CN101848931B - 具有改变的根构造的植物、涉及编码exostosin家族多肽及其同源物的基因的相关的构建体和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了尤其可用于改变植物的根构造的分离的多核苷酸和多肽及重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组分(例如植物或种子)、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码可用于改变植物根构造的多肽。

Description

具有改变的根构造的植物、涉及编码EXOSTOSIN家族多肽及其同源物的基因的相关的构建体和方法
发明领域
本发明领域涉及植物育种和遗传学，并且具体地讲涉及用于改变植物根构造的重组DNA构建体。
发明背景
在所有(除了非常少的几个之外)自然生态系统中，水和营养物质的可用性限制了植物生长。它们在大多数农业生态系统中限制产量。植物根部起到重要作用，如水和营养物质摄取、在土壤中固定植物以及在根围建立生物相互作用。因此阐明植物根发育和功能的基因调控是农学和生态学中相当受关注的课题。
根系发源于在胚胎形成期间发育的初生根。初生根产生次生根，次生根继而产生三生根。所有次生、三生、四生以及更进一步分生的根均被称为侧根。包括玉米在内的许多植物也可从连续的地下节位(冠根)或地上节位(支柱根)处产生不定根。有三个主要过程影响根系的总体构造。第一个是在初生根分裂组织中的细胞分裂过程，该过程通过加入新生细胞到根中使得根不定生长。第二个是侧根形成过程，该过程增加根系的探索能力。第三个是根毛形成过程，该过程增加初生根和侧根的总表面(Lopez-Bucio等人，Current Opinion in Plant Biology(2003)6：280-287)。在已经分离出的玉米突变体中仅仅缺少根型的一个亚型。已经鉴定了拟南芥属的根形态基因突变体如SHORTROOT和SCARECROW，它显示初生根和侧根的发育缺陷(J.E.Malamy，Plant，Cell and Environment(2005)28：67-77)。
已经鉴定了许多特异性影响根发育的玉米突变体(Hochhol dinger等人，2004，Annals of Botany 93：359-368)。隐性突变体rtcs和rt1不形成或形成较少的冠根和支柱根，然而初生根和侧根不受影响。在隐性突变体des 21中，缺失侧生种子根和根毛。隐性突变体rth1-3缺失根毛。突变体lrt1和rum1在侧根开始产生之前受影响，而突变体slr1和slr2的侧根伸长能力受到削弱。决定根系构造的内源响应途径包括激素、细胞循环调节子和调节基因。水分胁迫和营养物质可用性属于决定根系构造的环境响应途径。
提交于2005年2月14日的美国专利申请2005-57473(美国专利公开公布2005/223429A1，公布于2005年10月6日)涉及使用拟南芥属细胞分裂素氧化酶基因改变植物中的细胞分裂素含量并刺激根生长。
美国专利公开6,344,601(公布于2002年2月5日)涉及在植物细胞中低表达或超表达肌动蛋白抑制蛋白(profilin)以改变植物生长习性，例如减少根系或根毛系统会使花期推迟。
WO2004/US16432(提交于2004年5月21日(WO2004/106531，公布于2004年12月9日)涉及使用超表达顺式-异戊烯转移酶的方法操纵生长速率和/或产量和/或构造。
提交于2004年9月30日的美国专利申请2004/489500(美国专利公开公布2005/059154A1，公布于2005年3月13日)涉及使用在植物中超表达转录因子E2F的方法改变细胞数量、构造和产量。
可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥属中使用该方法(Weigel等人，2000，Plant Physiol.122：1003-1013)。
插入转录增强子元件能够显著激活和/或提高附近内源基因的表达。
发明内容
本发明包括：
在一个实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15或31比较时具有至少80％的序列同一性，或在与SEQ ID NO：25比较时具有至少95％的序列同一性。
在第二实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15或31比较时具有至少85％的序列同一性。
在第三实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15或31比较时具有至少90％的序列同一性。
在第四实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST样多肽的核酸序列或所述核酸序列的全长互补序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15或31比较时具有至少95％的序列同一性。
在第五实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST样多肽的核酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO：15、25、或31。
在第六实施方案中，分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码EXST或EXST样多肽的核酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：14、24、或30。
在另一个实施方案中，包含任何前述多核苷酸的载体和重组构建体，以及包含所述重组构建体的细胞。
在另一个实施方案中，用任一前述多核苷酸来转化细胞的方法，以及用于生产和再生包含任一前述多核苷酸的转化植物的方法。
在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造。
在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体包含：
(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或
(b)抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于ClustalV比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽，并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中，改变植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性；以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造；以及任选地，(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
在另一个实施方案中，评价植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该转基因植物的根构造；以及任选地，(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任选地，(e)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该子代植物的根构造。
在另一个实施方案中，评价植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该子代植物的根构造。
在另一个实施方案中，测定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变；以及任选地，(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任选地，(e)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中，测定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中，测定植物农学特征改变的方法，该方法包括：
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：
(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；
(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变；
以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及任选地，(e)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中，测定植物农学特征改变的方法，该方法包括：
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：
(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；
(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体，并且当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造；
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及
(d)测定所述子代植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中，改变植物根构造的方法，该方法包括：
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：
(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；以及
(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体，并且其中该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造；以及
任选地，(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体，并且其中该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的农学特性。在另一个实施方案中，评价植物根构造的方法，该方法包括：
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：
(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；
(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及
(c)评价与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时该转基因植物的根构造；
以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及任选地，(e)评价与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时该子代植物的根构造。
在另一个实施方案中，评价植物根构造的方法，该方法包括：
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：
(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；
(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及
(d)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时所述子代植物的根构造。
在另一方面，本发明也涉及对基因变异进行作图的方法，所述基因变异与控制种子发育期间的胚芽/胚乳大小和/或改变植物中的含油表型有关，所述方法包括：
(a)使两种植物品种杂交；并且
(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异：
(i)选自SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28、30或33的核酸序列；或
(ii)编码选自SEQ ID NO：15；17、19、21、23、25、27、29、31或34的多肽的核酸序列，
其中所述评价是使用选自下组方法进行的：RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分析。
在另一个实施方案中，本发明涉及改变种子发育期间的胚芽/胚乳尺寸和/或改变植物中含油表型的分子育种方法，所述方法包括：
(a)使两种植物品种杂交；并
(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异：
(i)选自SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28、30或33的核酸序列；或
(ii)编码选自SEQ ID NO：15；17、19、21、23、25、27、29、31或34的多肽的核酸序列；
其中所述评价是使用选自下组方法进行的：RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分析。
本发明中还包括上述植物的任何子代、上述植物的任何种子以及来自任一上述植物和子代植物的细胞。
生产可作为产品销售的种子的方法，该种子提供改变的根构造，该方法包括任一前述优选的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体。
附图以及序列表的说明
根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。
图1示出pHSbarENDs2激活标记构建体(SEQ ID NO：1)的图谱，该构建体用于制备拟南芥属种群。
图2示出载体pDONRTM/Zeo(SEQ ID NO：2)的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985(互补链)。
图3示出载体pDONRTM221(SEQ ID NO：3)的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985(互补链)。
图4示出载体pBC-yellow(SEQ ID NO：4)的图谱，该载体是用于构建拟南芥属表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷酸9695-9819(互补链)。
图5示出PHP27840(SEQ ID NO：5)的图谱，该载体是用于构建大豆表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸7310至-434；attR2位点位于核苷酸8890-9014。
图6示出PHP23236(SEQ ID NO：6)的图谱，该载体是用于构建GaspeFlint衍生的玉米品系的表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸2006-2130；attR2位点位于核苷酸2899-3023。
图7示出PHP10523(SEQ ID NO：7)的图谱，它是存在于农杆菌菌株LBA4404中的质粒DNA。
图8示出PHP23235(SEQ ID NO：8)的图谱，它是用于构建目的载体PHP23236的载体。
图9示出了入门克隆PHP20234(SEQ ID NO：9)的图谱，它是转运PINII终止子的载体。attR2位点位于核苷酸591-747；attL3位点位于核苷酸1100-1195。
图10示出PHP28529(SEQ ID NO：10)的图谱，该载体是用于构建玉米品系表达载体的目的载体。attR3位点位于核苷酸3613-3737；attR4位点位于核苷酸2035-2159。
图11示出了入门克隆PHP28408(SEQ ID NO：11)的图谱，它是转运组成型玉米GOS2启动子的载体。attL4位点位于核苷酸160-255；attR1位点位于核苷酸2301-2447。
图12示出了入门克隆PHP22020(SEQ ID NO：12)的图谱，它是转运玉米根NAS2启动子的载体。attR1位点位于核苷酸31-187；attL4位点位于核苷酸2578-2673。
图13示出PHP29635(SEQ ID NO：13)的图谱，该载体是用于构建Gaspe Flint衍生的玉米品系的表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸40786-40910；attR2位点位于核苷酸41679-41803。
图14示出PIIOXS2a-FRT87(ni)m(SEQ ID NO：43)的图谱，该载体用于构建目的载体PHP29635。
图15A至15I示出以下全长氨基酸序列的多重比对：SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、以及SEQ ID NO：35、36、37、和38。完全匹配共有序列的残基显示为暗色。将共有序列显示于每个比对上部。共有残基通过直接取多数来确定。
图16示出图15A至15I中示出的EXST同源物的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值图表。
图17是实施例17中用于半水耕玉米生长的培养基。
图18是列出实施例17中与不同硝酸盐浓度对Gaspe Flint衍生的玉米品系的生长和发育的影响相关的数据的图表。
序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。
序列表包含用于核苷酸序列字符的单字母码和用于氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1pHSbarENDs2
SEQ ID NO：2pDONRTM/Zeo
SEQ ID NO：3pDONRTM221
SEQ ID NO：4pBC-yellow
SEQ ID NO：5PHP27840
SEQ ID NO：6PHP23236
SEQ ID NO：7PHP10523
SEQ ID NO：8PHP23235
SEQ ID NO：9PHP20234
SEQ ID NO：10PHP28529
SEQ ID NO：11PHP28408
SEQ ID NO：12PHP22020
SEQ ID NO：13PHP29635
重叠群：列出了本文所述的多肽、包含编码多肽全部或其主要部分的核酸片段的cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQID NO：)。
表1
EXST和EXST样蛋白
  蛋白质   克隆命名   SEQ ID NO：(氨基酸)   SEQ ID NO：(核苷酸)
  EXST样   重叠群：cfp5n.pk007.k11cfp5n.pk007.k11.fcfp6n.pk005.i1   14   15
  EXST样   重叠群：cfp3n.pk069.l15cfp3n.pk069.l15.fp0127.cntdd86rap0127.cntdd86ra.f   16   17
  EXST样   my.ceb1.pk0010.e5   18   19
  EXST样   cfp6n.pk002.a5：fis   20   21
  EXST样   rls24.pk0026.h11：fis   22   23
  EXST样   p0127.cntdd86ra：fis   24   25
  EXST样   cfp5n.pk007.k11：fis   26   27
  EXST样   esl1c.pk006.l19：fis   28   29
  EXST样   cfp1n.pk002.o16.f：fis   30   31
SEQ ID NO：32是拟南芥属胚囊发育停顿蛋白5(embryo sacdevelopment arrest 5)(EDA5，Exostosin家族蛋白或EXST蛋白，NCBIGI NO：15228598，At3g03650)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：33是ORF，对应于SEQ ID NO：32的核苷酸245-1744。
SEQ ID NO：34对应于蛋白序列(NCBI GI NO：15228598)，该序列由SEQ ID NO：33编码
SEQ ID NO：35对应于NCBI GI NO：115476598(稻)。
SEQ ID NO：36对应于NCBI GI NO：115487106(稻)。
SEQ ID NO：37对应于NCBI GI NO：115452759(稻)。
SEQ ID NO：38对应于NCBI GI NO：115441893(稻)。
SEQ ID NO：39是attB1序列。
SEQ ID NO：40是attB2序列。
SEQ ID NO：41是实施例9中的正向引物VC062。
SEQ ID NO：42是实施例9中的反向引物VC063。
SEQ ID NO：43PIIOXS2a-FRT87(ni)m。
SEQ ID NO：44是玉米NAS2启动子。
SEQ ID NO：45是GOS2启动子。
SEQ ID NO：46是泛素启动子。
SEQ ID NO：47是S2A启动子。
SEQ ID NO：48是PINII终止子。
优选实施方案的详细描述
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用方式并入本文。
如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
术语“根构造”指构成根的不同部分的布置方式。术语“根构造”、“根结构”、“根系”或“根系构造”在这里可互换使用。
一般来讲，植物由胚发育成的第一种根称为初生根。在大多数双子叶植物中，初生根被称为主根。这种主根向下生长并产生分枝根(侧根)。在单子叶植物中，植物的初生根发生分枝，生成须根系。
术语“改变的根构造”指与参照植株或对照植株比较，在其不同发育阶段构成根系的不同部分的改变状况。应当理解，改变的根构造涵盖了一种或多种可测量参数(包括但不限于一个或多个根系部分的直径、长度、数目、角度或表面)的改变，所述根系部分包括但不限于初生根、侧根或分枝根、不定根和根毛，所有这些均在本发明的范围内。这些改变可导致根所占的面积或空间的整体改变。参照植株或对照植株在其基因组中不含重组DNA构建体或异源构建体。
“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。
“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长和收获指数。
“Exostosin家族”、“at-Exostosin家族、exst、at-exst本文可互换使用，指拟南芥属位点AT3G03650(SEQ ID NO：32)。
EXST指由AT3G03650(SEQ ID NO：32)的ORF(SEQ ID NO：33编码的蛋白(SEQ ID NO：34)。
“exst样”指拟南芥属“exostosin家族”位点AT3G03650(SEQ IDNO：32)的来自不同物种的核苷酸同源物，如玉米和大豆，并且不受限制的包括任何以下核苷酸序列：SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28和30。
“EXST样”指拟南芥属“EXOSTOSIN家族”多肽(SEQ ID NO：34)的来自不同物种的蛋白同源物，如玉米和大豆，并且不受限制的包括任何以下氨基酸序列：SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29和31。
“环境条件”指植物生长的条件，例如水的可用性、营养物质(例如氮)的可用性或者病害的存在。
“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。优选的是，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。
“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
术语“可操作地连接”指核酸片段联合成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。
“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。
在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(Inc.，Madison，WI)的
Figure GPA00001103575900193
程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1、缺口罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALSSAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“趋异度”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。
现在来看优选的实施方案：
优选的实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组分(例如植株或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。
优选的分离的多核苷酸和多肽
本发明包括如下优选的分离的多核苷酸和多肽：
分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列；任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述多肽优选为EXST或EXST样蛋白。
分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。所述多肽优选为EXST或EXST样蛋白。
分离的多核苷酸，该多核苷酸包含(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。该分离的多核苷酸编码EXST或EXST样蛋白。
优选的重组DNA构建体和抑制DNA构建体。
在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。
在一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸包含(i)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。
在另一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)核酸序列，所述核酸序列在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。
图15A至15I示出以下氨基酸序列的多重比对：SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、以及SEQ ID NO：35、36、37、和38。用
Figure GPA00001103575900211
生物信息计算包(
Figure GPA00001103575900212
Inc.，Madison，WI)的
Figure GPA00001103575900213
程序进行序列多重比对。具体地讲，使用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)，多重比对预设参数为空位罚分＝10，空位长度罚分＝10，成对比对预设参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5以及DIAGONALS SAVED＝5。
图16显示图15A至15I中显示的EXST同源物的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值。
在另一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码EXST或EXST样蛋白。
在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。
抑制DNA构建体优选包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至：(a)以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，或(ii)所述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列。或者(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样蛋白；或(c)以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，或(ii)所述(c)(i)的核酸序列的全长互补序列。该抑制DNA构建体优选包含共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如，siRNA构建体或miRNA构建体)。
应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。术语“抑制”包括降低、减少、下调、减弱、抑制、消除或阻止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括(并且不限于)反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。
抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％同一性的同一性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性)。
抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。
“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号：5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。
“共抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA和在细胞内或体外能被翻译成蛋白质的RNA在内的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，1998，Plant J.，16：651-659；以及Gura，2000Nature 404：804-808)。
另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。
此前描述的是“发夹”结构的利用，该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎环”结构(于1999年10月21日公开的PCT专利公开WO99/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的相关基因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷酸形成，在构建体中该多核苷酸不具有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制的综述，参见Wesley，S.V.等人，2003，Methods in Molecular Biology，PlantFunctional Genomics：Methods and Protocols 236：273-286。
其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任何的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(于1999年12月2日公开的PCT专利公开WO 99/61632)。
使用聚-T和聚-A序列产生茎环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00894)。
然而另一种变型涉及使用合成的重复序列来促进茎环结构中的茎的形成。用这种重组DNA片段产生的转基因生物体已经显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的蛋白质的水平降低，如于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00904中所述。
RNA干扰是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature 391：8061998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有(Fire等人，Trends Genet.15：3581999)。这种防止外来基因表达的保护作用可能是通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，响应源自病毒感染或源自转座因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中的存在通过还没有完全表征的机制引发了RNAi反应。
细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及使dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，Nature 409：3632001)。源自dicer活性的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19个破基对的双链体(Elbashir等人，Genes Dev.15：188，2001)。Dicer还涉及从保守结构的前体RNA上切下21个和22个核苷酸的小时序RNA(stRNA)，该小时序RNA参与翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science 293：834)。RNAi响应还涉及内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生(Elbashir等人，Genes Dev.15：188，2001)。此外，RNA干扰还涉及小RNA(如miRNA)介导的基因沉默，可推定是通过调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见(例如)Allshire，Science 297：1818-18192002；Volpe等人，Science 297：1833-18372002；Jenuwein，Science 297：2215-22182002；和Hall等人，Science 297：2232-22372002)。这样，本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或者作为另一种选择通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的基因沉默。
已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等人(Nature 391：806，1998)首次在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到RNAi。Wianny和Goetz(Nature Cell Biol.2：70，1999)描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人(Nature 404：293，2000)描述了在用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人(Nature 411：4942001)描述了通过将合成的21-核苷酸RNA的双链体引入包括人胚肾和HeLa细胞在内的培养的哺乳动物细胞中而诱导的RNAi。
小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。
小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。
据认为，小RNA和它们的RNA靶标之间的序列互补性有助于确定采用了哪种机制(RNA裂解或翻译抑制)。据信，优选与它们的靶标互补的siRNA通过RNA裂解起作用。一些miRNA与它们的靶基因具有完全或几乎完全的互补性，并且对于至少一些这样的miRNA，已经证实了RNA裂解。其他miRNA与它们的靶标具有若干错配，并且在翻译水平上明显抑制了它们的靶标。同样，无需坚持特定的作用机理，出现了这样一种一般规律：完全或几乎完全的互补性引起RNA裂解，而当miRNA/靶标双链体含有许多错配时倾向于翻译抑制。对于此规律的一个明显例外是植物中微RNA 172(miR172)。miR172的其中一个靶标是APETALA2(AP2)，尽管miR172与AP2具有几乎完全的互补性，但其表现出引起AP2的翻译抑制而不是引起RNA裂解。
微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lages-Quintana等人，Science 294：853-858 2001，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-7392002；Lau等人，Science 294：858-862，2001；Lee和Ambros，Science 294：862-864，2001；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619，2002；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-728，2002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495，2002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626，2002)。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。在动物中，涉及加工miRNA前体的酶称为Dicer，这是一种核糖核酸酶III样蛋白(Grishok等人，Cell 106：23-342001；Hutvagner等人，Science 293：834-8382001；Ketting等人，Genes.Dev.15：2654-2659，2001)。植物也具有Dicer样酶，即DCL1(以前称为CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1)，并且最近有证据表明，其像Dicer一样，也涉及发夹前体的加工以产生成熟miRNA(Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495，2002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626，2002)。此外，最近的研究已经清楚地表明，至少某些miRNA发夹前体最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在，并且在单个转录物中可存在几种不同的miRNA以及相关发夹(Lagos-Quintana等人，Science 294：853-8582001；Lee等人，EMBO J21：4663-46702002)。最近的研究还测定了从dsRNA产物的miRNA链选择，所述dsRNA产物是通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz等人，2003，Cell 115：199-208)。看起来，经加工的dsRNA的两端的稳定性(即G∶C与A∶U的含量比，和/或错配)影响链选择，具有低稳定性的末端更容易因解旋酶活性而解旋。低稳定性末端的5′末端链被整合至RISC复合物内，而另一条链被降解。
微RNA看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位点位于靶mRNA的3′非翻译区中(Lee等人，Cell 75：843-854，1993；Wightman等人，Cell 75：855-862，1993；Reinhart等人，Nature 403：901-906，2000；Slack等人，Mol.Cell 5：659-6692000)，并且在lin-4和let-7miRNA与其靶位点之间有几个错配。lin-4或let-7miRNA的结合看起来引起了由靶mRNA编码的蛋白质的稳态水平下调，而不影响转录物自身(Olsen和Ambros，Dev.Biol.216：671-680，1999)。另一方面，最近有证据表明，在某些情况下，miRNA可引起靶转录物在靶位点内特异性RNA裂解，并且该裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间具有100％的互补性(Hutvagner和Zamore，Science 297：2056-2060 2002；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619 2002)。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径：当靶互补性＜100％时，蛋白下调，当靶互补性是100％时，RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似(Hamilton和Baulcombe 1999；Hammond等人，2000；Zamore等人，2000；Elbashir等人，2001)，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。
用生物信息学鉴定miRNA的靶标在动物中没有成功，这可能是因为动物miRNA与它们的靶标具有低水平的互补性。另一方面，生物信息学方法已经成功地用于预测植物miRNA的靶标(Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619 2002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495 2002；Rhoades等人，Cell 110：513-520 2002)，因此，看起来植物miRNA与它们的推定靶标的整体互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码涉及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。
本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)优选包含至少一种调控序列。
优选的调控序列是启动子。
多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。
虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。
使用组织特异表达和/或胁迫特异表达可消除不需要的效应但保留改变根构造的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-291)。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；稻肌动蛋白(McElroy等人，Plant Cell 2：163-171(1990))；泛素(UBI)(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利公开5,659,026)、玉米GOS2启动子(WO0020571A2，公布于2000年4月1日)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。
在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调控启动子。
优选的组织特异性启动子或发育调控启动子是这样的DNA序列，该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中的表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。
种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、马铃薯块茎特异蛋白(patatin)(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人，1989，EMBO J.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人，1990，Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人，1988，Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等人，1987，EMBO J.6：3571-3577)、B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，1988，EMBO J.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等人，1988，Plant Mol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBO J.6：3559-3564)和甘薯贮藏蛋白(sporamin)(甘薯块根)(Hattori，T.等人，1990，Plant Mol.Biol.14：595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实例包括在拟南芥属和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人，Plant Sci.63：47-57(1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人，EMBO J 6：3559-3564(1987))。
可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
优选的启动子包括如下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，1999，Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“Primary Structureof a Novel Barley Gene Differentially Expressed in ImmatureAleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”。Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；以及3)玉米启动子Zag2(“Identification and molecularcharacterization of ZAG1，the maize homolog of the Arabidopsisflora homeotic gene AGAMOUS(ZAG1-拟南芥属花同源异形基因AGAMOUS的玉米同系物的鉴定和分子表征)”，Schmidt，R.J.等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993))。“Structural characterization，chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairsof AGAMOUS-like MADS-box genes from maize(两对来自玉米的AGAMOUS样MADS-box基因的结构表征、染色体定位及系统发育评价)”，Theissen等人，Gene 156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank AccessionX80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
用于在植物中调节本发明的核苷酸序列表达的其他优选启动子是维管元件特异性启动子或茎优选启动子。这种茎优选启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号：EF030816；Abrahams等人，Plant Mol.Biol.27：513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登录号：EF030817)等等，将这些文献以引用的方式并入本文。
启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子；在Okamuro，J.K.和Goldberg，R.B.，Biochemistry ofPlants 15：1-82(1989)的汇编中可找到许多实例。(将其与其他组成型启动子描述放在一起。)
优选的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶启动子、泛素启动子(SEQ ID NO：46)、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶启动子、R-等位基因启动子、根细胞启动子、维管组织特异性启动子S2A(Genbank登录号EF030816；SEQ ID NO：47)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自6260玉米的组成型启动子GOS2(SEQ ID NO：45)。其他优选的启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子(SEQ ID NO：44)、玉米Cyclo启动子(US2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI保藏号：U38790，gi：1063664)。
核苷酸序列的“主要部分”包含的核苷酸序列足以提供其包含的启动子的推定鉴定。核苷酸序列可由本领域技术人员来人工评价，或使用基于计算机的序列比较和鉴定工具进行评价，所述工具使用算法如BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool；Altschul等人(1993)J.Mol.Biol.215：403-410)。一般来讲，为了推定鉴定启动子核酸序列是否与已知启动子同源，包含三十或更多个邻接核苷酸的序列是必需的。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。
本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可加入到部分编码序列的5’非翻译区或编码序列以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。这种内含子对基因表达的增强通常在将其设置接近转录单位的5’端时为最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。通常参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，Springer，纽约(1994)。
如果期望进行多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3′-端处包含有多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源自天然基因，源自多种其他植物基因或源自T-DNA。要加入的3′端序列可源自(例如)胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶基因，或作为选择源自另外的植物基因，或较不优选的是源自任何其他真核基因。
“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例已经有所描述(Turner，R.和Foster，G.MolecularBiotechnology 3：225(1995))。
在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
任何植物均可选择用来鉴定将用于产生本发明重组DNA构建体和抑制DNA构建体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属植物、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。用于鉴定调控序列的特别优选的植物是拟南芥属植物、玉米、小麦、大豆和棉。
优选的组合物
本发明的优选组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的那些优选构建体)的植物。优选的组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和近交系。
优选地，在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的近交系植物。该近交系植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的根(或植物)构造，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出改变的根(或植物)构造的植物。优选地，种子是玉米。
优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，更优选地，是玉米或大豆植物，甚至更优选的是玉米植物，例如玉米杂交种植物或玉米近交系植物。植物还可以是向日葵、高梁、蓖麻、葡萄、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉、稻、大麦或小米。
优选地，重组DNA构建体稳定地整合进植物的基因组中。
尤其优选的实施方案包括但不限于如下优选的实施方案：
1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出改变的根构造。优选地，在与该对照植物比较时，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。
2.植物(优选地玉米或大豆植物)，所述植物在其基因组中包含：重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：
(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或
(b)抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：
(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽，并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。
3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码EXST或EXST样蛋白，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出改变的根构造。优选地，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。优选地，该EXST或EXST样蛋白来自拟南芥属(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
4.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含至少一种可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域的调控元件，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样蛋白，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。
5.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含至少一种可操作地连接至以下序列的全部或部分的调控元件：(a)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(b)(a)的核酸序列的全长互补序列，并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。
6.上述优选实施方案1-5中的植物的任何子代、上述优选实施方案1-5中的植物的任何种子、上述优选实施方案1-5中的植物的子代的任何种子以及来自上述优选实施方案1-5中的植物以及它们的子代的细胞。
在上述优选的实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中的任一项中，重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)优选包含至少一种在植物中有功能的启动子作为优选的调控序列。
在上述优选的实施方案1-6或本发明的任意其他实施方案中的任一项中，至少一种农学特性的改变是增加或减少，优选增加。
在任一前述的优选实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中，至少一种农学特性优选选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织中的含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、抗涝性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长以及收获指数；产量、绿度、生物量和根倒状是尤其优选进行改变的农学特性(优选增加)。
在任一前述的优选实施方案1-6或本发明的任何其他实施方案中，在与对照植物比较时，植物优选表现出至少一种与环境条件例如水和营养物质的可用性无关的农学特性的改变。
本领域的普通技术人员熟悉测定植物根构造改变的规程。例如，可检测分析转基因玉米植物的根构造在幼苗期、花期或成熟期的改变。根构造的改变可通过统计温室培育的植物顶部第3或第4节的节根数目或根带的宽度来测定。“根带”指成熟期植物在花盆底部的根丛宽度。植物根构造变化的其他量度包括但不限于侧根的数量、节根的平均根直径、侧根的平均根直径、根毛的数量和长度。侧根分枝的程度(如侧根数量、侧根长度)可通过这样测定：从完整的根系进行二次取样，将样本用平面扫描器或数码相机成像并用WinRHIZOTM软件(Regent Instruments Inc.)分析。
对提取的有关根表型的数据进行统计分析(通常为t检验)，以将转基因根与非转基因姊妹株植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下，还可使用单因素方差分析。
下面的实施例描述了一些用于检测根构造改变的代表性规程和技术。
也可通过在田间测试中，在相同条件下比较植物与对照或参照植物提高产量的能力，来评价植物根构造的改变。
也可通过在田间测试中比较植物在胁迫条件下(例如营养物质过剩或受限、水过剩或受限、存在病害)保持基本产量(优选地至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％产量)的能力，与非胁迫条件下的对照或参照植物的产量，来评价根构造改变。
根构造的改变可通过测定转基因植物较于参照植物或对照植物的抗根倒伏性来测量。
在评价或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(如，如本文描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照或参照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：
1.转化过的植物的子代，该转化过的植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植株)。
2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或变种品系是对照或参照植物)。
3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即亲本近交系或变种品系为对照植物或参照植物)。
4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：该植株可相对于这样的对照植株进行评价或测量，该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株相比较，核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性
Figure GPA00001103575900391
和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。
此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评价或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型通过诱变或转化而选择的植物。
优选的方法
优选的方法包括但不限于用于改变植物根构造的方法、用于评价植物根构造改变的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法以及用于产生种子的方法。优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，更优选地，是玉米或大豆植物，甚至更优选地，是玉米植物。植物还可以是向日葵、高梁、蓖麻、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉、稻、大麦或小米。种子优选的是玉米或大豆种子，更优选的是玉米种子，并且甚至更优选的是玉米杂交种种子或玉米近交系种子。
特别优选的方法包括但不限于如下方法：
改变植物根构造的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性；以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
改变植物根构造的方法，该方法包括：(a)将包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的抑制DNA构建体导入可再生植物细胞中，该调控序列可操作地连接至：
(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(B)
(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；以及
(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，或(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该转基因植物的根构造；该方法还可包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)评价与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时该子代植物的根构造。
评价植物根构造改变的方法，所述方法包括：(a)将包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的抑制DNA构建体导入可再生植物细胞中，该调控序列可操作地连接至：
(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或者(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；以及
(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
评价植物根构造的方法，所述方法包括：
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或者(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)评价与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时该子代植物的根构造。
测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，(b)在步骤(a)后，从可再生植物细胞中再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法还可包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，该核酸序列编码多肽，该多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)所述(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，(b)在步骤(a)后，从可再生植物细胞中再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；并且(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。测定植物中农学特性改变的方法可进一步包括：测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，该核酸序列编码多肽，该多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)所述(i)的核酸序列的全长互补序列；
(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样多肽；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。所述方法可进一步包括：(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码EXST或EXST样蛋白；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
产生种子(优选可作为提供改变的根构造的产品销售的种子)的方法，该方法包括任一上述的优选方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。
在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，测定转基因植物中农学特性改变的步骤(如果适用的话)可优选地包括测定在改变的环境条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时该转基因植物是否表现出至少一种农学特性的改变。
在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，测定子代植物中农学特性改变的步骤(如果适用的话)可优选地包括测定在改变的环境条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时该子代植物是否表现出至少一种农学特性的改变。
在任何前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，在所述导入步骤中所述可再生的植物细胞优选地包括愈伤组织细胞(优选胚胎)、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞优选来自近交系玉米植物。
在任一上述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，所述再生步骤优选包括：(i)在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞直至观察到愈伤组织；(ii)将所述步骤(i)的转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成的激素的第一培养基；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。
在任一前述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，存在供选择的替代方案用于将包含可操作地连接至少一种调控序列上的多核苷酸的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子、优选地作为转位因子的部件)导入可再生的植物细胞，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本发明多肽的内源基因的事件。
将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导转化。
在任一上述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，至少一种农学特性优选选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、抗涝性、氮摄取、根倒伏、茎倒伏、植株高度、穗长、茎倒伏以及收获指数。产量、绿度、生物量和根倒状是尤其优选进行改变的农学特性(优选增加)。
在任一上述的优选方法或本发明方法的任何其他实施方案中，在与对照植物比较时，植物优选表现出至少一种与环境条件无关的农学特性的改变。
将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导转化。
优选的技术如下文实施例所示，用于转化玉米植物细胞和大豆植物细胞。
用于转化双子叶植物(主要通过利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(以及获得转基因植物的其他优选方法包括公开的用于棉的那些(美国专利5,004,863、美国专利5,159,135、美国专利5,518,908)；用于大豆的那些(美国专利5,569,834、美国专利5,416,011、McCabe等人，Bio/Technology 6：923(1988)，Christou等人，PlantPhysiol.87：671674(1988))；用于芸苔属植物(Brassica)的那些(美国专利5,463,174)；用于花生的那些(Cheng等人，Plant Cell Rep.15：653657(1996)，McKently等人，Plant Cell Rep.14：699 703(1995))；用于番木瓜的那些；以及用于豌豆的那些(Grant等人，Plant Cell Rep.15：254258，(1995))。
用电穿孔、粒子轰击和农杆菌转化单子叶植物也已有报道并且作为优选的方法包括(例如)如在天门冬属(asparagus)中实现的转化和植物再生(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：5354，(1987))；在大麦中实现的转化和植物再生(Wan和Lemaux，PlantPhysiol.104：37(1994))；在玉米中实现的转化和植物再生(Rhodes等人，Science 240：204(1988)；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2：603 618(1990)；Fromm等人，Bio/Technology 8：833(1990)；Koziel等人，Bio/Technology 11：194，(1993)；Armstrong等人，CropScience 35：550-557(1995))；在燕麦中实现的转化和植物再生(Somers等人，Bio/Technology 10：1589(1992))；在鸭茅中实现的转化和植物再生(Horn等人，Plant Cell Rep.7：469(1988))；在稻中实现的转化和植物再生(Toriyama等人，Theor.Appl.Genet.205：34，(1986)；Part等人，Plant Mol.Biol.32：1135 1148，(1996)；Abedinia等人，Aust.J.Plant Physiol.24：133 141(1997)；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76：835(1988)；Zhang等人，Plant Cell Rep.7：379，(1988)；Battraw和Hall，Plant Sci.86：191 202(1992)；Christou等人，Bio/Technology 9：957(1991))；裸麦(De la Pena等人，Nature 325：274(1987))；在甘蔗中实现的转化和植物再生(Bower和Birch，Plant J.2：409(1992))；在高羊茅(tall fescue)中实现的转化和植物再生(Wang等人，Bio/Technology 10：691(1992))和在小麦中实现的转化和植物再生(Vasil等人，Bio/Technology 10：667(1992)；美国专利5,631,152)。
存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及要再生的具体植物物种。
从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach(编辑)，载于：Methodsfor Plant Molecular Biology，Academic Press，Inc.San Diego，CA，(1988))。该再生和生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞、培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。
含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。
在另一方面，本发明也涉及与改变根构造和/或改变植物至少一种农学特性有关的对基因变异进行作图的方法，所述方法包括：
(a)使两种植物品种杂交；并且
(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异：
(i)选自SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28、30或33的核酸序列；或
(ii)编码选自SEQ ID NO：15；17、19、21、23、25、27、29、31或34的多肽的核酸序列，
其中所述评价是使用选自下组方法进行的：RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分析。
在另一个实施方案中，本发明涉及改变根构造和/或改变植物至少一种农学特性的分子育种方法，所述方法包括：
(a)使两种植物品种杂交；并且
(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异：
(i)选自SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24、26、28、30或33的核酸序列；或
(ii)编码选自SEQ ID NO：15；17、19、21、23、25、27、29、31或34的多肽的核酸序列；
其中所述评价是使用选自下组方法进行的：RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分析。
术语“对基因变异进行作图”或“对基因变异性进行作图”可互换使用，并且定义了鉴定DNA序列中在不同植物品系、栽培变种、品种、家族、或物种之间存在差异的基因区域内天然发生或诱导发生的变化的方法。甚至由于极少的碱基变化导致的在特定位点(基因)的基因变异性能够改变可能生成的限制酶消化片段的形式。病原体变成基因型可能是由于被分析基因内的删除或插入导致，或者甚至只是由于能够产生或删除限制酶识别位点的单个核苷酸取代导致。RFLP分析利用这一方法并且利用具有对应于受关注的分离核酸片段的探针的Southern印迹法。
因此，如果多态性(即，基因或DNA片段中普遍存在的变型；也指在相同物种内存在若干形式的基因(等位基因))产生或破坏一个限制性核酸内切酶裂解位点，或者如果它导致DNA丢失或插入(例如可变的核苷酸串联重复(variable nucleotide tandem repeat，VNTR)多态性)，将改变能用限制性核酸内切酶消化生成的DNA片段的大小或特征。同样地，通过限制性片段分析能将具有变异序列的个体与那些具有初始序列的个体区分开来。将能用该方法鉴定的多态性称为“限制性片段长度多态性：(“RFLP”)。RFLP已经被广泛应用于人类和植物基因分析(Glassberg，UK专利申请2135774；Skolnick等人，Cytogen.Cell Genet.32：58-67(1982)；Botstein等人，Ann.J.Hum.Genet.32：314-331(1980)；Fischer等人(PCT专利申请WO 90/13668；Uhlen，PCT专利申请WO 90/11369)。
“单核苷酸多态性”或“SNP”的中心属性是多态性位点位于单个核苷酸上。据报道，SNP具有对RFLP或VNTR的某些优点。首先，SNP比其它类型的多态性更稳定。它们的自发突变率为大约10-9(Kornberg，DNAReplication，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，1980)，比VNTR(美国专利公开5,679,524)的频率低了大约1,000倍。其次，SNP的发生频率更高，并且比RFLP和VNTR更一致。因为SNP由序列变异产生，可通过随机基因组测序或cDNA分子测序来鉴定新的多态性。SNP也能由删除、点突变和插入产生。任何单个碱基改变，无论其起因，均可能是SNP。SNP的更高频率意味着它们可能比其它类别的多态性更易于鉴定。
SNP能够使用多种方法中的任何一种进行鉴定。此类方法包括直接的或间接的位点测序、使用限制性酶(其中位点相应的等位基因产生或破坏限制性位点)、使用等位基因特异性杂交探针、使用由多态性的不同等位基因或者其它生化物质编码的蛋白的特异抗体。SNP能通过许多方法进行测序。可使用两种基本方法进行DNA测序，Sanger等人的链终止法，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)74：5463-5467(1977)，以及Maxam和Gilbert的化学降解法，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)74：560-564(1977)。
此外，可通过改进的PCR技术检测单点突变，例如连接酶链反应(“LCR”)和PCR-单链构象多态性(“PCR-SSCP”)分析。也能使用PCR技术鉴定极少量样本中的基因表达水平，例如来自主体的组织或细胞。该技术称为反转录-PCR(“RT-PCR”)。
术语“分子育种”定义了在育种过程期间跟踪分子标记的方法。将分子标记与所期望的表型特征相连是普遍的。通过跟踪分离的分子标记或基因特征，而不是对表型进行评分，育种过程能通过种植更少的植物并免于对表型变型进行检测分析或目测而加快。该过程中有用的分子标记包括但不限于鉴定前文提到的可作图的基因变异时可用的任何标记，以及显示跨植物物种的同线性的任何紧接的基因。术语“同线性”指不同生物之间的基因组上的保守基因位置/顺序。这意味着发现两个或更多个基因位点(可以是紧接的，或者可以是不紧接的)位于不同物种间的相同基因组上。同线性的另一个术语是“基因组共线性”。
基因作图的目的是为了鉴定产生受关注的表型的基因。作图的第一阶段通常是定位染色体的普通区域，该区域与受关注的表型的传送有关。接下来鉴定该基因和最后的特定等位基因是否具有诱发作用。
关联作图一般分成两大类：1)候选基因关联作图，它与选择的候选基因的多态性有关，所述候选基因声称对控制特定性状的表型变异具有作用；和2)全基因组关联作图，或者基因组扫描，它检测整个基因组的基因变异以寻找关联多个复杂特性的信号。
在候选基因关联作图中，基于以前来自突变分析、生物化学途径、或所关注特性的关联分析的知识来选择候选基因。需要对一组独立的随机标记评分以推断基因关系。
全基因组关联作图是用于系统搜索基因组的因果基因变异的综合方法。测试大量标记以关联多个复杂特性，并且不需要预先知道关于候选基因的信息。(Zhu等人(2008)The Plant Genome，1：5-20)。
实施例
本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于所附权利要求书的范围内。
实施例1
制备具有激活标记基因的拟南芥属种群
构建18.5kb的T-DNA基二元构建体，pHSbarENDs2(图1；SEQ IDNO：1；)包含四个来源于花椰菜花叶病毒35S启动子的四个多聚增强子元件，对应于序列-341至-64，如Odell等人(1985)Nature 313：810-812所述。该构建体也包含允许质粒救援的载体序列(pUC9)、再动员T-DNA的转座子序列(Ds)、以及允许草胺磷选择转基因植物的bar基因。仅将从右边界(RB)至左边界(LB)包含的10.8kb片段转移到寄主植物基因组中。因为增强子元件位于靠近RB处，它们可诱导T-DNA整合后的基因组位点顺式激活。
将pHSbarENDs2构建体转化到根癌农杆菌菌株C58中，在25℃下在LB中培养至OD600～1.0。然后离心沉淀细胞，并重悬在相等体积的5％蔗糖/0.05％Silwet L-77(OSI Specialties，Inc)中。在早期抽薹时，培育拟南芥属生态型Col-0的土壤使用农杆菌悬浮液进行顶部灌溉。一周后，相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌菌株进行顶部灌溉。然后将该植物的种子设为标准。所得T1种子在土壤中播种，通过喷洒草胺磷(
Figure GPA00001103575900531
AgrEvo；Bayer Environmental Science)选择转基因幼苗。从大约35,000个单个草胺磷抗性T1植株中收集T2种子。培养T2植株并收集来自96个分离T2品系的相同体积的T3种子。这组成了360个亚群。
选择了总计100,000个草胺磷抗性T1幼苗。分开保存来自每个品系的T2种子。
实施例2A
筛选以鉴定具有改变根构造的品系(非限制性氮条件)
在与早期发育期间来自如实施例1所述的种群的对照幼苗进行比较时，可分析在不限制氮条件下培养的具有激活标记的拟南芥属幼苗的根系构造。
来自每个96,000个分离T1激活标记品系的十个T2种子可用氯气进行灭菌并种植在培养皿上，培养皿包含以下培养基：0.5x N-FreeHoagland’s，60mM KNO3，0.1％蔗糖，1mM MES和1％PhytagelTM。通常将10个平板置于架子中。平板在4℃下保存三天以使种子分层，然后在22℃光照和20℃黑暗垂直保持11天。光周期为16h；8h黑暗，平均光照强度为～180μmol/m2/s。架子(通常每个装有10个平板)在每个搁板中每日旋转。在第14天，评价平板的幼苗状态，拍摄整个平板的数字图像并分析根面积。将平板随机分成10个水平区域。在板上10个水平区域的每个区域中的根面积以总面积百分比表示。仅仅使用区域3至9的面积进行品系根总面积计算。可使用ICORIA开发的Rootbot图像分析工具(专有)评价根面积。根总面积以mm2表示。
期望具有增加的根生长特性的品系位于根分布区域的上端。假定架子有最多两个异常值，可使用滑动窗方法评价给定架子的根区域的变化。包括生长培养基、温度、和湿度在内的多个因素的环境变量可引起根生长的显著改变，尤其是在播种期间更是如此。因此根据播种日期和搁板来将所述品系分组以用于数据分析。然后通过平均根面积来拣选特定播种日期/搁板组中的架子。通过将架子ri的数据与来自下一个最低架子(ri-1，以及下一个最高平均根面积，ri-1)的数据进行合并来执行滑动窗根面积分布然后使用Grubbs型方法(Barnett等人，Outliers in Statistical Data，JohnWiley & Sons，第3版(1994)来分析组合分布的变量以鉴定ri中的异常值。
将通过上文所述方法测定的具有显著增加的根生长的品系命名为Phase1 hits。在相同分析条件下进行Phase 1 hits的重复试样再筛选。当任一个或两个Phase 2重复试样显示与平均值的显著差异时，认为该品系是经验证的根构造品系。
在Phase 2的至少一个平板中再次发现是异常值的那些品系经过室内进行的Phase 3筛选以验证Phase 1和Phase 2中获得的结果。使用下文所述的Rootboot图像分析(如上所述)和
Figure GPA00001103575900541
验证Phase 3的结果。在第一轮筛选中进行相同方式的确认。T2种子用50％家用漂白剂，0.01％triton X-100溶液灭菌，并以10颗种子/平板的密度置于与第一轮筛选所述的相同平板培养基上。在4℃下保存平板三天以使种子分层，并在与首次实验相同的温度和光周期下培养种子，光照强度为～160μmol/m2/s。将平板垂直放入10平板架的八个中心位置，第一个和最后一个位置放空白平板。每隔一天旋转架子和架子中的平板。每隔平板拍摄两组照片。第一组在14-16天拍摄，此时大多数品系的初生根已经到达平板底部，第二组照片在发育出更多侧根两天后拍摄。通常用后面的一组照片进行数据分析。用软件
Figure GPA00001103575900551
(Regent Instruments Inc)分析在垂直平板上生长的这些幼苗的根生长，该软件是特别设计的一种进行根测量的图像分析系统。
Figure GPA00001103575900552
利用像素对照来从较暗的背景辨别出根构造。为了在不拍摄背景情况下鉴定的根的最大量，所述像素级别是150-170，并且使用滤光器移除长度/宽度比率小于10.0的物体。进行分析的平板上的面积为从植物叶片边缘至距离平板底部约1cm处。使用完全相同的设置和分析面积分析一批的所有平板。
Figure GPA00001103575900554
给出的一个平板的总根长度得分除以已经萌发并沿平板生长一半的植物数目。每个品系培养三个平板，取它们的得分均值。然后将该平均值与同时培养的包含野生型种子的三个平板的平均值比较。
然后使用通过与野生型相比具有更高根生长数值进行再确认的拟南芥属激活标记品系，用于分子鉴定侧接T-DNA插入序列的DNA。
实施例2B
在突变种群中鉴定具有改变的根表型的突变品系(氮限制条件)
可使用两步筛选程序，该程序包括：
(1)用垂直平板检测分析法鉴定改变的根生长表型；
(2)在拯救的突变体品系中确认抗除草剂性和根表型；
初次筛选基于垂直平板，该平板包含无氮的Hoagland盐，0.3％蔗糖和1mM KNO3。该培养基也包含0.8％至1.0％PhytaGel作胶凝剂。具有1.0％Phytagel的培养基有时难以灌注，因为它凝固迅速，然而低于0.8％时当垂直放置时培养基将滑出平板。来自激活标记种群的突变体，其中100个单个品系的集合可用于总计36000个品系的筛选。在每个平板上，种植12个突变体和2个野生型Columbia种子。平板置于具有26℃恒温的培养室中，培养室为16小时-日循环，平板顶部的平均光照强度为110μE/m2s。这些平板在2.5周期限内拍照3-4次。当观察到清楚的根表型时拯救单个幼苗。拯救的幼苗在生长室(24℃，每日16小时，250至300μE/m2s)中生长至成熟以采集种子。
就次级筛选而言，将来自在初次筛选中鉴定的推定hits的种子播种于包含与上文相同的培养基(加上6mg/L双丙氨磷)的平板上。野生型Columbia种子在相同时间、但无双丙氨磷的相同培养基上播种。每个平板具有10个种子。每个突变体品系有3个平板，而野生型Columbia有2个平板作为重复试样。这些平板置于培养室中，生长条件与上文所述相同。剔除那些认为是假阳性的不具有抗除草剂性或无明显的根表型的品系。保存次级筛选验证的品系用于进一步研究。
实施例3
鉴定激活标记基因
使用下述两个标准程序中的一个或两个鉴定侧接导致根构造改变的T-DNA插入序列的基因：(1)热不对称交错PCR(TAIL)PCR(Liu等人，(1995)，Plant J.8：457-63)；以及(2)SAIFF PCR(Siebert等人，(1995)Nucleic Acids Res.23：1087-1088)。至于复杂的多聚T-DNA插入序列，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鉴定候选基因。在这些情况下，可使用包括反式PCR、质粒拯救和/或基因组文库构建在内的其他程序。
成功的结果是其中单个TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA边界序列和拟南芥属基因组序列。
一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与公开可用的拟南芥属基因组的序列比对来鉴定候选基因。
具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是激活的基因的候选基因。
为了验证鉴定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合伪克隆的可能性，用一个T-DNA中的寡核苷酸和一个候选基因特异性的寡核苷酸进行对基因组DNA的诊断PCR。将提供PCR产品的基因组DNA样本理解为表示T-DNA插入序列。该分析也验证了其中一种以上的插入事件发生在相同品系中的情况，例如，在TAIL和/或SAIFF PCR分析中鉴定是否有多个不同基因组片段。
实施例4
鉴定激活标记exst基因
通过如实施例2A所述的筛选程序获取exst基因。如实施例3所述进行激活标记基因的鉴定。
进一步分析显示具有改变的根构造的一个品系(112299)。提取来自品系的DNA，使用T-DNA左边界内的引物通过连接介导PCR(Siebert等人，(1995)Nucleic Acids Res.23：1087-1088)建立T-DNA插入序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与完全拟南芥属基因组的序列比对鉴定候选基因。将其中一个鉴定的插入位点鉴定为嵌合插入；左边界的T-DNA序列经测定位于T-DNA插入序列的两端。这仍然是可能的：位于靠近T-DNA右边界的增强子元件足够靠近以对附近的候选基因产生效应。在这种情况下，假定右边界位置位于插入位点，并将侧接插入位点的两个基因选作候选基因。其中一个最靠近嵌合插入序列的35S增强子的基因是AT3G03650(核苷酸245-1744，对应于ORF(SEQ ID NO：33)，它编码EXST蛋白(SEQ ID NO：34)，本文称为EXOSTOSIN家族或EXST。
实施例5A
验证候选拟南芥属基因(AT3G03650)经由转化到拟南芥属中增强植物 根构造的能力
可将候选基因转化到拟南芥属中并在35S启动子作用下过表达。如果在转基因品系中观察到与亲本激活标记品系相同或相似的表型，则将该候选基因认为是拟南芥属中验证过的“前导基因”。
可直接测试拟南芥属AT3G03650基因促进拟南芥属中的根构造的能力。
拟南芥属AT3G03650cDNA用寡核苷酸进行PCR扩增，寡核苷酸导入attB1(SEQ ID NO：39)序列，其上游为ATG起始密码子的共有起始序列(CAACA)和AT3G03650DNA(SEQ ID NO：57)的蛋白编码区的前25个核苷酸，以及attB2(SEQ ID NO：40)序列和包括所述cDNA终止密码子的蛋白编码区的最后25个核苷酸。使用InvitrogenTM
Figure GPA00001103575900571
技术，用pDONRTM/Zeo(InvitrogenTM，图2；SEQ ID NO：2)进行MultiSiteBP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONRTM/Zeo移除并定向地克隆了该在旁侧具有attB1(SEQ IDNO：39)和attB2(SEQ ID NO：40)位点的PCR产物而得到入门克隆PHP28732。
用紧接InvitrogenTM
Figure GPA00001103575900581
C1转化插入序列上游的1.3-kb35S启动子构建称为pBC-yellow(图4，SEQ ID NO：4)的16.8-kb T-DNA基的二元载体，所述插入序列包含侧接attR1和attR2序列的ccdB基因和氯霉素抗性基因(CAM)。该载体也包含在Rd29a启动子控制下的YFP标记用于选择转化过的种子。
使用InvitrogenTM
Figure GPA00001103575900582
技术，对包含定向克隆PCR产物和pBC-yellow的入门克隆进行MultiSite
Figure GPA00001103575900583
LR重组反应。这使得能够迅速地和定向地克隆pBC-yellow中在35S启动子后的AT3G03650基因。
使用如实施例1所述的相同农杆菌介导的转化程序将35S-AT3G03650基因构建体导入野生型拟南芥属生态型Col-0中。
通过存在的荧光YFP标记选择转基因T1种子。按照如实施例2A所述的程序对荧光种子进行根构造检测分析。每个构建体使用6个平板对转基因T1种子进行再筛选。包含从荧光种子中分选出的未转化的Columbia种子的两个平板(每个架子)作为对照。
每个构建体有六个平板进行统计学分析，并检测平板上生长的植物数量和它们的平均
Figure GPA00001103575900584
得分之间的趋势。
Figure GPA00001103575900585
得分进行趋势归一化处理，对应于构建体的根得分除以野生型根得分。
实施例5B
在氮限制条件下筛选候选基因
也可筛选如上文实施例5A所述通过存在的荧光标记YFP选择的转基因T1种子在氮限制条件下生长的抗性。为此目的，32个转基因个体可在一个有0.4mM KNO3或60mM KNO3的平板上紧邻着32个野生型个体生长。如果一个品系显示与对照的统计意义上的显著差异，可认为该品系是经验证的氮缺乏抗性品系。在掩蔽该平板图像以移除背景颜色后，每个个体收集两个不同的测量数据：总罗赛塔面积和进入绿色区的颜色百分比。使用色调、饱和度和强度数据(HIS)，绿色区由色调50至66组成。总罗赛塔面积用作植物生物量的量度，而绿色区通过剂量-响应研究已经显示指示氮同化作用。
实施例5C
验证候选拟南芥属基因(AT3G03650)经由转化进入拟南芥属后改善植 物氮利用率的能力
如实施例5B所述来筛选能够在氮限制条件下生长的转基因种子。
在第10、11、12和13天评价植物。与野生型植物相比，表达拟南芥属候选基因(AT3G03650)的转基因个体当在包含有限浓度的氮(0.4mMKNO3)的培养基上生长时，不被验证为氮缺乏抗性植物。
实施例5D
筛选以鉴定具有改善的硝酸盐摄取的品系
就每个过表达品系而言，将十二个T2植株播种在96孔微滴定板上，所述微滴定板包含2mM MgSO4，0.5mM KH2PO4，1mM CaCl2，2.5mM KCl，0.15mM Sprint 330，0.06mM FeSO4，1μM MnCl2·4H2O，1μM ZnSO4·7H2O，3μM H3BO3，0.1μM NaMoO4，0.1μM CuSO4·5H2O，
0.8mM硝酸钾，0.1％蔗糖，1mM MES，200μM溴酚红和0.40％PhytagelTM(pH测定培养基)。培养基pH使得溴酚呈红色，pH指示染料是黄色的。
将四个品系种植于每个平板中，每个平板上包含12个野生型个体和来自某一已经显示具有改善的硝酸盐摄取(阳性对照)的品系的12个个体，在每个96孔微滴定板上总计有72个个体可使用基于网络的随机序列发生器测定每个平板上的品系顺序。不将种子种植在96孔微滴定板上的Row A或Row H中。每个实验使用四个平板，使得每个品系分析最多48株植物。在暗处、4℃条件下保持平板三天以使种子分层，然后在22℃，光照和黑暗交替条件下水平放置六天。光周期为16小时光照；8小时黑暗，平均光照强度为～200mmol/m2/s。旋转并振动每个架子中的平板。在第八或第九天(生长五天或六天)，通过记录培养基颜色为粉红色、桃色、黄色或无发芽来评价幼苗状态。然后移除每孔上的植物和/或种子。将每个培养基块状物转移到1.2mL微滴定管中，并置于96孔深微滴定板中的相应孔中。将包含2μM荧光素的等体积水加入每个1.2mL微滴定管中。用土壤覆盖平板并用液体循环高压灭菌。将每个管充分混合，从每个管中移除等分试样并分析培养基中保留的硝酸盐的量。如果t检验显示某个品系与野生型对照具有显著差异(p＜0.05)，则可认为所述品系是验证过的具有改善的硝酸盐摄取品系。
实施例5E
验证包含候选拟南芥属基因(AT3G03650)的转基因品系氮摄取增加。
如实施例5D所述筛选氮摄取增加的转基因种子。
与不过表达拟南芥属候选基因的野生型植物相比，过表达拟南芥属候选基因(AT3G03650)的转基因个体经验证不是具有改善的硝酸盐摄取品系。
实施例6
cDNA文库的组成；
cDNA克隆的分离和测序
cDNA文库可通过许多可用的方法中的任一种制备。例如，通过首先根据生产商的说明书(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)制备Uni-ZAPTM XR载体中的cDNA文库，可将cDNA引入质粒载体中。根据Stratagene提供的说明书，将Uni-ZAPTM XR文库转换成质粒文库。转换后，cDNA插入序列将会包含在质粒载体pBluescript中。此外，可用T4DNA连接酶(New England Biolabs)将cDNA直接引入预切的BluescriptII SK(+)载体(Stratagene)中，然后根据生产商的说明书(GIBCO BRLProducts)将其转染进DH10B细胞中。一旦cDNA插入序列处于质粒载体中，从随机选取的含重组pBluescript质粒的细菌菌落制备质粒DNA，或者用对插入的cDNA序列旁侧的载体序列特异性的引物，通过聚合酶链式反应扩增插入的cDNA序列。将扩增的DNA插入序列或质粒DNA在引物标记法测序反应(dye-primer sequencing reaction)中进行测序，以产生部分cDNA序列(表达序列标记或“EST”；参见Adams等人，1991，Science252：1651-1656)。用Perkin Elmer Model 377荧光测序仪分析所得的EST。
用改进的转座规程产生全长插入序列(FIS)数据。从归档的甘油原种作为单一菌落回收确定了FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。将分离的DNA模板在基于PCR的测序反应中与载体引物M13正向和反向寡核苷酸反应并上样至自动化的测序仪上。通过与对其进行FIS查询的初始EST序列进行序列比对来确认克隆鉴定。
将确认的模板通过基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ty1转座因子(Devine和Boeke，1994，Nucleic Acids Res.22：3765-3772)的Primer Island转座试剂盒(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)进行转座。该体外转座系统在整个一组大DNA分子中随机地放入独特的结合位点。随后将转座的DNA用于通过电穿孔转化DH10B电-感受态细胞(Gibco BRL/Life Technologies，Rockville，MD)。转座因子含有另外的可选标记(称为DHFR；Fling和Richards，1983，Nucleic Acids Res.11：5147-5158)，使得能在琼脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每次转座反应随机地选择多个亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结合位点特异性的独特引物从转座事件位点向外进行测序(ABI Prism dye-terminator ReadyReaction mix)。
收集序列数据(ABI Prism Collectiohs)并用Phred和Phrap(Ewing，等人，1998，Genome Res.8：175-185；Ewing和Green，1998，Genome Res.8：186-194)进行装配。Phred是一种公用软件程序，该程序再次读取ABI序列数据，再次调出(recall)碱基，赋质量值，并将碱基序列(base call)和质量值写入可编辑的输出文件中。Phrap序列组装程序使用这些质量值来增加组装的序列重叠群的准确度。通过Consed序列编辑器(Gordon等人，1998，Genome Res.8：195-202)检查装配序列。
在一些克隆中，cDNA片段对应基因的3’-端的一部分并且不会涵盖整个开放阅读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一者。这两种方法中的第一种方法导致产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开放阅读框的片段。这两种方法均使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有时基于以前的知识(特定的基因应该存在于某些组织中)选择文库，有时则进行随机地选择。获得相同基因的反应可平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库池通常用3至5个不同的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增中，两种方法均使用载体特异性的(正向)引物，同时还使用基因特异性的(反向)引物，该正向引物对应位于克隆5’-端处的载体的一部分。第一种方法使用与已知基因序列的一部分互补的序列，而第二种方法使用与3’-非翻译区(也称为UTR)的一部分互补的基因特异性引物。在第二轮扩增中，两种方法均使用套式引物组。按照生产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段连接进pBluescript载体中。该试剂盒选自可得自包括InvitrogenTM(Carlsbad，CA)、Promega Biotech(Madison，WI)和Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)在内的一些供应商的许多试剂盒。如上所述，将质粒DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用Phred/Phrap进行装配。
实施例7
cDNA克隆的鉴定
编码EXST样多肽的cDNA克隆能通过这样鉴定：进行BLAST(基本的局部比对搜索工具)；Altschul等人，1993，J.Mol.Biol.215：403-410；还可参见国立卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释)，寻找与BLAST“nr”数据库中所包含序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译序列、源自3-维结构Brookhaven蛋白质数据库(Protein Data Bank)、SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最新的主要版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)的相似性。采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，能分析如实施例6中获得的cDNA序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的DNA序列的相似性。在所有的阅读框中翻译DNA并用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，1993，Nat.Genet.3：266-272)比较与“nr”数据库中包含的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计算仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P-值(概率)在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。
将受分析的EST与上述Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTn算法(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402.)对杜邦专利数据库比较具有序列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5′端或3′端序列的EST。在两个或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可装配成单一的连续核苷酸序列，从而使最初的片段在5′或3′初始方向上延伸。一旦确定了最5′的EST后，可如实施例6中所述，通过全长插入序列来确定其完整的序列。可用tBLASTn算法，通过将已知基因(来自专有来源或公开数据库的已知基因)的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找到属于不同物种的同源基因。tBLASTn算法对所有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库进行氨基酸查询的搜索。该搜索允许不同物种之间的核苷酸密码子使用的差异，并且允许密码子简并。
实施例8
制备cDNA文库并且鉴定编码EXST样多肽的cDNA克隆
如实施例6所述制备提供来自玉米、大豆、稻、向日葵、瓜尔、小麦、佛罗里达苦树(Florida bitterbush)、燕麦、棉、苋属植物和卡诺拉的不同组织的mRNA的cDNA文库，下文描述了该文库。下面描述了该文库的特征。
表2
来自玉米、大豆、稻、向日葵、瓜尔、小麦、佛罗里达苦树(Florida bitterbush)、燕麦、棉、苋属植物和卡诺拉的cDNA文库
  文库   组织   克隆
  cfp5n   玉米粒，收集阶段，全长富集的，标准化的   cfp5n.pk007.k11
  p0127   核组织，抽丝后5天，经筛选的1。   p0127.cntdd86ra
cfp6n 收集的玉米叶片和种子，全长富集的，标准化的   cfp6n.pk002.a5cfp6n.pk002.a5：fis
Ctn1c   玉米(Zea mays L.，B73)夜间收获的雄穗(v12阶段)。   ctn1c.pk002.p16
rls24   稻萌发叶片后15天，感染菌株稻瘟病菌4360-R-67(AVR2-YAMO)后24小时；易感的   rls 24.pk0026.h11rls 24.pk0026.h11：fis
esl1c   裸麦叶片，经冰冻以诱导冷响应基因序列，该序列能用于转化玉米以使其获得对低温或脱水胁迫的抗性。   esllc.pk006.119esl1c.pk006.l19：fis
cfp1n   收集的玉米雄穗V7至V12，全长富集的，标准化的   cfp1n.pk002.o16.f：fis
ebb2c 卡诺拉Rf基因敲除的突变品系02SM5的不成熟芽。   ebb2c.pk 005.f9ebb2c.pk005.f9：fis
lds1c   15DAF时收获的瓜耳(Cyamopsistetragonoloba)种子。   lds1c.pk008.m15lds1c.pk008.m15：fis
eas1c 反枝苋(Amaranthus retroflexus)种子   eas1c.pk002.p14eas1c.pk002.p14：fis
egh1c 陆地棉(Gossypium hirsutum)发芽的种子。   egh1c.pk005.b21egh1c.pk005.b21：fis
ort1f 燕麦(Avena strigosa)全长燕麦根尖   ort1f.pk014.e9ort1f.pk014.e9：fis
pps   佛罗里达苦树(Picramnia pentandra)的发育种子   pps.pk0007.b3pps.pk0007.b3：fis
hso1c 草酸氧化酶转基因向日葵植物   hso1c.pk001.n10hso1c.pk001.n10：fis
sgs1c 发芽4小时后的大豆种子   sgs1c.pk004.m16sgs1c.pk004.m14
scn1c   10个月的大豆(大豆L.，6705)胚发生悬浮培养物(坏死组织)。   scn1c.pk001.m7scn1c.pk001.m7：fis
wpa1c 小麦(Triticum aestivum)减数分裂前花药JIC   wpa1c.pk011.n19wpa1c.pk011.n19：fis
rdi2c   稻(Oryza sativa，Nipponbare)在枝梗一花器官原基形成处的发育花序   rdi2c.pk011.p5rdi2c.pk011.p5：fis
smj1c   来自转基因大豆的IPT转录物的表征。前导增产(大豆YE2.1)构建体表达农杆菌异戊烯基转移酶基因。 smj1c.pk006.c12.fsmj1c.pk006.c12.f：fis
使用来自表1中列出的克隆的EST序列进行的BLASTX搜索揭示所述多肽与来自稻的EXST样多肽的相似性(GI No.115476598、115487106、115452759和115441893分别对应于SEQ ID NO：35、36、37、和38。表3显示了表2列出的克隆的全长cDNA插入序列(“全长插入序列”或“FIS”)的BLASTP结果。每个cDNA插入序列编码完整蛋白或功能性蛋白(“完全基因序列”或“CGS”)。表3和表4也显示了使用Clustal V比对方法、使用默认参数计算的每对氨基酸序列的序列同一性百分比值：
表3
编码EXST样多肽同源物的多肽序列的BLAST结果和同一性百分比
  序列   状况   NCBI GI   BLAST pLog打分   ％同一性
  重叠群：cfp5n.pk007.k11cfp5n.pk007.k11.fcfp6n.pk005.i1SEQ ID NO：14   Contig   115487106(稻)SEQ ID NO：36   ＞180   77.5
  重叠群：cfp3n.pk069.l15cfp3n.pk069.l15.fp0127.cntdd86rap0127.cntdd86ra.fSEQ ID NO：16   Contig   115452759(稻)SEQ ID NO：37   176   70.0
  my.ceb1.pk0010.e5SEQ ID NO：18   FIS   115441893(稻)SEQ ID NO：38   160   90.1
  cfp6n.pk002.a5：fisSEQ ID NO：20   CGS   115452759(稻)SEQ ID NO：37   ＞180   82.4
  rls24.pk0026.h11：fisSEQ ID NO：22   CGS   115476598(稻)SEQ ID NO：35   ＞180   99.8
  p0127.cntdd86ra：fisSEQ ID NO：24   CGS   11542759(稻)SEQ ID NO：37   ＞180   80.8
  cfp5n.pk007.k11：fisSEQ ID NO：26   FIS   115487106(稻)SEQ ID NO：36   85   36.2
  esl1c.pk006.l19：fisSEQ ID NO：28   CGS   115487106(稻)SEQ ID NO：36   ＞180   78.9
  cfp1n.pk002.o16.f：fisSEQ ID NO：30   CGS   115476598(稻)SEQ ID NO：35   ＞180   63.5
图15A-15I示出以下全长氨基酸序列的多重比对：SEQ ID NO：15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、以及SEQ ID NO：35、36、37、和38。图16给出图15A-15I中给出的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。
用LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序进行序列比对和同一性百分比计算。用带默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)的Clustal比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)进行序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数为KTUPLE 1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALSSAVED＝5。
序列比对和BLAST打分以及概率显示包含本发明cDNA克隆的核酸片段编码EXST样多肽。
表4
编码与EXST和EXST样多肽同源的多肽的序列的BLAST结果
  序列   状况   参照序列   BLAST pLog机分   ％同一性
  重叠群：cfp5n.pk007.k11cfp5n.pk007.k11.fcfp6n.pk005.i1SEQ ID NO：14   CGS   JP2005185101中的SEQ ID 49101   ＞180   77.5
  重叠群：cfp3n.pk069.l15cfp3n.pk069.l15.fp0127.cntdd86rap0127.cntdd86ra.fSEQ ID NO：16   EST   US2004214272中的SEQ ID 345741   ＞180   80.1
  my.ceb1.pk0010.e5SEQ ID NO：18   CGS   US2004216190中的SEQ ID 7611   175   99.6
  cfp6n.pk002.a5：fisSEQ ID NO：20   CGS   US2004214272中的SEQ ID 345741   ＞180   98.9
rls24.pk0026.h11：fisSEQ ID NO：22   CGS   JP2005185101中的SEQ ID NO54370   ＞180   99.8
  p0127.cntdd86ra：fisSEQ ID NO：24   CGS   US20042中的SEQID 345741   ＞180   91.4
cfp5n.pk007.k11：fisSEQ ID NO：26   CGS   US2004214272中的SEQ ID 361954   94   75.1
esl1c.pk006.l19：fisSEQ ID NO：28   CGS   US2004216190-A1中的SEQ ID10067   ＞180   98.3
cfp1n.pk002.o16.f：fisSEQ ID NO：30   CGS   JP2005185101中的SEQ ID 54370   ＞180   63.5
实施例9
制备含有拟南芥属前导基因(AT3G03650)的同源物的植物表达载体
可使用诸如BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool)；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1993；也参见美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的万维网网址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法，鉴定与前导EXST基因同源的序列。同源EXST样序列，如实施例8所述的序列，可通过任何一种以下方法进行PCR扩增。
方法1(基于RNA的方法)：如果EXST同源物的蛋白编码区域的5’和3’序列信息是可用的，可如实施例5A所述设计基因特异性引物。可将RT-PCR用于植物RNA来获得含有EXST蛋白编码区的核酸片段，该EXST蛋白编码区旁侧为attB1(SEQ ID NO：39)和attB2(SEQ ID NO：40)序列。引物可含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。
方法2(基于DNA的方法)：作为另外一种选择，如果编码EXST多肽同源物的基因的cDNA克隆是可用的，可以PCR扩增完整cDNA插入序列(含有5′和3′非编码区)。可设计正向引物和反向引物，使它们分别或者含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBluescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQ IDNO：41)和反向引物VC063(SEQ ID NO：42)。
方法1和方法2可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物可含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。
可利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与
Figure GPA00001103575900681
供体载体(例如pDONRTM/Zeo(InvitrogenTM，图2；SEQ ID NO：2)或pDONRTM221(InvitrogeTM，图3；SEQ ID NO：3)组合。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONRTM221移除并定向地克隆了该在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entryclone)。使用InvitrogenTM
Figure GPA00001103575900682
ClonaseTM技术，然后可将来自入门克隆的同源EXST样基因转移到合适的目的载体中以获得植物表达载体，所述载体用于拟南芥属、玉米和大豆，如pBC-Yellow(图4；SEQ IDNO：4)、PHP27840(图5；SEQ ID NO：5)或PHP23236(图6；SEQ IDNO：6)，以获取植物表达载体，分别用于拟南芥属、大豆和玉米。
作为另外一种选择，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSite
Figure GPA00001103575900683
LR重组反应以产生表达载体。该程序的一个实例在实施例14A中有所描述，该实施例描述了用于转化玉米品系的玉米表达载体的构建。
实施例10
用验证过的拟南芥属前导基因及其同源物制备大豆表达载体并转化大 豆
为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属(Arabidopsis)基因(AT3G03650)和来自不同物种的对应同源物。
可将实施例5A和9中所述的入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体(图5，SEQ ID NO：5)中，使得该基因的表达处于SCP1启动子的控制下。
然后可用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。
为了诱导体细胞胚，可将子叶(长度为3-5mm，从大豆品种A2872的表面灭菌的未成熟种子解剖出来)于26℃在光下或黑暗下培养6-10周。然后切取体细胞胚(其产生次生胚)并将其置于合适的液体培养基内。在重复选择增殖为早期球形阶段胚的体细胞胚的簇后，按下面的描述保持该悬浮液。
可将大豆胚发生悬浮培养物在26℃下在摇床(150rpm)上的35mL液体培养基中保持，荧光光照采用16∶8小时(白天/黑夜)的时间表。通过将大约35mg组织移植进35ml液体培养基中，每两周将培养物进行传代培养。
然后可通过基因枪轰击方法(Klein等人，Nature(London)327：70-73，1987；美国专利4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。杜邦公司的BiolisticTMPDS1000/HE仪器(氦气改进型)可用于这些转化。
可用于帮助大豆转化的可选标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812，1985)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，Gene 25：179-188，1983)的潮霉素磷酸转移酶基因以及胭脂碱合成酶基因的3′区构成的嵌合基因，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的T-DNA。可用于帮助大豆转化的另一种可选标记基因是来自大豆或拟南芥属的除草剂抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中的第一共用酶。已经鉴定出ALS中的突变导致对三类ALS抑制剂中的某些或全部具有抗性(美国专利5,013,659；其全部内容以引用的方式并入本文)。除草剂抗性ALS基因的表达可处于SAM合成酶启动子(美国专利申请US-2003-0226166-A1；藉此将其全部内容以引用的方式并入本文)的控制下。
将如下物质(依次)加入50μL 60mg/mL的1μm金颗粒悬浮液：5μLDNA(1μg/μL)、20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl2(2.5M)。然后搅拌该颗粒制备物三分钟，在微量离心机(microfuge)中离心10秒并移除上清液。然后将DNA包覆的颗粒在400μL 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μL无水乙醇中。可将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次，每次一秒钟。然后将5μL该DNA-包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。
将大约300-400mg两周大的悬浮培养物置于60×15mm的空培养皿中并用吸管将残留的液体从组织移除。对于每次转化实验，大约5-10板的组织受到正常轰击。膜破裂压力设定为1100psi并将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡网大约3.5英寸的地方并轰击三次。轰击后，可将组织分成两份并放回液体培养基中，如上所述进行培养。
轰击后五至七天，用新鲜培养基更换该液体培养基，并在轰击后七至十二天，用含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换这种选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚芽发生簇长出来。移出分离的绿色组织并将其移植进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当成是独立的转化事件。然后可将这些悬浮培养物作为未成熟胚进行传代培养和维持，或者通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。
可通过在土壤中培养植物并在用
Figure GPA00001103575900701
分析总根质量前洗涤根部来测量大豆增大的根构造。
然后可分析用验证过的基因转化大豆植株以研究相对于对照或参照植株的农学特性。例如，在多种环境条件(如氮限制条件、干旱等)下的氮利用效率、产量增强和/或稳定性。
实施例11
使用颗粒轰击用验证过的拟南芥属前导基因转化玉米
为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。
可将实施例5A中所述的
Figure GPA00001103575900702
入门克隆用于将每种基因定向克隆进玉米转化载体中。玉米基因的表达可处于组成型启动子的控制下，例如玉米泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632，1989，以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992)。
然后可通过下面的方法将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。可从源于近交玉米系H99和LH132杂交的发育中的颖果切取未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分离胚，这时它们长为1.0至1.5mm。然后将胚以轴线侧朝下放置并与琼脂糖硬化的N6培养基(Chu等人，Sci.Sin.Peking18：659-668，1975)接触。将胚在27℃下保持在黑暗中。从这些未成熟胚的胚鳞增生出易脆的胚发生愈伤组织，该愈伤组织由未分化的细胞块构成，在胚柄结构上长有体细胞原胚状体和胚状体。可将从该原外植体分离的胚发生愈伤组织在N6培养基上培养，并每两至三周在这种培养基上进行传代培养。
可将质粒p35S/Ac(得自Peter Eckes博士，Hoechst Ag，Frankfurt，Germany)用于转化实验以便提供可选标记。该质粒含有pat基因(见欧洲专利公布0242236)，该基因编码草胺膦乙酰转移酶(PAT)。酶PAT赋予对除草性谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草胺膦的抗性。p35S/Ac的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和胭脂碱合成酶基因的3′区的控制下，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA。
可将粒子轰击法(Klein等人，Nature 327：70-73(1987))用于将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法，利用下面的技术用DNA包覆金颗粒(直径1μm)。将10μg质粒DNA加入到50μL金颗粒悬浮液(每mL60mg)中。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)加入到该颗粒中。再加入这些溶液过程中涡旋该悬浮液。10分钟后，将试管粗略地离心(以15,000rpm进行5秒钟)并移除上清液。将该颗粒再悬浮于200μL的无水乙醇中，再次离心并移除上清液。再次进行乙醇冲洗并将颗粒再悬浮于终体积为30μL的乙醇中。可将DNA包覆的金颗粒等分试样(5μL)置于KaptonTM飞行圆盘(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用
Figure GPA00001103575900711
PDS-1000/He(Bio-Rad Instruments，Hercules CA)，采用1000psi的氦气压、0.5cm的间隙距离以及1.0cm的飞行距离，将颗粒加速射入玉米组织中。
对于轰击，将胚发生组织置于琼脂糖硬化的N6培养基上的滤纸上。组织布置成薄薄一层，并覆盖直径为约5cm的圆形区域。然后可将包含组织的培养皿置于离阻挡网大约8cm的PDS-1000/He的腔室内。然后将该腔室中的空气抽出至28英寸汞柱的真空。利用在击波管中氦气压力达到1000psi时破裂的可破裂膜，宏载体被氦气冲击波加速。
轰击后七天，可将组织转移至N6培养基中，该培养基含有双丙氨磷(每升5mg)并缺少酪蛋白或脯氨酸。组织继续在这种培养基上缓慢生长。另外两周后，可将组织转移至含有bialaphos的新鲜N6培养基上。六周后，在某些装有补充了双丙氨磷的培养基的盘上，可辨别直径约1cm的区域上有活性生长的愈伤组织。当在选择培养基上传代培养时，这些愈伤组织可继续生长。
通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。
可再生出转基因的T0植株并按照下面的HTP步骤确定它们的表型。可收集T1种子。
可栽培T1植株并分析表型变化。利用图像分析可定量下面的参数：可收集并定量植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。与合适的对照植物比较，导致根构造改变或上文列出的任何一种农学特性改变的表达构建体可被认为是拟南芥属前导基因在玉米中发挥功能以改变根构造或植物构造的证据。
此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥属基因的重组DNA构建体导入玉米品系内。
可对转基因植株(或者是近交的或者是杂交的)进行更有力的基于田间的实验来研究在多种环境条件下(如营养物质的改变和水的可利用性)的根构造或植物构造、产量提高和/或抗根倒伏性。
也可进行后续的产量分析，以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植物与不包含验证过的拟南芥属前导基因的对照(或参照)植物相比较时是否具有改善的产量表现。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物相对于对植物将具有改善的产量，优选地在不利环境条件下产量损失减少50％，或在不同环境条件下相对于对照植物将具有提高的产量(例如，与对照植物相比，在不限制氮的条件下产量提高。
实施例12
电穿孔根癌农杆菌LBA4404
将电穿孔感受态细胞(40μl)，例如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404(含有PHP10523)在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。
将DNA等分试样(0.5μL JT(US 7,087,812)亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H2O中的浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的农杆菌细胞混合，同时仍然保持在冰上。将该混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。通过按下“pulse(脉冲)”键两次(理想的是获得4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后，将0.5ml 2xYT培养基(或SOCmedium)加入到电穿孔管并转移至15ml Falcon管中。将细胞在28-30℃、200-250rpm下培养3小时。
将250μl的等分试样散布在#30B(YM+50μg/mL奇放线菌素)板上并在28-30℃下培养3天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个可选步骤中的其中一个：
选择1：用30μl 15mg/ml的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。
选择2：进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。
转化体的鉴定：
选取四个独立的克隆并划痕接种在AB基本培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#12S培养基)上用于分离单个克隆。将平板在28℃下培养2-3天。
对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其接种在4ml具有50mg/l的奇放线菌素的#60A中。将该混合物在28℃下摇动培养24小时。采用Qiagen Miniprep+可选的PB洗涤，从4ml培养物分离出质粒DNA。将DNA在30μl中洗提。如上所述，将2μl的等分试样用于电穿孔20μl DH10b+20μl ddH2O。
可任选地，可将15μl等分试样用于转化75-100μl的InvitrogenTMLibrary Efficiency DH5α。将细胞散布在LB培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#34T培养基)上并将其在37℃下培养过夜。
对于每个推定的共整合体选取3至4个独立的克隆并将其接种在4ml具有50μg/ml奇放线菌素的2xYT(#60A)上。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。
使用
Figure GPA00001103575900741
Miniprep，用任选PB洗涤液(稀释成50μl)从4mL培养物中分离质粒DNA，并且8μl质粒DNA用SalI(使用JT亲本和PHP10523作对照物)进行消化。
对于4个质粒利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用亲代DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。
作为另一种选择，对于高通量应用，例如针对Gaspe Flint衍生的玉米品系(实施例15-17)所描述的，代替通过限制性酶切分析来评价所得的共整合载体，可将三个克隆同时用于如实施例13所述的感染步骤。
实施例13
农杆菌介导的玉米的转化
为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。
农杆菌介导的玉米转化基本上按照Zhao等人，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)中描述的方法进行(还可参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840，以引用的方式将该文献并入本文)。该转化过程涉及细菌接种、共培养、静止期、选择以及植株再生。
1.未成熟胚的制备
从颖果切取未成熟胚并置于装有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。
2.胚的农杆菌感染以及共培养
2.1感染步骤
用1mL微量吸移管移出PHI-A培养基并加入1mL农杆菌悬浮液。轻轻倒置该管进行混合。将该混合物在室温下培养5分钟。
2.2共培养步骤
用1mL微量吸移管将农杆菌悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。确定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚的平板在20℃下于黑暗中培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。
3.推定的转基因事件的选择
向100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的每平板中转移10个胚，保持朝向，并用parafilm将培养皿密封。将平板在黑暗中于28℃培养。预计在6-8周将看见活性生长的推定事件(作为浅黄色胚组织)。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆性组织生长。取决于生长速率，以2-3周的间隔将推定的转基因胚组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行传代培养。记录事件。
4.T0植株的再生
将在PHI-D培养基上增殖的胚组织转移至100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚成熟培养基)进行传代培养并在28℃下，在黑暗中培养约10-18天，直至体细胞胚成熟。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中，并且在28℃于光中(约80μE，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在7-10天，将约10cm高的再生植株盆载于园艺混合物中，并使用标准园艺方法使其受冷而变得耐寒。
用于植物转化的培养基
1.PHI-A：4g/L的CHU基础盐、1.0mL/L的1000X Eriksson维生素混合物、0.5mg/L的盐酸硫胺素、1.5mg/L的2，4-D、0.69g/L的L-脯氨酸、68.5g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖，pH为5.2。在使用前加入100μM的乙酰丁香酮，过滤灭菌。
2.PHI-B：无葡萄糖的PHI-A，2，4-D增加至2mg/L，蔗糖减少至30g/L并且补充有0.85mg/L的硝酸银(过滤灭菌)，3.0g/L的固化剂(gelrite)，100μM的乙酰丁香酮(过滤灭菌)，pH为5.8。
3.PHI-C：无固化剂和乙酰丁香酮的PHI-B，2，4-D减少至1.5mg/L并且补充有8.0g/L的琼脂，0.5g/L的Ms-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭菌)。
4.PHI-D：补充有3mg/L的双丙氨磷bialapho(过滤灭菌)的PHI-C。
5.PHI-E：4.3g/L的Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRL11117-074)、0.5mg/L的烟酸、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.1g/L的肌醇、0.5mg/L的玉米素(Sigma，商品目录号：Z-0164)、1mg/L的吲哚乙酸(IAA)、26.4μg/L的脱落酸(ABA)、60g/L的蔗糖、3mg/L的双丙氨磷(过滤灭菌)、100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭菌)、8g/L的琼脂，pH为5.6。
6.PHI-F：不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E；蔗糖减少至40g/L；用1.5g/L的固化剂代替琼脂；pH为5.6。
通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，(1990)Bio/Technology 8：833-839)中。
可进行对转基因T0植株和T1植株的表型分析。
可分析T1植株表型的变化。利用图像分析，可在植株生长过程中在多个时间点，分析T1植株在植株面积、体积、生长速率方面的表型变化并且可进行颜色分析。可如实施例20中所述分析根构造的改变。
可对农学特性的改变进行后续分析，以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植株在与不含有验证过的拟南芥属前导基因的对照(或参照)植株比较时是否具有至少一种农学特性的改善。还可在多种环境条件下研究改变。
导致根构造显著改变的表达构建体将被认为是拟南芥属基因在玉米中发挥功能以改变根构造的证据。
实施例14A
利用农杆菌介导的转化构建具有拟南芥属前导基因(AT3G03650)的玉 米表达载体
用拟南芥属EXST基因(AT3G03650)在NAS2(SEQ ID NO：44)和GOS2(SEQ ID NO：45)启动子控制下制备玉米表达载体。PINII是终止子(SEQID NO：48)使用InvitrogenTM
Figure GPA00001103575900771
技术，如实施例5A所述制备的、包含拟南芥属EXST基因(AT3G03650)的入门克隆PHP 28739被用于独立的
Figure GPA00001103575900772
LR反应：
1)组成型玉米GOS2启动子入门克隆(PHP28408，图11，SEQ IDNO：11)和PinII终止子入门克隆(PHP20234，图9，SEQ IDNO：9)形成目的载体PHP28529(图10，SEQ ID NO：10)。将所得载体命名为PHP28976。
2)根玉米NAS2启动子入门克隆(PHP22020，图12，SEQ ID NO：12)和PinII终止子入门克隆(PHP20234，图9，SEQ ID NO：9)形成目的载体PHP28529(图10，SEQ ID NO：10)。将所得载体命名为PHP28913。
目的载体PHP28529被加到每个最终载体(PHP28983和PHP28984)中，也是：
1)RD29A启动子：：黄色荧光蛋白：：PinII终止子盒，用于拟南芥属种子分选。
2)泛素启动子：：moPAT/红色荧光蛋白融合基因：：PinII终止子盒，用于转化选择和玉米种子分选。
实施例14B
制备包含拟南芥属EXST基因及其同源物的玉米表达构建体
可使用实施例5A和14A所述的程序将拟南芥属EXST基因及其来自玉米和其他物种的对应同源物(表1)转化到玉米品系中。能如实施例5A和14A所述制备具有拟南芥属EXST基因及其来自玉米和其他物种的对应同源物(表1)的玉米表达载体。除了GOS2或NAS2启动子，其他启动子，例如(但不限于)泛素启动子、S2A和S2B启动子、玉米ROOTMET2启动子、玉米Cyclo、CR1BIO、CRWAQ81以及玉米ZRP2.4447，可用于引导EXST和EXST样基因在玉米中的表达。此外，多种终止子，例如但不限于PINII终止子，可用于完成所关注基因在玉米中的表达。
实施例14C
使用农杆菌介导转化，用拟南芥属前导基因(AT3G03650)和来自其他 物种的对应同源物来转化玉米品系
然后可将最终载体(玉米中表达的载体，实施例14A和B)分别电穿孔进入包含PHP10523的LBA4404农杆菌(图7；SEQ ID NO：7，Komari等人，Plant J 10：165-174(1996)，NCBI GI：59797027)中，以产生用于玉米转化的共整合载体。该共整合载体是通过最终载体(玉米表达载体)与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。除了实施例14A-B中所述的表达盒，该共整合载体还含有农杆菌菌株以及农杆菌介导转化所需的基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)。转化玉米品系可如实施例13所述进行。
实施例15
用于转化Gaspe Flint衍生的玉米品系的目的载体PHP23236和 PHP29635的制备
目的载体PHP23236(图6，SEQ ID NO：6)是通过用质粒PHP23235(图8，SEQ ID NO：8)转化包含质粒PHP10523(图7，SEQ ID NO：7)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP23236可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化GaspeFlint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于泛素启动子(SEQ ID NO：46)的控制之下。
PHP29635(图13，SEQ ID NO：13)是通过用质粒PIIOXS2a-FRT87(ni)m(图14，SEQ ID NO：43)转化包含质粒PHP10523的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP29635可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化Gaspe Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于S2A启动子(SEQ ID NO：47)的控制之下。
实施例16
用于转化Gaspe Flint衍生的玉米品系的质粒的制备
使用InvitrogenTM
Figure GPA00001103575900781
重组技术，可如实施例5A和9所述制备包含拟南芥属EXST基因(AT3G03650)或玉米EXST样同源物的入门克隆，该克隆用于定向克隆每个基因进入目的载体PHP23236(实施例15)用于在泛素启动子下表达，或进入目的载体PHP29635(实施例15)用于在S2A启动子下表达。每一种表达载体都是用于农杆菌介导玉米转化的T-DNA二元载体。
Gaspe Flint衍生的玉米品系可如实施例17中所述用表达构建体转化。
实施例17
用验证过的拟南芥属前导基因和来自其他物种的对应同源物转化Gaspe Flint衍生的玉米品系
为了检查所得表型，玉米植株可如实施例16所述进行转化以过表达拟南芥属AT3G03650基因和来自其他物种的同源物，如表1列出的基因。除了如实施例16所述的启动子之外，其他启动子，例如S2A和S2B启动子、玉米ROOTMET2启动子、玉米Cyclo、CR1BIO、CRWAQ81以及玉米ZRP2.4447，可用于引导EXST和EXST样基因在玉米中的表达。此外，多种终止子，例如但不限于PINII终止子，可用于完成所关注基因在Gaspe Flint衍生的玉米品系中的表达。
受体植株
受体植株细胞可来自具有短的生活周期(“快速循环”)、大小减少以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Flint(GF)品系品种的植株细胞。一种可能的候选植株品系变种是GF×QTM(Quick Turnaround Maize(快速周转玉米)，选择用于在温室条件下生长的Gaspe Flint的可公开获得形式)的F1杂交种，其在Tomes等人的美国专利申请公开2003/0221212中有所公开。从该品系获得的转基因植株具有如此小的大小使得它们可在4英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植株所需空间的1/4)并且它们在少于2.5个月时间内成熟。(传统上，一旦转基因植株适应温室后需要3.5个月来获得转基因T0种子。)另一合适的品系是GS3(高度可转化的品系)×Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良近交系。
转化规程
任何合适的方法可用于将转基因引入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌载体的接种类型的步骤，如实施例9所述。转化可在受体(靶标)植株的未成熟胚上进行。
精确的生长和植株跟踪
将由转化的玉米胚产生的转基因(T0)植株的事件群体在受控的温室环境中栽培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植株布局，在该布局中，实验植株被分成组(如，每组30株植株)，称为块，而每株植株随块被随机分配一个位置。
对于一组30株植株，24株转化的实验植株和6株对照植株(具有设定好的表型的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列(也叫做重复组或块)。每株植株(对照植株或实验植株)随块被随机分配一个位置，所述的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个30株植株的重复组中的每一个可栽培在相同的温室中。应该确定重复组的布局(布置方式)以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。
对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因植株。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评价引入基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植株与表达转基因的那些植株进行比较。
在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株，并且从那些植株收集的数据自动与那些植株相关联，使得所搜集的数据可与由该植株携带的转基因关联。例如，每个植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相关联。
作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国公布的专利申请2004/0122592，其以引用方式并入本文。
利用三维成像进行表型分析
对T0事件群体中的每株温室植株(包括任何对照植株)分析所关注的农学特性，并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据，该方式使得数据与该植株的辨识数据(见上面)相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。
在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植株以评价所关注的性状。优选的是，将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。
由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变，最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。
在单次成像分析操纵中，进行如下事件：(1)将植株传送至分析仪区域内，旋转360度以便其机器可读标签可被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧面图像并将其输入数据库；(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动，以及(4)将该植株传送出分析仪。
每24小时的周期让植物至少6个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。
成像仪器
可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH(Wurselen，Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec Scanalyzer HTSLT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。优选的是，对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5％，对于次要组成成像分析仪的仪器差异小于约10％。
软件
成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。可将多种市售的软件系统(如Matlab等)用于定量判读成像数据，并且这些软件系统中的任何一种均可应用于图像数据集。
传送系统
具有植物旋转装置的传送系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多4株植物(每株最高高度为1.5m)装上汽车，该汽车在循环的传送系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占有面积为约5m×5m。
可扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。
照明
任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择，可以变化照明以引起转基因(如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。
基于三维成像的生物量评价
为了更好地评价生物量，应该从至少三个轴(优选顶部视图和两个侧面(侧面1和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可通过如下计算来评价植物的体积：
在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该体系中，任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值(正较大和负较小两者)。大小(如面积)的任意单位可通过将物理参照加入到成像过程而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中均包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积单位，例如平方厘米(cm2)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度的盆足可用作物理参照。
颜色分类
成像技术还可用于确定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可通过多种计算方法确定颜色分类。
对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方案，包括绿色的两种或三种色调，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。
除了其在测定植物的大小、生长中的有效性，颜色分类还可用于评价其他产量构成性状。对于这些其他产量构成性状，可使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度(staygreen)”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可通过颜色分类来评价，该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用于在T0或T1植物生活周期末获取的图像，可鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如，可表示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可被鉴定为携带影响这种重要农学特性的转基因。
熟练的植物学家将认识到可指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素)的出现，以及认识到其他颜色分类方案可提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。
植物构造分析
改变植物构造参数的转基因也可用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可如下用于测定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何构造，并且随后基于该图像可进行不同构造参数的参数化鉴定。或者是单独地或者是组合地修改任何这些构造参数的转基因可通过应用此前所述的统计方法来鉴定。
花粉脱落日期
花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可通过活性雄花第一次出现在植物上来测定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日期。
作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授粉日期、第一穗丝日期)可由负责进行植物看护的工作任人员来记录。为了使数据完整性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操纵者变得舒适。
植物的取向
以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的构造。也就是说，植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的最大差别。将顶部图像用于测定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。
实施例18
在氮限制条件下筛选Gaspe Flint衍生的玉米品系
转基因植物将含有两个或三个剂量的Gaspe Flint-3与一个剂量的GS3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)，并且对于显性转基因将会以1∶1分离。将植物在Turface中栽培，每天用1mM KNO3生长培养基和2mMKNO3或更高的生长培养基浇洒四次(见图23)。在1mM KNO3培养基中培养的对照植物的绿度较小，产生较少的生物量并且在开花期具有较小的穗(关于样本数据的示例请参见图24)。
用统计学测定处理株之间所观察到的差异是否真有差异。图18示出了一种方法，该方法将字母放在数值后面。同一列中其后具有相同字母(不是字母组)的那些值不具有显著的差异。使用该方法，如果在一列中的值的后面没有字母，则该列中的这些值的任何之间不存在显著的差异，换句话讲，该列中的所有这些值是均等的。
与无效转基因相比较，转基因的表达将导致植物在1mM KNO3中具有改善的植物生长。因此生物量和绿度(如实施例17所述)将在生长期间进行监控，并与无效转基因植物比较。生长、绿度、开花期穗的大小的改善将表明氮耐受性增强。
实施例19
具有经验证的拟南芥属前导基因(AT3G03650)的玉米品系的产量分析
可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥属基因的重组DNA构建体导入玉米品系内。
可以将转基因植物(自交系或杂种)进行更强的基于田间的试验，以研究在不同环境条件(例如改变水和营养物质可利用性)下的产量增加和/或稳定性。
可对产量进行后续分析以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植株在与不含有验证过的拟南芥属前导基因的对照植株比较时，在不同环境条件下是否具有产量的改善。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物具有相对于对照植物更少的产量损失，优选50％更少的产量损失。
实施例20
测定玉米根构造改变的测定法
测定转基因玉米植物在幼苗期、花期或成熟期的根构造改变。测量玉米植物的根构造改变的测定法包括但不限于下面概述的方法。为了便于手动或自动地测定根构造改变，可让玉米植物在透明的盆中生长。
1)根量(干重)。让植物在Turface中生长。将烘干的根和根组织称重并计算根冠比。
2)侧根分枝的水平。侧根分枝的程度(如侧根数量、侧根长度)通过这样测定：从完整的根系进行二次取样，将样本用平面扫描器或数码相机成像并用WinRHIZOTM软件(Regent Instruments Inc.)分析。
3)根带宽度的测量。根带是植物成熟时在温室栽培盆的底部形成的根带或根量。测量成熟时根带的厚度(以mm为单位)，作为对根量的粗略评价。
4)节生根的计数。从支持培养基(support medium)(如盆栽混合物(potting mix))中分离出根后，可测定上部节位处出现的冠根数。另外，可测量冠根和/或支柱根的角度。对节生根和节生根的分枝量的数值分析形成对上述手动方法的另一种延伸。
对提取的有关根表型的所有数据进行统计分析(通常为t检验)，以将转基因根与非转基因姊妹株植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下，还可使用单因素方差分析。
实施例21
氮利用效率幼苗检测分析法
使用颜色标记物将转基因事件的种子分成转基因种子(杂合子)和无效转基因种子。进行两组不同的随机分配处理，使用所有处理的9个平行测定，使每个随机分块(block)有排列成6排9列的54个盆。
将每个处理的两个种子种在4英寸的方盆中，盆中包含在8英寸交错中心上的Turface，每天用包含以下营养物质的溶液浇灌四次：
1mM CaCl2     2mM MgSO4     0.5mM KH2PO4    83ppm Sprint330
3mM KCl       1mM KNO3      1μM ZnSO4      1μM MnCl2
3μM H3BO4    1μM MnCl2    0.1μM CuSO4    0.1μM NaMoO4
植物出苗后，将其减少到每盆一个种子。在收获时从盆中移除植物，并且将Turface从根部洗脱。使根与苗分开，把根置于纸袋中并且在70℃干燥70小时。将干燥后的植物部分(根和苗)称重并置于50mL的圆锥管中，管中有大约205/32英寸的钢球，在涂料振荡器中进行振荡研磨。将大约30mg研磨组织(记录重量用于后续的调节)在2mL 20％H2O2和6M H2SO4中水解30分钟，水解温度为170℃。冷却后加水至20mL，充分混合，移除50μL等分试样并将其加入950μL 1M Na2CO3中。通过将100μL该溶液置于96孔板的每个孔中，然后加入50μL OPA溶液，使用该溶液中的氨评价减少的总植物氮。测定荧光强度，激发(excitation)＝360nM/发射(emission)＝530nM，并且与溶解在相似溶液并用OPA溶液处理过的NH4Cl标准品进行比较。
OPA溶液-5μL巯基乙醇+1mL OPA储备液
OPA储备液-50mg邻苯二醛(OPA-Sigma#P0657)溶解于1.5mL甲醇+4.4mL 1MBorate缓冲液pH9.5(3.09g H3BO4+1g NaOH，溶于50mL水中)+0.55mL 20％SDS
使用这些数据，测量以下参数，并且使用Student t检验比较参数平均值与无效参数平均值：
植物生物重量
根生物量
苗生物量
根/苗比率
植物氮浓度
植物总氮
在每个随机分块中使用最近邻计算以及使用完全随机设计(CRD)模型的方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)计算差异。使用F统计，通过将总随机分块处理平均面积除以总随机分块误差平均面积计算每个随机分块的总处理效应。计算更大的Student t检验的概率用于比较每个转基因平均值与合适的无效转基因(或者批构建体或单个事件的无效转基因平均值)平均值。使用最小值(P＜t)0.1作为临界值。
实施例22
包含拟南芥属exostosin基因的玉米幼苗的根与来自不包含exostosin 基因的幼苗的根的比较分析
如实施例14A所述制备玉米表达载体，该载体包含玉米NAS2启动子(SEQ ID NO：44)和拟南芥属exostosin基因(SEQ ID NO：33)。
如实施例14C所述经由农杆菌介导的转化，通过制备共合体载体(PHP29009)完成玉米转化，并使用如实施例20所述的幼苗检测分析法对根进行检测。
在温室实验中检测分析所有10个来自构建体PHP29009((ZM-NAS2::AT-EXST)的事件，其中每个事件使9个植株在Turface培养基中生长至V4阶段。种子来自T1代(来自从T0植株收集的穗)。对照实验包括15株生长至相同阶段的批无效植物(非转基因的分离植物)。使用完全随机分组设计种植种子。在种植后18天收获植株，此时它们达到V4阶段。洗涤根部并从苗中分开收集。在用分析天平称量干重之前，所有样本进行烘干。
发现在与批无效对照植物进行比较时，总计4个事件具有显著的根干重变化、5个事件具有显著的苗干重变化、7个事件具有显著的根苗比率变化，ata P值小于0.1。六个事件，#4、#5、#6、#7、#9、和#10，具有显著的根/苗比率提高，并且1个事件，#1，具有显著的根/苗比率降低。
进行t检验分析以显示每个转基因事件和对照之间的显著差异。显示了每种特性的p值：根干重、苗干重、以及根-苗比率。粗体字表示转基因植物具有比对照植物更高的值。具有小于0.1的p值的那些值用星号(*)指示。
表5
转基因和对照幼苗的比较
  事件   根干重   苗干重   根/苗比率
  1   0.407   1.000   0.057*
  2   0.737   0.909   0.501
  3   0.931   0.893   0.576
  4   0.012*   0.093*   0.000*
  5   0.000*   0.431   0.000*
  6   0.022*   0.859   0.005*
  7   0.431   0.001*   0.061*
  8   0.949   0.017*   0.163
  9   0.003*   0.001*   0.000*
  10   0.404   0.000*   0.027*
实施例23
在田间标准氮和低氮条件下的转基因杂交体产量测试
在2007季，在Johnston，Iowa的农场中进行田间实验。
实验包括表达由玉米NAS2启动子启动的exostosin基因的七个(7)转基因事件。一个对照是批杂交7个事件的非无效转基因与无效转基因。其它对照是转化中使用的野生型。所有植物是由常见自交系受试者生成的杂交体。
施加两次处理，其中植物在“标准”氮条件下或在氮“耗尽”(stress)条件下进行处理。“标准”处理包括以250lb每英亩的比率施加氮肥。氮“耗尽”条件通过在其中土壤含氮量已经在以前多年的缺乏肥料条件下被作物耗尽的土地上种植转基因和非转基因对照玉米品系获得。
氮耗尽与标准氮处理相比引起30％的产量减少，并且需要每英亩100lb的施肥比率。用2排小块土地进行实验，其密度为每英亩32000株植物。在标准氮和氮耗尽处理中分别包括四次(4)和六次(6)重复。在2007年5月21日种植植物，并在2007年9月26日和27日一起收获。以每英亩蒲式耳测量产量。
表6以相对于无效转基因对照植物的产量增加百分比综述了实验的以每英亩蒲式耳计算的总产量数据。由于缺少种子，事件#7不在标准氮条件下进行测试。总体上，在低氮条件下的3个事件和在标准氮条件下的四个(4)事件显示与批无效转基因对照相比，产量显著增加。所有测试的事件都显示了相对于无效转基因植物的产量增加趋势。
表6
在低氮和标准氮条件下转基因植物对对照植物的产量测试。
  事件   产量相对于无效转基因的增加   显著性   处理
  1   16.15％   P＝0.1   低氮
  2   6.15％   1标准误差   低氮
  3   6.15％   1标准误差   低氮
  4   3.08％   低氮
  5   7.69％   P＝0.1   低氮
  6   2.31％   低氮
  7   7.69％   P＝0.1   低氮
  1   7.53％   P＝0.1   标准氮
  2   7.65％   P＝0.1   标准氮
  3   8.82％   P＝0.1   标准氮
  4   12.35％   P＝0.1   标准氮
  5   4.71％   标准氮
  6   7.53％   1标准误差   标准氮
实施例24
全基因组关联作图分析
可使用关联作图方法来鉴定与玉米根构造改变有关的标记。在该关联分析中，能够通过对几千个基因(基因位点)进行DNA测序分析玉米品系的集合。所述品系能够包括优良种质、可商购获得的栽培变种、以及其它公开的品种。
将获得对根构造改变或至少一种农学特性改变的表型评分。具有极端表型的品系将相对于全基因组关联测试(使用2×2相依表的Fisher精确检验)中的基因型进行测试。将使用基于结构的关联分析，其中使用标记数据控制群体结构。将使用基于模型的集分析软件，Structure，该软件由Pritchard等人开发，(Genetics 155：945-959(2000))，同时使用几百个标记的数百个玉米优良自交系的单倍型数据评价混合系数并且将自交系分配成许多亚群。这降低了假阳性的发生概率，假阳性可能由对关联作图统计的群体结构效应引发。使用Kuiper统计测试两个分配是否相同，并且测试给定标记与在给定亚群中的单倍型和表型之间的关联(Press等人，Numerical Recipes in C，第二版，Cambridge University Press，NY(2002))。
在至少一个亚群中的至少一个强峰值指示显著标记-性状关联(例如p＜0.001)。cM中给出了标记位点，零点是染色体起始处的第一个(距着丝点最远端)已知标记。这些图谱位点不是绝对的，而是提供基于内源遗传图谱的图谱位点预测。
实施例25
候选基因关联作图
设计引物以扩增来自单个自交系的一部分候选基因位点。获取该位点上的每个自交系的基因型，并且测试多态基因座与根构造改变或至少一种农学特性改变相关的统计意义上的显著性。
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Company andPioneer Hi-Bred International
<120>具有改变的根构造的植物、涉及编码EXOSTOSIN家族多肽及其同源物的基因的相关的构建体和方法
<130>BB1572
<140>60/984028
<141>2007-10-31
<160>48
<170>专利版本3.4
<210>1
<211>18491
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体
<400>1
catgaatcaa acaaacatac acagcgactt attcacacga gctcaaatta caacggtata  60
tatcctgccg tcgacaacca tggtctagac aggatccccg ggtaccgagc tcgaatttgc  120
aggtcgactg cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac atcaatccac ttgctttgaa  180
gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg  240
ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat  300
ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa  360
tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat tgccctttgg  420
tcttctgaga ctgttgcgtc atcccttacg tcagtggaga tatcacatca atccacttgc  480
tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca  540
tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga  600
tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct  660
gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcagttaac  720
ccgcgatcct gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga  780
agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt  840
gggaccactg tcggcagagg catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca  900
tttgtaggtg ccaccttcct tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca  960
atggaatccg aggaggtttc ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa ttgccctttg    1020
gtcttctgag actgttgcgt catcccttac gtcagtggag atatcacatc aatccacttg    1080
ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc    1140
atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg    1200
atggcatttg taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc    1260
tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcagttaa    1320
cccgcaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc    1380
aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc    1440
gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggatc gatccgtcga    1500
tcgaccaaag cggccatcgt gcctccccac tcctgcagtt cgggggcatg gatgcgcgga    1560
tagccgctgc tggtttcctg gatgccgacg gatttgcact gccggtagaa ctccgcgagg    1620
tcgtccagcc tcaggcagca gctgaaccaa ctcgcgaggg gatcgagccc ctgctgagcc    1680
tcgacatgtt gtcgcaaaat tcgccctgga cccgcccaac gatttgtcgt cactgtcaag    1740
gtttgacctg cacttcattt ggggcccaca tacaccaaaa aaatgctgca taattctcgg    1800
ggcagcaagt cggttacccg gccgccgtgc tggaccgggt tgaatggtgc ccgtaacttt    1860
cggtagagcg gacggccaat actcaacttc aaggaatctc acccatgcgc gccggcgggg    1920
aaccggagtt cccttcagtg aacgttatta gttcgccgct cggtgtgtcg tagatactag    1980
cccctggggc cttttgaaat ttgaataaga tttatgtaat cagtctttta ggtttgaccg    2040
gttctgccgc tttttttaaa attggatttg taataataaa acgcaattgt ttgttattgt    2100
ggcgctctat catagatgtc gctataaacc tattcagcac aatatattgt tttcatttta    2160
atattgtaca tataagtagt agggtacaat cagtaaattg aacggagaat attattcata    2220
aaaatacgat agtaacgggt gatatattca ttagaatgaa ccgaaaccgg cggtaaggat    2280
ctgagctaca catgctcagg ttttttacaa cgtgcacaac agaattgaaa gcaaatatca    2340
tgcgatcata ggcgtctcgc atatctcatt aaagcagggg gtgggcgaag aactccagca    2400
tgagatcccc gcgctggagg atcatccagc cggcgtcccg gaaaacgatt ccgaagccca    2460
acctttcata gaaggcggcg gtggaatcga aatctcgtga tggcaggttg ggcgtcgctt    2520
ggtcggtcat ttcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa    2580
ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca    2640
ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc    2700
cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat    2760
attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgccccc    2820
caattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact    2880
taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac    2940
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt    3000
tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg    3060
ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg    3120
acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg    3180
catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat    3240
acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac    3300
ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat    3360
gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag    3420
tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc    3480
tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc    3540
acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc    3600
cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc    3660
ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt    3720
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt    3780
atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat    3840
cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct    3900
tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat    3960
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc    4020
ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg    4080
ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc    4140
tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta    4200
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc    4260
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga    4320
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat    4380
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat    4440
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa    4500
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa    4560
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt    4620
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt    4680
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata    4740
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt    4800
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac    4860
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga    4920
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg    4980
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa    5040
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat    5100
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc    5160
tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga    5220
agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg    5280
gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta    5340
gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg    5400
aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct    5460
ttctaggggg ggggtaccga tctgagatcg gtaacgaaaa cgaacgggta gggatgaaaa    5520
cggtcggtaa cggtcggtaa aatacctcta ccgttttcat tttcatattt aacttgcggg    5580
acggaaacga aaacgggata taccggtaac gaaaacgaac gggataaata cggtaatcga    5640
aaaccgatac gatccggtcg ggttaaagtc gaaatcggac gggaaccggt atttttgttc    5700
ggtaaaatca cacatgaaaa catatattca aaacttaaaa acaaatataa aaaattgtaa    5760
acacaagtct taatgatcac tagtggcgcg cctaggagat ctcgagtagg gataacaggg    5820
taatacatag ataaaatcca tataaatctg gagcacacat agtttaatgt agcacataag    5880
tgataagtct tgggctcttg gctaacataa gaagccatat aagtctacta gcacacatga    5940
cacaatataa agtttaaaac acatattcat aatcacttgc tcacatctgg atcacttagc    6000
atgctacagc tagtgcaata ttagacactt tccaatattt ctcaaacttt tcactcattg    6060
caacggccat tctcctaatg acaaattttt catgaacaca ccattggtca atcaaatcct    6120
ttatctcaca gaaacctttg taaaataaat ttgcagtgga atattgagta ccagatagga    6180
gttcagtgag atcaaaaaac ttcttcaaac acttaaaaag agttaatgcc atcttccact    6240
cctcggcttt aggacaaatt gcatcgtacc tacaataatt gacatttgat taattgagaa    6300
tttataatga tgacatgtac aacaattgag acaaacatac ctgcgaggat cacttgtttt    6360
aagccgtgtt agtgcaggct tataatataa ggcatccctc aacatcaaat aggttgaatt    6420
ccatctagtt gagacatcat atgagatccc tttagattta tccaagtcac attcactagc    6480
acacttcatt agttcttccc actgcaaagg agaagatttt acagcaagaa caatcgcttt    6540
gattttctca attgttcctg caattacagc caagccatcc tttgcaacca agttcagtat    6600
gtgacaagca cacctcacat gaaagaaagc accatcacaa actagatttg aatcagtgtc    6660
ctgcaaatcc tcaattatat cgtgcacagc tacttcattt gcactagcat tatccaaaga    6720
caaggcaaac aattttttct caatgttcca cttaaccatg attgcagtga aggtttgtga    6780
taacctttgg ccagtgtggc gcccttcaac atgaaaaaag ccaacaattc ttttttggag    6840
acaccaatca tcatcaatcc aatggatggt gacacacatg tatgacttat tttgacaaga    6900
tgtccacata tccatagttg tactgaagcg agactgaaca tcttttagtt ttccatacaa    6960
cttttctttt tcttccaaat acaaatccat gatatatttt ctagcagtga cacgggactt    7020
tattggaaag tgagggcgca gagacttaac aaactcaaca aagtactcat gttctacaat    7080
attgaaagga tattcatgca tgattattgc caaatgaagc ttctttaggc taaccacttc    7140
atcgtactta taaggctcaa tgagatttat gtctttgcca tgatcctttt cactttttag    7200
acacaactga cctttaacta aactatgtga tgttctcaag tgatttcgaa atccgcttgt    7260
tccatgatga ccctcagccc tatacttagc cttgcaatta ggaaagttgc aatgtcccca    7320
tacctgaacg tatttctttc catcgacctc cacttcaatt tccttcttgg tgaaatgctg    7380
ccatacatcc gatgtgcact tctttgccct cttctgtggt gcttcttctt cgggttcagg    7440
ttgtggctgt ggttgtggtt ctggttgtgg ttgtggttgt ggttgtggtt catgaacaat    7500
agccatatca tcttgactcg gatctgtagc tgtaccattt gcattactac tgcttacact    7560
ctgaataaaa tgcctctcgg cctcagctgt tgatgatgat ggtgatgtgc ggccacatcc    7620
atgcccacgc gcacgtgcac gtacattctg aatccgacta gaagaggctt cagcttttct    7680
tttcaaccct gttataaaca gatttttcgt attattctac agtcaatatg atgcttccca    7740
atctacaacc aattagtaat gctaatgcta ttgctactgt ttttctaata tataccttga    7800
gcatatgcag agaatacgga atttgttttg cgagtagaag gcgctcttgt ggtagacatc    7860
aacttggcca atcttatggc tgagcctgag ggaggattat ttccaaccgg aggcgtcatc    7920
tgaggaatgg agtcgtagcc ggctagccga agtggagagc agagccctgg acagcaggtg    7980
ttcagcaatc agcttggtgc tgtactgctg tgacttgtga gcacctggac ggctggacag    8040
caatcagcag gtgttgcaga gcccctggac agcacacaaa tgacacaaca gcttggtgca    8100
atggtgctga cgtgctgtac tgctaagtgc tgtgagcctg tgagcagccg tggagacagg    8160
gagaccgcgg atggccggat gggcgagcgc cgagcagtgg aggtctggag gaccgctgac    8220
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<210>6
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<220>
<223>载体
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gctcttcaac tggaagagcg gttacccgga ccgaagcttg catgcctgca g           49911
<210>7
<211>36909
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体
<400>7
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<210>9
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<212>DNA
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caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc  48780
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata  48840
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta  48900
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca  48960
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga  49020
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg  49080
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg  49140
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg  49200
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag  49260
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa  49320
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat  49380
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc  49440
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc  49500
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc  49560
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc  49620
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc  49680
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt  49740
gcgcaacgtt gttgccattg ctgca                                        49765
<210>14
<211>1670
<212>DNA
<213>玉米
<220>
<221>misc_feature
<222>(1660)..(1660)
<223>n是a，c，g，或t
<400>14
atggcgcccc gcggccgcac cctcctcccg ctcgccgcgg ccaccgtcct cgtcgcttcc    60
accatcttcc tcttcgccgc cgccggtgcg cgctggcggc ccgccgacac cgacctcccc    120
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aacgccaccg ccggcaagga gctctccttt ctcgacgaga acggccgccc cgatgacccc    240
tcctccgcct cagcatccag ctccacctcc ggcgccaccc cggccgctgg tgtcgtcaga    300
tgtgaccccc gcgacgccgt cagggtattc atgtacgaca tgccgcccga gttccacttc    360
ggcctcctcg gctggtcgcc gccgtcccct gactccgtct ggccagacgt caccgccgcc    420
tccccgccgc cgcgctaccc cggggggctc aaccagcagc acagcgtgga gtactggctc    480
acgctcgacc tcctctcctc ctcgcccccc tgcggccgtc actccgcagt gcgggtctcc    540
gattcccgcg atgccgacct cgtcttcgtc cccttcttcg cgtccctcag ctacaaycgc    600
cactaccggc ccgtgccgcc cgagaagggc agcagggaca gggccatcca ggagaagctg    660
gtgcgggacc tcgcggcgcg gccggagtgg aggaggtacg gtggtgccga ccacgtcatc    720
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gtgctgtcag acttcgggag gtacccaccg agggtggcca gcttggagaa ggatgtcatt    840
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ccgaccctgt tatacttccg gggagcaatt tacaggaagg agggagggag cattcgacag    960
gagctatatt atatgctsaa agaagaaaag gatgtttact tttcctttgg aagtgtccag    1020
gaccatgggg ccagcaaagc tagccaagga atgcactcat caaaattttg cctaaatatt    1080
gctggggaca ccccttcttc caatcgtctg tttgatgcga tagttaccca ctgtgtccct    1140
gttatcatca gtgacgacat tgagctacct tatgaggatg tgttggatta ttcaaaattc    1200
tccatctttg tccgttcgtc tgatgctgtt aagaaaggtt acctgatgag actgctcagt    1260
ggtgtaagca agcaacaatg gacaaagatg tgggataggc tcaaagaggt ggataaacat    1320
tttgagtatc agtatccatc acagaaggat gatgcagtcc agatgatctg gcaagcattg    1380
tctagaaagg tgccatcaat taagctgaag gttcacagat ctaatagatt ttcaagatct    1440
aacagaggaa aataaacaga aaggggtgtg tctatcttgt ctctattggc taatctaatg    1500
taacacattt cactgacaca ggctctcagc ctttcccagt tgcacaaaat agatagattg    1560
taatactcag gttatcttta ggaaaggttt gtaccttaag atttgttggt tcagttgaag    1620
catatactgt caagtcaaag gttgttttgt aaggtatgtn aaatgtaatc               1670
<210>15
<211>484
<212>PRT
<213>玉米
<400>15
Met Ala Pro Arg Gly Arg Thr Leu Leu Pro Leu Ala Ala Ala Thr Val
1               5                   10                  15
Leu Val Ala Ser Thr Ile Phe Leu Phe Ala Ala Ala Gly Ala Arg Trp
            20                  25                  30
Arg Pro Ala Asp Thr Asp Leu Pro Val Pro Pro His Ala Phe Pro Thr
        35                  40                  45
Ala Val Pro Ala Ala Val Thr Ala Ser Ser Tyr Ser Asn Ala Thr Ala
    50                  55                  60
Gly Lys Glu Leu Ser Phe Leu Asp Glu Asn Gly Arg Pro Asp Asp Pro
65                  70                  75                  80
Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ala Thr Pro Ala Ala
                85                  90                  95
Gly Val Val Arg Cys Asp Pro Arg Asp Ala Val Arg Val Phe Met Tyr
            100                 105                 110
Asp Met Pro Pro Glu Phe His Phe Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Pro
        115                 120                 125
Ser Pro Asp Ser Val Trp Pro Asp Val Thr Ala Ala Ser Pro Pro Pro
    130                 135                 140
Arg Tyr Pro Gly Gly Leu Asn Gln Gln His Ser Val Glu Tyr Trp Leu
145                 150                 155                 160
Thr Leu Asp Leu Leu Ser Ser Ser Pro Pro Cys Gly Arg His Ser Ala
                165                 170                 175
Val Arg Val Ser Asp Ser Arg Asp Ala Asp Leu Val Phe Val Pro Phe
            180                 185                 190
Phe Ala Ser Leu Ser Tyr Asn Arg His Tyr Arg Pro Val Pro Pro Glu
        195                 200                 205
Lys Gly Ser Arg Asp Arg Ala Ile Gln Glu Lys Leu Val Arg Asp Leu
    210                 215                 220
Ala Ala Arg Pro Glu Trp Arg Arg Tyr Gly Gly Ala Asp His Val Ile
225                 230                 235                 240
Val Ala His His Pro Asn Ser Leu Leu His Ala Arg Ala Val Leu His
                245                 250                 255
Pro Ala Val Phe Val Leu Ser Asp Phe Gly Arg Tyr Pro Pro Arg Val
            260                 265                 270
Ala Ser Leu Glu Lys Asp Val Ile Ala Pro Tyr Lys His Met Ala Lys
        275                 280                 285
Thr Phe Val Asn Asp Ser Ala Gly Phe Asp Asp Arg Pro Thr Leu Leu
    290                 295                 300
Tyr Phe Arg Gly Ala Ile Tyr Arg Lys Glu Gly Gly Ser Ile Arg Gln
305                 310                 315                 320
Glu Leu Tyr Tyr Met Leu Lys Glu Glu Lys Asp Val Tyr Phe Ser Phe
                325                 330                 335
Gly Ser Val Gln Asp His Gly Ala Ser Lys Ala Ser Gln Gly Met His
            340                 345                 350
Ser Ser Lys Phe Cys Leu Asn Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn
        355                 360                 365
Arg Leu Phe Asp Ala Ile Val Thr His Cys Val Pro Val Ile Ile Ser
    370                 375                 380
Asp Asp Ile Glu Leu Pro Tyr Glu Asp Val Leu Asp Tyr Ser Lys Phe
385                 390                 395                 400
Ser Ile Phe Val Arg Ser Ser Asp Ala Val Lys Lys Gly Tyr Leu Met
                405                 410                 415
Arg Leu Leu Ser Gly Val Ser Lys Gln Gln Trp Thr Lys Met Trp Asp
            420                 425                 430
Arg Leu Lys Glu Val Asp Lys His Phe Glu Tyr Gln Tyr Pro Ser Gln
        435                 440                 445
Lys Asp Asp Ala Val Gln Met Ile Trp Gln Ala Leu Ser Arg Lys Val
    450                 455                 460
Pro Ser Ile Lys Leu Lys Val His Arg Ser Asn Arg Phe Ser Arg Ser
465                 470                 475                 480
Asn Arg Gly Lys
<210>16
<211>1776
<212>DNA
<213>玉米
<220>
<221>misc_feature
<222>(764)..(924)
<223>n是a，c，g，或t
<400>16
ccccctccca gctagccatg gccgcgcccc gctctggtcg ccgcccgcac tgccactgct    60
agccatggcc gccgccgccg cctgccggag cccgctggtc tggctcttcg cgctcgtcac    120
cgcactcttc ttcttctcct ggtacctcct cctcgactcc gccgcgggtc cagccgccgc    180
ccgccgcccc aaccagtggc tccgcctcgg cggcggcggg cggcgctccg gtcccggtag    240
gaaatgcgac cccgcggagg cgctgctgcg agtgttcatg tacgacctgc cccccgagtt    300
ccacttcgga ctgctcgact ggaagccccc cggcttcggc ggcggcgtgt ggcccgacat    360
cagggacggc gtgcctgact acccgggggg cctcaacctg cagcacagca tcgagtattg    420
gctcaccctc gacctcctgg cctccgagca gggcgcgccc acgccctgcg cagtggcgcg    480
ggtgcgccac gcggcggacg ccgacgtcgt cttcgtgccc ttcttcgcct cgctcagctt    540
caaccgccac tcccgggtgg taccgcccgc gcgggacagc gaggaccgcg cgctgcagcg    600
gaggctcctc gagttcctcg ccgcgcggcc cgagtggcgg aggactggcg ggcgggacca    660
cgtcgtgctc gcgcatcacc ccaacgggat gctcgacgcg cgctacaggt tctggccctg    720
cgtcttcgtg ctctgcgact tcgggaggta cccgcccagc gtcnnnnnnn nnnnnnnnnn    780
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    840
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    900
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngaaaga cgagaaagat gtgcatttct catttggaag  960
cgtagccggt aatgggatcg agcaagcaac acaagggatg cggtcatcca agttctgcct  1020
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tgttcccgtc acgatcagcg atgagattga gctcccgttt gaggatgtcc tcgactactc  1140
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gatcaaaggg atcagccgag aagagtggac acgcatgtgg aacaggctaa aggaagtgga  1260
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tcaggctcct tgattttgga ctagcaagct caggctttcg ccatgttttc aatctcgtag  1500
aatcaagagt tgatactgaa gaccaaatct taatcgcttg actgggggca gatgttagta  1560
tgttacagct gcagacatta gcggatagta aagttgaaac actttagcat agcagaatta  1620
catatccagt ggcacatcat tttcttcatt tttttttctt ttgcttgcga ttcatccaaa  1680
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ggcaatatag ttactgatca gttacagttg ctgggc                            1776
<210>17
<211>462
<212>PRT
<213>玉米
<220>
<221>misc_feature
<222>(234)..(287)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>17
Met Ala Ala Ala Ala Ala Cys Arg Ser Pro Leu Val Trp Leu Phe Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Ala Leu Phe Phe Phe Ser Trp Tyr Leu Leu Leu Asp Ser
            20                  25                  30
Ala Ala Gly Pro Ala Ala Ala Arg Arg Pro Asn Gln Trp Leu Arg Leu
        35                  40                  45
Gly Gly Gly Gly Arg Arg Ser Gly Pro Gly Arg Lys Cys Asp Pro Ala
    50                  55                  60
Glu Ala Leu Leu Arg Val Phe Met Tyr Asp Leu Pro Pro Glu Phe His
65                  70                  75                  80
Phe Gly Leu Leu Asp Trp Lys Pro Pro Gly Phe Gly Gly Gly Val Trp
                85                  90                  95
Pro Asp Ile Arg Asp Gly Val Pro Asp Tyr Pro Gly Gly Leu Asn Leu
            100                 105                 110
Gln His Ser Ile Glu Tyr Trp Leu Thr Leu Asp Leu Leu Ala Ser Glu
        115                 120                 125
Gln Gly Ala Pro Thr Pro Cys Ala Val Ala Arg Val Arg His Ala Ala
    130                 135                 140
Asp Ala Asp Val Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asn
145                 150                 155                 160
Arg His Ser Arg Val Val Pro Pro Ala Arg Asp Ser Glu Asp Arg Ala
                165                 170                 175
Leu Gln Arg Arg Leu Leu Glu Phe Leu Ala Ala Arg Pro Glu Trp Arg
            180                 185                 190
Arg Thr Gly Gly Arg Asp His Val Val Leu Ala His His Pro Asn Gly
        195                 200                 205
Met Leu Asp Ala Arg Tyr Arg Phe Trp Pro Cys Val Phe Val Leu Cys
    210                 215                 220
Asp Phe Gly Arg Tyr Pro Pro Ser Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
225                 230                 235                 240
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                245                 250                 255
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            260                 265                 270
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys
        275                 280                 285
Asp Glu Lys Asp Val His Phe Ser Phe Gly Ser Val Ala Gly Asn Gly
    290                 295                 300
Ile Glu Gln Ala Thr Gln Gly Met Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu Asn
305                 310                 315                 320
Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn Arg Leu Phe Asp Ser Ile Val
                325                 330                 335
Ser His Cys Val Pro Val Thr Ile Ser Asp Glu Ile Glu Leu Pro Phe
            340                 345                 350
Glu Asp Val Leu Asp Tyr Ser Lys Phe Ser Val Ile Val Arg Gly Ala
        355                 360                 365
Asp Ala Val Lys Lys Gly Phe Leu Met Asn Leu Ile Lys Gly Ile Ser
    370                 375                 380
Arg Glu Glu Trp Thr Arg Met Trp Asn Arg Leu Lys Glu Val Glu Lys
385                 390                 395                 400
His Phe Glu Tyr Gln Tyr Pro Ser Gln Thr Asp Asp Ala Val Gln Met
                405                 410                 415
Ile Trp Lys Ala Ile Ala Arg Lys Val Pro Ser Ile Arg Leu Lys Ile
            420                 425                 430
Asn Arg Leu Gln Arg Phe Ser Leu Phe Glu Thr Asn Arg Thr Asp Glu
        435                 440                 445
Thr Leu Pro Pro Ser Ser Ser Trp Leu Gln Asn Gln Ala Pro
    450                 455                 460
<210>18
<211>1174
<212>DNA
<213>玉米
<400>18
gcacgagtct tcgtgccctt cttctcctcg ctcagcttca acgtgcacgg tcgcaacatg  60
accgaccctg acaccgaggc cgaccgcctc ctgcaggttg aacttgtgga tattctctgg  120
aagtctaaat attggcaacg ttctgcgggc cgtgaccatg tcattcctat gcatcaccct  180
aatgctttca gattcctgcg agcaatggtg aatgcatcta ttcttatagt ttcagacttt  240
gggagataca caaaggaact ggcttccctg aggaaagatg ttgtggcacc atatgtgcat    300
gttgtgggtt ccttccttga tgacgatcca cctgatccat ttgaggctcg ccatacactg    360
cttttctttc gaggccgtac tgtcaggaaa gatgaaggga aaatccggtc aaaacttgag    420
aagatattaa aaggcaagga aggggtgcgc tttgaggata gcattgccac gggcgacggc    480
attaacatat ctacagaagg tatgcggtca tcaaagtttt gtctccaccc tgctggggac    540
actccttcct catgccgcct gtttgatgcc atagtcagtc attgtgttcc tgtgatagtc    600
agcagtcgaa tcgagctccc ttttgaagat gagattgatt acagtgagtt ctcccttttc    660
ttctccgttg aagaggctct aagacctgat tacttgctga acgagctcag acaggtcccc    720
aaaaggaagt gggttgatat gtggttgaag cttaagaatg tctcccatca ttatgaattc    780
cagtatcccc ccaggaaggg cgacgcggtg aacatgatat ggaggcaggt gaggcacaag    840
atccccgcag ttaaccttgc tattcacagg aacagaagac tgaaaattcc agactggtgg    900
ggataatgat tggtggtgaa tcgtgtacat attaccatat ccactgttag tcctggttat    960
tttcggtgcg ttatgatgga aacattgctc accgtccttt gtgaaccaaa gtgttcatct    1020
taagatccaa ggaccgagtc cacaactatt tgctgacagg aactgagatt atcacctctt    1080
ttttggtcga tttttgtgac ggcttcctat ttccccccct gatgctacaa aatagagggg    1140
acaaataaac ttacagtaac attatagagg agtc                                1174
<210>19
<211>282
<212>PRT
<213>玉米
<400>19
Met Thr Asp Pro Asp Thr Glu Ala Asp Arg Leu Leu Gln Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Val Asp Ile Leu Trp Lys Ser Lys Tyr Trp Gln Arg Ser Ala Gly Arg
            20                  25                  30
Asp His Val Ile Pro Met His His Pro Asn Ala Phe Arg Phe Leu Arg
        35                  40                  45
Ala Met Val Asn Ala Ser Ile Leu Ile Val Ser Asp Phe Gly Arg Tyr
    50                  55                  60
Thr Lys Glu Leu Ala Ser Leu Arg Lys Asp Val Val Ala Pro Tyr Val
65                  70                  75                  80
His Val Val Gly Ser Phe Leu Asp Asp Asp Pro Pro Asp Pro Phe Glu
                85                  90                  95
Ala Arg His Thr Leu Leu Phe Phe Arg Gly Arg Thr Val Arg Lys Asp
            100                 105                 110
Glu Gly Lys Ile Arg Ser Lys Leu Glu Lys Ile Leu Lys Gly Lys Glu
        115                 120                 125
Gly Val Arg Phe Glu Asp Ser Ile Ala Thr Gly Asp Gly Ile Asn Ile
    130                 135                 140
Ser Thr Glu Gly Met Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu His Pro Ala Gly
145                 150                 155                 160
Asp Thr Pro Ser Ser Cys Arg Leu Phe Asp Ala Ile Val Ser His Cys
                165                 170                 175
Val Pro Val Ile Val Ser Ser Arg Ile Glu Leu Pro Phe Glu Asp Glu
            180                 185                 190
Ile Asp Tyr Ser Glu Phe Ser Leu Phe Phe Ser Val Glu Glu Ala Leu
        195                 200                 205
Arg Pro Asp Tyr Leu Leu Asn Glu Leu Arg Gln Val Pro Lys Arg Lys
    210                 215                 220
Trp Val Asp Met Trp Leu Lys Leu Lys Asn Val Ser His His Tyr Glu
225                 230                 235                 240
Phe Gln Tyr Prc Pro Arg Lys Gly Asp Ala Val Asn Met Ile Trp Arg
                245                 250                 255
Gln Val Arg His Lys Ile Pro Ala Val Asn Leu Ala Ile His Arg Asn
            260                 265                 270
Arg Arg Leu Lys Ile Pro Asp Trp Trp Gly
        275                 280
<210>20
<211>1834
<212>DNA
<213>玉米
<400>20
ctccatagcg accaaccggc cgccgcgggt gaccaaccca gccgcgcttt cccccgtcag    60
atcccctcct agccagccat ggccgagccc cgttccgccc tccgcccgca ttgccactgt    120
tagtgccatg gccaccgcct gccggagccc gctcgtctgg ctcttcgcgc tcgccgccgc    180
gctattcttc ctctcctggt acctcctcct caactccgcc gcgggcccaa ccgccgcccg    240
ccgccccaac caggggctcc gcctcggcgg ccccggtagg aaatgcgacc ccgcggaggc    300
gctgctgcga gtgttcatgt acgacctgcc ccccgagttc cacttcggac tgctcgactg    360
gaagcccccg ggcttcggcg tcggcgtgtg gcccgacgtc agggacggcg tgccggacta    420
cccggggggg ctcaaccttc agcacagcat cgagtactgg ctcaccctcg acctcttggc    480
ctccgagcag ggcgcgccca cgccctgcgc agcggcgcgg gtgcgccacg cggcggacgc    540
cgacgtcgtc ttcgtgcctt tcttcgcctc gctcagcttc aaccgccact cccgggtggt    600
gccgcccgcg cggaacagcg aggaccgcgc gctgcaacgg aggctcctcg agttcctcgc    660
cgcgcggcct gagtggcgca ggaccggcgg gcgggaccac gtcgtgctcg cgcatcaccc    720
caacggtatg ctcgacgcgc gctacaggtt ctggccctgc gtcttcgtgc tctgcgactt    780
cgggaggtac ccgcccagcg tcgccaacct cgacaaggac atcatcgcgc cctatcggca    840
cctcgtcgcc aacttcgcta atgacaccgc cggatacgac gaccggccga cgctgctcta    900
cttccaaggc gccatctaca ggaaggatgg tggttccatt cggcaagaac tgtattacct    960
tctgaaagac gagaaagatg tgcatttctc atttggaagt gtagctggta atgggatcga    1020
gcaggcaaca caaggtatgc ggtcatccaa gttctgcctc aacattgcag gtgacactcc    1080
atcctccaac cgcctcttcg actccattgt cagtcactgt gttcccgtca tcatcagcga    1140
tgagattgag ctcccgtttg aggatgtcct cgactattca aagttcagcg tcatagtacg    1200
tggcgcagat gcagtcaaga aggggtttct aaagagcctg atcaaaggga tcagccaaga    1260
agagtggaca cgcatgtgga acaagctaaa ggaagtagaa aagcacttcg agtaccaata    1320
cccatctcag actgatgatg ccgtgcagat gatatggaag gctattgctc ggaaggtgcc    1380
ctctatccgt ctgaagatta acagactacg gagattttct cggtttgata ctaataggac    1440
agatgaaact ctacccagtc cttcttggct acagaatcag gcttcttgat ttttggacta    1500
gcaaactcca gctttcacca tgttttcaat cctgccgaaa caagagttga tactgaagac    1560
caaaccttaa tcgcatgact gggggcagat gttacagctg cagacattaa cggagagtaa    1620
agttgaaaca ctctagcata acagaattac atatccaatg gcacatcatt tttcttcatt    1680
tttcttactt aagattcatc caaaatgtcc ttggctgcag actaaggaca atgaattttg  1740
tatgaaaagc tgtacattct aggcggcaat ataattactg accagttaca gttgctgaaa  1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaag                              1834
<210>21
<211>453
<212>PRT
<213>玉米
<400>21
Met Ala Thr Ala Cys Arg Ser Pro Leu Vel Trp Leu Phe Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Phe Phe Leu Ser Trp Tyr Leu Leu Leu Asn Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Gly Pro Thr Ala Ala Arg Arg Pro Asn Gln Gly Leu Arg Leu Gly Gly
        35                  40                  45
Pro Gly Arg Lys Cys Asp Pro Ala Glu Ala Leu Leu Arg Val Phe Met
    50                  55                  60
Tyr Asp Leu Pro Pro Glu Phe His Phe Gly Leu Leu Asp Trp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Pro Gly Phe Gly Gly Gly Val Trp Pro Asp Val Arg Asp Gly Val Pro
                85                  90                  95
Asp Tyr Pro Gly Gly Leu Asn Leu Gln His Ser Ile Glu Tyr Trp Leu
            100                 105                 110
Thr Leu Asp Leu Leu Ala Ser Glu Gln Gly Ala Pro Thr Pro Cys Ala
        115                 120                 125
Ala Ala Arg Val Arg His Ala Ala Asp Ala Asp Val Val Phe Val Pro
    130                 135                 140
Phe Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asn Arg His Ser Arg Val Val Pro Pro
145                 150                 155                 160
Ala Arg Asn Ser Glu Asp Arg Ala Leu Gln Arg Arg Leu Leu Glu Phe
                165                 170                 175
Leu Ala Ala Arg Pro Glu Trp Arg Arg Thr Gly Gly Arg Asp His Val
            180                 185                 190
Val Leu Ala His His Pro Asn Gly Met Leu Asp Ala Arg Tyr Arg Phe
        195                 200                 205
Trp Pro Cys Val Phe Val Leu Cys Asp Phe Gly Arg Tyr Pro Pro Ser
    210                 215                 220
Val Ala Asn Leu Asp Lys Asp Ile Ile Ala Pro Tyr Arg His Leu Val
225                 230                 235                 240
Ala Asn Phe Ala Asn Asp Thr Ala Gly Tyr Asp Asp Arg Pro Thr Leu
                245                 250                 255
Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Tyr Arg Lys Asp Gly Gly Ser Ile Arg
            260                 265                 270
Gln Glu Leu Tyr Tyr Leu Leu Lys Asp Glu Lys Asp Val His Phe Ser
        275                 280                 285
Phe Gly Ser Val Ala Gly Asn Gly Ile Glu Gln Ala Thr Gln Gly Met
    290                 295                 300
Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu Asn Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser
305                 310                 315                 320
Asn Arg Leu Phe Asp Ser Ile Val Ser His Cys Val Pro Val Ile Ile
                325                 330                 335
Ser Asp Glu Ile Glu Leu Pro Phe Glu Asp Val Leu Asp Tyr Ser Lys
            340                 345                 350
Phe Ser Val Ile Val Arg Gly Ala Asp Ala Val Lys Lys Gly Phe Leu
        355                 360                 365
Lys Ser Leu Ile Lys Gly Ile Ser Gln Glu Glu Trp Thr Arg Met Trp
    370                 375                 380
Asn Lys Leu Lys Glu Val Glu Lys His Phe Glu Tyr Gln Tyr Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Thr Asp Asp Ala Val Gln Met Ile Trp Lys Ala Ile Ala Arg Lys
                405                 410                 415
Val Pro Ser Ile Arg Leu Lys Ile Asn Arg Leu Arg Arg Phe Ser Arg
            420                 425                 430
Phe Asp Thr Asn Arg Thr Asp Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Trp Leu
        435                 440                 445
Gln Asn Gln Ala Ser
    450
<210>22
<211>2080
<212>DNA
<213>水稻
<400>22
ggcatagcgg catgcatcgc agcataggcc ggtcaagaag acgatggccc tgacgaggcg  60
cctcctcatc gatctctcgt caagacgccg ccttttcaac gccggcaaat tctccaccac  120
gcacaagaag aaaccagtgc tccatgaagg gagggagcag gggtgttgtt gaaatggagc  180
agcagctcgt ttctttgatt tgatctttgg cagtaagtaa ttcggggttt gaatttatta  240
tttttgtttt gggcgaattt cattccagcg gtgagtttgg ctggattctt gcgctgctcg  300
cgcgcgctgg tgtcgtggat ggtggcggag aggaagatgc agccatcgcc ggcggcgccg  360
ccggcggcgg agcaccggag gcgggcgctg ctgcgctacg tggtgttcct cgcggtctcc  420
ctcctcgcct tctcctgctg ggctctcgtc agctcgcgga tcgacggcgc cgtcctcgcg  480
gcgaccgccg gcggcgagca tgacgaccac gatggcatta ttgttagaag cagcacccaa  540
gcggagatgc cagcgagagg cgggaacgcg acgtcgcgcg gcgccgtcga ggtgggtgtg  600
ggtactccgg cggcgatgat cacccggcag ccgtcgtcgg gagagacgac gacgacggcg  660
gcgttggcgg cgacgtgcga cgcggagagc gcgctgctga gggtgtacct ctacgacctc  720
ccgccggagt tccacttcgg catgctgggg tgggacggca aggcggccgg cgcggcgtgg  780
ccggacgtgg ccggcgaccc gcgcgccgtg ccgcgctacc cgggcggcct gaacctgcag  840
cacagcgtcg agtactggct caccctggac atcctctcct ccaccacctc cggcgaccac  900
cgccgccgcc gtccgtgcac cgccgtgagg gtgacgaacg cgagccttgc cgacgtgttc  960
ctggtgccgt tcttcgcgtc gctgagctac aaccggcagt cgaagtcgcc gcacggcggc  1020
catgggagtg gcggccggag cgacaggcag ctgcagggcg agctggtgag gtacctggcg  1080
aggcgggagg agtggcggcg gtggggcggc gcggaccacc tcgtcgtgcc gcaccacccg  1140
aacagcatga tggacgcccg gcggcggctc agcgccgcca tgttcgtcct ctccgacttc  1200
ggcaggtacc cgccggacgt cgccaacctg aggaaggacg tgatcgcgcc gtacaagcac  1260
gtcgtcccct ccctcggcga cggcgactcg ccggggttcg agcagcgccc cgtcctcgct  1320
tacttccagg gcgccattca taggaaaaat ggtggaaggg ttcgtcagag gctgtaccag  1380
ctgatcaagg acgagaagga cgtccacttc acctacggca gcgtccgtca gaacggcatc  1440
aggcgcgcca ccaaggggat ggcctcctcc aagttctgcc tcaacatcgc cggcgacacc  1500
ccctcctcca accgcctctt cgacgccatc gtcagccact gcgtccccgt gatcatcagc  1560
gacgacatcg agctcccctt cgaggacgtc ctcgactact ccgccttctg cgtgttcgtc  1620
cgcgcctccg acgccgtcaa gaggggcttc ctgctgcatc tcctcagggg gatctcccag  1680
gaagaatgga cggcaatgtg gaggaggctg aaggaggttg cacaccactt cgagtaccag  1740
tacccttcgc agcctggtga cgctgttcag atgatctggg gagctgtagc tcggaagatg  1800
catttggtga agctgcaact tcacaagcgt ggtagatatc agaggacatt ttctgaatca  1860
taaaaggtta gggtagcaaa gcatggagga gattcagagc tataggttgc agtttttgat  1920
caataatttt catgtggctg gtaaagttct atggtcattt tgcaatctaa gttgcaagga  1980
ctatgtgcag ccagtctttg tccaagaggt aattattaga cagttagtta taaattatat  2040
tattcttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                        2080
<210>23
<211>514
<212>PRT
<213>水稻
<400>23
Met Val Ala Glu Arg Lys Met Gln Pro Ser Pro Ala Ala Pro Pro Ala
1               5                   10                  15
Ala Glu His Arg Arg Arg Ala Leu Leu Arg Tyr Val Val Phe Leu Ala
            20                  25                  30
Val Ser Leu Leu Ala Phe Ser Cys Trp Ala Leu Val Ser Ser Arg Ile
        35                  40                  45
Asp Gly Ala Val Leu Ala Ala Thr Ala Gly Gly Glu His Asp Asp His
    50                  55                  60
Asp Gly Ile Ile Val Arg Ser Ser Thr Gln Ala Glu Met Pro Ala Arg
65                  70                  75                  80
Gly Gly Asn Ala Thr Ser Arg Gly Ala Val Glu Val Gly Val Gly Thr
                85                  90                  95
Pro Ala Ala Met Ile Thr Arg Gln Pro Ser Ser Gly Glu Thr Thr Thr
            100                 105                 110
Thr Ala Ala Leu Ala Ala Thr Cys Asp Ala Glu Ser Ala Leu Leu Arg
        115                 120                 125
Val Tyr Leu Tyr Asp Leu Pre Pre Glu Phe His Phe Gly Met Leu Gly
    130                 135                 140
Trp Asp Gly Lys Ala Ala Gly Ala Ala Trp Pro Asp Val Ala Gly Asp
145                 150                 155                 160
Pro Arg Ala Val Pro Arg Tyr Pro Gly Gly Leu Asn Leu Gln His Ser
                165                 170                 175
Val Glu Tyr Trp Leu Thr Leu Asp Ile Leu Ser Ser Thr Thr Ser Gly
            180                 185                 190
Asp His Arg Arg Arg Arg Pro Cys Thr Ala Val Arg Val Thr Asn Ala
        195                 200                 205
Ser Leu Ala Asp Val Phe Leu Val Pro Phe Phe Ala Ser Leu Ser Tyr
    210                 215                 220
Asn Arg Gln Ser Lys Ser Pro His Gly Gly His Gly Ser Gly Gly Arg
225                 230                 235                 240
Ser Asp Arg Gln Leu Gln Gly Glu Leu Val Arg Tyr Leu Ala Arg Arg
                245                 250                 255
Glu Glu Trp Arg Arg Trp Gly Gly Ala Asp His Leu Val Val Pro His
            260                 265                 270
His Pro Asn Ser Met Met Asp Ala Arg Arg Arg Leu Ser Ala Ala Met
        275                 280                 285
Phe Val Leu Ser Asp Phe Gly Arg Tyr Pro Pro Asp Val Ala Asn Leu
    290                 295                 300
Arg Lys Asp Val Ile Ala Pro Tyr Lys His Val Val Pro Ser Leu Gly
305                 310                 315                 320
Asp Gly Asp Ser Pro Gly Phe Glu Gln Arg Pro Val Leu Ala Tyr Phe
                325                 330                 335
Gln Gly Ala Ile His Arg Lys Asn Gly Gly Arg Val Arg Gln Arg Leu
            340                 345                 350
Tyr Gln Leu Ile Lys Asp Glu Lys Asp Val His Phe Thr Tyr Gly Ser
        355                 360                 365
Val Arg Gln Asn Gly Ile Arg Arg Ala Thr Lys Gly Met Ala Ser Ser
    370                 375                 380
Lys Phe Cys Leu Asn Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn Arg Leu
385                 390                 395                 400
Phe Asp Ala Ile Val Ser His Cys Val Pro Val Ile Ile Ser Asp Asp
                405                 410                 415
Ile Glu Leu Pro Phe Glu Asp Val Leu Asp Tyr Ser Ala Phe Cys Val
            420                 425                 430
Phe Val Arg Ala Ser Asp Ala Val Lys Arg Gly Phe Leu Leu His Leu
        435                 440                 445
Leu Arg Gly Ile Ser Gln Glu Glu Trp Thr Ala Met Trp Arg Arg Leu
    450                 455                 460
Lys Glu Val Ala His His Phe Glu Tyr Gln Tyr Pro Ser Gln Pro Gly
465                 470                 475                 480
Asp Ala Val Gln Met Ile Trp Gly Ala Val Ala Arg Lys Met His Leu
                485                 490                 495
Val Lys Leu Gln Leu His Lys Arg Gly Arg Tyr Gln Arg Thr Phe Ser
            500                 505                 510
Glu Ser
<210>24
<211>1802
<212>DNA
<213>玉米
<400>24
ccccctccca gctagccatg gccgcgcccc gctctggtcg ccgcccgcac tgccactgct  60
agccatggcc gccgccgccg cctgccggag cccgctggtc tggctcttcg cgctcgtcac  120
cgcactcttc ttcttctcct ggtacctcct cctcgactcc gccgcgggtc cagccgccgc  180
ccgccgcccc aaccagtggc tccgcctcgg cggcggcggg cggcgctccg gtcccggtag  240
gaaatgcgac cccgcggagg cgctgctgcg agtgttcatg tacgacctgc cccccgagtt  300
ccacttcgga ctgctcgact ggaagccccc cggcttcggc ggcggcgtgt ggcccgacat  360
cagggacggc gtgcctgact acccgggggg cctcaacctg cagcacagea tegagtattg  420
gctcaccctc gacctcctgg cctccgagca gggcgcgccc acgccctgcg cagtggcgcg  480
ggtgcgccac gcggcggacg ccgacgtcgt cttcgtgccc ttcttcgcct cgctcagctt  540
caaccgccac tcccgggtgg taccgcccgc gcgggacagc gaggaccgcg cgctgcagcg  600
gaggctcctc gagttcctcg ccgcgcggcc cgagtggcgg aggactggcg ggcgggacca  660
cgtcgtgctc gcgcatcacc ccaacgggat gctcgacgcg cgctacaggt tctggccctg  720
cgtcttcgtg ctctgcgact tcgggaggta cccgcccagc gtcgccaacc tcgacaagga  780
cgtcatcgcg ccctaccggc acctcgtcgc caacttcgct aatgacaccg ccggatacga  840
cgaccggccg acattgctct acttccaagg cgccatctac aggaaggacg gtggtttcat  900
ccggcaagaa ctgtattacc ttctgaaaga cgagaaagat gtgcatttct catttggaag  960
cgtagccggt aatgggatcg agcaagcaac acaagggatg cggtcatcca agttctgcct  1020
caacattgca ggtgacactc catcctccaa ccgcctcttt gactccatag tcagtcactg  1080
tgttcccgtc acgatcagcg atgagattga gctcccgttt gaggatgtcc tcgactactc  1140
gaagttcagt gtcatagtac gtggcgcaga cgcagtcaag aaggggtttc taatgaacct  1200
gatcaaaggg atcagccgag aagagtggac acgcatgtgg aacaggctaa aggaagtgga  1260
aaagcacttt gagtaccaat acccatctca gaccgatgat gccgtgcaga tgatatggaa  1320
ggccattgct cggaaggtgc cgtctatccg gctgaagatt aacagactgc aaagattttc  1380
tctgtttgag actaacagga cagatgagac tctaccccca tcttcttctt ggctacagaa  1440
tcaggctcct tgattttgga ctagcaagct caggctttcg ccatgttttc aatctcgtag  1500
aatcaagagt tgatactgaa gaccaaatct taatcgcttg actgggggca gatgttagta  1560
tgttacagct gcagacatta gcggatagta aagttgaaac actttagcat agcagaatta  1620
catatccagt ggcacatcat tttcttcatt ttttttttct tttgcttgcg attcatccaa  1680
agtgtcctcg gctgcagact aaggacaatg aattttgtat gtgaagctgt atattctagg  1740
cggcaatata gttactgatc agttacagtt gctgagcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  1800
aa                                                                 1802
<210>25
<211>462
<212>PRT
<213>玉米
<400>25
Met Ala Ala Ala Ala Ala Cys Arg Ser Pro Leu Val Trp Leu Phe Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Ala Leu Phe Phe Phe Ser Trp Tyr Leu Leu Leu Asp Ser
            20                  25                  30
Ala Ala Gly Pro Ala Ala Ala Arg Arg Pro Asn Gln Trp Leu Arg Leu
        35                  40                  45
Gly Gly Gly Gly Arg Arg Ser Gly Pro Gly Arg Lys Cys Asp Pro Ala
    50                  55                  60
Glu Ala Leu Leu Arg Val Phe Met Tyr Asp Leu Pro Pro Glu Phe His
65                  70                  75                  80
Phe Gly Leu Leu Asp Trp Lys Pro Pro Gly Phe Gly Gly Gly Val Trp
                85                  90                  95
Pro Asp Ile Arg Asp Gly Val Pro Asp Tyr Pro Gly Gly Leu Asn Leu
            100                 105                 110
Gln His Ser Ile Glu Tyr Trp Leu Thr Leu Asp Leu Leu Ala Ser Glu
        115                 120                 125
Gln Gly Ala Pro Thr Pro Cys Ala Val Ala Arg Val Arg His Ala Ala
    130                 135                 140
Asp Ala Asp Val Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asn
145                 150                 155                 160
Arg His Ser Arg Val Val Pro Pro Ala Arg Asp Ser Glu Asp Arg Ala
                165                 170                 175
Leu Gln Arg Arg Leu Leu Glu Phe Leu Ala Ala Arg Pro Glu Trp Arg
            180                 185                 190
Arg Thr Gly Gly Arg Asp His Val Val Leu Ala His His Pro Asn Gly
        195                 200                 205
Met Leu Asp Ala Arg Tyr Arg Phe Trp Pro Cys Val Phe Val Leu Cys
    210                 215                 220
Asp Phe Gly Arg Tyr Pre Pre Ser Val Ala Asn Leu Asp Lys Asp Val
225                 230                 235                 240
Ile Ala Pro Tyr Arg His Leu Val Ala Asn Phe Ala Asn Asp Thr Ala
                245                 250                 255
Gly Tyr Asp Asp Arg Pro Thr Leu Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Tyr
            260                 265                 270
Arg Lys Asp Gly Gly Phe Ile Arg Gln Glu Leu Tyr Tyr Leu Leu Lys
        275                 280                 285
Asp Glu Lys Asp Val His Phe Ser Phe Gly Ser Val Ala Gly Asn Gly
    290                 295                 300
Ile Glu Gln Ala Thr Gln Gly Met Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu Asn
305                 310                 315                 320
Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn Arg Leu Phe Asp Ser Ile Val
                325                 330                 335
Ser His Cys Val Pro Val Thr Ile Ser Asp Glu Ile Glu Leu Pro Phe
            340                 345                 350
Glu Asp Val Leu Asp Tyr Ser Lys Phe Ser Val Ile Val Arg Gly Ala
        355                 360                 365
Asp Ala Val Lys Lys Gly Phe Leu Met Asn Leu Ile Lys Gly Ile Ser
    370                 375                 380
Arg Glu Glu Trp Thr Arg Met Trp Asn Arg Leu Lys Glu Val Glu Lys
385                 390                 395                 400
His Phe Glu Tyr Gln Tyr Pro Ser Gln Thr Asp Asp Ala Val Gln Met
                405                 410                 415
Ile Trp Lys Ala Ile Ala Arg Lys Val Pro Ser Ile Arg Leu Lys Ile
            420                 425                 430
Asn Arg Leu Gln Arg Phe Ser Leu Phe Glu Thr Asn Arg Thr Asp Glu
        435                 440                 445
Thr Leu Pro Pro Ser Ser Ser Trp Leu Gln Asn Gln Ala Pro
    450                 455                 460
<210>26
<211>1674
<212>DNA
<213>玉米
<400>26
ctagcatctc ttttctcata tgcagtacca catatatttc gttttacctc tattgagtat    60
aaaatcttta aatcgtagag tcttctaccg taactctatt tccctattta ctattgtacg    120
acttttaaca actagcacta catcgtcgac aaaaggtata caccaaggga tttcccctct    180
acgccccctg tgaccttatt catcacaaag gcgaaaaggt aagtgcttaa agttgatctt    240
tgatgtagta ctgtcctaat tgtgaagttg tatatgtcca tattacttgt tcgaacacta    300
gtcacaacat tggtccttag gagtatcttc atgaaggtgc ctcaaaataa tgctcccaaa    360
attaaaatac tacaacataa agtgtttagg gtactaaaaa aacaaatcga actccaccag    420
ttaagcccta tatcatgtat tttagaaaat aaagtatatt attagaaaac aaaaggttca    480
gtatattgta gaaaaaatag gacactaatc tagggtgtag tatatctgga tcactttatt    540
gtctaaccta tgtttttttg ttaaaaaatt tataaaacag gattacctgt ttttatgagt    600
tgaacccaat atcttaaaac aacacaatga ttaaaggctt tattggagat attctaatga    660
gcccaatgta tttcattaaa atttatgttt gtccaaatcc atttcataac attttttggt    720
actttatcat aaaccttaat caaatcaata aaaacatgtg tagatcatcc ttttgttctc    780
tatactggtc tatcacttgt cttattaaaa atgactttca tggttgatct tttaggtatg    840
aaaccgattt ggttagaaga gatcctcgct attccattga gggagggagc attcgacagg    900
agctatatta tatgctcaaa gaagaaaagg atgtttactt ttcctttgga agtgtccagg    960
accatggggc cagcaaagct agccaaggaa tgcactcatc aaaattttgc ctaaatattg    1020
ctggggacac cccttcttcc aatcgtctgt ttgatgcgat agttacccac tgtgtccctg    1080
ttatcatcag tgacgacatt gagctacctt atgaggatgt gttggattat tcaaaattct  1140
ccatctttgt ccgttcgtct gatgctgtta agaaaggtta cctgatgaga ctgctcagtg  1200
gtgtaagcaa gcaacaatgg acaaagatgt gggaraggct caaagaggtg gataaacatt  1260
ttgagtatca gtatccatca cagaaggatg atgcagtcca gatgatctgg caagcattgt  1320
ctagaaaggt gccatcaatt aagctgaagg ttcacagatc taatagattt tcaagatcta  1380
acagaggaaa ataaacagaa aggggtgtgt ctatcttgtc tctattggct aatctaatgt  1440
aacacatttc actgacacag gctctcagcc tttcccagtt gcacaaaata gatagattgt  1500
aatactcagg ttatctttag gaaaggtttg taccttaaga tttgttggtt cagttgaagc  1560
atatactgtc aagtcaaagg ttgttttgta aggtatgtta aatgtaatca tgaaagaaag  1620
acttggtttt gctgtttcaa aaaaaaaaaa aasaaaasaa aaaaaaaaaa aaaa        1674
<210>27
<211>1674
<212>PRT
<213>玉米
<400>27
Cys Thr Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Thr Thr Thr Cys Thr
1               5                   10                  15
Cys Ala Thr Ala Thr Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Thr Thr Thr Cys Gly Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys
        35                  40                  45
Thr Cys Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala
    50                  55                  60
Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Cys Gly Thr Ala Gly Ala Gly
65                  70                  75                  80
Thr Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Gly Thr Ala Ala Cys Thr Cys
                85                  90                  95
Thr Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Ala Thr Thr Thr Ala Cys Thr
            100                 105                 110
Ala Thr Thr Gly Thr Ala Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala
        115                 120                 125
Cys Ala Ala Cys Thr Ala Gly Gys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys
    130                 135                 140
Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala
145                 150                 155                 160
Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys
                165                 170                 175
Cys Thr Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly
            180                 185                 190
Ala Cys Cys Thr Thr Ala Thr Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Ala
        195                 200                 205
Ala Gly Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ala Ala Gly Thr
    210                 215                 220
Gly Cys Thr Thr Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Thr Cys Thr Thr
225                 230                 235                 240
Thr Gly Ala Thr Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys
                245                 250                 255
Thr Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ala
            260                 265                 270
Thr Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Thr
        275                 280                 285
Gly Thr Thr Cys Gly Ala Ala Cys Ala Cys Thr Ala Gly Thr Cys Ala
    290                 295                 300
Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Ala Gly
305                 310                 315                 320
Gly Ala Gly Thr Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly
                325                 330                 335
Gly Thr Gly Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly
            340                 345                 350
Cys Thr Cys Cys Cys Ala Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Thr
        355                 360                 365
Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Gly Thr Gly
    370                 375                 380
Thr Thr Thr Ala Gly Gly Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala Ala Ala Ala
385                 390                 395                 400
Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Ala
                405                 410                 415
Cys Cys Ala Gly Thr Thr Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Ala Thr Ala
            420                 425                 430
Thr Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala
        435                 440                 445
Ala Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala
    450                 455                 460
Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala
465                 470                 475                 480
Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala
                485                 490                 495
Ala Thr Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Thr Ala Ala Thr Cys Thr Ala
            500                 505                 510
Gly Gly Gly Thr Gly Thr Ala Gly Thr Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly
        515                 520                 525
Gly Ala Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Ala Thr Thr Gly Thr Cys Thr
    530                 535                 540
Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly
545                 550                 555                 560
Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala
                565                 570                 575
Ala Cys Ala Gly Gly Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr
            580                 585                 590
Thr Thr Ala Thr Gly Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Ala
        595                 600                 605
Ala Thr Ala Thr Cys Thr Thr Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala
    610                 615                 620
Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr
625                 630                 635                 640
Thr Ala Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Cys Thr Ala
                645                 650                 655
Ala Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr
            660                 665                 670
Thr Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Ala Thr Gly Thr
        675                 680                 685
Thr Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr
    690                 695                 700
Cys Ala Thr Ala Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr
705                 710                 715                 720
Ala Cys Thr Thr Thr Ala Thr Cys Ala Thr Ala Ala Ala Cys Cys Thr
                725                 730                 735
Thr Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala
            740                 745                 750
Ala Ala Cys Ala Thr Gly Thr Gly Thr Ala Gly Ala Thr Cys Ala Thr
        755                 760                 765
Cys Cys Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Cys Thr Ala Thr Ala
    770                 775                 780
Cys Thr Gly Gly Thr Cys Thr Ala Thr Cys Ala Cys Thr Thr Gly Thr
785                 790                 795                 800
Cys Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Thr
                805                 810                 815
Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Ala Thr Cys Thr Thr Thr
            820                 825                 830
Thr Ala Gly Gly Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Gly Ala Thr
        835                 840                 845
Thr Thr Gly Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Cys
    850                 855                 860
Cys Thr Cys Gly Cys Thr Ala Thr Thr Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala
865                 870                 875                 880
Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ala Thr Thr Cys Gly Ala
                885                 890                 895
Cys Ala Gly Gly Ala Gly Cys Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr Ala
            900                 905                 910
Thr Gly Cys Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala
        915                 920                 925
Gly Gly Ala Thr Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Cys Cys
    930                 935                 940
Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Gly
945                 950                 955                 960
Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala
                965                 970                 975
Ala Gly Cys Thr Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly
            980                 985                 990
Cys Ala Cys Thr Cys Ala Thr Cys  Ala Ala Ala Ala Thr  Thr Thr Thr
        995                 1000                 1005
Gly Cys  Cys Thr Ala Ala Ala  Thr Ala Thr Thr Gly  Cys Thr Gly
    1010                 1015                 1020
Gly Gly  Gly Ala Cys Ala Cys  Cys Cys Cys Thr Thr  Cys Thr Thr
    1025                 1030                 1035
Cys Cys  Ala Ala Thr Cys Gly  Thr Cys Thr Gly Thr  Thr Thr Gly
    1040                 1045                 1050
Ala Thr  Gly Cys Gly Ala Thr  Ala Gly Thr Thr Ala  Cys Cys Cys
    1055                 1060                 1065
Ala Cys  Thr Gly Thr Gly Thr  Cys Cys Cys Thr Gly  Thr Thr Ala
    1070                 1075                 1080
Thr Cys  Ala Thr Cys Ala Gly  Thr Gly Ala Cys Gly  Ala Cys Ala
    1085                 1090                 1095
Thr Thr  Gly Ala Gly Cys Thr  Ala Cys Cys Thr Thr  Ala Thr Gly
    1100                 1105                 1110
Ala Gly  Gly Ala Thr Gly Thr  Gly Thr Thr Gly Gly  Ala Thr Thr
    1115                 1120                 1125
Ala Thr  Thr Cys Ala Ala Ala  Ala Thr Thr Cys Thr  Cys Cys Ala
    1130                 1135                 1140
Thr Cys  Thr Thr Thr Gly Thr  Cys Cys Gly Thr Thr  Cys Gly Thr
    1145                 1150                 1155
Cys Thr  Gly Ala Thr Gly Cys  Thr Gly Thr Thr Ala  Ala Gly Ala
    1160                 1165                 1170
Ala Ala  Gly Gly Thr Thr Ala  Cys Cys Thr Gly Ala  Thr Gly Ala
    1175                 1180                 1185
Gly Ala  Cys Thr Gly Cys Thr  Cys Ala Gly Thr Gly  Gly Thr Gly
    1190                 1195                 1200
Thr Ala  Ala Gly Cys Ala Ala  Gly Cys Ala Ala Cys  Ala Ala Thr
    1205                 1210                 1215
Gly Gly  Ala Cys Ala Ala Ala  Gly Ala Thr Gly Thr  Gly Gly Gly
    1220                 1225                 1230
Ala Thr  Ala Gly Gly Cys Thr  Cys Ala Ala Ala Gly  Ala Gly Gly
    1235                 1240                 1245
Thr Gly  Gly Ala Thr Ala Ala  Ala Cys Ala Thr Thr  Thr Thr Gly
    1250                 1255                 1260
Ala Gly  Thr Ala Thr Cys Ala  Gly Thr Ala Thr Cys  Cys Ala Thr
    1265                 1270                 1275
Cys Ala  Cys Ala Gly Ala Ala  Gly Gly Ala Thr Gly  Ala Thr Gly
    1280                 1285                 1290
Cys Ala  Gly Thr Cys Cys Ala  Gly Ala Thr Gly Ala  Thr Cys Thr
    1295                 1300                 1305
Gly Gly  Cys Ala Ala Gly Cys  Ala Thr Thr Gly Thr  Cys Thr Ala
    1310                 1315                 1320
Gly Ala  Ala Ala Gly Gly Thr  Gly Cys Cys Ala Thr  Cys Ala Ala
    1325                 1330                 1335
Thr Thr  Ala Ala Gly Cys Thr  Gly Ala Ala Gly Gly  Thr Thr Cys
    1340                 1345                 1350
Ala Cys  Ala Gly Ala Thr Cys  Thr Ala Ala Thr Ala  Gly Ala Thr
    1355                 1360                 1365
Thr Thr  Thr Cys Ala Ala Gly  Ala Thr Cys Thr Ala  Ala Cys Ala
    1370                 1375                 1380
Gly Ala  Gly Gly Ala Ala Ala  Ala Thr Ala Ala Ala  Cys Ala Gly
    1385                 1390                 1395
Ala Ala  Ala Gly Gly Gly Gly  Thr Gly Thr Gly Thr  Cys Thr Ala
    1400                 1405                 1410
Thr Cys  Thr Thr Gly Thr Cys  Thr Cys Thr Ala Thr  Thr Gly Gly
    1415                 1420                 1425
Cys Thr  Ala Ala Thr Cys Thr  Ala Ala Thr Gly Thr  Ala Ala Cys
    1430                 1435                 1440
Ala Cys  Ala Thr Thr Thr Cys  Ala Cys Thr Gly Ala  Cys Ala Cys
    1445                 1450                 1455
Ala Gly  Gly Cys Thr Cys Thr  Cys Ala Gly Cys Cys  Thr Thr Thr
    1460                 1465                 1470
Cys Cys  Cys Ala Gly Thr Thr  Gly Cys Ala Cys Ala  Ala Ala Ala
    1475                 1480                 1485
Thr Ala Gly Ala Thr Ala Gly Ala Thr Thr Gly Thr Ala Ala Thr
    1490                1495                1500
Ala Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Thr Thr Thr
    1505                1510                1515
Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr Gly Thr Ala Cys
    1520                1525                1530
Cys Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Gly Thr Thr Gly Gly
    1535                1540                1545
Thr Thr Cys Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Thr Ala
    1550                1555                1560
Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Ala
    1565                1570                1575
Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr Ala Ala Gly Gly
    1580                1585                1590
Thr Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ala Thr
    1595                1600                1605
Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Thr
    1610                1615                1620
Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys
    1625                1630                1635
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
    1640                1645                1650
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
    1655                1660                1665
Ala Ala Ala Ala Ala Ala
    1670
<210>28
<211>1893
<212>DNA
<213>裸麦
<400>28
caccagatcg acgattcgcc atgctccccc gtgcaccact ccggccatga gcctcgcgct    60
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<210>29
<211>480
<212>PRT
<213>裸麦
<400>29
Met Ala Pro Pro Arg Ala Arg Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Thr Val Leu Val Ala Ser Thr Ile Phe Leu Phe Ala Ala Ala Gly Ala
            20                  25                  30
Gly Arg Trp Arg Pro Ala Asp Thr Gly Leu Pro Val Pro Ala Thr Pro
        35                  40                  45
Ala Asp Phe Ser Ala Val Pro Ile Gly Val Ser Val Thr Ser Thr Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Glu Leu Ser Phe Leu Asp Glu Asn Gly Arg Pro Asp Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Ser Gly Ser Ala Ala Ala Ala Glu Pro Gly Arg Cys Asp Pro
                85                  90                  95
Arg Asp Ala Ala Val Arg Val Phe Val Tyr Asp Met Pro Pro Glu Phe
            100                 105                 110
His Phe Gly Leu Leu Gly Trp Ala Pro Pro Pro Gly Asn Gly Gly Gly
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Val Trp Pro Asp Val Arg Gly Gly Thr Val Pro Arg Tyr Pro Gly Gly
    130                 135                 140
Leu Asn Gln Gln His Ser Val Glu Tyr Trp Leu Thr Leu Asp Leu Leu
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Ala Ser Ser Ser Ala Ala Pro Cys Gly Pro Ala Val Arg Val Ala Asp
                165                 170                 175
Ser Arg Asp Ala Asp Leu Ile Phe Val Pro Phe Phe Ala Ser Leu Ser
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Tyr Asn Arg His Ser Lys Ala Val Pro Pro Glu Lys Val Ser Arg Asp
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Met Tyr Leu Gln Glu Lys Leu Val Arg Tyr Leu Val Ala Gln Pro Glu
    210                 215                 220
Trp Lys Arg Ser Gly Gly Ala Aap His Val Val Val Ala His His Pro
225                 230                 235                 240
Asn Ser Leu Leu His Ala Arg Ser Ala Leu Phe Pro Ala Val Phe Va1
                245                 250                 255
Leu Ser Asp Phe Gly Arg Tyr His Pro Arg Val Ala Ser Leu Glu Lys
            260                 265                 270
Asp Leu Ile Ala Pro Tyr Arg His Met Ala Lys Thr Phe Val Asn Asp
        275                 280                 285
Thr Ala Gly Phe Asp Asp Arg Pro Thr Leu Leu Tyr Phe Arg Gly Ala
    290                 295                 300
Ile Tyr Arg Lys Glu Gly Gly Asn Ile Arg Gln Glu Leu Tyr Asn Met
305                 310                 315                 320
Leu Lys Asp Glu Arg Asp Val Phe Phe Ser Phe Gly Ser Val Gln Asp
                325                 330                 335
His Gly Val Ser Lys Ala Ser Gln Gly Met His Ser Ser Lys Phe Cys
            340                 345                 350
Leu Asn Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn Arg Leu Phe Asp Ala
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Ile Val Ser His Cys Val Pro Val Ile Ile Ser Asp Asp Ile Glu Leu
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Pro Tyr Glu Asp Ile Leu Asp Tyr Ser Lys Phe Ser Ile Phe Val Arg
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Ser Ser Asp Ala Ile Lys Lys Gly Tyr Leu Met Arg Leu Ile Lys Gly
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Ile Asn Lys His Arg Trp Thr Arg Met Trp Lys Arg Leu Lys Glu Val
            420                 425                 430
Asp Lys His Phe Glu Tyr Gln Phe Pro Ser His Lys Asp Asp Ala Ala
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Gln Met Ile Trp Gln Ala Leu Ala Arg Lys Val Pro Ser Ile Arg Leu
    450                 455                 460
Lys Ala His Arg Phe Arg Arg Ser Ser Arg Ser Glu Arg Gly Asn Lys
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<210>30
<211>1869
<212>DNA
<213>玉米
<400>30
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aaaaaaaaa                                                            1869
<210>31
<211>511
<212>PRT
<213>玉米
<400>31
Met Val Val Val Glu Arg Lys Met Gln Pro Leu Pro Pro Pro Glu Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Val Val Arg Phe Val Val Phe Met Ala Val Ser Leu Leu Ala
            20                  25                  30
Leu Phe Cys Trp Ala Leu Val Asn Ser Arg Ile Asn Val Ala Met Pro
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Phe Val Met Arg Asp Val Asp Lys Thr Pro Ala Phe Thr
    50                  55                  60
Gly Leu Glu Asp Arg Gln Arg His Pro Ala Gly Asp Pro Ala Trp Thr
65                  70                  75                  80
Ser Ala Ala Pro Gln Ala Val Pro Val Thr Ser Asn Val Thr Ala Gly
                85                  90                  95
Ser Val Lys Leu Gly Asp Pro Val Leu Arg Glu Pro Leu Ala Gly Glu
            100                 105                 110
Ala Glu Arg Glu Arg Ser Glu Arg Cys Asp Ala Asp Ser Ala Ala Leu
        115                 120                 125
Arg Val Tyr Met Tyr Asp Leu Pro Ala Glu Phe His Phe Gly Met Leu
    130                 135                 140
Gly Trp Glu Arg Lys Gly Lys Leu Ala Trp Pro Asp Val Arg Asp Ala
145                 150                 155                 160
His Ala Ala Pro His Tyr Pro Gly Gly Leu Asn Leu Gln His Ser Val
                165                 170                 175
Ala Tyr Trp Leu Thr Leu Asp Ile Leu Ser Ser Ala Leu Pro Pro Gly
            180                 185                 190
Ser Asp Val Val Arg Asp Arg Pro Cys Val Ala Val Arg Val Thr Asn
        195                 200                 205
Ala Ser Leu Ala Asn Val Phe Phe Val Pro Phe Phe Ala Ser Leu Ser
    210                 215                 220
Tyr Asn Arg His Ser Lys Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Ser Arg Asn
225                 230                 235                 240
Arg Val Leu Gln Ala Glu Leu Val Lys Tyr Leu Met Arg Lys Glu Glu
                245                 250                 255
Trp Arg Arg Trp Gly Gly Lys Asn His Leu Ile Val Pro His His Pro
            260                 265                 270
Asn Ser Leu Met Glu Ala Arg Lys Lys Leu Ser Ala Ala Met Phe Val
        275                 280                 285
Leu Ser Asp Phe Gly Arg Tyr Ser Pro Asp Val Ala Asn Leu Lys Lys
    290                 295                 300
Asp Val Ile Ala Pro Tyr Lys His Val Leu Arg Ser Leu Gly Asp Gly
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Asp Ser Pro Ser Phe Glu Gln Arg Pro Ile Leu Ala Tyr Phe Gln Gly
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Ala Ile His Arg Lys Ala Gly Gly Lys Val Arg Gln Lys Leu Tyr His
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Leu Leu Lys Asp Glu Arg Asp Val His Phe Thr Tyr Gly Ser Val Arg
        355                 360                 365
Gln Asn Gly Ile Arg Arg Ala Thr Ala Gly Met Ser Thr Ser Lys Phe
    370                 375                 380
Cys Leu Asn Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn Arg Leu Phe Asp
385                 390                 395                 400
Ala Ile Val Ser His Cys Val Pro Val Ile Ile Ser Asp Asp Ile Glu
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Leu Pro Phe Glu Asp Met Leu Asp Tyr Ser Glu Phe Cys Val Phe Val
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Arg Ser Ala Asp Ala Ala Lys Lys Gly Phe Leu Leu Arg Leu Leu Arg
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Gly Ile Ser Arg Glu Glu Trp Thr Lys Met Trp Met Arg Leu Lys Lys
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Val Thr His His Phe Glu Tyr Gln Tyr Pro Ser Arg Ser Gly Asp Ala
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Val Gln Met Thr Trp Ser Ala Val Ala Arg Lys Met His Ser Val Gln
                485                 490                 495
Leu Gln Leu His Lys Arg Ala Arg Phe His Arg Thr Val Ser Val
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<210>32
<211>1744
<212>DNA
<213>拟南芥属
<400>32
cttcggcgtt ttcatcgttt ctcatctacc tcgaaatttt ctcgtcactc taatcaaaaa    60
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catcatcaag aactcaaaca gttctccaca aaacaacgca ccaaaacccc aaaacagaga    480
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gaaaccagag agaaacggtg tcgtttggcc tgatatcaga gtcaatgttc ctcaccatcc    720
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taaccaaaag cagaagaaga gccaggacaa agagttgcag gaaaatgtgg tgaaatacgt    960
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tccgaatagt atgtcgacgg caaggcataa gctatttccg gcgatgtttg tggtcgctga    1080
ctttggtaga tactcgccac atgttgccaa tgttgacaaa gacattgtgg ctccatacaa    1140
acaccttgtt ccatcgtatg ttaatgacac atcgggcttt gatggccgtc cgatcttgct    1200
ctacttccaa ggagccatct accgcaaagc tggtggattt gtgagacaag agctatataa    1260
tcttctcaaa gaagaaaaag acgtccactt ctctttcgga agcgtaagga accacggcat    1320
atctaaagcc ggcgaaggaa tgagatcgtc caagttctgt ctcaacatag ccggggatac    1380
accatcctcg aatcgcctct tcgacgccat agctagtcac tgtatacccg tgatcattag    1440
cgatgacatc gagttaccat atgaggatgt cctcaactac aatgagttct gtctctttgt    1500
cagatcatca gacgctttaa agaaagggtt tctgatgggt cttgtcagga gtattggcag    1560
agaagagtat aataagatgt ggcttcggtt gaaggaagtg gagaggtatt tcgatttgcg    1620
ttttccggtg aaggatgacg agggagatta tgcagttcag atgatttgga aagctgttgc    1680
caggaaagct cctttggtga agatgaaggt tcacagattt cagaggttta caaggccttt    1740
ttag                                                               1744
<210>33
<211>1500
<212>DNA
<213>拟南芥属
<400>33
atgggtgaga aaacaaactc acgttatctc ggtgtaatca tcactcgaaa atctataatt  60
ttcttgttca tatcaatcat caccgtcctt tcttggtttt ttatcttttc ttccacaaac  120
cctaaccgag ttctcgatca catctcagta tcagaatcca cagatgtacc tctcatcatc  180
atcaagaact caaacagttc tccacaaaac aacgcaccaa aaccccaaaa cagagaagga  240
gcagaaacag aggaacccat taaagaaaac agaggaggaa caaaaacaga gtcatccatg  300
aatcaaaaca gaggcgaaac cctccggtgt atccaaaggg tttctccttc tccaaggcca  360
ttgaaagtct acatgtatga tatgagtcca gagtttcatt ttgggttatt gggttggaaa  420
ccagagagaa acggtgtcgt ttggcctgat atcagagtca atgttcctca ccatccaggt  480
ggtcttaact tgcagcacag tgttgagtat tggctcacat tagatctttt gttctctgag  540
cttccagaag attctagaag ctctcgggcc gcgatacgtg taaagaactc gagcgaagct  600
gatgtcgtgt tcgtgccctt cttctcttca ttgagctata accgattctc taaggttaac  660
caaaagcaga agaagagcca ggacaaagag ttgcaggaaa atgtggtgaa atacgtaacg  720
tcccaaaaag agtggaagac ctcaggaggg aaggatcatg tgatcatggc gcatcatccg  780
aatagtatgt cgacggcaag gcataagcta tttccggcga tgtttgtggt cgctgacttt  840
ggtagatact cgccacatgt tgccaatgtt gacaaagaca ttgtggctcc atacaaacac  900
cttgttccat cgtatgttaa tgacacatcg ggctttgatg gccgtccgat cttgctctac  960
ttccaaggag ccatctaccg caaagctggt ggatttgtga gacaagagct atataatctt  1020
ctcaaagaag aaaaagacgt ccacttctct ttcggaagcg taaggaacca cggcatatct  1080
aaagccggcg aaggaatgag atcgtccaag ttctgtctca acatagccgg ggatacacca  1140
tcctcgaatc gcctcttcga cgccatagct agtcactgta tacccgtgat cattagcgat  1200
gacatcgagt taccatatga ggatgtcctc aactacaatg agttctgtct ctttgtcaga  1260
tcatcagacg ctttaaagaa agggtttctg atgggtcttg tcaggagtat tggcagagaa  1320
gagtataata agatgtggct tcggttgaag gaagtggaga ggtatttcga tttgcgtttt  1380
ccggtgaagg atgacgaggg agattatgca gttcagatga tttggaaagc tgttgccagg  1440
aaagctcctt tggtgaagat gaaggttcac agatttcaga ggtttacaag gcctttttag  1500
<210>34
<211>499
<212>PRT
<213>拟南芥属
<400>34
Met Gly Glu Lys Thr Asn Ser Arg Tyr Leu Gly Val Ile Ile Thr Arg
1               5                   10                  15
Lys Ser Ile Ile Phe Leu Phe Ile Ser Ile Ile Thr Val Leu Ser Trp
            20                  25                  30
Phe Phe Ile Phe Ser Ser Thr Asn Pro Asn Arg Val Leu Asp His Ile
        35                  40                  45
Ser Val Ser Glu Ser Thr Asp Val Pro Leu Ile Ile Ile Lys Asn Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Ser Pro Gln Asn Asn Ala Pro Lys Pro Gln Asn Arg Glu Gly
65                  70                  75                  80
Ala Glu Thr Glu Glu Pro Ile Lys Glu Asn Arg Gly Gly Thr Lys Thr
                85                  90                  95
Glu Ser Ser Met Asn Gln Asn Arg Gly Glu Thr Leu Arg Cys Ile Gln
            100                 105                 110
Arg Val Ser Pro Ser Pro Arg Pro Leu Lys Val Tyr Met Tyr Asp Met
        115                 120                 125
Ser Pro Glu Phe His Phe Gly Leu Leu Gly Trp Lys Pro Glu Arg Asn
    130                 135                 140
Gly Val Val Trp Pro Asp Ile Arg Val Asn Val Pro His His Pro Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Asn Leu Gln His Ser Val Glu Tyr Trp Leu Thr Leu Asp Leu
                165                 170                 175
Leu Phe Ser Glu Leu Pro Glu Asp Ser Arg Ser Ser Arg Ala Ala Ile
            180                 185                 190
Arg Val Lys Asn Ser Ser Glu Ala Asp Val Val Phe Val Pro Phe Phe
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Ser Tyr Asn Arg Phe Ser Lys Val Asn Gln Lys Gln Lys
    210                 215                 220
Lys Ser Gln Asp Lys Glu Leu Gln Glu Asn Val Val Lys Tyr Val Thr
225                 230                 235                 240
Ser Gln Lys Glu Trp Lys Thr Ser Gly Gly Lys Asp His Val Ile Met
                245                 250                 255
Ala His His Pro Asn Ser Met Ser Thr Ala Arg His Lys Leu Phe Pro
            260                 265                 270
Ala Met Phe Val Val Ala Asp Phe Gly Arg Tyr Ser Pro His Val Ala
        275                 280                 285
Asn Val Asp Lys Asp Ile Val Ala Pro Tyr Lys His Leu Val Pro Ser
    290                 295                 300
Tyr Val Asn Asp Thr Ser Gly Phe Asp Gly Arg Pro Ile Leu Leu Tyr
305                 310                 315                 320
Phe Gln Gly Ala Ile Tyr Arg Lys Ala Gly Gly Phe Val Arg Gln Glu
                325                 330                 335
Leu Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Glu Lys Asp Val His Phe Ser Phe Gly
            340                 345                 350
Ser Val Arg Asn His Gly Ile Ser Lys Ala Gly Glu Gly Met Arg Ser
        355                 360                 365
Ser Lys Phe Cys Leu Asn Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn Arg
    370                 375                 380
Leu Phe Asp Ala Ile Ala Ser His Cys Ile Pro Val Ile Ile Ser Asp
385                 390                 395                 400
Asp Ile Glu Leu Pro Tyr Glu Asp Val Leu Asn Tyr Asn Glu Phe Cys
                405                 410                 415
Leu Phe Val Arg Ser Ser Asp Ala Leu Lys Lys Gly Phe Leu Met Gly
            420                 425                 430
Leu Val Arg Ser Ile Gly Arg Glu Glu Tyr Asn Lys Met Trp Leu Arg
        435                 440                 445
Leu Lys Glu Val Glu Arg Tyr Phe Asp Leu Arg Phe Pro Val Lys Asp
    450                 455                 460
Asp Glu Gly Asp Tyr Ala Val Gln Met Ile Trp Lys Ala Val Ala Arg
465                 470                 475                 480
Lys Ala Pro Leu Val Lys Met Lys Val His Arg Phe Gln Arg Phe Thr
                485                 490                 495
Arg Pro Phe
<210>35
<211>566
<212>PRT
<213>水稻
<400>35
Met Ala Leu Thr Arg Arg Leu Leu Ile Asp Leu Ser Ser Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Leu Phe Asn Ala Gly Lys Phe Ser Thr Thr His Lys Lys Lys Pro Val
            20                  25                  30
Leu His Glu Ala Val Ser Leu Ala Gly Phe Leu Arg Cys Ser Arg Ala
        35                  40                  45
Leu Val Ser Trp Met Val Ala Glu Arg Lys Met Gln Pro Ser Pro Ala
    50                  55                  60
Ala Pro Pro Ala Ala Glu His Arg Arg Arg Ala Leu Leu Arg Tyr Val
65                  70                  75                  80
Val Phe Leu Ala Val Ser Leu Leu Ala Phe Ser Cys Trp Ala Leu Val
                85                  90                  95
Ser Ser Arg Ile Asp Gly Ala Val Leu Ala Ala Thr Ala Gly Gly Glu
            100                 105                 110
His Asp Asp His Asp Gly Ile Ile Val Arg Ser Ser Thr Gln Ala Glu
        115                 120                 125
Met Pro Ala Arg Gly Gly Asn Ala Thr Ser Arg Gly Ala Val Glu Val
    130                 135                 140
Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Met Ile Thr Arg Gln Pro Ser Ser Gly
145                 150                 155                 160
Glu Thr Thr Thr Thr Ala Ala Leu Ala Ala Thr Cys Asp Ala Glu Ser
                165                 170                 175
Ale Leu Leu Arg Val Tyr Leu Tyr Aap Leu Pro Pre Glu Phe His Phe
            180                 185                 190
Gly Met Leu Gly Trp Asp Gly Lys Ala Ala Gly Ala Ala Trp Pro Asp
        195                 200                 205
Val Ala Gly Asp Pro Arg Ala Val Pro Arg Tyr Pro Gly Gly Leu Asn
    210                 215                 220
Leu Gln His Ser Val Glu Tyr Trp Leu Thr Leu Asp Ile Leu Ser Ser
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Gly Asp His Arg Arg Arg Arg Pro Cys Thr Ala Val Arg
                245                 250                 255
Val Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Val Phe Leu Val Pro Phe Phe Ala
            260                 265                 270
Ser Leu Ser Tyr Asn Arg Gln Ser Lys Ser Pro His Gly Gly His Gly
        275                 280                 285
Ser Gly Gly Arg Ser Asp Arg Gln Leu Gln Gly Glu Leu Val Arg Tyr
    290                 295                 300
Leu Ala Arg Arg Glu Glu Trp Arg Arg Trp Gly Gly Ala Asp His Leu
305                 310                 315                 320
Val Val Pro His His Pro Asn Ser Met Met Asp Ala Arg Arg Arg Leu
                325                 330                 335
Ser Ala Ala Met Phe Val Leu Ser Asp Phe Gly Arg Tyr Pro Pro Asp
            340                 345                 350
Val Ala Asn Leu Arg Lys Asp Val Ile Ala Pro Tyr Lys His Val Val
        355                 360                 365
Pro Ser Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Phe Glu Gln Arg Pro Val
    370                 375                 380
Leu Ala Tyr Phe Gln Gly Ala Ile His Arg Lys Asn Gly Gly Arg Val
385                 390                 395                 400
Arg Gln Arg Leu Tyr Gln Leu Ile Lys Asp Glu Lys Asp Val His Phe
                405                 410                 415
Thr Tyr Gly Ser Val Arg Gln Asn Gly Ile Arg Arg Ala Thr Lys Gly
            420                 425                 430
Met Ala Ser Ser Lys Phe Cys Leu Asn Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser
        435                 440                 445
Ser Asn Arg Leu Phe Asp Ala Ile Val Ser His Cys Val Pro Val Ile
    450                 455                 460
Ile Ser Asp Asp Ile Glu Leu Pro Phe Glu Asp Val Leu Asp Tyr Ser
465                 470                 475                 480
Ala Phe Cys Val Phe Val Arg Ala Ser Asp Ala Val Lys Arg Gly Phe
                485                 490                 495
Leu Leu His Leu Leu Arg Gly Ile Ser Gln Glu Glu Trp Thr Ala Met
            500                 505                 510
Trp Arg Arg Leu Lys Glu Val Ala His His Phe Glu Tyr Gln Tyr Pro
        515                 520                 525
Ser Gln Pro Gly Asp Ala Val Gln Met Ile Trp Gly Ala Val Ala Arg
    530                 535                 540
Lys Met His Leu Val Lys Leu Gln Leu His Lys Arg Gly Arg Tyr Gln
545                 550                 555                 560
Arg Thr Phe Ser Glu Ser
                565
<210>36
<211>475
<212>PRT
<213>水稻
<400>36
Met Pro Pro Arg Ala Arg Thr Leu Leu Met Pro Leu Ala Ala Ala Thr
1               5                   10                  15
Leu Leu Val Ala Ser Thr Ile Phe Leu Phe Ala Ala Thr Gly Ala Arg
            20                  25                  30
Trp Arg Pro Ala Asp Thr Gly Leu Pro Val Pro Ala Ala Asp Phe Ser
        35                  40                  45
Ala Ala Val Leu Glu Ser Ala Val Thr Asp Thr Thr Ala Ala Ala Lys
    50                  55                  60
Glu Leu Ser Phe Val Asp Glu Asn Gly Arg Pro Asp Asp Pro Ala Ser
65                  70                  75                  80
Ser Ser Ala Ala Ala Ala Arg Cys Asp Pro Thr His Ala Ala Val Arg
                85                  90                  95
Val Phe Met Tyr Asp Leu Pro Pro Glu Phe His Phe Gly Ile Leu Gly
            100                 105                 110
Trp Ser Pro Pro Thr Asp Gly Ala Ala Asp Ala Ala Met Trp Pro Asp
        115                 120                 125
Val Gly Ser Gly Ala Ala Ala Pro Arg Tyr Pro Gly Gly Leu Asn Gln
    130                 135                 140
Gln His Ser Val Glu Tyr Trp Leu Thr Leu Asp Leu Leu Ser Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Pro Pro Cys Gly Ala Ala Val Arg Val Ala Asp Ser Arg Asp Ala
                165                 170                 175
Asp Val Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ser Leu Ser Tyr Asn Arg His
            180                 185                 190
Ser Arg Val Val Pro Pro Glu Lys Val Ser Arg Asp Lys Glu Leu Gln
        195                 200                 205
Glu Lys Leu Val Arg Tyr Leu Met Ala Gln Pro Glu Trp Lys Arg Ser
    210                 215                 220
Gly Gly Ala Asp His Val Ile Val Ala His His Pro Asn Ser Leu Leu
225                 230                 235                 240
His Ala Arg Ser Val Leu Phe Pro Val Val Phe Val Leu Ser Asp Phe
                245                 250                 255
Gly Arg Tyr His Pro Arg Val Ala Ser Leu Glu Lys Asp Val Ile Ala
            260                 265                 270
Pro Tyr Lys His Met Ala Lys Thr Phe Val Asn Asp Ser Ala Gly Phe
        275                 280                 285
Asp Asp Arg Pro Thr Leu Leu Tyr Phe Arg Gly Ala Ile Phe Arg Lys
    290                 295                 300
Glu Gly Gly Asn Ile Arg Gln Glu Leu Tyr Tyr Met Leu Lys Asp Glu
305                 310                 315                 320
Lys Asp Val Tyr Phe Ala Phe Gly Ser Val Gln Asp His Gly Ala Ser
                325                 330                 335
Lys Ala Ser Lys Gly Met His Ala Ser Lys Phe Cys Leu Asn Ile Ala
            340                 345                 350
Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn Arg Leu Phe Asp Ala Ile Val Ser His
        355                 360                 365
Cys Val Pro Val Ile Ile Ser Asp Asp Ile Glu Leu Pro Tyr Glu Asp
    370                 375                 380
Ala Leu Asp Tyr Ser Lys Phe Ser Ile Phe Val Arg Ser Ser Asp Ala
385                 390                 395                 400
Val Lys Lys Gly Tyr Leu Met Arg Leu Ile Arg Gly Val Ser Lys His
                405                 410                 415
Gln Trp Thr Arg Met Trp Asn Arg Leu Lys Glu Val Asp Lys His Phe
            420                 425                 430
Glu Tyr Gln Tyr Pro Ser Gln Lys Asp Asp Ala Val Gln Met Ile Trp
        435                 440                 445
Gln Ala Leu Ala Arg Lys Val Pro Ala Ile Arg Leu Lys Ser His Arg
    450                 455                 460
Ser Arg Arg Phe Ser Arg Tyr Asp Arg Gly Lys
465                 470                 475
<210>37
<211>468
<212>PRT
<213>水稻
<400>37
Met AIa Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Cys Arg Arg Arg Pro
1               5                   10                  15
Ile Ala Trp Phe Phe Ala Ile Ala Ala Leu Leu Phe Phe Phe Ser Trp
            20                  25                  30
Tyr Leu Leu Leu Asp Ser Ala Ala Val Thr Pro Glu Pro Leu Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Arg Gly Gln Gly Leu Arg Val Gly Ser Ser Gly Arg Lys Cys Asp
    50                  55                  60
Pro Ala Thr Ala Ala Leu Arg Val Phe Met Tyr Asp Leu Pro Ala Glu
65                  70                  75                  80
Phe His Phe Gly Leu Leu Asp Trp Glu Pro Gln Gly Gly Gly Gly Gly
                85                  90                  95
Gly Gly Gly Gly Val Trp Pro Asp Val Arg Gly Gly Gly Val Pro Glu
            100                 105                 110
Tyr Pro Gly Gly Leu Asn Leu Gln His Ser Ile Glu Tyr Trp Leu Thr
        115                 120                 125
Leu Asp Leu Leu Ala Ser Glu Gln Gly Ala Pro Thr Pro Cys Gly Ala
    130                 135                 140
Val Arg Val Arg His Ala Ala Ala Ala Asp Val Val Phe Val Pro Phe
145                 150                 155                 160
Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asn Arg His Ser Lys Val Val Pro Pro Ala
                165                 170                 175
Arg Ala Ser Glu Asp Arg Ala Leu Gln Arg Arg Leu Leu Asp Tyr Leu
            180                 185                 190
Ala Ala Arg Pro Glu Trp Arg Arg Ser Gly Gly Arg Asp His Val Val
        195                 200                 205
Leu Ala His His Pro Asn Gly Met Leu Asp Ala Arg Tyr Lys Leu Trp
    210                 215                 220
Pre Cys Val Phe Val Leu Cys Aap Phe Gly Arg Tyr Pro Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Ala Gly Leu Asp Lys Asp Val Ile Ala Pro Tyr Arg His Val Val Pro
                245                 250                 255
Asn Phe Ala Asn Asp Ser Ala Gly Tyr Asp Asp Arg Pro Thr Leu Leu
            260                 265                 270
Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Tyr Arg Lys Asp Gly Gly Phe Ile Arg Gln
        275                 280                 285
Glu Leu Tyr Tyr Leu Leu Lys Asp Glu Lys Asp Val His Phe Ser Phe
    290                 295                 300
Gly Ser Val Val Gly Asn Gly Ile Glu Gln Ala Thr Gln Gly Met Arg
305                 310                 315                 320
Ala Ser Lys Phe Cys Leu Asn Ile Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser Asn
                325                 330                 335
Arg Leu Phe Asp Ser Ile Val Ser His Cys Val Pro Ile Ile Ile Ser
            340                 345                 350
Asp Glu Ile Glu Leu Pro Phe Glu Asp Val Leu Asp Tyr Ser Lys Phe
        355                 360                 365
Cys Ile Ile Val Arg Gly Ala Asp Ala Val Lys Lys Gly Phe Leu Met
    370                 375                 380
Asn Leu Ile Asn Gly Ile Ser Arg Glu Asp Trp Thr Arg Met Trp Asn
385                 390                 395                 400
Arg Leu Lys Glu Val Glu Arg His Phe Glu Tyr Gln Tyr Pro Ser Gln
                405                 410                 415
Asn Asp Asp Ala Val Gln Met Ile Trp Lys Ala Ile Ala Arg Lys Ala
            420                 425                 430
Pro Ser Ile Arg Leu Lys Val Asn Arg Leu Arg Arg Phe Ser Arg Phe
        435                 440                 445
Glu Thr Asn Arg Thr Asp Glu Thr Pro Thr Arg Ser Ser Trp Leu Glu
    450                 455                 460
Asn Gln Pro Ser
465
<210>38
<211>437
<212>PRT
<213>水稻
<400>38
Met Ala Ser Pro Ser Ser Arg Ala Val Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Val Phe Ala Val Pro Thr Thr Phe Leu Tyr Leu Thr Ser
            20                  25                  30
Ala Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Leu Leu Leu Asn Leu Lys Pro Phe
        35                  40                  45
Gly Ala Arg Cys Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Leu Arg Val
    50                  55                  60
Phe Met Tyr Asp Leu Pro Arg Arg Phe His Val Gly Met Met Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ser Ala Ser Gly Phe Pro Ala Trp Pro Pro Ser Ala Gly Gly Ile Arg
                85                  90                  95
Arg Gln His Ser Val Glu Tyr Trp Met Met Ala Ser Leu Gln Gly Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Asn Gly Ser Ser Ser Glu Glu Gly Arg Glu Ala Val
        115                 120                 125
Arg Val Thr Asp Pro Asp Ala Ala Glu Ala Phe Phe Val Pro Phe Phe
    130                 135                 140
Ser Ser Leu Ser Phe Asn Val His Gly Arg Asn Met Thr Asp Pro Glu
145                 150                 155                 160
Thr Glu Ala Asp Arg Leu Leu Gln Val Glu Leu Met Glu Ile Leu Trp
                165                 170                 175
Lys Ser Lys Tyr Trp Gln Arg Ser Ala Gly Arg Asp His Val Ile Pro
            180                 185                 190
Met His His Pro Asn Ala Phe Arg Phe Leu Arg Asp Met Val Asn Ala
        195                 200                 205
Ser Ile Leu Ile Val Ala Asp Phe Gly Arg Tyr Thr Lys Glu Leu Ala
    210                 215                 220
Ser Leu Arg Lys Asp Val Val Ala Pro Tyr Val His Val Val Asp Ser
225                 230                 235                 240
Phe Leu Asn Asp Asp Pro Pro Asp Pro Phe Asp Asp Arg Pro Thr Leu
                245                 250                 255
Leu Phe Phe Arg Gly Arg Thr Val Arg Lys Asp Glu Gly Lys Ile Arg
            260                 265                 270
Ala Lys Leu Ala Lys Ile Leu Lys Gly Lys Asp Gly Val Arg Phe Glu
        275                 280                 285
Asp Ser Leu Ala Thr Gly Glu Gly Ile Lys Thr Ser Thr Glu Gly Met
    290                 295                 300
Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu His Pro Ala Gly Asp Thr Pro Ser Ser
305                 310                 315                 320
Cys Arg Leu Phe Asp Ala Ile Val Ser His Cys Val Pro Val Ile Val
                325                 330                 335
Ser Ser Arg Ile Glu Leu Pro Phe Glu Asp Glu Ile Asp Tyr Ser Glu
            340                 345                 350
Phe Ser Leu Phe Phe Ser Val Glu Glu Ala Leu Arg Pro Asp Tyr Leu
        355                 360                 365
Leu Asn Gln Leu Arg Gln Ile Gln Lys Thr Lys Trp Val Glu Ile Trp
    370                 375                 380
Ser Lys Leu Lys Asn Val Ser His His Tyr Glu Phe Gln Asn Pro Pro
385                 390                 395                 400
Arg Lys Gly Asp Ala Val Asn Met Ile Trp Arg Gln Val Lys His Lys
                405                 410                 415
Val Pro Ala Val Asn Leu Ala Ile His Arg Asn Arg Arg Leu Lys Ile
            420                 425                 430
Pro Asp Trp Trp Gly
        435
<210>39
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct    29
<210>40
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt    29
<210>41
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
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<210>42
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
ttaaaccact ttgtacaaga aagctgggtg cgtaatacga ctcactatag ggc    53
<210>43
<211>12856
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体
<400>43
cgccttggcg cgccgatcat ccacaagttt gtacaaaaaa gctgaacgag aaacgtaaaa  60
tgatataaat atcaatatat taaattagat tttgcataaa aaacagacta cataatactg  120
taaaacacaa catatccagt cactatggcg gccgcattag gcaccccagg ctttacactt  180
tatgcttccg gctcgtataa tgtgtggatt ttgagttagg atttaaatac gcgttgatcc  240
ggcttactaa aagccagata acagtatgcg tatttgcgcg ctgatttttg cggtataaga  300
atatatactg atatgtatac ccgaagtatg tcaaaaagag gtatgctatg aagcagcgta  360
ttacagtgac agttgacagc gacagctatc agttgctcaa ggcatatatg atgtcaatat  420
ctccggtctg gtaagcacaa ccatgcagaa tgaagcccgt cgtctgcgtg ccgaacgctg  480
gaaagcggaa aatcaggaag ggatggctga ggtcgcccgg tttattgaaa tgaacggctc  540
ttttgctgac gagaacaggg gctggtgaaa tgcagtttaa ggtttacacc tataaaagag  600
agagccgtta tcgtctgttt gtggatgtac agagtgatat cattgacacg cccggtcgac  660
ggatggtgat ccccctggcc agtgcacgtc tgctgtcaga taaagtctcc cgtgaacttt  720
acccggtggt gcatatcggg gatgaaagct ggcgcatgat gaccaccgat atggccagtg  780
tgccggtctc cgttatcggg gaagaagtgg ctgatctcag ccaccgcgaa aatgacatca  840
aaaacgccat taacctgatg ttctggggaa tataaatgtc aggctccctt atacacagcc  900
agtctgcagg tcgaccatag tgactggata tgttgtgttt tacagtatta tgtagtctgt  960
tttttatgca aaatctaatt taatatattg atatttatat cattttacgt ttctcgttca  1020
gctttcttgt acaaagtggt gttaacctag acttgtccat cttctggatt ggccaactta  1080
attaatgtat gaaataaaag gatgcacaca tagtgacatg ctaatcacta taatgtgggc    1140
atcaaagttg tgtgttatgt gtaattacta gttatctgaa taaaagagaa agagatcatc    1200
catatttctt atcctaaatg aatgtcacgt gtctttataa ttctttgatg aaccagatgc    1260
atttcattaa ccaaatccat atacatataa atattaatca tatataatta atatcaattg    1320
ggttagcaaa acaaatctag tctaggtgtg ttttgcgaat tgcggccgcc accgcggtgg    1380
agctcgaatt ccggtccggg tcacctttgt ccaccaagat ggaactgcgg ccgctcatta    1440
attaagtcag gcgcgcctct agttgaagac acgttcatgt cttcatcgta agaagacact    1500
cagtagtctt cggccagcct ggccatatgg attccgcggg cctagaaggc catttaaatc    1560
ctgaggatct ggtcttccta aggacccggg atatcggacc gattaaactt taattcggtc    1620
cgaagcttga agttcctatt ccgaagttcc tattctccag aaagtatagg aacttcgcat    1680
gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc    1740
taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc    1800
tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat    1860
aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt    1920
gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt    1980
ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta    2040
gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt    2100
ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga    2160
tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa    2220
aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc    2280
gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca    2340
gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt    2400
ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc    2460
acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat tcctttccca    2520
ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc tccacaccct    2580
ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct cccccaaatc    2640
cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc ccctctctac    2700
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatgca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt    2760
catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat    2820
gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat  2880
cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt  2940
tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc  3000
gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt  3060
cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat  3120
ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc  3180
gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt  3240
ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctcgatcg  3300
gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt  3360
gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta  3420
tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca  3480
tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt  3540
gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct  3600
gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt  3660
ttggtgttac ttctgcaggt cgactttaac ttagcctagg atccacacga caccatgata  3720
gaggtgaaac cgattaacgc agaggatacc tatgaactaa ggcatagaat actcagacca  3780
aaccagccga tagaagcgtg tatgtttgaa agcgatttac ttcgtggtgc atttcactta  3840
ggcggctatt acgggggcaa actgatttcc atagcttcat tccaccaggc cgagcactca  3900
gaactccaag gccagaaaca gtaccagctc cgaggtatgg ctaccttgga aggttatcgt  3960
gagcagaagg cgggatcgag tctaattaaa cacgctgaag aaattcttcg taagaggggg  4020
gcggacttgc tttggtgtaa tgcgcggaca tccgcctcag gctactacaa aaagttaggc  4080
ttcagcgagc agggagaggt attcgacacg ccgccagtag gacctcacat cctgatgtat  4140
aaaaggatca cataactagc tagtcagtta acctagactt gtccatcttc tggattggcc  4200
aacttaatta atgtatgaaa taaaaggatg cacacatagt gacatgctaa tcactataat  4260
gtgggcatca aagttgtgtg ttatgtgtaa ttactagtta tctgaataaa agagaaagag  4320
atcatccata tttcttatcc taaatgaatg tcacgtgtct ttataattct ttgatgaacc  4380
agatgcattt cattaaccaa atccatatac atataaatat taatcatata taattaatat  4440
caattgggtt agcaaaacaa atctagtcta ggtgtgtttt gcgaattcag agctcgaatt  4500
cattccgatt aatcgtggcc tcttgctctt caggatgaag agctatgttt aaacgtgcaa  4560
gcgctactag acaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat gtgttattaa gttgtctaag  4620
cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc agccaacagc tccccgaccg  4680
gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac aggcagccca tcagtccggg acggcgtcag  4740
cgggagagcc gttgtaaggc ggcagacttt gctcatgtta ccgatgctat tcggaagaac  4800
ggcaactaag ctgccgggtt tgaaacacgg atgatctcgc ggagggtagc atgttgattg  4860
taacgatgac agagcgttgc tgcctgtgat caaatatcat ctccctcgca gagatccgaa  4920
ttatcagcct tcttattcat ttctcgctta accgtgacag gctgtcgatc ttgagaacta  4980
tgccgacata ataggccate gctggctaaa gccgctgagg aagctgagtg gcgctatttc  5040
tttagaagtg aacgttgacg atcgtcgacc gtaccccgat gaattaattc ggacgtacgt  5100
tctgaacaca gctggatact tacttgggcg attgtcatac atgacatcaa caatgtaccc  5160
gtttgtgtaa ccgtctcttg gaggttcgta tgacactagt ggttcccctc agcttgcgac  5220
tagatgttga ggcctaacat tttattagag agcaggctag ttgcttagat acatgatctt  5280
caggccgtta tctgtcaggg caagcgaaaa ttggccattt atgacgacca atgccccgca  5340
gaagctccca tctttgccgc catagacgcc gcgcccccct tttggggtgt agaacatcct  5400
tttgccagat gtggaaaaga agttcgttgt cccattgttg gcaatgacgt agtagccggc  5460
gaaagtgcga gacccatttg cgctatatat aagcctacga tttccgttgc gactattgtc  5520
gtaattggat gaactattat cgtagttgct ctcagagttg tcgtaatttg atggactatt  5580
gtcgtaattg cttatggagt tgtcgtagtt gcttggagaa atgtcgtagt tggatgggga  5640
gtagtcatag ggaagacgag cttcatccac taaaacaatt ggcaggtcag caagtgcctg  5700
ccccgatgcc atcgcaagta cgaggcttag aaccaccttc aacagatcgc gcatagtctt  5760
ccccagctct ctaacgcttg agttaagccg cgccgcgaag cggcgtcggc ttgaacgaat  5820
tgttagacat tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt gaacaaattc  5880
ttccaactga tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttgt ccaagataag cctgcctagc  5940
ttcaagtatg acgggctgat actgggccgg caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac  6000
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taccaaggca acgctatgtt ctcttgcttt tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat  6240
cgtggctggc tcgaagatac ctgcaagaat gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag  6300
ttcgcgctta gctggataac gccacggaat gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc    6360
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caaagctcgc cgcgttgttt catcaagcct tacagtcacc gtaaccagca aatcaatatc    6480
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cgtgacaggt ttgcgaatcc gttgctgcca cttgttaacc cttttgccag atttggtaac    7320
tataatttat gttagaggcg aagtcttggg taaaaactgg cctaaaattg ctggggattt    7380
caggaaagta aacatcacct tccggctcga tgtctattgt agatatatgt agtgtatcta    7440
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cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt    7620
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ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag    8400
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg    8460
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatet ccagcagatc    8520
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt    8550
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt    8640
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca    8700
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg    8760
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac    8820
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg    8880
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc    8940
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg    9000
cagggggggg gggggggggg gacttccatt gttcattcca cggacaaaaa cagagaaagg    9060
aaacgacaga ggccaaaaag cctcgctttc agcacctgtc gtttcctttc ttttcagagg    9120
gtattttaaa taaaaacatt aagttatgac gaagaagaac ggaaacgcct taaaccggaa    9180
aattttcata aatagcgaaa acccgcgagg tcgccgcccc gtaacctgtc ggatcaccgg    9240
aaaggacccg taaagtgata atgattatca tctacatatc acaacgtgcg tggaggccat    9300
caaaccacgt caaataatca attatgacgc aggtatcgta ttaattgatc tgcatcaact    9360
taacgtaaaa acaacttcag acaatacaaa tcagcgacac tgaatacggg gcaacctcat    9420
gtcccccccc cccccccccc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct    9480
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa    9540
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta    9600
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc    9660
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg    9720
agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa    9780
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg    9840
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc    9900
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg    9960
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat    10020
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata    10080
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc    10140
atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattggtc    10200
gacgatettg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg  ccacgaccc ggattgaagg    10260
cgagatccag caactcgcgc cagatcatcc tgtgacggaa ctttggcgcg tgatgactgg    10320
ccaggacgtc ggccgaaaga gcgacaagca gatcacgctt ttcgacagcg tcggatttgc    10380
gatcgaggat ttttcggcgc tgcgctacgt ccgcgaccgc gttgagggat caagccacag    10440
cagcccactc gaccttctag ccgacccaga cgagccaagg gatctttttg gaatgctgct    10500
ccgtcgtcag gctttccgac gtttgggtgg ttgaacagaa gtcattatcg tacggaatgc    10560
caagcactcc cgaggggaac cctgtggttg gcatgcacat acaaatggac gaacggataa    10620
accttttcac gcccttttaa atatccgtta ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt    10680
acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc    10740
tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa    10800
gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgttgaa ggagccactc agcaagctgg    10860
tacgattgta atacgactca ctatagggcg aattgagcgc tgtttaaacg ctcttcaact    10920
ggaagagcgg ttacccggac cgaagcttga agttcctatt ccgaagttcc tattctctag    10980
aaagtatagg aacttcagat ctcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggt    11040
cgactctaga ggatccacca tgagcccaga acgacgcccg gccgacatcc gccgtgccac    11100
cgaggcggac atgccggcgg tctgcaccat cgtcaaccac tacatcgaga caagcacggt    11160
caacttccgt accgagccgc aggaaccgca ggactggacg gacgacctcg tccgtctgcg    11220
ggagcgctat ccctggctcg tcgccgaggt ggacggcgag gtcgccggca tcgcctacgc    11280
gggcccctgg aaggcacgca acgcctacga ctggacggcc gagtcgaccg tgtacgtctc    11340
cccccgccac cagcggacgg gactgggctc cacgctctac acccacctgc tgaagtccct    11400
ggaggcacag ggcttcaaga gcgtggtcgc tgtcatcggg ctgcccaacg acccgagcgt    11460
gcgcatgcac gaggcgctcg gatatgcccc ccgcggcatg ctgcgggcgg ccggcttcaa    11520
gcacgggaac tggcatgacg tgggtttctg gcagctggac ttcagcctgc cggtaccgcc  11580
ccgtccggtc ctgcccgtca ccgagatctg atccgtcgac caacctagac ttgtccatct  11640
tctggattgg ccaacttaat taatgtatga aataaaagga tgcacacata gtgacatgct  11700
aatcactata atgtgggcat caaagttgtg tgttatgtgt aattactagt tatctgaata  11760
aaagagaaag agatcatcca tatttcttat cctaaatgaa tgtcacgtgt ctttataatt  11820
ctttgatgaa ccagatgcat ttcattaacc aaatccatat acatataaat attaatcata  11880
tataattaat atcaattggg ttagcaaaac aaatctagtc taggtgtgtt ttgcgaattg  11940
cggccgcgct ctggggcctt cccatggaca ccggtaattc ccctgatctt ctctccttca  12000
tcaatggatg ccatgtttca taacaataac accaaatgtt tgatgagcta ccaacaattg  12060
cgcaaagact atggctaagc tcgagctcgc tcgctacaag ttgttgactt tcaaatacaa  12120
gtttgttttt ggaacaccaa atattctaca tgatctttca ctaagttgcg caccactatc  12180
aaaagattat ctaggccatt attcaagtaa agagtgaaca cgtctaagac ccacaaccac  12240
accaaataga atacgcatac atgcaacata ttgtgcaaga agtatccaac tggactccca  12300
tgtattctaa aactattttc gtagagttaa agttatgaca aacttatcaa ataaaaattt  12360
gaacgctgga ccaaaacttt catctttcaa atccaccatc gtctatcctc ataaattgtt  12420
ttgattataa cacatctacg taaatcattt gttttgaaca atactaattt aattttatta  12480
agtcaaataa cctgcttaga aaataatccc tccacctcat ttaacaattt cttgtcaaac  12540
acacaccaag aaaaaaatta atgaaagaga aaagaaatga aaaggacatg gagttgaata  12600
ctagcaaaat tgattgaagg aagattcaca attgaaattg aaaccattta atttattttc  12660
gggtccataa taataaattg gtaagaataa aaacccgatc aagtccggta cagtacaatt  12720
ccactccacc aactccttac ttaaacccct atttataccc actctcatcc tcactcttcc  12780
ttcacctctc acactctctt ctctctctca aaaccctcac acaaacgctg cgtttagtgt  12840
aagaaat tca atccgg                                                 12856
<210>44
<211>825
<212>DNA
<213>玉米
<400>44
aaatccttac agaattgctg tagtttcata gtgctagatg tggacagcaa agcgccgctg    60
tatgcttctg cttttctttt ttggtgtgtg tagccacatc ctttgttcct gcccggcgcc    120
atcccacttg gttgtttttt  tttatgattg aaagccttca tgcttcctcg gtcaatcacc   180
ggtgcgcact gggagcatcg ccggaaaaaa aattcttcgg ctaagagtaa cttctttctc  240
cttttcttct ctgatctcgc gagcagtgct gataacgtgt tgtaatctac ttagcggtaa  300
cgagattgag agagacaaaa tgacagaact attgtcttta ttgcagagtg tcatgtattt  360
atacagggga tacaaagtct cccaaggggt gtgtcccttg ggagtaactg ccagttgatc  420
acaggacaat attttgtaac aaaacgtaca catcgtcaaa atagcgaggc atgaaactgg  480
ccttggccat ggacgcgtga agcgcgccat gcgttggata tgtggtcaat aagtatatac  540
aatacaatgt ttaacagagc tgatagtact gctttggcac atttttgtcc acgcttcatg  600
agagataaaa cacctgcacg taaattcaca tgctgcactg aaggcccgat cactgaggag  660
cgaactgccg taactccctt ctatatatac ccccagtccc tgtttcagtt ttcgtcaagc  720
tagcagcacc aagttgtcga tcacttgcct gctcttgagc tcgattaagc tatcatcagc  780
tacagcatcc gatcccaaac tgcaactgta gcagcgacaa ctgcc                  825
<210>45
<211>860
<212>DNA
<213>玉米
<400>45
ctggtaatta ttggctgtag gattctaaac agagcctaaa tagctggaat agctctagcc  60
ctcaatccaa actaatgata tctatactta tgcaactcta aatttttatt ctaaaagtaa  120
tatttcattt ttgtcaacga gattctctac tctattccac aatcttttga agcaatattt  180
accttaaatc tgtactctat accaataatc atatattcta ttatttattt ttatctctct  240
cctaaggagc atccccctat gtctgcatgg cccccgcctc gggtcccaat ctcttgctct  300
gctagtagca cagaagaaaa cactagaaat gacttgcttg acttagagta tcagataaac  360
atcatgttta cttaacttta atttgtatcg gtttctacta tttttataat atttttgtct  420
ctatagatac tacgtgcaac agtataatca acctagttta atccagagcg aaggattttt  480
tactaagtac gtgactccat atgcacagcg ttccttttat ggttcctcac tgggcacagc  540
ataaacgaac cctgtccaat gttttcagcg cgaacaaaca gaaattccat cagcgaacaa  600
acaacataca tgcgagatga aaataaataa taaaaaaagc tccgtctcga taggccggca  660
cgaatcgaga gcctccatag ccagtttttt ccatcggaac ggcggttcgc gcacctaatt  720
atatgcacca cacgcctata aagccaacca acccgtcgga ggggcgcaag ccagacagaa  780
gacagcccgt cagcccctct cgtttttcat ccgccttcgc ctccaaccgc gtgcgctcca  840
cgcctcctcc aggaaagcga 860
<210>46
<211>899
<212>DNA
<213>玉米
<400>46
gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta  60
taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt  120
atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca  180
gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt  240
ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg  300
caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta  360
gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct  420
ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa  480
tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta  540
aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt  600
ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca  660
cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg  720
ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag  780
gcggcctcct cctcctctca cggcacggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct  840
tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttccc   899
<210>47
<211>879
<212>DNA
<213>紫花苜蓿
<400>47
aattcccatg atcttctctc cttcatcaat ggatgccatg tttcataaca ataacaccaa    60
atgtttgatg agctaccaac aattgcgcaa agactatggc taagctcgag ctcgctcgct    120
acaagttgtt gactttcaaa tacaagtttg tttttggaac accaaatatt ctacatgatc    180
tttcactaag ttgcgcacca ctatcaaaag attatctagg ccattattca agtaaagagt    240
gaacacgtct aagacccaca accacaccaa atagaatacg catacatgca acatattgtg    300
caagaagtat ccaactggac tcccatgtat tctaaaacta ttttcgtaga gttaaagtta    360
tgacaaactt atcaaataaa aatttgaacg ctggaccaaa actttcatct ttcaaatcca  420
ccatcgtcta tcctcataaa ttgttttgat tataacacat ctacgtaaat catttgtttt  480
gaacaatact aatttaattt tattaagtca aataacctgc ttagaaaata atccctccac  540
ctcatttaac aatttcttgt caaacacaca ccaagaaaaa aattaatgaa agagaaaaga  600
aatgaaaagg acatggagtt gaatactagc aaaattgatt gaaggaagat tcacaattga  660
aattgaaacc atttaattta ttttcgggtc cataataata aattggtaag aataaaaacc  720
cgatcaagtc cggtacagta caattccact ccaccaactc cttacttaaa cccctattta  780
tacccactct catcctcact cttccttcac ctctccccct ctcttctctc tctcaaaacc  840
ctcacacaaa cgctgcgttt agtgtaagaa attcaatcc                         879
<210>48
<211>318
<212>DNA
<213>马铃薯
<400>48
agacttgtcc atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca  60
catagtgaca tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac  120
tagttatctg aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac  180
gtgtctttat aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat  240
aaatattaat catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg  300
tgttttgcga attgcggc                                                318

Claims (13)

1.改变植物根构造的方法，所述方法包括：
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成；以及
(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造，
其中所述植物是玉米植物。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括：
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
3.评价植物根构造的方法，所述方法包括：
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成；
(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时所述转基因植物的根构造，
其中所述植物是玉米植物。
4.权利要求3的方法，所述方法还包括：
(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(e)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时所述子代植物的根构造。
5.评价植物根构造的方法，所述方法包括：
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成；
(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(d)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时所述子代植物的根构造，
其中所述植物是玉米植物。
6.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成；
(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)测定所述转基因植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变，
其中所述植物是玉米植物。
7.权利要求6的方法，所述方法还包括：
(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(e)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
8.权利要求7的方法，其中所述测定步骤包括：测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
9.权利要求7的方法，其中所述测定步骤(e)包括：测定所述子代植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
10.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成；
(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(d)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变，
其中所述植物是玉米植物。
11.权利要求10的方法，其中所述测定步骤包括测定所述子代植物在多种环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
12.对基因变异进行作图的方法，所述基因变异表现出植物根构造的改变和/或植物至少一种农学特性的改变，所述方法包括：
(a)使两种植物品种杂交；并且
(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异：
(i)SEQ ID NO：33的核酸序列；或
(ii)编码SEQ ID NO：34的多肽的核酸序列；
其中所述评价是使用选自下组的方法进行的：RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分析，
其中所述植物是玉米植物。
13.用于改变植物根构造和/或改变植物至少一种农学特性的分子育种方法，所述方法包括：
(a)使两种植物品种杂交；并且
(b)在得自步骤(a)的杂交的子代植物中针对以下序列来评价基因变异：
(i)SEQ ID NO：33的核酸序列；或
(ii)编码SEQ ID NO：34的多肽的核酸序列；
其中所述评价是使用选自下组的方法进行的：RFLP分析、SNP分析、和基于PCR的分析，
其中所述植物是玉米植物。
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