcaacaac acacagagcg acatttcgaa taacacagtt gagcgcgacc atggacaaga 1740
agtacagcat cggcctggac atcggcacca acagcgtggg ctgggccgtg atcaccgacg 1800
agtacaaggt acgagcggga tacatgttta tactcctcct gtaggtcgct ccttcatgta 1860
atgtgttgcg attaaaacgg tgcgcaggtg ccgagcaaga agttcaaggt gctgggcaac 1920
accgacaggc acagcatcaa gaagaacctg atcggcgccc tgctgttcga cagcggcgag 1980
accgccgagg ccaccaggct gaagaggacc gccaggagga ggtacaccag gaggaagaac 2040
aggatctgct acctgcagga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc 2100
ttccacaggc tggaggagag cttcctggtg gaggaggaca agaagcacga gaggcacccg 2160
atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtacccgac catctaccac 2220
ctgaggaaga agctggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgaggctgat ctacctggcc 2280
ctggcccaca tgatcaagtt caggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaacccggac 2340
aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag 2400 102
gagaacccga tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgagcgc caggctgagc 2460
aagagcagga ggctggagaa cctgatcgcc cagctgccgg gcgagaagaa gaacggcctg 2520
ttcggcaacc tgatcgccct gagcctgggc ctgaccccga acttcaagag caacttcgac 2580
ctggccgagg acgccaagct gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac 2640
ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgttcc tggccgccaa gaacctgagc 2700
gacgccatcc tgctgagcga catcctgagg gtgaacaccg agatcaccaa ggccccgctg 2760
agcgccagca tgatcaagag gtacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaggcc 2820
ctggtgaggc agcagctgcc ggagaagtac aaggagatct tcttcgacca gagcaagaac 2880
ggctacgccg gctacatcga cggcggcgcc agccaggagg agttctacaa gttcatcaag 2940
ccgatcctgg agaagatgga cggcaccgag gagctgctgg tgaagctgaa cagggaggac 3000
ctgctgagga agcagaggac cttcgacaac ggcagcatcc cgcaccagat ccacctgggc 3060
gagctgcacg ccatcctgag gaggcaggag gacttctacc cgttcctgaa ggacaacagg 3120
gagaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccgtact acgtgggccc gctggccagg 3180
ggcaacagca ggttcgcctg gatgaccagg aagagcgagg agaccatcac cccgtggaac 3240
ttcgaggagg tggtggacaa gggcgccagc gcccagagct tcatcgagag gatgaccaac 3300
ttcgacaaga acctgccgaa cgagaaggtg ctgccgaagc acagcctgct gtacgagtac 3360
ttcaccgtgt acaacgagct gaccaaggtg aagtacgtga ccgagggcat gaggaagccg 3420
gccttcctga gcggcgagca gaagaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaacagg 3480
aaggtgaccg tgaagcagct gaaggaggac tacttcaaga agatcgagtg cttcgacagc 3540
gtggagatca gcggcgtgga ggacaggttc aacgccagcc tgggcaccta ccacgacctg 3600
ctgaagatca tcaaggacaa ggacttcctg gacaacgagg agaacgagga catcctggag 3660
gacatcgtgc tgaccctgac cctgttcgag gacagggaga tgatcgagga gaggctgaag 3720
acctacgccc acctgttcga cgacaaggtg atgaagcagc tgaagaggag gaggtacacc 3780
ggctggggca ggctgagcag gaagctgatc aacggcatca gggacaagca gagcggcaag 3840
accatcctgg acttcctgaa gagcgacggc ttcgccaaca ggaacttcat gcagctgatc 3900
cacgacgaca gcctgacctt caaggaggac atccagaagg cccaggtgag cggccagggc 3960
gacagcctgc acgagcacat cgccaacctg gccggcagcc cggccatcaa gaagggcatc 4020
ctgcagaccg tgaaggtggt ggacgagctg gtgaaggtga tgggcaggca caagccggag 4080
aacatcgtga tcgagatggc cagggagaac cagaccaccc agaagggcca gaagaacagc 4140
agggagagga tgaagaggat cgaggagggc atcaaggagc tgggcagcca gatcctgaag 4200
gagcacccgg tggagaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag 4260
aacggcaggg acatgtacgt ggaccaggag ctggacatca acaggctgag cgactacgac 4320 103
gtggaccaca tcgtgccgca gagcttcctg aaggacgaca gcatcgacaa caaggtgctg 4380
accaggagcg acaagaacag gggcaagagc gacaacgtgc cgagcgagga ggtggtgaag 4440
aagatgaaaa actactggag gcagctgctg aacgccaagc tgatcaccca gaggaagttc 4500
gacaacctga ccaaggccga gaggggcggc ctgagcgagc tggacaaggc cggcttcatt 4560
aaaaggcagc tggtggagac caggcagatc accaagcacg tggcccagat cctggacagc 4620
aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctgatca gggaggtgaa ggtgatcacc 4680
ctgaagagca agctggtgag cgacttcagg aaggacttcc agttctacaa ggtgagggag 4740
atcaataatt accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtggtggg caccgccctg 4800
attaaaaagt acccgaagct ggagagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac 4860
gtgaggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gagatcggca aggccaccgc caagtacttc 4920
ttctacagca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca ccctggccaa cggcgagatc 4980
aggaagaggc cgctgatcga gaccaacggc gagaccggcg agatcgtgtg ggacaagggc 5040
agggacttcg ccaccgtgag gaaggtgctg tccatgccgc aggtgaacat cgtgaagaag 5100
accgaggtgc agaccggcgg cttcagcaag gagagcatcc tgccgaagag gaacagcgac 5160
aagctgatcg ccaggaagaa ggactgggac ccgaagaagt acggcggctt cgacagcccg 5220
accgtggcct acagcgtgct ggtggtggcc aaggtggaga agggcaagag caagaagctg 5280
aagagcgtga aggagctggt gggcatcacc atcatggaga ggagcagctt cgagaagaac 5340
ccagtggact tcctggaggc caagggctac aaggaggtga agaaggacct gatcattaaa 5400
ctgccgaagt acagcctgtt cgagctggag aacggcagga agaggatgct ggccagcgcc 5460
ggcgagctgc agaagggcaa cgagctggcc ctgccgagca agtacgtgaa cttcctgtac 5520
ctggccagcc actacgagaa gctgaagggc agcccggagg acaacgagca gaagcagctg 5580
ttcgtggagc agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttcagc 5640
aagagggtga tcctggccga cgccaacctg gacaaggtgc tgagcgccta caacaagcac 5700
agggacaagc cgatcaggga gcaggccgag aacatcatcc acctgttcac cctgaccaac 5760
ctgggcgccc cggccgcctt caagtacttc gacaccacca tcgacaggaa gaggtacacc 5820
agcaccaagg aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag 5880
accaggatcg acctgagcca gctgggcggc gacagcagcc cgccgaagaa gaagaggaag 5940
gtgagctgga aggacgccag cggctggagc aggatgtgag ctcaattaac tttgaattcc 6000
cttcgattca tccggcgcgg tgggctatgg acctgcagca gcaagctaat taagtttata 6060
tatattgcat gagagagcat gcaccgctaa ccatatatac tactgagact tctgaattct 6120
agtatatgta atccttttgt ttgggtttag gaggcaattc taatcatgta tgccgaattc 6180 104
caaagagtgg aaaacaagca aaatgttaaa tatacatgcc attttcggag gcaatttttt 6240
tcatgagggc atgttgctat aattccgggg accttggact tcttggagca ccttcctgtg 6300
acttaggcat acatgattag attataatcc aattagttaa gtcatagaaa attacctcat 6360
tctcatctcc atctccattt ctctatttct tctcaatcaa ggaccaaaat agcacttttg 6420
ctaaaaaaca agttagattg caaaccaaag tgcacaatac atagtaaaag gtatatgcaa 6480
catatttgaa tactcaaacc tctcatactt acattttcca tcattttgtt ccatttagcc 6540
tgtttgagct cggggttgga ctccaaaacc tcatgtcaac ataacttgat ccttttagca 6600
aactatgagc tctaacacca tacaatggtc aacaagaact attccaaaca taggaatgac 6660
ccaaactaca agtcaaagta tacttagctc tttgggcact tacaggttct aactttgata 6720
attctgtact tcttgtgacc atgactctgc tcgagctagg atcttgagcc ttatgactta 6780
aacaattaaa ccacaaacat tacctcaatg gttgtaagcc acgtccatat atcacagact 6840
tcaatgcatt cagactattc acagcttgac caaccttgac ctcttgcaag aacctcttct 6900
tctttgtgac cttaggtact ttagtcttct tgaccttctc ccttgctctt cataccttga 6960
agtccttctt gccttcacct tagttcaatc agctatctcc aagtcatgca cattgagttc 7020
cacttagtca atgtccatcc ttcaacttga cttgtgatgt ccacaattca tagtcatctc 7080
agtctatggg tccatcatgc ttgactccat gtgatgaacc ttgtaaggtt ttcactaagt 7140
acatgctcag acctttaatt gtgttgccat ccaaaaaaac caaaacctag attggaccat 7200
tcattatatt catcaatcat tgtacttgca agagtgatca aggtcatatt atttctctca 7260
actactccat tttgttgagg ggtgtcagtt gtggagactt cttgtttgat cccaacctca 7320
tcacaatact catgaatata gttgttgtca aattcatttc cattgtcact tcttattttt 7380
cttgattttg caatcaaact cattttgtac tttcatggta aatttattca atgttgatgc 7440
aacttttgac ttttcttgaa gaaagaacac tcaattacat ctagagaaat catcaacaac 7500
gaccaaacaa tacaggtttc ccccaacact agcatattat gtaggaccaa ataaatccat 7560
gtgaagtaac tctagtggtc ttggtgttga cataaaagcg tttgtaggat gtgtattggc 7620
aacttgtttt ccagcttgac atgcactata aaagattttc ctttttcaaa cacaacatct 7680
ttcaaatctc taaccatttc tttctttgga agcttcttgt tggggaaatg atccccggac 7740
cctaggaccc accggtcaga gagcgcgagg aagagccccc ggtcgctggg acccgttggt 7800
ccgctggaaa atgtggttac gtcaaccctg aaagaacccg cccctggttg agccccgtgg 7860
caccgagcct agggtcgagc gcggtggaat ctgacaggag gggccagaca tgttggaggg 7920
gaaccactca agtggatccc gcgcctggcc ccagaatgac ccgtcattaa tacccaacca 7980
cattaaccat gcctggcacc gagccatagc acggacgtcg gtccacttcc cactcatgac 8040
ctacgaacca gttgggctgc atagcactca tgaccgatag gttgaaggct tggcttcgca 8100 105
gagtgaaagg cgctgcatac atgtgaaggc tcgacttctt tttcttttcc tttcttttct 8160
tttctatttt taggtttcca atttaaattc caattttttt gtggagttca tatttggatc 8220
aaatagacaa attcacctat cagtatgaat agatgcattt attttgttta tatctatttt 8280
cttcatattt atatagtatt tcccttattc tttatatcat tttcaatttg taattggtaa 8340
gtttggtctt aaattcccca tttgggcact aatatatttt tattaatatt attattatta 8400
ttattattat tatttataga tgcacaaaca cataaactcc gacatgatgc atagattatt 8460
ttagatgtca ctagttaatg gttcacttta aatatggtta ttcccatgtt ctaatgagta 8520
gagggcaaag catatattga ggtcaactct ttccttatta tttacaaatt ggggaaattc 8580
tattcataac tcttcttctc tctcccaagt agcttaatct tcaccatggt gatttcattg 8640
cactttgcac attttgatca ctttattcct tgtaacccga gtcaaagtgt caatgatctt 8700
gataggatac tccgtgcagg ttagatcacc ttgcacactg agttcttcca ttggtaactg 8760
ttcctctggc ggaccgttcg aagggatctt taaacatacg aacagatcac ttaaagttct 8820
tctgaagcaa cttaaagtta tcaggcatgc atggatcttg gaggaatcag atgtgcagtc 8880
agggaccata gcacaggaca ggcgtcttct actggtgcta ccagcaaatg ctggaagccg 8940
ggaacactgg gtacgttgga aaccacgtga tgtggagtaa gataaactgt aggagaaaag 9000
catttcgtag tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt 9060
acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca 9120
aagctggttt aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcagc tggagctgag cttccggggt 9180
tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 9240
caccgagtcg gtgctttttt tttcggaccg cgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 9300
ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 9360
tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 9420
ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 9480
tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 9540
ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 9600
acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 9660
aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 9720
ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 9780
aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 9840
agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 9900
ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 9960 106
ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 10020
ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 10080
gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg 10140
ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg 10200
cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac 10260
gccgctcgtc ctcccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg 10320
ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat 10380
ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta 10440
acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga 10500
tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt 10560
tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt 10620
tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac 10680
tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac 10740
gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt 10800
ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt 10860
gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat 10920
ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg 10980
gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata 11040
catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa 11100
taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag 11160
cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt 11220
ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggatc cggcagcagc 11280
catgcagaag ctgatcaaca gcgtgcagaa ctacgcctgg ggcagcaaga ccgccctgac 11340
cgagctgtac ggcatggaga accccagcag ccagcccatg gccgagctgt ggatgggcgc 11400
ccaccccaag agcagcagcc gcgtgcagaa cgccgccggc gacatcgtga gcctgcgcga 11460
cgtgatcgag agcgacaaga gcaccctgct gggcgaggcc gtggccaagc gcttcggcga 11520
gctgcccttc ctgttcaagg tgctgtgcgc cgcccagccc ctgagcatcc aggtgcaccc 11580
caacaagcac aacagcgaga tcggcttcgc caaggagaac gccgccggca tccccatgga 11640
cgccgccgag cgcaactaca aggaccccaa ccacaagccc gagctggtgt tcgccctgac 11700
ccccttcctg gccatgaacg ccttccgcga gttcagcgag atcgtgagcc tgctgcagcc 11760
cgtggccggc gcccaccccg ccatcgccca cttcctgcag cagcccgacg ccgagcgcct 11820
gagcgagctg ttcgccagcc tgctgaacat gcagggcgag gagaagagcc gcgccctggc 11880 107
catcctgaag agcgccctgg acagccagca gggcgagccc tggcagacca tccgcctgat 11940
cagcgagttc taccccgagg acagcggcct gttcagcccc ctgctgctga acgtggtgaa 12000
gctgaacccc ggcgaggcca tgttcctgtt cgccgagacc ccccacgcct acctgcaggg 12060
cgtggccctg gaggtgatgg ccaacagcga caacgtgctg cgcgccggcc tgacccccaa 12120
gtacatcgac atccccgagc tggtggccaa cgtgaagttc gaggccaagc ccgccaacca 12180
gctgctgacc cagcccgtga agcagggcgc cgagctggac ttccccatcc ccgtggacga 12240
cttcgccttc agcctgcacg acctgagcga caaggagacc accatcagcc agcagagcgc 12300
cgccatcctg ttctgcgtgg agggcgacgc caccctgtgg aagggcagcc agcagctgca 12360
gctgaagccc ggcgagagcg ccttcatcgc cgccaacgag agccccgtga ccgtgaaggg 12420
ccacggccgc ctggcccgcg tgtacaacaa gctgtgatag gagctcgatc cgtcgacctg 12480
cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 12540
cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 12600
gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 12660
acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 12720
ctatgttact agatcggcgc gccgcaattg aagtttgggc ggccagcatg gccgtatccg 12780
caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tcctgccacc 12840
agccagccaa cagctccccg accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg atacaggcag 12900
cccatcagaa ttaattctca tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc 12960
ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc 13020
ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca 13080
taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata 13140
atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg agggaagcgt 13200
tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg 13260
aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac 13320
acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag 13380
ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg 13440
ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc 13500
gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag 13560
ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct 13620
tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg 13680
cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa 13740 108
atgtagtgct tacgttgtcc cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga 13800
aggatgtcgc tgccgactgg gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac 13860
ttgaagctag gcaggcttat cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt 13920
tggaagaatt tgttcactac gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct 13980
ctagtggatc tccgtacccg gggatctggc tcgcggcgga cgcacgacgc cggggcgaga 14040
ccataggcga tctcctaaat caatagtagc tgtaacctcg aagcgtttca cttgtaacaa 14100
cgattgagaa tttttgtcat aaaattgaaa tacttggttc gcatttttgt catccgcggt 14160
cagccgcaat tctgacgaac tgcccattta gctggagatg attgtacatc cttcacgtga 14220
aaatttctca agcgctgtga acaagggttc agattttaga ttgaaaggtg agccgttgaa 14280
acacgttctt cttgtcgatg acgacgtcgc tatgcggcat cttattattg aataccttac 14340
gatccacgcc ttcaaagtga ccgcggtagc cgacagcacc cagttcacaa gagtactctc 14400
ttccgcgacg gtcgatgtcg tggttgttga tctagattta ggtcgtgaag atgggctcga 14460
gctaggagca agtgatttta tcgctaagcc gttcagtatc agagagtttc tagcacgcat 14520
tcgggttgcc ttgcgcgtgc gccccaacgt tgtccgctcc aaagaccgac ggtctttttg 14580
ttttactgac tggacactta atctcaggca acgtcgcttg atgtccgaag ctggcggtga 14640
ggtgaaactt acggcaggtg agttcaatct tctcctcgcg tttttagaga aaccccgcga 14700
cgttctatcg cgcgagcaac ttctcattgc cagtcgagta cgcgacgagg aggtttatga 14760
caggagtata gatgttctca ttttgaggct gcgccgcaaa cttgaggcag atccgtcaag 14820
ccctcaactg ataaaaacag caagaggtgc cggttatttc tttgacgcgg acgtgcaggt 14880
ttcgcacggg gggacgatgg cagcctgagc caattcccag atccccgagg aatcggcgtg 14940
agcggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg 15000
gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc 15060
ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca 15120
gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt 15180
ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 15240
cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 15300
cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 15360
ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac 15420
aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc 15480
gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 15540
gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 15600
gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 15660 109
gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 15720
ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 15780
ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa 15840
cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 15900
tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 15960
gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag 16020
cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg 16080
gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg 16140
aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa 16200
aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg 16260
gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 16320
cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc 16380
tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 16440
ccactcgacc gccggcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag 16500
gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat gagagctttg 16560
ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg 16620
tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc 16680
cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta caaccaatta accaattctg 16740
attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa 16800
taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc 16860
ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac 16920
ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga 16980
ctgaatccgg tgagaatggc aaaagctctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 17040
ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 17100
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 17160
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 17220
aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 17280
aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 17340
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 17400
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 17460
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 17520 110
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 17580
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 17640
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 17700
tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 17760
caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 17820
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 17880
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 17940
ttgatccgga atta 17954
<210> 36
<211> 17045
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 24079
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<220>
<221> промотор
<222> (312)..(2356)
<223> prGRMZM2G146551-01
<220>
<221> ген
<222> (2358)..(6527)
<223> cCas9-01
<220>
<221> мутация
<222> (5847)..(5849)
<223> мутация L на V
<220>
<221> мутация
<222> (5892)..(5894)
<223> мутация I на V
<220>
<221> Терминатор
<222> (6542)..(7860)
<223> tGRMZM2G146551-01
<220>
<221> промотор
<222> (7874)..(8248)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (8249)..(8354) 111
<223> rsgRNAZmVLHP-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (8250)..(8269)
<223> мишень ZmVLHP2
<220>
<221> другой_признак
<222> (8270)..(8281)
<223> rCrRNA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (8286)..(8354)
<223> rTracrRNA-01
<220>
<221> промотор
<222> (8365)..(10356)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (10373)..(11551)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (11574)..(11826)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (11870)..(11999)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (12279)..(13067)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (13162)..(13292)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (13367)..(13999)
<223> cVirG-09
<220>
<221> ген
<222> (14029)..(15102)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (15145)..(15549)
<223> oVS1-02
<220> 112
<221> другой_признак
<222> (16227)..(17033)
<223> oCOLE-06
<400> 36
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
taccgggacc catgtagtat cacatgagtg agtcaaggac taagtattat gcattttgtt 360
tctcactcac ggattagctc gcaatcatca tagtgaaatc tagctactgg cactatcgaa 420
atctagctct ttgccgagtg cactttatcg agcactcgac aaagcattct ttatcgagtg 480
ccagtcttgg cgaaataaga ctctcgacaa agaccttgtt taccgaggga gaaacactcg 540
gcgtaaaaag acactcggca aagaagactt tgctgagtgt caaaccctca gcgaaatgcg 600
accctcggca aaggaccgtc agcagccatc tatagttgat ggctattaac ttcgcgagtg 660
tcaggcgttg acacacgaca aaatatcttt tttgtcgagt gtcactgggc aaacacttgg 720
taaacctatg ttttgccgag tgtctttcct tgacactcga caaagtatat ttgttttttc 780
tttttcccca aactttttgt ggtgtgtttc tacaatatat agacctattt gttcaatttt 840
ggcacaatta taaaagtgtt tgctataact atcagattta gtttgcttaa ttggatttct 900
ttggataatt cagatttgaa ctacaagcca cttgaaaaat ggaaaacagt gaatacaaaa 960
atgacattca tgttatttag cacaagttat gatctatttc aggaacatgc gagaattttc 1020
gaacaccatt ctcacaaaac atgattgcgg acttgtgatc aagttgtttt aaaattgtat 1080
aaaacaaaaa caaagtcaga aaatcatgaa acttgttgac atgtcatgat atcatatgta 1140
gagactctaa taaaaatttg agattgtttc atgaaagttg tcacgcgcta tgtgtagaaa 1200
cctagcccgt ctacattgag gttctatgat ttcatgtgaa ggacatctag gcatcaatgt 1260
ttatgataat atcttatgtt tgtttggacg aaatattaaa aacaaataaa aaggggtcct 1320
tgatcacttt gacgagcatt gcactcagca aagggtgcct ttgctgagtg caatggtcat 1380
agaactcggt agaaaaacat acatagacat agggaaactt gctttaccgc gtgctatggc 1440
caagacactc ggcaaactag gctcctttgt cgagttccat cccaagcact cgacattgga 1500
actgcgactg ggcctcacag aagctttctt tgccgagtgc cactaagcga ggaactcgga 1560
tgctcagcaa aggctctgtc atcgtcacga tgtcttttgt ttgtcgtgta ccagttggca 1620
ctcggtaaag actttactga gtgcccgata gaaagtactc gacaaagaga ccgttgccaa 1680
cgtttggttc actgagggct ctttgctgcc ttttggactt gacaaagaag ccgtctccag 1740 113
tagtgtctcc tgggaggcgg gatttatgtt ttttcccgga gctctgtggg acatcatgga 1800
cggtccagtc tggtgatcta aaatagacgg tttgccaagc tcacagagaa gtctttaaga 1860
tcttccacga tgcacgcatg ctttaaggtt agttagtgtt tggtctgaaa aagcgtcaac 1920
aattaggaaa caagaactaa aattattaaa ggacagatca ggaagcatgc atgttcttct 1980
tctatagtgt gtgttgagcc tgagtttggc cttttaggct ttattagggg gctcacagtc 2040
taactaagga gttgtattga tgtgctgaca aatattatgt tcgatcgtca cagtgttctt 2100
atgcggatcg attaggcccg atcatggtga aataaactaa ccaccggtaa gcccgggcag 2160
ccctagagca tgcagcggcc tacgtgaagc ccgcacatcg catcgtcgtc cgtcaggcgc 2220
taacggccgg ccgctgcatg cgtcgccggc gaactctctg ctgagccacc cgtcctccct 2280
ataagtagct atcccagcac cgtcgtctat caaccacaca cagagcggca tttcgaataa 2340
cacaggtgag cgcgaccatg gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaaca 2400
gcgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc gagcaagaag ttcaaggtgc 2460
tgggcaacac cgacaggcac agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca 2520
gcggcgagac cgccgaggcc accaggctga agaggaccgc caggaggagg tacaccagga 2580
ggaagaacag gatctgctac ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg 2640
acagcttctt ccacaggctg gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgaga 2700
ggcacccgat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag tacccgacca 2760
tctaccacct gaggaagaag ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg aggctgatct 2820
acctggccct ggcccacatg atcaagttca ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga 2880
acccggacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc 2940
tgttcgagga gaacccgatc aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgcca 3000
ggctgagcaa gagcaggagg ctggagaacc tgatcgccca gctgccgggc gagaagaaga 3060
acggcctgtt cggcaacctg atcgccctga gcctgggcct gaccccgaac ttcaagagca 3120
acttcgacct ggccgaggac gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc 3180
tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga 3240
acctgagcga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagggt gaacaccgag atcaccaagg 3300
ccccgctgag cgccagcatg atcaagaggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc 3360
tgaaggccct ggtgaggcag cagctgccgg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga 3420
gcaagaacgg ctacgccggc tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt 3480
tcatcaagcc gatcctggag aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaaca 3540
gggaggacct gctgaggaag cagaggacct tcgacaacgg cagcatcccg caccagatcc 3600
acctgggcga gctgcacgcc atcctgagga ggcaggagga cttctacccg ttcctgaagg 3660 114
acaacaggga gaagatcgag aagatcctga ccttccgcat cccgtactac gtgggcccgc 3720
tggccagggg caacagcagg ttcgcctgga tgaccaggaa gagcgaggag accatcaccc 3780
cgtggaactt cgaggaggtg gtggacaagg gcgccagcgc ccagagcttc atcgagagga 3840
tgaccaactt cgacaagaac ctgccgaacg agaaggtgct gccgaagcac agcctgctgt 3900
acgagtactt caccgtgtac aacgagctga ccaaggtgaa gtacgtgacc gagggcatga 3960
ggaagccggc cttcctgagc ggcgagcaga agaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga 4020
ccaacaggaa ggtgaccgtg aagcagctga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct 4080
tcgacagcgt ggagatcagc ggcgtggagg acaggttcaa cgccagcctg ggcacctacc 4140
acgacctgct gaagatcatc aaggacaagg acttcctgga caacgaggag aacgaggaca 4200
tcctggagga catcgtgctg accctgaccc tgttcgagga cagggagatg atcgaggaga 4260
ggctgaagac ctacgcccac ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagaggagga 4320
ggtacaccgg ctggggcagg ctgagcagga agctgatcaa cggcatcagg gacaagcaga 4380
gcggcaagac catcctggac ttcctgaaga gcgacggctt cgccaacagg aacttcatgc 4440
agctgatcca cgacgacagc ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgagcg 4500
gccagggcga cagcctgcac gagcacatcg ccaacctggc cggcagcccg gccatcaaga 4560
agggcatcct gcagaccgtg aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggcaggcaca 4620
agccggagaa catcgtgatc gagatggcca gggagaacca gaccacccag aagggccaga 4680
agaacagcag ggagaggatg aagaggatcg aggagggcat caaggagctg ggcagccaga 4740
tcctgaagga gcacccggtg gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact 4800
acctgcagaa cggcagggac atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac aggctgagcg 4860
actacgacgt ggaccacatc gtgccgcaga gcttcctgaa ggacgacagc atcgacaaca 4920
aggtgctgac caggagcgac aagaacaggg gcaagagcga caacgtgccg agcgaggagg 4980
tggtgaagaa gatgaaaaac tactggaggc agctgctgaa cgccaagctg atcacccaga 5040
ggaagttcga caacctgacc aaggccgaga ggggcggcct gagcgagctg gacaaggccg 5100
gcttcattaa aaggcagctg gtggagacca ggcagatcac caagcacgtg gcccagatcc 5160
tggacagcag gatgaacacc aagtacgacg agaacgacaa gctgatcagg gaggtgaagg 5220
tgatcaccct gaagagcaag ctggtgagcg acttcaggaa ggacttccag ttctacaagg 5280
tgagggagat caataattac caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtggtgggca 5340
ccgccctgat taaaaagtac ccgaagctgg agagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg 5400
tgtacgacgt gaggaagatg atcgccaaga gcgagcagga gatcggcaag gccaccgcca 5460
agtacttctt ctacagcaac atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctggccaacg 5520 115
gcgagatcag gaagaggccg ctgatcgaga ccaacggcga gaccggcgag atcgtgtggg 5580
acaagggcag ggacttcgcc accgtgagga aggtgctgtc catgccgcag gtgaacatcg 5640
tgaagaagac cgaggtgcag accggcggct tcagcaagga gagcatcctg ccgaagagga 5700
acagcgacaa gctgatcgcc aggaagaagg actgggaccc gaagaagtac ggcggcttcg 5760
acagcccgac cgtggcctac agcgtgctgg tggtggccaa ggtggagaag ggcaagagca 5820
agaagctgaa gagcgtgaag gagctggtgg gcatcaccat catggagagg agcagcttcg 5880
agaagaaccc agtggacttc ctggaggcca agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga 5940
tcattaaact gccgaagtac agcctgttcg agctggagaa cggcaggaag aggatgctgg 6000
ccagcgccgg cgagctgcag aagggcaacg agctggccct gccgagcaag tacgtgaact 6060
tcctgtacct ggccagccac tacgagaagc tgaagggcag cccggaggac aacgagcaga 6120
agcagctgtt cgtggagcag cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg 6180
agttcagcaa gagggtgatc ctggccgacg ccaacctgga caaggtgctg agcgcctaca 6240
acaagcacag ggacaagccg atcagggagc aggccgagaa catcatccac ctgttcaccc 6300
tgaccaacct gggcgccccg gccgccttca agtacttcga caccaccatc gacaggaaga 6360
ggtacaccag caccaaggag gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc 6420
tgtacgagac caggatcgac ctgagccagc tgggcggcga cagcagcccg ccgaagaaga 6480
agaggaaggt gagctggaag gacgccagcg gctggagcag gatgtgacca tggagctcta 6540
aactttgaat tcccttcgat tcatccggca cagcgggcta tggaccttca gcagcaagct 6600
aattaagttg gcagcatgca ccgctaacct tatatactac tgagacttcc aaattctagt 6660
atatgtaatc cttttgttcg ggttcatgat cgaattccaa agagtggaaa acaagcaaaa 6720
ggttaaatat acatgccatt tttggaggca tttttttcat gagggcatgt ttcgatatat 6780
ggaccactaa atatacatat catttacttt cctacaaatt tgctacatcc ttggaaatgc 6840
atagtctgtc tccaagaaaa agatactctg attacatcac tagtacacac agcctctata 6900
gtggcggttc tagagacatt ttcactggcg cttttcagtg ccgccagtgt taggggccag 6960
tggaaatcgc catttccatt caataaccgc cagtggaaaa agcatttcca ctggcggttt 7020
tcttaagcaa ccgccagtgg aaatgtttcc cgtctttttt taaattttcg tactgaaatt 7080
tatatattta cacacacaaa catatatata tatatattga tattgataaa catgtagtat 7140
tgatactaaa agcaacatga aattaaattc tatcatacat ttatatacat caaagtcttg 7200
tttacaacca tgtatgcatc acacattata tacatcaaag ttttcactta agctctaata 7260
actatctcgg ctaagagata gtctactaat ttctgttagt attctaaact ctggcaaagc 7320
taatgttccg gaagcatcgt gatatttccc ttctgcggga atgacctctt tcaatatgaa 7380
tgtgcacagg tcctcaacta tgccatacaa tgcaccttca gtcaagttct ccgggcttcc 7440 116
tttttgaaat tgctgtaaag gaagtttata aacatcatct atttatactc aataataaca 7500
catttgcatc tttaatgaca taaatacata cgtgactatt actaataata ccttgccagg 7560
gttcgtgatg tatcgtccat tcattctcat aaactcgcac acgtagaacc cacataggac 7620
cgatccgggt ggttgcttgt ggcactacat aacgggagat tggttattta gttgcaacat 7680
tgtcctatgt acgtacatgt atgatatgta ttcataaatt cacatactta ctggccagtt 7740
ataatggatg tctagtggca cacctttttt ggacgtgtcg tactttccac catgtagctt 7800
ataaaaccta aatgccctgt gatctcaaat agaatcacca tgttattcta caattctcat 7860
gggacccttc gaagggatct ttaaacatac gaacagatca cttaaagttc ttctgaagca 7920
acttaaagtt atcaggcatg catggatctt ggaggaatca gatgtgcagt cagggaccat 7980
agcacaggac aggcgtcttc tactggtgct accagcaaat gctggaagcc gggaacactg 8040
ggtacgttgg aaaccacgtg atgtggagta agataaactg taggagaaaa gcatttcgta 8100
gtgggccatg aagcctttca ggacatgtat tgcagtatgg gccggcccat tacgcaattg 8160
gacgacaaca aagactagta ttagtaccac ctcggctatc cacatagatc aaagctggtt 8220
taaaagagtt gtgcagatga tccgtggcag ctggagctga gcttccgggg ttttagagct 8280
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 8340
ggtgcttttt ttttcggacc gcgcctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta 8400
gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca 8460
cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata 8520
atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt 8580
agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt 8640
tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc 8700
attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt 8760
agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag 8820
tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac 8880
aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa 8940
tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg 9000
tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc 9060
tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc 9120
ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca 9180
gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa 9240
atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac 9300 117
acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt 9360
cctccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc 9420
ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc 9480
tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag 9540
tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca 9600
tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat 9660
gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat 9720
gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg 9780
gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag 9840
atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg 9900
catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg 9960
ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt 10020
ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat 10080
atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc 10140
atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt 10200
atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat 10260
gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt 10320
cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcagggat ccggcagcag ccatgcagaa 10380
gctgatcaac agcgtgcaga actacgcctg gggcagcaag accgccctga ccgagctgta 10440
cggcatggag aaccccagca gccagcccat ggccgagctg tggatgggcg cccaccccaa 10500
gagcagcagc cgcgtgcaga acgccgccgg cgacatcgtg agcctgcgcg acgtgatcga 10560
gagcgacaag agcaccctgc tgggcgaggc cgtggccaag cgcttcggcg agctgccctt 10620
cctgttcaag gtgctgtgcg ccgcccagcc cctgagcatc caggtgcacc ccaacaagca 10680
caacagcgag atcggcttcg ccaaggagaa cgccgccggc atccccatgg acgccgccga 10740
gcgcaactac aaggacccca accacaagcc cgagctggtg ttcgccctga cccccttcct 10800
ggccatgaac gccttccgcg agttcagcga gatcgtgagc ctgctgcagc ccgtggccgg 10860
cgcccacccc gccatcgccc acttcctgca gcagcccgac gccgagcgcc tgagcgagct 10920
gttcgccagc ctgctgaaca tgcagggcga ggagaagagc cgcgccctgg ccatcctgaa 10980
gagcgccctg gacagccagc agggcgagcc ctggcagacc atccgcctga tcagcgagtt 11040
ctaccccgag gacagcggcc tgttcagccc cctgctgctg aacgtggtga agctgaaccc 11100
cggcgaggcc atgttcctgt tcgccgagac cccccacgcc tacctgcagg gcgtggccct 11160
ggaggtgatg gccaacagcg acaacgtgct gcgcgccggc ctgaccccca agtacatcga 11220 118
catccccgag ctggtggcca acgtgaagtt cgaggccaag cccgccaacc agctgctgac 11280
ccagcccgtg aagcagggcg ccgagctgga cttccccatc cccgtggacg acttcgcctt 11340
cagcctgcac gacctgagcg acaaggagac caccatcagc cagcagagcg ccgccatcct 11400
gttctgcgtg gagggcgacg ccaccctgtg gaagggcagc cagcagctgc agctgaagcc 11460
cggcgagagc gccttcatcg ccgccaacga gagccccgtg accgtgaagg gccacggccg 11520
cctggcccgc gtgtacaaca agctgtgata ggagctcgat ccgtcgacct gcagatcgtt 11580
caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 11640
tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 11700
tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 11760
aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 11820
tagatcggcg cgccgcaatt gaagtttggg cggccagcat ggccgtatcc gcaatgtgtt 11880
attaagttgt ctaagcgtca atttgtttac accacaatat atcctgccac cagccagcca 11940
acagctcccc gaccggcagc tcggcacaaa atcaccactc gatacaggca gcccatcaga 12000
attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt 12060
caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt 12120
gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc 12180
tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga 12240
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagggaagcg ttgatcgccg 12300
aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc gaaccgacgt 12360
tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca cacagtgata 12420
ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga gctttgatca 12480
acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc gctgtagaag 12540
tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag cgcgaactgc 12600
aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca gccacgatcg 12660
acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc ttggtaggtc 12720
cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag gcgctaaatg 12780
aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga aatgtagtgc 12840
ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg aaggatgtcg 12900
ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata cttgaagcta 12960
ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat 13020
ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aagtagtcgg caaataaagc tctagtggat 13080 119
ctccgtaccc ggggatctgg ctcgcggcgg acgcacgacg ccggggcgag accataggcg 13140
atctcctaaa tcaatagtag ctgtaacctc gaagcgtttc acttgtaaca acgattgaga 13200
atttttgtca taaaattgaa atacttggtt cgcatttttg tcatccgcgg tcagccgcaa 13260
ttctgacgaa ctgcccattt agctggagat gattgtacat ccttcacgtg aaaatttctc 13320
aagcgctgtg aacaagggtt cagattttag attgaaaggt gagccgttga aacacgttct 13380
tcttgtcgat gacgacgtcg ctatgcggca tcttattatt gaatacctta cgatccacgc 13440
cttcaaagtg accgcggtag ccgacagcac ccagttcaca agagtactct cttccgcgac 13500
ggtcgatgtc gtggttgttg atctagattt aggtcgtgaa gatgggctcg agctaggagc 13560
aagtgatttt atcgctaagc cgttcagtat cagagagttt ctagcacgca ttcgggttgc 13620
cttgcgcgtg cgccccaacg ttgtccgctc caaagaccga cggtcttttt gttttactga 13680
ctggacactt aatctcaggc aacgtcgctt gatgtccgaa gctggcggtg aggtgaaact 13740
tacggcaggt gagttcaatc ttctcctcgc gtttttagag aaaccccgcg acgttctatc 13800
gcgcgagcaa cttctcattg ccagtcgagt acgcgacgag gaggtttatg acaggagtat 13860
agatgttctc attttgaggc tgcgccgcaa acttgaggca gatccgtcaa gccctcaact 13920
gataaaaaca gcaagaggtg ccggttattt ctttgacgcg gacgtgcagg tttcgcacgg 13980
ggggacgatg gcagcctgag ccaattccca gatccccgag gaatcggcgt gagcggtcgc 14040
aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg 14100
aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg 14160
tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg 14220
ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc 14280
tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg 14340
aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag 14400
gtttccgcag ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg 14460
gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc 14520
cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga 14580
aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg 14640
cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg 14700
attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag 14760
ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt 14820
caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc 14880
cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc 14940
agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac 15000 120
ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc 15060
taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta 15120
gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg 15180
tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag 15240
ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat 15300
ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca 15360
taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg 15420
cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg 15480
gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac 15540
cgccggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc 15600
gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg 15660
gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga 15720
tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc 15780
gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa 15840
actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt 15900
tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg 15960
caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt 16020
tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg 16080
gtgagaatgg caaaagctct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 16140
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 16200
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 16260
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 16320
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 16380
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 16440
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 16500
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 16560
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 16620
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 16680
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 16740
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 16800
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 16860 121
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 16920
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 16980
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttgatccgg 17040
aatta 17045
<210> 37
<211> 16776
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 24091
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (330)..(2417)
<223> prZmGRMZM2G471240-01
<220>
<221> ген
<222> (2420)..(6589)
<223> cCas9-01
<220>
<221> мутация
<222> (5909)..(5911)
<223> мутация L на V
<220>
<221> мутация
<222> (5954)..(5956)
<223> мутация I на V
<220>
<221> Терминатор
<222> (6596)..(7591)
<223> tZmGRMZM2G471240-01
<220>
<221> промотор
<222> (7605)..(7979)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (7981)..(8085)
<223> rsgRNAZmVLHP-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (7981)..(8000)
<223> xZmVLHP2 122
<220>
<221> другой_признак
<222> (8001)..(8012)
<223> rCrRNA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (8017)..(8085)
<223> rTracrRNA-01
<220>
<221> промотор
<222> (8096)..(10087)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (10104)..(11282)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (11305)..(11557)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (11601)..(11730)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (12010)..(12798)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (12893)..(13023)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (13098)..(13730)
<223> cVirG-09
<220>
<221> ген
<222> (13760)..(14833)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (14876)..(15280)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (15958)..(16764)
<223> oCOLE-06
<400> 37
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60 123
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
tacctcgcga atgcatctag atgggaccct atttgtactc attccatgtc tcataaactt 360
tgggcaccat ccatccaaca catccaatct aaacacacca aacgatgggg aatggaaaga 420
gcagtattcg attcaacaat ggcaaacaaa tatcactgaa ttagaccaag aataaaccta 480
attagacaac gacctcccaa ccatcattcg tcaggctgta aagaagataa agctgccttg 540
gggcatggat caagcagaac accagagatg aatccaaaca cacagaaaat cacgcgcgct 600
gtctacaatg acaacaagcc ccacatttca ttgcagtaca ctgggctaca aaggcacgta 660
caacaaagag ctagggaaac attgcggagg gcacgagaga gcagctaact tgacaatata 720
gcagactgag cttgcactgt tagcaggcga ggaagggaat catggggacg gagaatgggg 780
tccatgcccg cgaaggagaa ggcggacgcc gccacggtgg caccggcgca cgcgcacaca 840
gggaacccgc acaggcagcc aaggatgctg cctcgccatt gcgccggtcg tctctgccac 900
gctcctctct ctctcccgct gcatcgccgt ggatggggca agcagagagc agggactgcg 960
acgatctggg cggaggactc gccttggaga gcgcggacgc agacgggatt ctagggagag 1020
agcgaagacg gggcgcgcgc ggcgctcgcg cggcgtggtg gcggcgagat tagcgggggt 1080
ggggggaggg cggagccgtg gtgagggtgt ggacgccctc cttaccctct taagtagtag 1140
tagagatata atccgttcca aaatatccat ccgttcaatt tatatttcgt ttgatctttt 1200
taccctaaat ttgattgact catcttatta aaaaagttca taactattat taatctttat 1260
tgagatatca tttagcatat aatatacttt aagtgtggtt ttagattttt tttaaaaaaa 1320
aaaattcgca aaaattaaat gaaacgaccc aatcaaactt gaaaagtaaa actaattata 1380
aatttgaacg gaaggagtaa gaggatgttt gaatgtacta gagctaatag ttggttgctt 1440
taaaatttgc tagtagaatt agctagctaa taaatatcta gataactatt agctaatttg 1500
ctaaaacagc taatagttga actattagct agattgtttg gatgtattcg gctaatttta 1560
atggctaact attagctata gtacaatatt caaacacctc ctaattaaaa tggacaaata 1620
tctcttcttt tggtcccttg cgttagattt ttcatatctc cttatttagt ataaaagaat 1680
catcaaaaag tggacaaccc ctagtggaac accattttag tagtggttgc atgaaacctt 1740
tcgcgcacca gtttctatgt gtcactctaa aaatgggaca gcatgtacgt agtgcctata 1800
tatatacaag tcatctatcg ttgcctcctc agttcatcac taatcacact tattgtgccc 1860
tcgacgagta tctatagcta gctcattaat cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca 1920
ttggcgagct actcgtcgcg gcgtccaagc aatacctgta gcacgaaggc gatcgccggg 1980 124
agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc 2040
ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag 2100
gagctggacg caccggaggc gaggctggcg gactacttcg actacatcgc cggaaccagc 2160
accggcggtc tcatcaccgc cttgctgacc gcgcccggca aggacaagcg gcctctctag 2220
gctgccaagg acatcaacca cttttacatc cataactgcc cgcgcatctt tcctcagaag 2280
tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc atccatccag catcgtacgt acgtcctcta 2340
tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt tgtggcatgc atgcatgcat gtgagcagga 2400
gcaggcttgc gaaaacccca tggacaagaa gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa 2460
cagcgtgggc tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg ccgagcaaga agttcaaggt 2520
gctgggcaac accgacaggc acagcatcaa gaagaacctg atcggcgccc tgctgttcga 2580
cagcggcgag accgccgagg ccaccaggct gaagaggacc gccaggagga ggtacaccag 2640
gaggaagaac aggatctgct acctgcagga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga 2700
cgacagcttc ttccacaggc tggaggagag cttcctggtg gaggaggaca agaagcacga 2760
gaggcacccg atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtacccgac 2820
catctaccac ctgaggaaga agctggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgaggctgat 2880
ctacctggcc ctggcccaca tgatcaagtt caggggccac ttcctgatcg agggcgacct 2940
gaacccggac aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca 3000
gctgttcgag gagaacccga tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgagcgc 3060
caggctgagc aagagcagga ggctggagaa cctgatcgcc cagctgccgg gcgagaagaa 3120
gaacggcctg ttcggcaacc tgatcgccct gagcctgggc ctgaccccga acttcaagag 3180
caacttcgac ctggccgagg acgccaagct gcagctgagc aaggacacct acgacgacga 3240
cctggacaac ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgttcc tggccgccaa 3300
gaacctgagc gacgccatcc tgctgagcga catcctgagg gtgaacaccg agatcaccaa 3360
ggccccgctg agcgccagca tgatcaagag gtacgacgag caccaccagg acctgaccct 3420
gctgaaggcc ctggtgaggc agcagctgcc ggagaagtac aaggagatct tcttcgacca 3480
gagcaagaac ggctacgccg gctacatcga cggcggcgcc agccaggagg agttctacaa 3540
gttcatcaag ccgatcctgg agaagatgga cggcaccgag gagctgctgg tgaagctgaa 3600
cagggaggac ctgctgagga agcagaggac cttcgacaac ggcagcatcc cgcaccagat 3660
ccacctgggc gagctgcacg ccatcctgag gaggcaggag gacttctacc cgttcctgaa 3720
ggacaacagg gagaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccgtact acgtgggccc 3780
gctggccagg ggcaacagca ggttcgcctg gatgaccagg aagagcgagg agaccatcac 3840 125
cccgtggaac ttcgaggagg tggtggacaa gggcgccagc gcccagagct tcatcgagag 3900
gatgaccaac ttcgacaaga acctgccgaa cgagaaggtg ctgccgaagc acagcctgct 3960
gtacgagtac ttcaccgtgt acaacgagct gaccaaggtg aagtacgtga ccgagggcat 4020
gaggaagccg gccttcctga gcggcgagca gaagaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa 4080
gaccaacagg aaggtgaccg tgaagcagct gaaggaggac tacttcaaga agatcgagtg 4140
cttcgacagc gtggagatca gcggcgtgga ggacaggttc aacgccagcc tgggcaccta 4200
ccacgacctg ctgaagatca tcaaggacaa ggacttcctg gacaacgagg agaacgagga 4260
catcctggag gacatcgtgc tgaccctgac cctgttcgag gacagggaga tgatcgagga 4320
gaggctgaag acctacgccc acctgttcga cgacaaggtg atgaagcagc tgaagaggag 4380
gaggtacacc ggctggggca ggctgagcag gaagctgatc aacggcatca gggacaagca 4440
gagcggcaag accatcctgg acttcctgaa gagcgacggc ttcgccaaca ggaacttcat 4500
gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt caaggaggac atccagaagg cccaggtgag 4560
cggccagggc gacagcctgc acgagcacat cgccaacctg gccggcagcc cggccatcaa 4620
gaagggcatc ctgcagaccg tgaaggtggt ggacgagctg gtgaaggtga tgggcaggca 4680
caagccggag aacatcgtga tcgagatggc cagggagaac cagaccaccc agaagggcca 4740
gaagaacagc agggagagga tgaagaggat cgaggagggc atcaaggagc tgggcagcca 4800
gatcctgaag gagcacccgg tggagaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta 4860
ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt ggaccaggag ctggacatca acaggctgag 4920
cgactacgac gtggaccaca tcgtgccgca gagcttcctg aaggacgaca gcatcgacaa 4980
caaggtgctg accaggagcg acaagaacag gggcaagagc gacaacgtgc cgagcgagga 5040
ggtggtgaag aagatgaaaa actactggag gcagctgctg aacgccaagc tgatcaccca 5100
gaggaagttc gacaacctga ccaaggccga gaggggcggc ctgagcgagc tggacaaggc 5160
cggcttcatt aaaaggcagc tggtggagac caggcagatc accaagcacg tggcccagat 5220
cctggacagc aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctgatca gggaggtgaa 5280
ggtgatcacc ctgaagagca agctggtgag cgacttcagg aaggacttcc agttctacaa 5340
ggtgagggag atcaataatt accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtggtggg 5400
caccgccctg attaaaaagt acccgaagct ggagagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa 5460
ggtgtacgac gtgaggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gagatcggca aggccaccgc 5520
caagtacttc ttctacagca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca ccctggccaa 5580
cggcgagatc aggaagaggc cgctgatcga gaccaacggc gagaccggcg agatcgtgtg 5640
ggacaagggc agggacttcg ccaccgtgag gaaggtgctg tccatgccgc aggtgaacat 5700
cgtgaagaag accgaggtgc agaccggcgg cttcagcaag gagagcatcc tgccgaagag 5760 126
gaacagcgac aagctgatcg ccaggaagaa ggactgggac ccgaagaagt acggcggctt 5820
cgacagcccg accgtggcct acagcgtgct ggtggtggcc aaggtggaga agggcaagag 5880
caagaagctg aagagcgtga aggagctggt gggcatcacc atcatggaga ggagcagctt 5940
cgagaagaac ccagtggact tcctggaggc caagggctac aaggaggtga agaaggacct 6000
gatcattaaa ctgccgaagt acagcctgtt cgagctggag aacggcagga agaggatgct 6060
ggccagcgcc ggcgagctgc agaagggcaa cgagctggcc ctgccgagca agtacgtgaa 6120
cttcctgtac ctggccagcc actacgagaa gctgaagggc agcccggagg acaacgagca 6180
gaagcagctg ttcgtggagc agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag 6240
cgagttcagc aagagggtga tcctggccga cgccaacctg gacaaggtgc tgagcgccta 6300
caacaagcac agggacaagc cgatcaggga gcaggccgag aacatcatcc acctgttcac 6360
cctgaccaac ctgggcgccc cggccgcctt caagtacttc gacaccacca tcgacaggaa 6420
gaggtacacc agcaccaagg aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg 6480
cctgtacgag accaggatcg acctgagcca gctgggcggc gacagcagcc cgccgaagaa 6540
gaagaggaag gtgagctgga aggacgccag cggctggagc aggatgtgac catgggacaa 6600
gtggctttac tgtcagtcac atgcttgtaa ataagtagac tttattttaa taaaacataa 6660
aaatatatat atgttcttga atataaaatt gataaccaaa ttaaaattcg aaccatcact 6720
tatacataat tttactttat tttttataaa acgtgaacgg gaaggactac cgtgaatgac 6780
tatagaacca atcatactag tataaaatat atgatgacac tacgggagag acaaactttg 6840
tctggcgcta aatattttgc cgagtgtgaa ttcacgggca ctaggcaaag atcttctttg 6900
ccgagtgtta cgctgggcaa agtaagacac taggtaaatc agtcatttgc cgagtgtccg 6960
ccactaggca aagcaaaaca ctggcaaatc aaaagtttac ctagtgccag acactaggca 7020
aaaaaaaaac gctcggcaaa tcggaagttt ccctagtgcc agacactaga caaagaaaaa 7080
cacttgataa actagcgtcg tcagctaaca ccatccacca accgttaacg ttgccgagta 7140
tctgacttcg acactcggca aagaaggtct ctttgcctag tgtcggtctg gaacactagg 7200
caaagaggca ctttacctag tgtcgtattt tgacactcag taaaataatt ttttttcttt 7260
ctgcttccaa actttttatg atgtgttcct atagcaccta gaactacatg tcaagttttg 7320
gtaaaatttt tgaagttttt gctatattta cttaatttat tttatttaat tgaatttctt 7380
ttgataattc aaatttgaac tcggcaaggt aagaagcgag ggtagcctgg aaacacactt 7440
tgcctagtgt tacactcggt acaggagcct cccctgccta gtgctgcact cgacaaaaga 7500
ttcgcctttg cctagcgctg cactcggcac aggagtcgcc tttgcctagt gctgcactag 7560
gcaaagcctc cgttaccgtg ccttccatcg tcggaccctt cgaagggatc tttaaacata 7620 127
cgaacagatc acttaaagtt cttctgaagc aacttaaagt tatcaggcat gcatggatct 7680
tggaggaatc agatgtgcag tcagggacca tagcacagga caggcgtctt ctactggtgc 7740
taccagcaaa tgctggaagc cgggaacact gggtacgttg gaaaccacgt gatgtggagt 7800
aagataaact gtaggagaaa agcatttcgt agtgggccat gaagcctttc aggacatgta 7860
ttgcagtatg ggccggccca ttacgcaatt ggacgacaac aaagactagt attagtacca 7920
cctcggctat ccacatagat caaagctggt ttaaaagagt tgtgcagatg atccgtggca 7980
gctggagctg agcttccggg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 8040
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttttcggac cgcgcctgca 8100
gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 8160
taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt 8220
atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 8280
gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 8340
ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 8400
caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 8460
gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 8520
ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 8580
tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 8640
aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt 8700
ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca 8760
cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg 8820
ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag 8880
gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc 8940
ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc 9000
caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt 9060
cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc cccccctctc taccttctct 9120
agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt 9180
tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac 9240
gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc 9300
tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt 9360
tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt 9420
tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc 9480
ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg 9540 128
tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata 9600
ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg 9660
gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac 9720
tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct 9780
tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 9840
gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac 9900
cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat 9960
acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg 10020
ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact 10080
tctgcaggga tccggcagca gccatgcaga agctgatcaa cagcgtgcag aactacgcct 10140
ggggcagcaa gaccgccctg accgagctgt acggcatgga gaaccccagc agccagccca 10200
tggccgagct gtggatgggc gcccacccca agagcagcag ccgcgtgcag aacgccgccg 10260
gcgacatcgt gagcctgcgc gacgtgatcg agagcgacaa gagcaccctg ctgggcgagg 10320
ccgtggccaa gcgcttcggc gagctgccct tcctgttcaa ggtgctgtgc gccgcccagc 10380
ccctgagcat ccaggtgcac cccaacaagc acaacagcga gatcggcttc gccaaggaga 10440
acgccgccgg catccccatg gacgccgccg agcgcaacta caaggacccc aaccacaagc 10500
ccgagctggt gttcgccctg acccccttcc tggccatgaa cgccttccgc gagttcagcg 10560
agatcgtgag cctgctgcag cccgtggccg gcgcccaccc cgccatcgcc cacttcctgc 10620
agcagcccga cgccgagcgc ctgagcgagc tgttcgccag cctgctgaac atgcagggcg 10680
aggagaagag ccgcgccctg gccatcctga agagcgccct ggacagccag cagggcgagc 10740
cctggcagac catccgcctg atcagcgagt tctaccccga ggacagcggc ctgttcagcc 10800
ccctgctgct gaacgtggtg aagctgaacc ccggcgaggc catgttcctg ttcgccgaga 10860
ccccccacgc ctacctgcag ggcgtggccc tggaggtgat ggccaacagc gacaacgtgc 10920
tgcgcgccgg cctgaccccc aagtacatcg acatccccga gctggtggcc aacgtgaagt 10980
tcgaggccaa gcccgccaac cagctgctga cccagcccgt gaagcagggc gccgagctgg 11040
acttccccat ccccgtggac gacttcgcct tcagcctgca cgacctgagc gacaaggaga 11100
ccaccatcag ccagcagagc gccgccatcc tgttctgcgt ggagggcgac gccaccctgt 11160
ggaagggcag ccagcagctg cagctgaagc ccggcgagag cgccttcatc gccgccaacg 11220
agagccccgt gaccgtgaag ggccacggcc gcctggcccg cgtgtacaac aagctgtgat 11280
aggagctcga tccgtcgacc tgcagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga 11340
ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag 11400 129
catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga 11460
gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat 11520
aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggc gcgccgcaat tgaagtttgg 11580
gcggccagca tggccgtatc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta 11640
caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa 11700
aatcaccact cgatacaggc agcccatcag aattaattct catgtttgac agcttatcat 11760
cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc 11820
tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat 11880
aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac 11940
aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 12000
aaacagacca tgagggaagc gttgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt 12060
ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg tacatttgta cggctccgca 12120
gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc tggttacggt gaccgtaagg 12180
cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc ggcttcccct 12240
ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga cgacatcatt 12300
ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg caatgacatt 12360
cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt gctgacaaaa 12420
gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt tgatccggtt 12480
cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa ctcgccgccc 12540
gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg gtacagcgca 12600
gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact gggcaatgga gcgcctgccg 12660
gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt atcttggaca agaagatcgc 12720
ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcact acgtgaaagg cgagatcacc 12780
aaagtagtcg gcaaataaag ctctagtgga tctccgtacc cggggatctg gctcgcggcg 12840
gacgcacgac gccggggcga gaccataggc gatctcctaa atcaatagta gctgtaacct 12900
cgaagcgttt cacttgtaac aacgattgag aatttttgtc ataaaattga aatacttggt 12960
tcgcattttt gtcatccgcg gtcagccgca attctgacga actgcccatt tagctggaga 13020
tgattgtaca tccttcacgt gaaaatttct caagcgctgt gaacaagggt tcagatttta 13080
gattgaaagg tgagccgttg aaacacgttc ttcttgtcga tgacgacgtc gctatgcggc 13140
atcttattat tgaatacctt acgatccacg ccttcaaagt gaccgcggta gccgacagca 13200
cccagttcac aagagtactc tcttccgcga cggtcgatgt cgtggttgtt gatctagatt 13260
taggtcgtga agatgggctc gagctaggag caagtgattt tatcgctaag ccgttcagta 13320 130
tcagagagtt tctagcacgc attcgggttg ccttgcgcgt gcgccccaac gttgtccgct 13380
ccaaagaccg acggtctttt tgttttactg actggacact taatctcagg caacgtcgct 13440
tgatgtccga agctggcggt gaggtgaaac ttacggcagg tgagttcaat cttctcctcg 13500
cgtttttaga gaaaccccgc gacgttctat cgcgcgagca acttctcatt gccagtcgag 13560
tacgcgacga ggaggtttat gacaggagta tagatgttct cattttgagg ctgcgccgca 13620
aacttgaggc agatccgtca agccctcaac tgataaaaac agcaagaggt gccggttatt 13680
tctttgacgc ggacgtgcag gtttcgcacg gggggacgat ggcagcctga gccaattccc 13740
agatccccga ggaatcggcg tgagcggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc 13800
ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg 13860
catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa 13920
agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga 13980
cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag 14040
catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat 14100
ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag 14160
tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg 14220
ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt 14280
actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg 14340
cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg 14400
cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga 14460
aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac 14520
agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg 14580
catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg 14640
gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt 14700
caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc 14760
ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc 14820
cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg 14880
tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg 14940
gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta 15000
agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat 15060
taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga 15120
gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg 15180 131
gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg 15240
gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 15300
aggtgttgct gactcatacc aggcctgaat cgccccatca tccagccaga aagtgaggga 15360
gccacggttg atgagagctt tgttgtaggt ggaccagttg gtgattttga acttttgctt 15420
tgccacggaa cggtctgcgt tgtcgggaag atgcgtgatc tgatccttca actcagcaaa 15480
agttcgattt attcaacaaa gccgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt 15540
tacaaccaat taaccaattc tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat 15600
ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga 15660
gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg 15720
actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt 15780
gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctc tgcattaatg 15840
aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 15900
cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 15960
ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 16020
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 16080
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 16140
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 16200
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 16260
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 16320
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 16380
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 16440
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 16500
tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 16560
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 16620
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 16680
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 16740
aaggatcttc acctagatcc ttttgatccg gaatta 16776
<210> 38
<211> 17475
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 24094 132
<220>
<221> другой_признак
<222> (4)..(259)
<223> bNRB-05
<220>
<221> промотор
<222> (330)..(2417)
<223> prZmGRMZM2G471240-01
<220>
<221> ген
<222> (2420)..(7288)
<223> cAmCyanCas9-01
<220>
<221> Терминатор
<222> (7295)..(8290)
<223> tZmGRMZM2G471240-01
<220>
<221> промотор
<222> (8304)..(8678)
<223> prOsU3-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (8679)..(8784)
<223> rsgRNAZmVLHP-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (8680)..(8699)
<223> мишень ZmVLHP2
<220>
<221> другой_признак
<222> (8700)..(8711)
<223> rCrRNA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (8716)..(8784)
<223> rTracrRNA-01
<220>
<221> промотор
<222> (8795)..(10786)
<223> prUbi1-04
<220>
<221> ген
<222> (10803)..(11981)
<223> cPMI-09
<220>
<221> Терминатор
<222> (12004)..(12256)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> другой_признак 133
<222> (12300)..(12429)
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (12709)..(13497)
<223> cSpec-03
<220>
<221> промотор
<222> (13592)..(13722)
<223> prVirG-01
<220>
<221> ген
<222> (13797)..(14429)
<223> cVirG-09
<220>
<221> ген
<222> (14459)..(15532)
<223> cRepA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (15575)..(15979)
<223> oVS1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (16657)..(17463)
<223> oCOLE-06
<400> 38
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300
tacctcgcga atgcatctag atgggaccct atttgtactc attccatgtc tcataaactt 360
tgggcaccat ccatccaaca catccaatct aaacacacca aacgatgggg aatggaaaga 420
gcagtattcg attcaacaat ggcaaacaaa tatcactgaa ttagaccaag aataaaccta 480
attagacaac gacctcccaa ccatcattcg tcaggctgta aagaagataa agctgccttg 540
gggcatggat caagcagaac accagagatg aatccaaaca cacagaaaat cacgcgcgct 600
gtctacaatg acaacaagcc ccacatttca ttgcagtaca ctgggctaca aaggcacgta 660
caacaaagag ctagggaaac attgcggagg gcacgagaga gcagctaact tgacaatata 720
gcagactgag cttgcactgt tagcaggcga ggaagggaat catggggacg gagaatgggg 780
tccatgcccg cgaaggagaa ggcggacgcc gccacggtgg caccggcgca cgcgcacaca 840
gggaacccgc acaggcagcc aaggatgctg cctcgccatt gcgccggtcg tctctgccac 900 134
gctcctctct ctctcccgct gcatcgccgt ggatggggca agcagagagc agggactgcg 960
acgatctggg cggaggactc gccttggaga gcgcggacgc agacgggatt ctagggagag 1020
agcgaagacg gggcgcgcgc ggcgctcgcg cggcgtggtg gcggcgagat tagcgggggt 1080
ggggggaggg cggagccgtg gtgagggtgt ggacgccctc cttaccctct taagtagtag 1140
tagagatata atccgttcca aaatatccat ccgttcaatt tatatttcgt ttgatctttt 1200
taccctaaat ttgattgact catcttatta aaaaagttca taactattat taatctttat 1260
tgagatatca tttagcatat aatatacttt aagtgtggtt ttagattttt tttaaaaaaa 1320
aaaattcgca aaaattaaat gaaacgaccc aatcaaactt gaaaagtaaa actaattata 1380
aatttgaacg gaaggagtaa gaggatgttt gaatgtacta gagctaatag ttggttgctt 1440
taaaatttgc tagtagaatt agctagctaa taaatatcta gataactatt agctaatttg 1500
ctaaaacagc taatagttga actattagct agattgtttg gatgtattcg gctaatttta 1560
atggctaact attagctata gtacaatatt caaacacctc ctaattaaaa tggacaaata 1620
tctcttcttt tggtcccttg cgttagattt ttcatatctc cttatttagt ataaaagaat 1680
catcaaaaag tggacaaccc ctagtggaac accattttag tagtggttgc atgaaacctt 1740
tcgcgcacca gtttctatgt gtcactctaa aaatgggaca gcatgtacgt agtgcctata 1800
tatatacaag tcatctatcg ttgcctcctc agttcatcac taatcacact tattgtgccc 1860
tcgacgagta tctatagcta gctcattaat cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca 1920
ttggcgagct actcgtcgcg gcgtccaagc aatacctgta gcacgaaggc gatcgccggg 1980
agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc 2040
ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag 2100
gagctggacg caccggaggc gaggctggcg gactacttcg actacatcgc cggaaccagc 2160
accggcggtc tcatcaccgc cttgctgacc gcgcccggca aggacaagcg gcctctctag 2220
gctgccaagg acatcaacca cttttacatc cataactgcc cgcgcatctt tcctcagaag 2280
tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc atccatccag catcgtacgt acgtcctcta 2340
tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt tgtggcatgc atgcatgcat gtgagcagga 2400
gcaggcttgc gaaaacccca tggccctgtc caacaagttc atcggcgacg acatgaagat 2460
gacctaccac atggacggct gcgtgaacgg ccactacttc accgtgaagg gcgagggcag 2520
cggcaagccc tacgagggca cccagacctc caccttcaag gtgaccatgg ccaacggcgg 2580
ccccctggcc ttctccttcg acatcctgtc caccgtgttc atgtacggca accgctgctt 2640
caccgcctac cccaccagca tgcccgacta cttcaagcag gccttccccg acggcatgtc 2700
ctacgagaga accttcacct acgaggacgg cggcgtggcc accgccagct gggagatcag 2760 135
cctgaagggc aactgcttcg agcacaagtc caccttccac ggcgtgaact tccccgccga 2820
cggccccgtg atggccaaga agaccaccgg ctgggacccc tccttcgaga agatgaccgt 2880
gtgcgacggc atcttgaagg gcgacgtgac cgccttcctg atgctgcagg gcggcggcaa 2940
ctacagatgc cagttccaca cctcctacaa gaccaagaag cccgtgacca tgccccccaa 3000
ccacgtggtg gagcaccgca tcgccagaac cgacctggac aagggcggca acagcgtgca 3060
gctgaccgag cacgccgtgg cccacatcac ctccgtggtg cccttcggcg gcggcggatc 3120
cgacaagaag tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac agcgtgggct gggccgtgat 3180
caccgacgag tacaaggtgc cgagcaagaa gttcaaggtg ctgggcaaca ccgacaggca 3240
cagcatcaag aagaacctga tcggcgccct gctgttcgac agcggcgaga ccgccgaggc 3300
caccaggctg aagaggaccg ccaggaggag gtacaccagg aggaagaaca ggatctgcta 3360
cctgcaggag atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacaggct 3420
ggaggagagc ttcctggtgg aggaggacaa gaagcacgag aggcacccga tcttcggcaa 3480
catcgtggac gaggtggcct accacgagaa gtacccgacc atctaccacc tgaggaagaa 3540
gctggtggac agcaccgaca aggccgacct gaggctgatc tacctggccc tggcccacat 3600
gatcaagttc aggggccact tcctgatcga gggcgacctg aacccggaca acagcgacgt 3660
ggacaagctg ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg agaacccgat 3720
caacgccagc ggcgtggacg ccaaggccat cctgagcgcc aggctgagca agagcaggag 3780
gctggagaac ctgatcgccc agctgccggg cgagaagaag aacggcctgt tcggcaacct 3840
gatcgccctg agcctgggcc tgaccccgaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga 3900
cgccaagctg cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca 3960
gatcggcgac cagtacgccg acctgttcct ggccgccaag aacctgagcg acgccatcct 4020
gctgagcgac atcctgaggg tgaacaccga gatcaccaag gccccgctga gcgccagcat 4080
gatcaagagg tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaggccc tggtgaggca 4140
gcagctgccg gagaagtaca aggagatctt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg 4200
ctacatcgac ggcggcgcca gccaggagga gttctacaag ttcatcaagc cgatcctgga 4260
gaagatggac ggcaccgagg agctgctggt gaagctgaac agggaggacc tgctgaggaa 4320
gcagaggacc ttcgacaacg gcagcatccc gcaccagatc cacctgggcg agctgcacgc 4380
catcctgagg aggcaggagg acttctaccc gttcctgaag gacaacaggg agaagatcga 4440
gaagatcctg accttccgca tcccgtacta cgtgggcccg ctggccaggg gcaacagcag 4500
gttcgcctgg atgaccagga agagcgagga gaccatcacc ccgtggaact tcgaggaggt 4560
ggtggacaag ggcgccagcg cccagagctt catcgagagg atgaccaact tcgacaagaa 4620
cctgccgaac gagaaggtgc tgccgaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta 4680 136
caacgagctg accaaggtga agtacgtgac cgagggcatg aggaagccgg ccttcctgag 4740
cggcgagcag aagaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaacagga aggtgaccgt 4800
gaagcagctg aaggaggact acttcaagaa gatcgagtgc ttcgacagcg tggagatcag 4860
cggcgtggag gacaggttca acgccagcct gggcacctac cacgacctgc tgaagatcat 4920
caaggacaag gacttcctgg acaacgagga gaacgaggac atcctggagg acatcgtgct 4980
gaccctgacc ctgttcgagg acagggagat gatcgaggag aggctgaaga cctacgccca 5040
cctgttcgac gacaaggtga tgaagcagct gaagaggagg aggtacaccg gctggggcag 5100
gctgagcagg aagctgatca acggcatcag ggacaagcag agcggcaaga ccatcctgga 5160
cttcctgaag agcgacggct tcgccaacag gaacttcatg cagctgatcc acgacgacag 5220
cctgaccttc aaggaggaca tccagaaggc ccaggtgagc ggccagggcg acagcctgca 5280
cgagcacatc gccaacctgg ccggcagccc ggccatcaag aagggcatcc tgcagaccgt 5340
gaaggtggtg gacgagctgg tgaaggtgat gggcaggcac aagccggaga acatcgtgat 5400
cgagatggcc agggagaacc agaccaccca gaagggccag aagaacagca gggagaggat 5460
gaagaggatc gaggagggca tcaaggagct gggcagccag atcctgaagg agcacccggt 5520
ggagaacacc cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga acggcaggga 5580
catgtacgtg gaccaggagc tggacatcaa caggctgagc gactacgacg tggaccacat 5640
cgtgccgcag agcttcctga aggacgacag catcgacaac aaggtgctga ccaggagcga 5700
caagaacagg ggcaagagcg acaacgtgcc gagcgaggag gtggtgaaga agatgaaaaa 5760
ctactggagg cagctgctga acgccaagct gatcacccag aggaagttcg acaacctgac 5820
caaggccgag aggggcggcc tgagcgagct ggacaaggcc ggcttcatta aaaggcagct 5880
ggtggagacc aggcagatca ccaagcacgt ggcccagatc ctggacagca ggatgaacac 5940
caagtacgac gagaacgaca agctgatcag ggaggtgaag gtgatcaccc tgaagagcaa 6000
gctggtgagc gacttcagga aggacttcca gttctacaag gtgagggaga tcaataatta 6060
ccaccacgcc cacgacgcct acctgaacgc cgtggtgggc accgccctga ttaaaaagta 6120
cccgaagctg gagagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgaggaagat 6180
gatcgccaag agcgagcagg agatcggcaa ggccaccgcc aagtacttct tctacagcaa 6240
catcatgaac ttcttcaaga ccgagatcac cctggccaac ggcgagatca ggaagaggcc 6300
gctgatcgag accaacggcg agaccggcga gatcgtgtgg gacaagggca gggacttcgc 6360
caccgtgagg aaggtgctgt ccatgccgca ggtgaacatc gtgaagaaga ccgaggtgca 6420
gaccggcggc ttcagcaagg agagcatcct gccgaagagg aacagcgaca agctgatcgc 6480
caggaagaag gactgggacc cgaagaagta cggcggcttc gacagcccga ccgtggccta 6540 137
cagcgtgctg gtggtggcca aggtggagaa gggcaagagc aagaagctga agagcgtgaa 6600
ggagctggtg ggcatcacca tcatggagag gagcagcttc gagaagaacc cagtggactt 6660
cctggaggcc aagggctaca aggaggtgaa gaaggacctg atcattaaac tgccgaagta 6720
cagcctgttc gagctggaga acggcaggaa gaggatgctg gccagcgccg gcgagctgca 6780
gaagggcaac gagctggccc tgccgagcaa gtacgtgaac ttcctgtacc tggccagcca 6840
ctacgagaag ctgaagggca gcccggagga caacgagcag aagcagctgt tcgtggagca 6900
gcacaagcac tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttcagca agagggtgat 6960
cctggccgac gccaacctgg acaaggtgct gagcgcctac aacaagcaca gggacaagcc 7020
gatcagggag caggccgaga acatcatcca cctgttcacc ctgaccaacc tgggcgcccc 7080
ggccgccttc aagtacttcg acaccaccat cgacaggaag aggtacacca gcaccaagga 7140
ggtgctggac gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga ccaggatcga 7200
cctgagccag ctgggcggcg acagcagccc gccgaagaag aagaggaagg tgagctggaa 7260
ggacgccagc ggctggagca ggatgtgacc atgggacaag tggctttact gtcagtcaca 7320
tgcttgtaaa taagtagact ttattttaat aaaacataaa aatatatata tgttcttgaa 7380
tataaaattg ataaccaaat taaaattcga accatcactt atacataatt ttactttatt 7440
ttttataaaa cgtgaacggg aaggactacc gtgaatgact atagaaccaa tcatactagt 7500
ataaaatata tgatgacact acgggagaga caaactttgt ctggcgctaa atattttgcc 7560
gagtgtgaat tcacgggcac taggcaaaga tcttctttgc cgagtgttac gctgggcaaa 7620
gtaagacact aggtaaatca gtcatttgcc gagtgtccgc cactaggcaa agcaaaacac 7680
tggcaaatca aaagtttacc tagtgccaga cactaggcaa aaaaaaaacg ctcggcaaat 7740
cggaagtttc cctagtgcca gacactagac aaagaaaaac acttgataaa ctagcgtcgt 7800
cagctaacac catccaccaa ccgttaacgt tgccgagtat ctgacttcga cactcggcaa 7860
agaaggtctc tttgcctagt gtcggtctgg aacactaggc aaagaggcac tttacctagt 7920
gtcgtatttt gacactcagt aaaataattt tttttctttc tgcttccaaa ctttttatga 7980
tgtgttccta tagcacctag aactacatgt caagttttgg taaaattttt gaagtttttg 8040
ctatatttac ttaatttatt ttatttaatt gaatttcttt tgataattca aatttgaact 8100
cggcaaggta agaagcgagg gtagcctgga aacacacttt gcctagtgtt acactcggta 8160
caggagcctc ccctgcctag tgctgcactc gacaaaagat tcgcctttgc ctagcgctgc 8220
actcggcaca ggagtcgcct ttgcctagtg ctgcactagg caaagcctcc gttaccgtgc 8280
cttccatcgt cggacccttc gaagggatct ttaaacatac gaacagatca cttaaagttc 8340
ttctgaagca acttaaagtt atcaggcatg catggatctt ggaggaatca gatgtgcagt 8400
cagggaccat agcacaggac aggcgtcttc tactggtgct accagcaaat gctggaagcc 8460 138
gggaacactg ggtacgttgg aaaccacgtg atgtggagta agataaactg taggagaaaa 8520
gcatttcgta gtgggccatg aagcctttca ggacatgtat tgcagtatgg gccggcccat 8580
tacgcaattg gacgacaaca aagactagta ttagtaccac ctcggctatc cacatagatc 8640
aaagctggtt taaaagagtt gtgcagatga tccgtggcag ctggagctga gcttccgggg 8700
ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 8760
gcaccgagtc ggtgcttttt ttttcggacc gcgcctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg 8820
cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt 8880
ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac 8940
tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa 9000
atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt 9060
tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa 9120
tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac 9180
taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac 9240
tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta 9300
aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc 9360
gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga 9420
accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc 9480
tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa 9540
attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac 9600
ggcaccggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc 9660
gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc 9720
gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta 9780
cgccgctcgt cctccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg 9840
gttagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga 9900
tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct 9960
aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg 10020
atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat 10080
ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg 10140
ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa 10200
ctacctggtg gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta 10260
cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt 10320 139
tttactgatg catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt 10380
tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta 10440
tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat 10500
ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat 10560
acatgatggc atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata 10620
ataaacaagt atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca 10680
gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg 10740
tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcagggat ccggcagcag 10800
ccatgcagaa gctgatcaac agcgtgcaga actacgcctg gggcagcaag accgccctga 10860
ccgagctgta cggcatggag aaccccagca gccagcccat ggccgagctg tggatgggcg 10920
cccaccccaa gagcagcagc cgcgtgcaga acgccgccgg cgacatcgtg agcctgcgcg 10980
acgtgatcga gagcgacaag agcaccctgc tgggcgaggc cgtggccaag cgcttcggcg 11040
agctgccctt cctgttcaag gtgctgtgcg ccgcccagcc cctgagcatc caggtgcacc 11100
ccaacaagca caacagcgag atcggcttcg ccaaggagaa cgccgccggc atccccatgg 11160
acgccgccga gcgcaactac aaggacccca accacaagcc cgagctggtg ttcgccctga 11220
cccccttcct ggccatgaac gccttccgcg agttcagcga gatcgtgagc ctgctgcagc 11280
ccgtggccgg cgcccacccc gccatcgccc acttcctgca gcagcccgac gccgagcgcc 11340
tgagcgagct gttcgccagc ctgctgaaca tgcagggcga ggagaagagc cgcgccctgg 11400
ccatcctgaa gagcgccctg gacagccagc agggcgagcc ctggcagacc atccgcctga 11460
tcagcgagtt ctaccccgag gacagcggcc tgttcagccc cctgctgctg aacgtggtga 11520
agctgaaccc cggcgaggcc atgttcctgt tcgccgagac cccccacgcc tacctgcagg 11580
gcgtggccct ggaggtgatg gccaacagcg acaacgtgct gcgcgccggc ctgaccccca 11640
agtacatcga catccccgag ctggtggcca acgtgaagtt cgaggccaag cccgccaacc 11700
agctgctgac ccagcccgtg aagcagggcg ccgagctgga cttccccatc cccgtggacg 11760
acttcgcctt cagcctgcac gacctgagcg acaaggagac caccatcagc cagcagagcg 11820
ccgccatcct gttctgcgtg gagggcgacg ccaccctgtg gaagggcagc cagcagctgc 11880
agctgaagcc cggcgagagc gccttcatcg ccgccaacga gagccccgtg accgtgaagg 11940
gccacggccg cctggcccgc gtgtacaaca agctgtgata ggagctcgat ccgtcgacct 12000
gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 12060
gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 12120
tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 12180
tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 12240 140
tctatgttac tagatcggcg cgccgcaatt gaagtttggg cggccagcat ggccgtatcc 12300
gcaatgtgtt attaagttgt ctaagcgtca atttgtttac accacaatat atcctgccac 12360
cagccagcca acagctcccc gaccggcagc tcggcacaaa atcaccactc gatacaggca 12420
gcccatcaga attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg 12480
cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg 12540
cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc 12600
ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat 12660
aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagggaagcg 12720
ttgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc 12780
gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca 12840
cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga 12900
gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc 12960
gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag 13020
cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca 13080
gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc 13140
ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag 13200
gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga 13260
aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg 13320
aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata 13380
cttgaagcta ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 13440
ttggaagaat ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aagtagtcgg caaataaagc 13500
tctagtggat ctccgtaccc ggggatctgg ctcgcggcgg acgcacgacg ccggggcgag 13560
accataggcg atctcctaaa tcaatagtag ctgtaacctc gaagcgtttc acttgtaaca 13620
acgattgaga atttttgtca taaaattgaa atacttggtt cgcatttttg tcatccgcgg 13680
tcagccgcaa ttctgacgaa ctgcccattt agctggagat gattgtacat ccttcacgtg 13740
aaaatttctc aagcgctgtg aacaagggtt cagattttag attgaaaggt gagccgttga 13800
aacacgttct tcttgtcgat gacgacgtcg ctatgcggca tcttattatt gaatacctta 13860
cgatccacgc cttcaaagtg accgcggtag ccgacagcac ccagttcaca agagtactct 13920
cttccgcgac ggtcgatgtc gtggttgttg atctagattt aggtcgtgaa gatgggctcg 13980
agctaggagc aagtgatttt atcgctaagc cgttcagtat cagagagttt ctagcacgca 14040
ttcgggttgc cttgcgcgtg cgccccaacg ttgtccgctc caaagaccga cggtcttttt 14100 141
gttttactga ctggacactt aatctcaggc aacgtcgctt gatgtccgaa gctggcggtg 14160
aggtgaaact tacggcaggt gagttcaatc ttctcctcgc gtttttagag aaaccccgcg 14220
acgttctatc gcgcgagcaa cttctcattg ccagtcgagt acgcgacgag gaggtttatg 14280
acaggagtat agatgttctc attttgaggc tgcgccgcaa acttgaggca gatccgtcaa 14340
gccctcaact gataaaaaca gcaagaggtg ccggttattt ctttgacgcg gacgtgcagg 14400
tttcgcacgg ggggacgatg gcagcctgag ccaattccca gatccccgag gaatcggcgt 14460
gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt 14520
ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc 14580
cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc 14640
agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt 14700
tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt 14760
ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg 14820
gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt 14880
actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga 14940
caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc 15000
cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca 15060
cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg 15120
tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat 15180
cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt 15240
gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg 15300
cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga 15360
acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg 15420
gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct 15480
agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga 15540
gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt 15600
ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg 15660
gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa 15720
aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct 15780
ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct 15840
tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg 15900
ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc 15960
gccactcgac cgccggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca 16020 142
ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt 16080
gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt 16140
gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag 16200
ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct 16260
gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 16320
ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 16380
cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa 16440
cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg 16500
actgaatccg gtgagaatgg caaaagctct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 16560
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 16620
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 16680
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 16740
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 16800
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 16860
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 16920
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 16980
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 17040
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 17100
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 17160
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 17220
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 17280
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 17340
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 17400
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 17460
tttgatccgg aatta 17475
<210> 39
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 39
ttgtgctgct ccacgaaca 19 143
<210> 40
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 40
gccagccact acgagaagct 20
<210> 41
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 41
ctgcttctgc tcgttgtcct ccgg 24
<210> 42
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> промотор
<400> 42
gcggatgctg gcacagc 17
<210> 43
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 43
ggcattgctt ccttctccg 19
<210> 44
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 44
cagggagcga ggtac 15
<210> 45
<211> 20 144
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 45
ctggtggcca acgtgaagtt 20
<210> 46
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 46
gcttcacggg ctgggtc 17
<210> 47
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 47
aggccaagcc cgccaaccag 20
<210> 48
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 48
gcggatgctg gcacaga 17
<210> 49
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 49
gcattgcttc cttcgcca 18
<210> 50
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность 145
<220>
<223> зонд
<400> 50
cagggaggta cgaacc 16
<210> 51
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 51
gcggcgaaga agcgaa 16
<210> 52
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 52
gcggcgtctc cagcttc 17
<210> 53
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 53
ccaggaactg cg 12
<210> 54
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 54
aagaaacgcc ggctgagt 18
<210> 55
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 146
<400> 55
accttgcggg gcgtt 15
<210> 56
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 56
ccaggaactg cg 12
<210> 57
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 57
aagaaacgcc ggctgagt 18
<210> 58
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 58
ccttgcgcgg cgtc 14
<210> 59
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 59
ccaggaactg cg 12
<210> 60
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 60
tgatcctcga ggccaagct 19 147
<210> 61
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 61
aggtcgaggt cccctcca 18
<210> 62
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 62
cctgctaccc gggc 14
<210> 63
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 63
cgcgccctgc taccc 15
<210> 64
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 64
gcgcgtgctt accagga 17
<210> 65
<211> 13
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 65
tcgaggagtg ccc 13
<210> 66
<211> 16 148
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 66
caccgatgag caggcg 16
<210> 67
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 67
agatacacct tccggccg 18
<210> 68
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 68
ttcctcccgg aagc 14
<210> 69
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 69
caccgatgag caggcg 16
<210> 70
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 70
agatacacct tccggccagt 20
<210> 71
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность 149
<220>
<223> зонд
<400> 71
ctcctcccgg aagc 14
<210> 72
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 72
caagtttctg gacaaggaga ttctc 25
<210> 73
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 73
aagaattccc ttcttaatag ctggaga 27
<210> 74
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 74
cacgagcaca ttgctaacct tgctgg 26
<210> 75
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 75
tcaccgatga gcaggca 17
<210> 76
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 150
<400> 76
atacaccttc cggccagc 18
<210> 77
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 77
ttcctcccgg aagc 14
<210> 78
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 78
gatagggcta aagagatgtg ggaa 24
<210> 79
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 79
ctttgttcac attagggctc aaataa 26
<210> 80
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 80
tagactgaga tggatg 16
<210> 81
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 81
aaaaccaccg gagaagacga 20 151
<210> 82
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 82
aggtgtggcg gcagtga 17
<210> 83
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 83
caccgtcatt gttc 14
<210> 84
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 84
caagtttctg gacaaggaga ttctc 25
<210> 85
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 85
aagaattccc ttcttaatag ctggaga 27
<210> 86
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 86
cacgagcaca ttgctaacct tgctgg 26
<210> 87
<211> 15 152
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 87
gcgacgccgg aaagg 15
<210> 88
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 88
tggcgtggtt tcgtcttctt a 21
<210> 89
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> зонд
<400> 89
aagagcggcg tctggaggtg actca 25
<210> 90
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 90
aaccgcatcg tcagaaaaac 20
<210> 91
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 91
tcaacttaac cggccaaatc 20
<210> 92
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность 153
<220>
<223> Праймер
<400> 92
catcccttct cttccctcct g 21
<210> 93
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 93
gccagtgtga gtgtgtatga gca 23
<210> 94
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 94
catcgttttc tcccctcctc a 21
<210> 95
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 95
actgatatgc acggcgcca 19
<210> 96
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 96
tgcagtagct tcattttcac cg 22
<210> 97
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 154
<400> 97
aggaattgat atgtacgccc gt 22
<210> 98
<211> 16279
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вектор 24075
<220>
<221> другой_признак
<222> (1)..(517)
<223> bNRB-07
<220>
<221> промотор
<222> (538)..(1697)
<223> prAtEFaA1-02
<220>
<221> ген
<222> (1716)..(5885)
<223> cCas9-05
<220>
<221> мутация
<222> (5205)..(5207)
<223> мутация L на V
<220>
<221> мутация
<222> (5250)..(5252)
<223> мутация I на V
<220>
<221> Терминатор
<222> (5894)..(6146)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (6173)..(6620)
<223> prAtU6-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6621)..(6640)
<223> мишень 1 AtGL1
<220>
<221> другой_признак
<222> (6621)..(6725)
<223> rsgRNA AtGL1-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (6641)..(6652)
<223> rCrRNA-01 155
<220>
<221> другой_признак
<222> (6657)..(6725)
<223> rTracrRNA-01
<220>
<221> промотор
<222> (6726)..(7173)
<223> prAtU6-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (7174)..(7193)
<223> мишень 2 AtGl1
<220>
<221> другой_признак
<222> (7174)..(7278)
<223> rsgRNA AtGL1-02
<220>
<221> другой_признак
<222> (7194)..(7205)
<223> rCrRNA-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (7210)..(7278)
<223> rTracrRNA-01
<220>
<221> промотор
<222> (7295)..(7640)
<223> prCMP-02
<220>
<221> ген
<222> (7653)..(8447)
<223> cNpt2-10
<220>
<221> Терминатор
<222> (8476)..(8728)
<223> tNOS-05-01
<220>
<221> промотор
<222> (8755)..(10752)
<223> prGmUBI-01
<220>
<221> ген
<222> (10765)..(11454)
<223> cAmCyan-06
<220>
<221> Терминатор
<222> (11477)..(12119)
<223> tPsE9-01
<220>
<221> другой_признак
<222> (12193)..(12311) 156
<223> bNLB-03
<220>
<221> ген
<222> (12928)..(13716)
<223> cSpec-03
<220>
<221> ген
<222> (13751)..(14824)
<223> cRepA-08
<220>
<221> другой_признак
<222> (14867)..(15271)
<223> oVC1-04
<220>
<221> другой_признак
<222> (15441)..(16247)
<223> oCOLE-06
<400> 98
gccaggacgt cggccgaaag agcgacaagc agatcacgct tttcgacagc gtcggatttg 60
cgatcgagga tttttcggcg ctgcgctacg tccgcgaccg cgttgaggga tcaagccaca 120
gcagcccact cgaccttcta gccgacccag acgagccaag ggatcttttt ggaatgctgc 180
tccgtcgtca ggctttccga cgtttgggtg gttgaacaga agtcattatc gcacggaatg 240
ccaagcactc ccgaggggaa ccctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga cgaacggata 300
aaccttttca cgccctttta aatatccgat tattctaata aacgctcttt tctcttaggt 360
ttacccgcca atatatcctg tcaaacactg atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa 420
tctgatcatg agcggagaat taagggagtc acgttatgac ccccgccgat gacgcgggac 480
aagccgtttt acgtttggaa ctgacagaac cgcaacgttg aaggcgcgcc actcagcaag 540
cttgatatcg gaagtttctc tcttgaggga ggttgctcgt ggaatgggac acatatggtt 600
gttataataa accatttcca ttgtcatgag attttgaggt taatatatac tttacttgtt 660
cattatttta tttggtgttt gaataaatga tataaatggc tcttgataat ctgcattcat 720
tgagatatca aatatttact ctagagaaga gtgtcatata gattgatggt ccacaatcaa 780
tgaaattttt gggagacgaa catgtataac catttgcttg aataacctta attaaaaggt 840
gtgattaaat gatgtttgta acatgtagta ctaaacattc ataaaacaca accaacccaa 900
gaggtattga gtattcacgg ctaaacaggg gcataatggt aatttaaaga atgatattat 960
tttatgttaa accctaacat tggtttcgga ttcaacgcta taaataaaac cactctcgtt 1020
gctgattcca tttatcgttc ttattgaccc tagccgctac acacttttct gcgatatctc 1080
tgaggtaagc gttaacgtac ccttagatcg ttctttttct ttttcgtctg ctgatcgttg 1140
ctcatattat ttcgatgatt gttggattcg atgctctttg ttgattgatc gttctgaaaa 1200 157
ttctgatctg ttgtttagat tttatcgatt gttaatatca acgtttcact gcttctaaac 1260
gataatttat tcatgaaact attttcccat tctgatcgat cttgttttga gattttaatt 1320
tgttcgattg attgttggtt ggtggatcta tatacgagtg aacttgttga tttgcgtatt 1380
taagatgtat gtcgatttga attgtgattg ggtaattctg gagtagcata acaaatccag 1440
tgttcccttt ttctaagggt aattctcgga ttgtttgctt tatatctctt gaaattgccg 1500
atttgattga atttagctcg cttagctcag atgatagagc accacaattt ttgtggtaga 1560
aatcggtttg actccgatag cggcttttta ctatgattgt tttgtgttaa agatgatttt 1620
cataatggtt atatatgtct actgttttta ttgattcaat atttgattgt tctttttttt 1680
gcagatttgt tgaccaggga tccgcggccg ctaaaatgga taagaagtat tctattggac 1740
ttgatattgg aaccaactct gtgggatggg ctgttattac tgacgagtat aaggttccat 1800
ctaagaagtt caaggttctt ggaaacactg atagacactc tattaagaag aaccttattg 1860
gtgctcttct tttcgattct ggagagactg ctgaggctac tagacttaag agaactgcta 1920
gaagaagata tactagaaga aagaacagaa tttgctatct tcaagagatt ttctctaacg 1980
agatggctaa ggttgacgat tctttcttcc acagacttga ggagtctttc cttgttgagg 2040
aggataagaa gcacgagaga cacccaattt tcggaaacat tgttgacgag gttgcttatc 2100
acgagaagta tccaactatt tatcacctta gaaagaagct cgttgattct actgataagg 2160
ctgatcttag acttatttat cttgctcttg ctcacatgat taagttcaga ggacacttcc 2220
ttattgaggg agatcttaac ccagataact ctgacgttga taagctcttc attcaacttg 2280
ttcaaactta taaccaactt ttcgaggaga acccaattaa cgcttctgga gttgacgcta 2340
aggctattct ttctgctaga ctttctaagt ctagaaggct tgagaacctt attgctcaac 2400
ttccaggaga gaagaagaac ggacttttcg gaaaccttat tgctctttct cttggactta 2460
ctccaaactt caagtctaac ttcgatcttg ctgaggacgc taagctccaa ctttctaagg 2520
atacttacga cgatgatctt gataaccttc ttgctcaaat tggagatcaa tacgctgatc 2580
ttttccttgc tgctaagaac ctttctgacg ctattcttct ttctgatatt cttagagtta 2640
acactgagat tactaaggct ccactttctg cttctatgat taagagatac gacgagcacc 2700
accaagatct tactcttctt aaggctcttg ttagacaaca acttccagag aagtataagg 2760
agattttctt cgatcaatct aagaacggat acgctggata tattgacgga ggagcttctc 2820
aagaggagtt ctataagttc attaagccaa ttcttgagaa gatggacgga actgaggagc 2880
ttcttgttaa gctcaacaga gaggatcttc ttagaaagca aagaactttc gataacggat 2940
ctattccaca ccaaattcac cttggagagc ttcacgctat tcttagaagg caagaggatt 3000
tctatccatt ccttaaggat aacagagaga agattgagaa gattcttact ttccgtattc 3060
catattacgt tggaccactt gctagaggaa actctagatt cgcttggatg actagaaagt 3120 158
ctgaggagac tattactcct tggaacttcg aggaggttgt tgataaggga gcttctgctc 3180
aatctttcat tgagagaatg actaacttcg ataagaacct tccaaacgag aaggttcttc 3240
caaagcactc tcttctttac gagtatttca ctgtttataa cgagcttact aaggttaagt 3300
acgttactga gggaatgaga aagccagctt tcctttctgg agagcaaaag aaggctattg 3360
ttgatcttct tttcaagact aacagaaagg ttactgttaa gcaacttaag gaggattatt 3420
tcaagaagat tgagtgcttc gattctgttg agatttctgg agttgaggat agattcaacg 3480
cttctcttgg aacttatcac gatcttctta agattattaa ggataaggat ttccttgata 3540
acgaggagaa cgaggatatt cttgaggata ttgttcttac tcttactctt ttcgaggata 3600
gagagatgat tgaggagaga cttaagactt acgctcacct tttcgacgat aaggttatga 3660
agcaacttaa gagaagaaga tatactggat ggggtagact ttctagaaag ctcattaacg 3720
gaattagaga taagcaatct ggaaagacta ttcttgattt ccttaagtct gacggattcg 3780
ctaacagaaa cttcatgcaa cttattcacg acgattctct tactttcaag gaggatattc 3840
aaaaggctca agtttctgga caaggagatt ctcttcacga gcacattgct aaccttgctg 3900
gatctccagc tattaagaag ggaattcttc aaactgttaa ggttgttgac gagcttgtta 3960
aggttatggg tagacacaag ccagagaaca ttgttattga gatggctaga gagaaccaaa 4020
ctactcaaaa gggacaaaag aactctagag agagaatgaa gagaattgag gagggaatta 4080
aggagcttgg atctcaaatt cttaaggagc acccagttga gaacactcaa cttcaaaacg 4140
agaagctcta tctttattat cttcaaaacg gaagagatat gtacgttgat caagagcttg 4200
atattaacag actttctgat tacgacgttg atcacattgt tccacaatct ttccttaagg 4260
acgattctat tgataacaag gttcttacta gatctgataa gaacagagga aagtctgata 4320
acgttccatc tgaggaggtt gttaagaaga tgaagaacta ttggagacaa cttcttaacg 4380
ctaagctcat tactcaaaga aagttcgata accttactaa ggctgagaga ggaggacttt 4440
ctgagcttga taaggctgga ttcattaaga gacaacttgt tgagactaga caaattacta 4500
agcacgttgc tcaaattctt gattctagaa tgaacactaa gtacgacgag aacgataagc 4560
tcattagaga ggttaaggtt attactctta agtctaagct cgtttctgat ttcagaaagg 4620
atttccaatt ctataaggtt agagagatta acaactatca ccacgctcac gacgcttatc 4680
ttaacgctgt tgttggaact gctcttatta agaagtatcc aaaacttgag tctgagttcg 4740
tttacggaga ttataaggtt tacgacgtta gaaagatgat tgctaagtct gagcaagaga 4800
ttggaaaggc tactgctaag tatttcttct attctaacat tatgaacttc ttcaagactg 4860
agattactct tgctaacgga gagattagaa agaggccact tattgagact aacggagaga 4920
ctggagagat tgtttgggat aagggaagag atttcgctac tgttagaaag gttctttcta 4980 159
tgccacaagt taacattgtt aagaaaactg aggttcaaac tggaggattc tctaaggagt 5040
ctattcttcc aaagagaaac tctgataagc tcattgctag aaagaaggat tgggacccaa 5100
agaagtacgg aggattcgat tctccaactg ttgcttattc tgttcttgtt gttgctaagg 5160
ttgagaaggg aaagtctaag aagctcaagt ctgttaagga gcttgttgga attactatta 5220
tggagagatc ttctttcgag aagaacccag ttgatttcct tgaggctaag ggatataagg 5280
aggttaagaa ggatcttatt attaagctcc caaagtattc tcttttcgag cttgagaacg 5340
gaagaaagag aatgcttgct tctgctggag agcttcaaaa gggaaacgag cttgctcttc 5400
catctaagta cgttaacttc ctttatcttg cttctcacta cgagaagctc aagggatctc 5460
cagaggataa cgagcaaaag caacttttcg ttgagcaaca caagcactat cttgacgaga 5520
ttattgagca aatttctgag ttctctaaga gagttattct tgctgacgct aaccttgata 5580
aggttctttc tgcttataac aagcacagag ataagccaat tagagagcaa gctgagaaca 5640
ttattcacct tttcactctt actaaccttg gtgctccagc tgctttcaag tatttcgata 5700
ctactattga tagaaagaga tatacttcta ctaaggaggt tcttgacgct actcttattc 5760
accaatctat tactggactt tacgagacta gaattgatct ttctcaactt ggaggagatt 5820
cttctccacc aaagaagaag agaaaggttt cttggaagga cgcttctgga tggtctagaa 5880
tgtgacgtcg cgtgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 5940
tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 6000
taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 6060
atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 6120
cgcggtgtca tctatgttac tagatctgca gatcggaccc ctaattagct aaaagcttcg 6180
ttgaacaacg gaaactcgac ttgccttccg cacaatacat catttcttct tagctttttt 6240
tcttcttctt cgttcataca gttttttttt gtttatcagc ttacattttc ttgaaccgta 6300
gctttcgttt tcttcttttt aactttccat tcggagtttt tgtatcttgt ttcatagttt 6360
gtcccaggat tagaatgatt aggcatcgaa ccttcaagaa tttgattgaa taaaacatct 6420
tcattcttaa gatatgaaga taatcttcaa aaggcccctg ggaatctgaa agaagagaag 6480
caggcccatt tatatgggaa agaacaatag tatttcttat ataggcccat ttaagttgaa 6540
aacaatcttc aaaagtccca catcgcttag ataagaaaac gaagctgagt ttatatacag 6600
ctagagtcga agtagtgatt ggaaaagttg tagactgaga gttttagagc tagaaatagc 6660
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 6720
tttttaagct tcgttgaaca acggaaactc gacttgcctt ccgcacaata catcatttct 6780
tcttagcttt ttttcttctt cttcgttcat acagtttttt tttgtttatc agcttacatt 6840
ttcttgaacc gtagctttcg ttttcttctt tttaactttc cattcggagt ttttgtatct 6900 160
tgtttcatag tttgtcccag gattagaatg attaggcatc gaaccttcaa gaatttgatt 6960
gaataaaaca tcttcattct taagatatga agataatctt caaaaggccc ctgggaatct 7020
gaaagaagag aagcaggccc atttatatgg gaaagaacaa tagtatttct tatataggcc 7080
catttaagtt gaaaacaatc ttcaaaagtc ccacatcgct tagataagaa aacgaagctg 7140
agtttatata cagctagagt cgaagtagtg attgcagtga tgaacaatga cgggttttag 7200
agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg 7260
agtcggtgct ttttttttgg cgcgcctaaa gcttctggca gacaaagtgg cagacatact 7320
gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa gaaaacgcgt gaaataatgc gtctgacaaa 7380
ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca aagtggtccc taccacgatg gaaaaactgt 7440
gcagtcggtt tggctttttc tgacgaacaa ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc 7500
accatgtgaa ggcatcttca gactccaata atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaat 7560
aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc 7620
cctcattgtt aagggagcaa ggatcctaaa ccatgattga acaagatgga ttgcacgcag 7680
gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 7740
gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 7800
agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 7860
tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 7920
actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 7980
ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 8040
cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 8100
ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 8160
tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 8220
atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 8280
gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 8340
aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 8400
attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgatga gagctctaga 8460
tccccgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct 8520
gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata 8580
attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa 8640
ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg 8700
cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattgggta ccctaattag ctaaattcca 8760 161
aaattttcag ttagtcctta ctaattatta aattatagta ttaatccaat gtgattgcgg 8820
ttacatcatg tacggaaaaa taattctaat ccttgattta aatttgatct tgactattta 8880
tttattcttt atttcatttt gtaaatcatt ttatgtatct cctggcaagc aattttatcc 8940
accttgcacc aacaccttcg ggttccataa tcaaaccacc ttaacttcac accatgctgt 9000
aactcacacc gcccagcatc tccaatgtga aagaagctaa aatttaataa acaatcatac 9060
gaagcagtga caaaatacca gatggtatta atgctttgat aaaattaatt ggaaagtata 9120
aaatggtaga aaataataaa ttataattaa tttaaataag ataaaaaata attaaaaact 9180
aaaatgttaa aattttaaaa aaattatttt aaataatatt taaaaacatt aaaaatcatt 9240
ttaaaaaatt tatttataga acaattaaat aaatatttca gctaataaaa aacaaaagct 9300
tacctagcct tagaagacaa cttgtccaac aattagatga tacccattgc ccttacgttt 9360
tctttaacat caattattgt ttttgtcaac aagctatctt ttagttttat tttattggta 9420
aaaaatatgt cgccttcaag ttgcatcatt taacacatct cgtcattaga aaaataaaac 9480
tcttccctaa acgattagta gaaaaaatca ttcgataata aataagaaag aaaaattaga 9540
aaaaaataac ttcattttaa aaaaatcatt aaggctatat tttttaaatg actaatttta 9600
tatagactgt aactaaaagt atacaattta ttatgctatg tatcttaaag aattacttat 9660
aaaaatctac ggaagaatat cttacaaagt gaaaaacaaa tgagaaagaa tttagtggga 9720
tgattatgat tttatttgaa aattgaaaaa ataattatta aagactttag tggagtaaga 9780
aagctttcct attagtcttt tcttatccat aaaaaaaaaa aaaaatctag cgtgacagct 9840
tttccataga ttttaataat gtaaaatact ggtagcagcc gaccgttcag gtaatggaca 9900
ctgtggtcct aacttgcaac gggtgcgggc ccaatttaat aacgccgtgg taacggataa 9960
agccaagcgt gaagcggtga aggtacatct ctgactccgt caagattacg aaaccgtcaa 10020
ctacgaagga ctccccgaaa tatcatctgt gtcataaaca ccaagtcaca ccatacatgg 10080
gcacgcgtca caatatgatt ggagaacggt tccaccgcat atgctataaa atgcccccac 10140
acccctcgac cctaatcgca cttcaattgc aatcaaatta gttcattctc tttgcgcagt 10200
tccctacctc tcctttcaag gttcgtagat ttcttctgtt tttttttctt cttctttatt 10260
gtttgttcta catcagcatg atgttgattt gattgtgttt tctatcgttt catcgattat 10320
aaattttcat aatcagaaga ttcagctttt attaatgcaa gaacgtcctt aattgatgat 10380
tttataaccg taaattaggt ctaattagag tttttttcat aaagattttc agatccgttt 10440
acaacaagcc ttaattgttg attctgtagt cgtagattaa ggtttttttc atgaactact 10500
tcagatccgt taaacaacag ccttatttgt tgatacttca gtcgtttttc aagaaattgt 10560
tcagatccgt tgataaaagc cttattcgtt gattctgtat ggtatttcaa gagatattgc 10620
tcaggtcctt tagcaactac cttatttgtt gattctgtgg ccatagatta ggattttttt 10680 162
tcacgaaatt gcttcttgaa attacgtgat ggattttgat tctgatttat cttgtgattg 10740
ttgactctac agagatctaa aaaaatggcc ctgtccaaca agttcatcgg cgacgacatg 10800
aagatgacct accacatgga cggctgcgtg aacggccact acttcaccgt gaagggcgag 10860
ggcagcggca agccctacga gggcacccag acctccacct tcaaggtgac gatggccaac 10920
ggcggccccc tggccttctc cttcgacatc ctgtccaccg tgttcatgta cggcaaccgc 10980
tgcttcaccg cctaccccac cagcatgccc gactacttca agcaggcctt ccccgacggc 11040
atgtcctacg agagaacctt cacctacgag gacggcggcg tggccaccgc cagctgggag 11100
atcagcctga agggcaactg cttcgagcac aagtccacct tccacggcgt gaacttcccc 11160
gccgacggcc ccgtgatggc caagaagacc accggctggg atccctcctt cgagaagatg 11220
accgtgtgcg acggcatctt gaagggcgac gtgaccgcct tcctgatgct gcagggcggc 11280
ggcaactaca gatgccagtt ccacacctcc tacaagacca agaagcccgt gaccatgccc 11340
cccaaccacg tggtggagca ccgcatcgcc agaaccgacc tggacaaggg cggcaacagc 11400
gtgcagctga ccgagcacgc cgtggcccac atcacctccg tggtgccctt ctgatgaact 11460
agtgaattcg agctcaagct ttcgttcgta tcatcggttt cgacaacgtt cgtcaagttc 11520
aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag aatcctactg agtttgagta ttatggcatt 11580
gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa tttactgtgt tttttattcg 11640
gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa gagttaatga atgatatggt 11700
ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa 11760
tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg 11820
cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg tagttgtacc attatgctta 11880
ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct gcaaatgtta ctgaatacaa 11940
gtatgtcctc ttgtgtttta gacatttatg aactttcctt tatgtaattt tccagaatcc 12000
ttgtcagatt ctaatcattg ctttataatt atagttatac tcatggattt gtagttgagt 12060
atgaaaatat tttttaatgc attttatgac ttgccaattg attgacaaca tgcatcaatc 12120
ggaccgttaa ctagctagac ggccaggatc gccgcgtgag cctttagcaa ctagctagat 12180
taattaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa 12240
tatatcctgc caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca 12300
ctcgatacag gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg 12360
cagactttgc tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg 12420
aaacacggat gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg 12480
cctgtgatca aatatcatct ccctcgcaga gatccgaatt atcagccttc ttattcattt 12540 163
ctcgcttaac cgtgacaggc tgtcgatctt gagaactatg ccgacataat aggaaatcgc 12600
tggataaagc cgctgaggaa gctgagtggc gctatttctt tagaagtgaa cgtcgactca 12660
tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat 12720
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 12780
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 12840
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 12900
ataacaattt cacacaggaa acagaccatg agggaagcgt tgatcgccga agtatcgact 12960
caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta 13020
catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg 13080
gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg 13140
gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt 13200
gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa 13260
tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg 13320
gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag 13380
gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg 13440
ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc 13500
cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg 13560
gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac ttgaagctag gcaggcttat 13620
cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac 13680
gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct ctagtggatc tccgtacccg 13740
aggaatcggc gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg 13800
tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc 13860
agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg 13920
gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc 13980
agattttttc gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga 14040
cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga 14100
gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga 14160
ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga 14220
agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt 14280
ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt 14340
aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac caagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac 14400
ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg 14460 164
gccggagtac atcgagatcg agctggctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa 14520
gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg 14580
ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa 14640
gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg 14700
caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc 14760
tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc 14820
ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg 14880
actctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa 14940
cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg acacacatgt aagtgactga 15000
tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct 15060
taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa 15120
agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc 15180
ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca 15240
agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc 15300
tgactcatac caggccatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 15360
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 15420
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 15480
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 15540
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 15600
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 15660
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 15720
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 15780
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 15840
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 15900
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 15960
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 16020
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 16080
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 16140
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 16200
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttgat ccggacaaac 16260
aaacaaatac agtaattta 16279
<---

Claims (22)

1. Способ редактирования геномной ДНК растения, предусматривающий:
a) получение первого растения, где первое растение, включающее MATL мутацию с потерей функции, представляет собой линию-индуктор гаплоидов растения, и где указанное первое растение экспрессирует фермент для модификации ДНК и по меньшей мере одну направляющую нуклеиновую кислоту;
b) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию;
c) опыление второго растения пыльцой от первого растения; и
d) отбор по меньшей мере одного редактируемого гаплоидного потомка, полученного с помощью опыления на стадии (c), где редактируемый гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и по меньшей мере одной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленных первым растением.
2. Способ по п. 1, где фермент для модификации ДНК представляет собой сайт-направленную нуклеазу, выбранную из группы, состоящей из нуклеазы Cas9, нуклеазы Cpf1, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, химерной Cas9-цитидиндезаминазы, химерной Cas9-адениндезаминазы, химерной FEN1-FokI, никазы Cas9 (nCas9), химерной нуклеазы dCas9, не содержащей FokI, и нуклеазы dCpf1, не содержащей FokI.
3. Способ по п. 1, где по меньшей мере одна направляющая нуклеиновая кислота представляет собой направляющую РНК.
4. Способ по п. 1, где отредактированного гаплоидного потомка обрабатывают с помощью средства для удвоения числа хромосом, за счет чего получают потомка, являющегося удвоенным гаплоидом.
5. Способ по п. 4, где средство для удвоения числа хромосом представляет собой колхицин, пронамид, дитипир, трифлуралин или другое известное средство, ингибирующее образование микротрубочек.
6. Способ по п. 1, где первое растение является однодольным растением или двудольным растением.
7. Способ по п. 6, где первое растение представляет собой однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока.
8. Способ по п. 1, где второе растение является однодольным растением или двудольным растением.
9. Способ по п. 8, где второе растение представляет собой однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока.
10. Способ по п. 3, где второе растение представляет собой растение маиса.
11. Способ по п. 10, где направляющая РНК представляет собой последовательность из 18–21 нуклеотида, включающую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21 и 23.
12. Способ по п. 1, где в первом растении экспрессируется маркерный ген.
13. Способ по п. 12, где маркерный ген выбран из группы, состоящей из GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, C1, R-nj, антоцианиновых пигментов и любого другого маркерного гена.
14. Способ по п. 1, где первое растение представляет собой растение маиса, выбранное и/или полученное из линий Stock 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS или NP2222-matl.
15. Способ по п.1, где первое растение представляет собой растение маиса, и второе растение представляет собой растение маиса.
16. Способ по п. 1, где первое растение и второе растение относятся к разным видам.
17. Способ по п. 16, где первое растение представляет собой растение пшеницы, а второе растение представляет собой растение маиса.
18. Способ по п. 16, где первое растение представляет собой растение маиса, а второе растение представляет собой растение пшеницы.
RU2019119844A 2016-12-02 2017-12-04 Одновременное редактирование генов и индукция гаплоидов RU2788349C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662429260P 2016-12-02 2016-12-02
US62/429,260 2016-12-02
PCT/US2017/064512 WO2018102816A1 (en) 2016-12-02 2017-12-04 Simultaneous gene editing and haploid induction

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2023100348A Division RU2023100348A (ru) 2016-12-02 2017-12-04 Одновременное редактирование генов и индукция гаплоидов

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019119844A RU2019119844A (ru) 2021-01-11
RU2019119844A3 RU2019119844A3 (ru) 2021-04-08
RU2788349C2 true RU2788349C2 (ru) 2023-01-17

Family

ID=

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2349642C2 (ru) * 2003-03-12 2009-03-20 Исихара Сангио Кайся, Лтд. Растительные клетки и организмы растений с модифицированным клеточным ростом, развитием и дифференцировкой
WO2011044132A1 (en) * 2009-10-06 2011-04-14 The Regents Of The University Of California Generation of haploid plants and improved plant breeding
RU2551313C2 (ru) * 2013-06-24 2015-05-20 Государственное научное учреждение Воронежский научно-исследовательский институт сельского хозяйства имени В.В. Докучаева Российской академии сельскохозяйственных наук Способ создания гомозиготных линий ржи
RU2560599C2 (ru) * 2008-01-18 2015-08-20 Зингента Партисипейшнс Аг Растения кукурузы, отличающиеся локусам количественных признаков qtl

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2349642C2 (ru) * 2003-03-12 2009-03-20 Исихара Сангио Кайся, Лтд. Растительные клетки и организмы растений с модифицированным клеточным ростом, развитием и дифференцировкой
RU2560599C2 (ru) * 2008-01-18 2015-08-20 Зингента Партисипейшнс Аг Растения кукурузы, отличающиеся локусам количественных признаков qtl
WO2011044132A1 (en) * 2009-10-06 2011-04-14 The Regents Of The University Of California Generation of haploid plants and improved plant breeding
RU2551313C2 (ru) * 2013-06-24 2015-05-20 Государственное научное учреждение Воронежский научно-исследовательский институт сельского хозяйства имени В.В. Докучаева Российской академии сельскохозяйственных наук Способ создания гомозиготных линий ржи

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102670917B1 (ko) 동시 유전자 편집 및 반수체 유도
CN108368517B (zh) 用于快速植物转化的方法和组合物
KR102248730B1 (ko) 유전자 표적화를 위한 범용 공여자 시스템
KR102238137B1 (ko) 공여자 삽입을 결정하기 위한 작물에서의 신속 표적화 분석
KR102046450B1 (ko) 일시적인 유전자 발현을 통해 완전한 식물에서 부위-특이적인 변형을 수행하는 방법
KR101447300B1 (ko) 안트라닐레이트 신타제의 엽록체를 표적으로 하는 발현에 의한 고-트립토판 옥수수의 생산
US9181559B2 (en) Generation of high polyhydroxybutyrate producing oilseeds
CN109312350B (zh) 非生物胁迫耐性的植物和方法
CN112204147A (zh) 基于Cpf1的植物转录调控系统
CN113621642A (zh) 一种用于农作物杂交育种制种的遗传智能化育制种系统及其应用
CN111836825A (zh) 优化的植物crispr/cpf1系统
CN112119160A (zh) 用于在植物中生产重组蛋白的复制和非复制载体及其使用方法
CN101842488B (zh) 使用转多基因改变α-和β-生育三烯酚含量的组成和方法
CN114302644B (zh) 调控植物中基因表达的启动子
CN101466839B (zh) 控制甜菜抽苔的转基因植株和方法
CN110643628B (zh) 水稻bZIP基因及其下游基因qLTG3-1在提高植物耐低温上的应用
RU2788349C2 (ru) Одновременное редактирование генов и индукция гаплоидов
KR102720045B1 (ko) 동시 유전자 편집 및 반수체 유도
CN107365772B (zh) 一种植物花粉特异性启动子psp1及其应用
CN101848931B (zh) 具有改变的根构造的植物、涉及编码exostosin家族多肽及其同源物的基因的相关的构建体和方法
KR20210137055A (ko) 네이티브 miRNA의 게놈 편집을 통한 표적 유전자 발현의 억제
CN116457465A (zh) 用于基因组修饰的方法和组合物
CN106459161A (zh) 涉及谷氨酸受体多肽编码基因的构建体和方法
KR20210084557A (ko) 오크로박트럼-매개 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법
KR101820605B1 (ko) 단회 포자 형성 균주 및 이의 제조 방법