CN101827938A - 涉及rt1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物 - Google Patents

涉及rt1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物 Download PDF

Info

Publication number
CN101827938A
CN101827938A CN200880022664A CN200880022664A CN101827938A CN 101827938 A CN101827938 A CN 101827938A CN 200880022664 A CN200880022664 A CN 200880022664A CN 200880022664 A CN200880022664 A CN 200880022664A CN 101827938 A CN101827938 A CN 101827938A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
sequence
recombinant dna
construction body
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880022664A
Other languages
English (en)
Inventor
H·萨凯
G·塔拉米诺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Publication of CN101827938A publication Critical patent/CN101827938A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

本发明描述了尤其可用于改变植物根构造的分离的多核苷酸和多肽及重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子),以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接在植物中有功能的启动子的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码可用于改变植物根构造的多肽。

Description

涉及RT1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物
发明领域
本发明涉及可用于改变植物根构造的组合物和方法。另外,本发明涉及已经用本发明的组合物进行遗传转化的植物。
发明背景
对于植物根的发育和功能的基因调控所知相对较少。阐明基因调控是很重要的,因为根起着诸如获取水和营养物质以及植物固定在土壤中之类的重要功能。
玉米根构造由在不同植物发育阶段形成的不同的根类型构成。已经描述了玉米中在不同发育阶段特定根类型受到影响的许多突变体(如rtcs(rootless concerning crown and seminal roots(冠根和种子根生长缺陷突变体))、lrt1(lateral rootless1)(侧根生长缺陷突变体1))、rt1((root less 1)(根生长缺陷突变体1)(Hochholdinger等人(2004)Annals of Botany 93:359-368)。突变体rt1是已经分离出的根系形成的第一个突变体,它显示具有数目减少的茎生根。rt1突变体在较高的茎节处不存在任何茎生根,同时在前两个茎节处的冠状根数目仅有轻微差异。突变体rt1作为单基因隐性性状遗传,其图谱位于染色体3(MaizeGDB,见World Wide Web,maizegdb.org)
rt1突变体由Jenkins首次描述(Jenkins M T(1930)J Hered 21:79-80),但仍无对编码rt1表型相关蛋白的核酸的分子分析。实际上,迄今为止仍无rt1编码蛋白特性的报道。
发明概述
本发明包括:
在一个实施方案中分离的多核苷酸包括:(i)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13或21比较时,基于Clustal V比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述多肽在植物中的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列,其中(i)的全长互补核酸序列由相同数目的核苷酸组成,并且是100%互补的。
在另一个实施方案中,一种分离的多肽,在与SEQ ID NO:13或21比较时,基于Clustal V比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述多肽在植物中的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
在另一个实施方案中,一种分离的多核苷酸包含:(i)一种核酸序列,该序列在与SEQ ID NO:12或20比较时,基于Clustal V比对方法,具有至少50%的序列同一性,并且其中所述多核苷酸编码多肽,其中所述多肽的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造,或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。
在另一个实施方案中,一种分离的多核苷酸包含(i)一种核酸序列,该序列在与SEQ ID NO:12或20比较时,基于Clustal V比对方法,具有至少50%的序列同一性,并且其中所述多核苷酸编码多肽,其中所述多肽的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造,并且其中所述多肽序列包含至少一个选自SEQ ID NO:22和23的基序,其中所述基序是基本上保守的亚序列。
在另一个实施方案中,一种编码多肽的分离的多核苷酸,其中所述多肽的表达导致改变的根构造,并且其中多肽序列包含至少一个选自SEQ ID NO:22和23的基序,其中所述基序是基本上保守的亚序列。
在另一个实施方案中,一种在基因组中包含重组DNA构建体的植物,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控元件的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
在另一个实施方案中,一种在基因组中包含重组DNA构建体的植物,该重组DNA构建体包含:
(a)可操作地连接至少一个调控元件的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或
(b)抑制DNA构建体,该构建体包含至少一个调控元件,该调控元件有效连接至:(i)如下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽,并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时,所述植物表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中,一种改变植物根构造的方法,该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸,其中该多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造;并且任选地,(c)获得源自该转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
在另一个实施方案中,一种评价植物根构造的方法,该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸,其中该多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及(c)与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较来评价该转基因植物的根构造;以及任选地,(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;以及任选地,(e)与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较来评价该子代植物的根构造。
在另一个实施方案中,一种评价植物根构造的方法,该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸,其中该多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;(c)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;以及(d)与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较来评价该子代植物的根构造。
在另一个实施方案中,一种确定植物农学特性改变的方法,该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸,其中该多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及(c)确定该转基因植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变;以及任选地,(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;以及任选地,(e)确定该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中,一种确定植物农学特性改变的方法,该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸,其中该多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;(c)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;并且(d)确定该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中,一种确定植物农学特征改变的方法,该方法包括:
(a)将包含至少一个调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该调控元件可操作地连接至:
(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与源所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;
(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及
(c)确定该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变;
以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及任选地,(e)确定该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中,一种确定植物农学特征改变的方法,该方法包括:
(a)将包含至少一个调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该调控元件可操作地连接至:
(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;
(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造;
(c)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及
(d)确定该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
在另一个实施方案中,一种改变植物根构造的方法,该方法包括:
(a)将包含至少一个调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该调控元件可操作地连接至:
(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;或(B)(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;以及
(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造;以及任选地,(c)获得源自该转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且其中该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的农学特性;
在另一个实施方案中,一种评价植物根构造的方法,该方法包括:
(a)将包含至少一个调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该调控元件可操作地连接至:
(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;
(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及
(c)与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较评价该转基因植物的根构造;
以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及任选地,(e)与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较来评价该子代植物的根构造。
在另一个实施方案中,一种评价植物根构造的方法,该方法包括:
(a)将包含至少一个调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该调控元件可操作地连接至:
(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;
(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;
(c)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及
(d)与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较评价该子代植物的根构造。
本发明中还包括的是上述植物的任何子代、上述植物的任何种子以及来自任意上述植物和子代植物的细胞。
一种生产可作为产品销售的种子的方法,该种子提供改变的根构造,该方法包括任意前述优选的方法,并且还包括从所述子代植物获得种子,其中所述种子在它们的基因组中包含所述重组DNA构建体。
附图以及序列清单的说明
根据以下的详细描述和附图以及序列清单,可以更全面地理解本发明,以下的详细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分。
图1描述了在bac克隆b0541.c13(SEQ ID NO:9)上的RT1基因。
图2示出了在加入乙烯以后诱导的RT1转录。
图3A至3B示出了来自B73(SEQ ID NO:13)的RT1蛋白、大米RT1同源物(NCBI General标识符SEQ ID NO:17)、拟南芥RT1同源物(NCBI General标识符SEQ ID NO:19)和来自克隆cfp7n.pk6.i3的玉米RT1同源物(SEQ ID NO:21)的全长氨基酸序列的多重比对。所有序列间保守的氨基酸在顶行用星号(*)标出;该程序用短划线来使序列间最大程度的对齐。在所有四个序列之间的两个高度保守基序在比对中用下划线标出。采用Clustal比对方法(Higgins和Sharp,1989,CABIOS.5:151-153)使用默认参数(空位罚分(GAP PENALTY)=10,空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)=10)执行下面的用于产生序列多重比对的方法参数。
图4示出了图3A至3B中显示的每对氨基酸序列的百分比序列同一性的图表。
图5示出了载体pDONORTM/Zeo。
图6示出了载体pDONORTM221。
图7示出了载体PHP27840。
图8示出了载体PHP23236。
图9示出了载体PHP10523。
图10示出了载体PHP28408。
图11示出了载体PHP20234。
图12示出了载体PHP28529。
图13示出了载体PHP22020。
图14示出了载体PHP23112。
图15示出了载体PHP23235。
图16示出了载体PHP29635。
图17示出了载体pIIOXS2a-FRT87(ni)m。
图18是实施例19中用于半水栽玉米生长的培养基。
图19是列出实施例19中与不同硝酸盐浓度对Gaspe Bay Flint衍生的玉米系生长和发育的影响相关的数据的图表。
图20a至c图示了rt1和在田间、温室或水栽条件下生长的野生型植物的比较。
序列描述以及相关联的序列列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。
序列列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码,如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的,该标准在Nucleic Acids Res.13:3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2):345-373(1984)中描述,将这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中示出的规则。
SEQ ID NO:1是实施例2中所用的标记MZA8757-F81的正向引物。
SEQ ID NO:2是实施例2中所用的标记MZA8757-R593的反向引物。
SEQ ID NO:3是实施例2中所用的标记MZA15417-F132的正向引物。
SEQ ID NO:4是实施例1中所用的标记MZA15417-R607的反向引物。
SEQ ID NO:5是实施例2中所用的CAP标记b0541的正向引物。
SEQ ID NO:6是实施例2中所用的CAP标记b0541的反向引物。
SEQ ID NO:7是实施例2中所用的CAP标记b0461的正向引物
SEQ ID NO:8是实施例2中所用的CAP标记b0461的反向引物。
SEQ ID NO:9是实施例3中所述的来源于BAC b0541.c13的候选基因的序列。
SEQ ID NO:10是实施例3中所用的RT1 3006F的正向引物。
SEQ ID NO:11是实施例3中所用的RT1 17631R的反向引物。
SEQ ID NO:12是实施例3中所述的RT1的B73cDNA。
SEQ ID NO:13是由SEQ ID NO:12的核苷酸50至1382(终止)编码的RT1氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是正向引物4405F,用于
实施例5中。
SEQ ID NO:15是实施例5中所用的etr4Rnew反向引物。
SEQ ID NO:16是编码来自大米的最接近多肽RT1同源物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17对应于由SEQ ID NO:16的核苷酸91至1263(终止)编码的RT1氨基酸序列同源物,并且用NCBI General标识符115434026示出。
SEQ ID NO:18是编码来自拟南芥的最接近多肽RT1同源物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19对应于由SEQ ID NO:18的核苷酸132至1493(终止)编码的RT 1氨基酸序列同源物,并且用NCBI General标识符15217667示出。
SEQ ID NO:20是对应于玉米RT1序列的玉米同源物的EST。
SEQ ID NO:21是由SEQ ID NO:20编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22对应于图3A至3B中示出的比对中的基序I。
SEQ ID NO:23对应于图3A至3B中示出的比对中的基序II。
SEQ ID NO:24是实施例9中描述的attB1序列。
SEQ ID NO:25是实施例9中描述的attB2序列。
SEQ ID NO:26是实施例9中描述的正向引物VC062的序列。
SEQ ID NO:27是实施例9中描述的反向引物VC063的序列。
SEQ ID NO:28是实施例9中描述的载体pDONORTM/Zeo的序列。
SEQ ID NO:29是实施例9中描述的载体pDONORTM/221的序列。
SEQ ID NO:30是实施例9中描述的PHP27840的序列。
SEQ ID NO:31是实施例9中描述的PHP23236的序列。
SEQ ID NO:32是PHP10523的序列。
SEQ ID NO:33是NAS2启动子的序列。
SEQ ID NO:34是GOS2启动子的序列。
SEQ ID NO:35是泛素启动子的序列。
SEQ ID NO:36是PINII终止子的序列。
SEQ ID NO:37是PHP28408的序列。
SEQ ID NO:38是PHP20234的序列。
SEQ ID NO:39是PHP28529的序列。
SEQ ID NO:40是PHP22020的序列。
SEQ ID NO:41是PHP23112的序列。
SEQ ID NO:42是PHP23235的序列。
SEQ ID NO:43是PHP29635的序列。
SEQ ID NO:44是pIIOXS2a-FRT87(ni)m的序列。
SEQ ID NO:45是S2A启动子的序列。
发明详述
藉此将本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。
如本文所用的并在附加的权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义,除非上下文中清楚地另有指明。因此,例如,“一株植物”的涵义包括多株此类植物,“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物,等等。
术语“根构造”指构成根的不同植物部分的布置方式。术语“根构造”、“根组织结构”、“根系”和“根系结构”本文可以互换使用。
一般来讲,植物由胚发育成的第一种根称为初生根。在大多数双子叶植物中,初生根被称为主根。这种主根向下生长并产生分枝根(侧根)。在单子叶植物中,植物的初生根发生分枝,生成须根系。
术语“改变的根构造”指与参照植株或对照植株比较,在其不同发育阶段构成根系的不同部分的改变状况。应该理解,改变的根构造涵盖了一种或多种可测量参数(包括但不限于一个或多个根系部分的直径、长度、数目、角度或表面)的改变,所述根系部分包括但不限于初生根、侧根或分枝根、冠根、不定根和根毛,所有这些都在本发明的范围内。这些改变可导致根所占的区域或空间的整体改变。
“农学特性”是可测量的参数,包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、茎杆倒伏、根穿透、植株高度、穗长和收获指数。
“收获指数”指粒重除以总株重。
“rt1”(rootless 1)指玉米突变体的核苷酸序列。
“rt1”指玉米突变体的多肽。
“RT1”指玉米RT1野生型基因和cDNA,无限制的分别包括SEQID NO:9和SEQ ID NO:12。“RT1”指玉米RT1野生型蛋白,由SEQID NO:9的外显子和SEQ ID NO:12的cDNA编码。
“RT1样”指玉米RT1序列的核苷酸同源物,并对应于大米、拟南芥、和另外的玉米序列,无限制的分别包括SEQ ID NO:16、18、和20的核苷酸序列。
“RT1样”指玉米RT1蛋白的多肽同源物,并无限制地包括SEQ IDNO:17、19和21的氨基酸序列,分别对应于另外的大米、拟南芥和另外的玉米同源物。
“环境条件”指植物生长的条件,例如水的可用性、营养物质(例如氮或磷)的可用性、土壤类型、或者昆虫或病害的存在。
“改变环境条件”指植物生长条件的改变,包括但不限于水的可用性、营养物质(例如氮或磷)的可用性、土壤类型、或者昆虫或病害的存在。
“根倒伏”指茎杆从中间倾倒。根倒伏可能最早在营养阶段后期发生并且最晚在采收成熟时发生。根倒伏可能受杂交感病性(即使杂交体受有害物影响导致根倒伏)、环境胁迫(干旱、洪涝)、昆虫和病害的影响。在一些情况下,根倒伏可能是由玉米根虫伤害所致。
“根穿透”指植物根系穿透到土壤中的速率和深度。
“土壤类型”指在具体样本中根据不同尺寸的颗粒确定土壤质地,包括但不限于矿物质颗粒。术语“土壤类型”也指在改变物理条件下(包括但不限于水含量和耕作)的土壤致密度。一般来讲,土壤部分地由细小的土石颗粒构成,根据尺寸分成沙土、粉土、和粘土。每种尺寸起到显著不同的作用。例如,最大的颗粒,沙土,决定透气和水系特征,然而最小的亚显微颗粒,粘土颗粒,具有化学活性,能结合水和植物营养素。这些尺寸的比率决定土壤类型:粘土、壤土、粘壤土、粉砂壤土、等等。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA,而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞:种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物,包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。优选的是,异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中,使得该多核苷酸能传递至连续的世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列,或者如果来自相同物种,则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用,并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物,任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代:“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA),“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸,“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸,“U”表示尿苷酸,“T”表示脱氧胸苷酸,“R”表示嘌呤(A或G),“Y”表示嘧啶(C或T),“K”表示G或T,“H”表示A或C或T,“I”表示肌苷,而“N”表示任意核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用,指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可以包括修饰,包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可以通过细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽;即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物;即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质,例如核酸和/或蛋白质,该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分,或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可以从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括细胞或载体,通过导入异源核酸改变细胞,来源于该改变细胞的细胞也改变了。它不包括自然发生事件(例如,自发突变、自然转化/转导/转座)改变的细胞或载体,例如那些无蓄意的人为干预而发生的改变。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此,重组DNA构建体可以包含源于不同来源的调控序列和编码序列,或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“调控序列”和“调控元件”本文可互换使用。
“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列),并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列等。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子,无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可以互换使用,并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达,而是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
术语“可操作地连接”指核酸片段联合成单一片段,使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如,在启动子能够调节核酸片段的转录时,该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。因此,核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”,并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中,在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内,转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。
“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。
在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中,导致基因稳定遗传。一旦稳定转化,核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中,引起基因表达而没有基因稳定遗传。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时,该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同,则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上,则该植物在该基因座处是半合子的。
序列比对和百分比同一性可以用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定,这些方法包括但不限于
Figure G2008800226640D00161
生物信息计算包(
Figure G2008800226640D00162
Inc.,Madison,WI)的
Figure G2008800226640D00163
程序。除非另外说明,否则本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp,1989,CABIOS.5:151-153)采用默认参数(空位罚分=10,空位长度罚分=10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、缺口罚分=3、窗口(WINDOW)=5和DIAGONALS SAVED=5。而对于核酸,这些参数为KTUPLE=2,空位罚分=5,窗口=4和DIAGONALS SAVED=4。用Clustal V程序比对序列后,可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明,否则本文提供的和申明的百分比同一性和趋异度是以该方式计算。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring HarborLaboratory Press:Cold Spring Harbor,1989(下文称为“Sambrook”)。
现在来看优选的实施方案:
优选的实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植株或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。
优选的分离的多核苷酸和多肽
本发明包括如下优选的分离的多核苷酸和多肽:
分离的多核苷酸,包括:(i)编码多肽的核酸序列,当与SEQ ID NO:13或21比较时,基于Clustal V比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述多肽在植物中的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造,或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列,其中(i)的完全互补序列和核酸序列由相同数目的核苷酸构成并且100%互补。
任意上述分离的多核苷酸可以用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。
一种分离的多肽,在与SEQ ID NO:13或21比较时,基于ClustalV比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述多肽在植物中的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
一种分离的多核苷酸,该核苷酸包含(i)在与SEQ ID NO:13或21比较时,基于Clustal V比对方法,具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述多核苷酸编码多肽,其中所述多肽的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造,或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任意上述分离的多核苷酸可以用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。该分离的多核苷酸编码RT1或RT1样蛋白。
优选的重组DNA构建体和抑制DNA构建体
在一个方面,本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。
在一个优选的实施方案中,重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如,在植物中有功能的启动子)的多核苷酸,其中该多核苷酸包含(i)编码氨基酸序列的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)所述(i)核酸序列的全长互补序列;
在另一个优选实施方案中,重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如,在植物中有功能的启动子)的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含(i)核酸序列,在与SEQ ID NO:12、16、18、或20比较时,基于Clustal V比对方法,该序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)(i)核酸序列的全长互补序列。
图3A至3B示出了B73RT1(SEQ ID NO:13)、大米RT1同源物(SEQ ID NO:17)、拟南芥RT1同源物(SEQ ID NO:19)、和来自克隆cfp7n.pk6.i3的玉米RT1同源物(SEQ ID NO:21)的全长氨基酸序列的多重比对。所有序列间保守的氨基酸在顶行用星号(*)标出;该程序用短划线来使序列间最大程度的对齐。两个高度保守序列基序在比对中用下划线标出。采用Clustal比对方法(Higgins和Sharp,1989,CABIOS.5:151-153)使用默认参数(空位罚分=10,空位长度罚分=10)执行下面的用于产生序列多重比对的方法参数,并且成对比对默认参数为KTUPLE=1,空位罚分=3,窗口=5以及DIAGONALS SAVED=5。
图4示出了图3A至3B中显示的每对氨基酸序列的百分比序列同一性的图表。
在另一个优选的实施方案中,重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如,在植物中有功能的启动子)的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码RT1或RT1样蛋白。优选地,该RT1或RT1样蛋白来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycinemax)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
在另一方面,本发明包括抑制DNA构建体。
抑制DNA构建体优选包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至:(a)以下序列的全部或部分:(i)编码多肽的核酸序列,当与SEQ ID NO:13、或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)(a)(i)核酸序列的全长互补序列;或者(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1蛋白;或(c)以下序列的全部或部分:(i)核酸序列,当与SEQ ID NO:12或20比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)(c)(i)核酸序列的全长互补序列。该抑制DNA构建体优选包含共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如,siRNA构建体或miRNA构建体)。
应该理解(正如本领域技术人员将会理解的),本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此,氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地,导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如,天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如,赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内,如测定所编码的产物的生物活性的保留。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时,导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说,该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的,“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制,和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括(并且不限于)反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。
抑制DNA构建体可以包含源自所关注的靶基因的区域并且可以包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法,该区域可以与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100%相同或者有少于100%的同一性(如,有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性)。
抑制DNA构建体是本领域所熟知的,一旦选定所关注的靶基因就很容易构建,并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体,以及更通常的是,RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体,例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。
“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补,并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号:5,107,065)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分,即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。
“共抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA并且可以在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前,已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人,1998,Plant J.,16:651-659;以及Gura,2000,Nature 404:804-808)。
另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。
此前描述的是“发夹”结构的利用,该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分,导致已表达的RNA形成潜在的“茎-环”结构(于1999年10月21日公开的PCT专利公开WO99/53050)。在这种情况下,茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的相关基因的多核苷酸形成,并且环由一些相关基因的多核苷酸形成,在构建体中该多核苷酸不具有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制的综述,参见Wesley,S.V.等人,2003,Methods inMolecular Biology,Plant Functional Genomics:Methods and Protocols236:273-286。
其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任意的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(于1999年12月2日公开的PCT专利公开No.WO 99/61632)。
使用聚-T和聚-A序列产生茎-环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00894)。
然而另一种改变形式涉及使用合成的重复序列来促进茎-环结构中的茎的形成。用这种重组DNA片段产生的转基因生物体已经显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的蛋白质的水平降低,如于2002年1月3日公开的PCT专利公开No.WO 02/00904中所述。
RNA干扰是指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人,Nature 391:8061998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默,并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制,并且通常由不同植物区系和门所共有(Fire等人,Trends Genet.15:3581999)。这种防止外来基因表达的保护作用可能是通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应,响应源自病毒感染或源自转座因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中的存在通过还没有完全表征的机制引发了RNAi反应。
细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及使dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人,Nature 409:3632001)。源自dicer活性的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸,并且包含约19个碱基对的双链体(Elbashir等人,Genes Dev.15:1882001)。Dicer还涉及从保守结构的前体RNA上切下21个和22个核苷酸的小时序RNA(stRNA),该小时序RNA参与翻译控制(Hutvagner等人,2001,Science 293:834)。RNAi响应还涉及内切核酸酶复合物,通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC),其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生(Elbashir等人,Genes Dev.15:188 2001)。此外,RNA干扰还涉及小RNA(如miRNA)介导的基因沉默,可推定是通过调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见(例如)Allshire,Science297:1818-1819 2002;Volpe等人,Science 297:1833-1837 2002;Jenuwein,Science 297:2215-2218 2002;和Hall等人,Science 297:2232-2237 2002)。这样,本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或者作为另一种选择通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默,其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的基因沉默。
已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等人(Nature 391:806 1998)首次在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到RNAi。Wianny和Goetz(Nature Cell Biol.2:701999)描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人(Nature 404:2932000)描述了在用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人(Nature 411:4942001)描述了通过将合成的21-核苷酸RNA的双链体引入包括人胚肾和HeLa细胞在内的培养的哺乳动物细胞中而诱导的RNAi。
小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在能够通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。
小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时,小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时,据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么,这些事件的后果是基因表达受到抑制。
据认为,小RNA和它们的RNA靶标之间的序列互补性有助于确定采用了哪种机制(RNA裂解或翻译抑制)。据信,优选与它们的靶标互补的siRNA通过RNA裂解起作用。一些miRNA与它们的靶基因具有完全或几乎完全的互补性,并且对于至少一些这样的miRNA,已经证实了RNA裂解。其他miRNA与它们的靶标具有若干错配,并且在翻译水平上明显抑制了它们的靶标。同样,无需坚持特定的作用机理,出现了这样一种一般规律:完全或几乎完全的互补性引起RNA裂解,而当miRNA/靶标双链体含有许多错配时倾向于翻译抑制。对于此规律的一个明显例外是植物中微RNA 172(miR172)。miR172的其中一个靶标是APETALA2(AP2),尽管miR172与AP2具有几乎完全的互补性,但其表现出引起AP2的翻译抑制而不是引起RNA裂解。
微RNA(miRNA)是已经在动物和植物中都鉴定到的长度为约19至约24个核苷酸(nt)的非编码RNA(Lagos-Quintana等人,Science 294:853-858 2001;Lagos-Quintana等人,Curr.Biol.12:735-739 2002;Lau等人,Science 294:858-862 2001;Lee和Ambros,Science 294:862-8642001;Llave等人,Plant Cell 14:1605-1619 2002;Mourelatos等人,Genes.Dev.16:720-728 2002;Park等人,Curr.Biol.12:1484-1495 2002;Reinhart等人,Genes.Dev.16:1616-1626 2002)。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的,并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。在动物中,涉及加工miRNA前体的酶称为Dicer,这是一种类核糖核酸酶III蛋白(Grishok等人,Cell 106:23-34 2001;Hutvagner等人,Science 293:834-838 2001;Ketting等人,Genes.Dev.15:2654-2659 2001)。植物也具有类Dicer酶,即DCL1(以前称为CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1),并且最近有证据表明,其像Dicer一样,也涉及发夹前体的加工以产生成熟miRNA(Park等人,Curr.Biol.12:1484-1495 2002;Reinhart等人,Genes.Dev.16:1616-1626 2002)。此外,最近的研究已经清楚地表明,至少某些miRNA发夹前体最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在,并且在单个转录物中可以存在几种不同的miRNA以及相关发夹(Lagos-Quintana等人,Science 294:853-858 2001;Lee等人,EMBO J21:4663-4670 2002)。最近的研究还检验了miRNA链从dsRNA产物的选择,所述dsRNA产物是通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz等人,2003,Cell 115:199-208)。看起来,经加工的dsRNA的两端的稳定性(即G∶C与A∶U的含量比,和/或错配)影响链选择,具有低稳定性的末端更容易因解旋酶活性而解旋。低稳定性末端的5′末端链被整合至RISC复合物内,而另一条链被降解。
微RNA看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。就lin-4和let-7而言,靶位点位于靶mRNA的3′非翻译区中(Lee等人,Cell 75:843-854 1993;Wightman等人,Cell 75:855-862 1993;Reinhart等人,Nature 403:901-906 2000;Slack等人,Mol.Cell 5:659-669 2000),并且在lin-4和let-7miRNA与其靶位点之间有几个错配。lin-4或let-7miRNA的结合看起来引起了由靶mRNA编码的蛋白质的稳态水平下调,而不影响转录物自身(Olsen和Ambros,Dev.Biol.216:671-680 1999)。另一方面,最近有证据表明,在某些情况下,miRNA可以引起靶转录物在靶位点内特异性RNA裂解,并且该裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间具有100%的互补性(Hutvagner和Zamore,Science 297:2056-2060 2002;Llave等人,PlantCell 14:1605-1619 2002)。看起来有可能miRNA可以进入至少两条靶基因调控途径:当靶互补性<100%时,蛋白下调,当靶互补性是100%时,RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似(Hamilton和Baulcombe 1999;Hammond等人,2000;Zamore等人,2000;Elbashir等人,2001),并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。
用生物信息学鉴定miRNA的靶标在动物中没有成功,这可能是因为动物miRNA与它们的靶标具有低水平的互补性。另一方面,生物信息学方法已经成功地用于预测植物miRNA的靶标(Llave等人,Plant Cell14:1605-1619 2002;Park等人,Curr.Biol.12:1484-1495 2002;Rhoades等人,Cell 110:513-5202002),因此,看起来植物miRNA与它们的推定靶标的整体互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码涉及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。
本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)优选包含至少一种调控序列。
优选的调控序列是启动子。
多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)中。可以根据所需结果来选择启动子,并且可以包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。
在35S启动子控制下的候选基因的高水平组成型表达可以具有多效性。可以在通过不同启动子驱动时测试候选基因的效率。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子;CaMV 35S核心启动子(Odell等人,Nature 313:810-812(1985));水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人,Plant Cell 2:163-171(1990));泛素启动子(Christensen等人,Plant Mol.Biol.12:619-632(1989)和Christensen等人,Plant Mol.Biol.18:675-689(1992));pEMU(Last等人,Theor.Appl.Genet.81:581-588(1991));MAS(Velten等人,EMBO J.3:2723-2730(1984));ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些以及玉米GOS2(WO0020571A2)。
在选择启动子用于本发明方法时,可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调节启动子。
优选的组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列,该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达,并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子都可用于本发明的方法中。
种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂启动子(Kti3,Jofuku和Goldberg,Plant Cell 1:1079-1093(1989))、patatin启动子(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa,M.等人,1989,EMBO J.8:23-29)、convicilin启动子、豌豆球蛋白启动子和豆球蛋白启动子(豌豆子叶)(Rerie,W.G.等人,1991,Mol.Gen.Genet.259:149-157;Newbigin,E.J.等人,1990,Planta 180:461-470;Higgins,T.J.V.等人,1988,Plant.Mol.Biol.11:683-695)、玉米蛋白启动子(玉米胚乳)(Schemthaner,J.P.等人,1988,EMBO J.7:1249-1255)、菜豆蛋白启动子(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan,C.等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3320-3324)、植物凝集素启动子(菜豆子叶)(Voelker,T.等人,1987,EMBO J.6:3571-3577)、B-伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子和大豆球蛋白启动子(大豆子叶)(Chen,Z-L等人,1988,EMBO J.7:297-302)、谷蛋白启动子(水稻胚乳)、大麦醇溶蛋白启动子(大麦胚乳)(Marris,C.等人,1988,Plant Mol.Biol.10:359-366)、麦谷蛋白启动子和醇溶蛋白启动子(小麦胚乳)(Colot,V.等人,1987,EMBO J.6:3559-3564)和sporamin启动子(甘薯块根)(Hattori,T.等人,1990,Plant Mol.Biol.14:595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体中的异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥属和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人,Bio/Technology 7:L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人,Plant Sci.63:47-57(1989)),以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人,EMBO J 6:3559-3564(1987))。
可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在,例如,通过化合物(化学诱导剂),或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
优选的启动子包括如下启动子:1)胁迫可诱导的RD29A启动子(Kasuga等人,1999,Nature Biotechnol.17:287-91);2)大麦启动子B22E;B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“PrimaryStructure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in ImmatureAleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”。Klemsdal,S.S.等人,Mol.Gen.Genet.228(1/2):9-16(1991));和3)玉米启动子,Zag2(“Identification and molecular characterizationof ZAG1,the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic geneAGAMOUS”,Schmidt,R.J.等人,Plant Cell 5(7):729-737(1993))。“Structural characterization,chromosomal localization and phylogeneticevaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize”,Theissen等人,Gene 156(2):155-166(1995);NCBI GenBank AccessionNo.X80206))。Zag2转录物可以在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到,并且引导Ciml在发育中的雌花序心皮中表达,Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的其他优选启动子是茎特异性启动子。这种茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登记号:EF030816;Abrahams等人,Plant Mol Biol.27:513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登记号:EF030817)等等,将这些文献以引用的方式并入本文。
启动子可以整个源于天然基因,或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成,或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解,不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中,或者在不同的发育阶段,或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到,由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围,一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子;在Okamuro,J.K.和Goldberg,R.B.,Biochemistry of Plants 15:1-82(1989)的汇编中可以找到许多实例。
优选的启动子可以包括:RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶启动子、泛素启动子、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶启动子、R-等位基因启动子、根细胞启动子、维管组织优选的启动子S2A(Genbank登录号EF030816;SEQ ID NO:76)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他优选的启动子包括根优选的启动子,例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439,公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998,公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487,公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770,公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号:U38790,gi:1063664)。
本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)也可以包括其他调控序列,包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个优选的实施方案中,本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可以加至部分编码序列的5’非翻译区或编码序列以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示,在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上都增强高达1000倍。参见Buchman和Berg,Mol.Cell Biol.8:4395-4405(1988);Callis等人,Genes Dev.1:1183-1200(1987)。这种内含子对基因表达的增强通常在将其设置接近转录单位的5’端时为最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。通常参见The Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot(编辑),Springer,纽约(1994)。
如果期望进行多肽表达,则通常希望在多核苷酸编码区的3′-端处包含有多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可以源自天然基因,源自多种其他植物基因或源自T-DNA。要加入的3′端序列可以源自(例如)胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶基因,或作为选择源自另外的植物基因,或较不优选的是源自任何其他真核基因。
“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例已经有所描述(Turner,R.和Foster,G.Molecular Biotechnology 3:225(1995))。
任何植物都可以选择用来鉴定将用于产生本发明重组DNA构建体和抑制DNA构建体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属植物、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉(canola)、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、酸果蔓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、阔叶菊苣、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、莱檬、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、黍、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、番木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、车前草、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏树、辐射松、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、水稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。用于鉴定调控序列的特别优选的植物是拟南芥属植物、玉米、小麦、大豆和棉花。
优选的组合物
本发明的优选组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的那些优选构建体)的植物。优选的组合物还包括这种植物的任何子代,以及从这种植物或其子代获得的种子。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂种和自交系。
优选地,在杂交种子繁殖的农作物中,成熟的转基因植物可以自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种子。这些种子可以生长而产生将会表现出改变的农学特性(如,在氮或磷限制条件下农学特性增加)的植物,或者可以用于育种程序以产生杂交种子,这些杂交种子可以生长而产生将会表现出改变的根构造的植物。优选地,种子是玉米。
优选地,植物是单子叶植物或双子叶植物,更优选地,是玉米或大豆植物,甚至更优选的是玉米植物,例如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。
优选地,重组DNA构建体稳定地整合进植物的基因组中。
尤其优选的实施方案包括但不限于如下优选的实施方案:
1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物),该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。优选地,在与该对照植物比较时,该植物还表现出至少一种农学特性的改变。
2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物),该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码RT1或RT1样蛋白,并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时,所述植物表现出改变的根构造。优选地,在与该对照植物比较时,该植物还表现出至少一种农学特性的改变。优选地,该RT1或RT1样蛋白来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
3.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物),该抑制DNA构建体包含至少一个可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域的调控元件,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样蛋白,并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时,所述植物表现出至少一种农学特性的改变。
4.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物),该抑制DNA构建体包含至少一个可操作地连接至以下序列的全部或部分的调控元件:(a)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19、或21比较时,基于Clustal V比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(b)(a)的核酸序列的完全互补序列,并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时,所述植物表现出至少一种农学特性的改变。
5.上述优选实施方案1-4中的植物的任何子代、上述优选实施方案1-4中的植物的任何种子、上述优选实施方案1-4中的植物的子代的任何种子以及来自上述优选实施方案1-4中的植物以及它们的子代的细胞。
在上述优选的实施方案1-5或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中,重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)优选包含至少一个在植物中有功能的启动子作为优选的调控序列。
在上述优选的实施方案1-5或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中,至少一种农学特性的改变是增加或减少,优选增加。
在上述优选的实施方案1-5或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中,是绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织的氮含量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、抗旱性、氮摄取、根倒伏、根穿透以及收获指数中的至少一种的改变。
绿度、收获指数、产量、生物量、抗根倒伏性、改善的根穿透是用于改变的特别优选的农学特性。此外,这些农学特性优选地相对于对照植物提高。
在上述优选的实施方案1-5或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中,在与对照植物比较时,植物优选表现出至少一种与(例如)水和营养物质的可利用性无关的农学特性的改变。
本领域的普通技术人员熟悉确定植物根构造改变的规程。例如,根构造的改变可以通过统计温室培育的植物顶部第3或第4节的节根数目或根带的宽度来确定。根构造改变的其他度量包括但不限于与对照或参照植物比较时活力、生长、大小、产量、改善的根穿透或抗根倒伏性的改变。
下面的实施例描述了一些用于检测根构造改变的代表性规程和技术。
人们还可以在多种环境条件(如营养物质过剩或营养物质有限、暴露于昆虫或疾病)下的田间实验中,通过测量与正常的营养或水条件比较时在那些条件下基本等价的产量,或者通过测量与对照或参照植物比较时在过剩或有限的营养物质和水的条件下较少的产量下降,从而通过植物保持足够的产量阈值的能力来评估根构造的改变。
根构造的改变可以通过确定转基因植物较于参照植物或对照植物的抗根倒伏性来测量。改善的根穿透是用于测定根构造中改变的附加量度。
在评估或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(如,如本文描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时,本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照或参照植物。例如,通过如下非限制性示例来说明:
1.转化植物的子代,该植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的,使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株:包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即,未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植株)。
2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至自交系中,例如在玉米中,或基因渗入进变体中,例如在大豆中:基因渗入品系将通常相对于亲本自交系或变种品系进行测量(即,亲本自交系或变种品系是对照或参照植物)。
3.双杂交系,其中第一杂交系由两个亲本自交系产生,而第二杂交系由相同的两个亲本自交系产生,不同的是其中一个亲本自交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体):第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即亲本自交系或变种品系为对照植物或参照植物)。
4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株:该植株可以相对于这样的对照植株进行评估或测量,该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体),但具有与该植株相当的遗传背景(例如,与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株相比较,核遗传物质具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术;其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(
Figure G2008800226640D00331
)和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。
此外,本领域的普通技术人员将容易认识到,评估或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型,通过诱变或转化而选择的植物。
优选的方法
优选的方法包括但不限于用于改变植物根构造的方法、用于评价植物根构造改变的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于评价植物农学特性改变的方法以及用于产生种子的方法。优选地,植物是单子叶植物或双子叶植物,更优选地,是玉米或大豆植物,甚至更优选地,是玉米植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。种子优选的是玉米或大豆种子,更优选的是玉米种子,并且甚至更优选的是玉米杂种种子或玉米自交系种子。
特别优选的方法包括但不限于如下方法:
一种改变植物根构造的方法,该方法包括:(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸,其中该多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性;
以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。该方法可以另外包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物。
一种改变植物根构造的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞,该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分:(i)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)(a)(i)核酸序列的全长互补序列;以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。该方法可以另外包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物。
一种改变植物根构造的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞,该抑制DNA构建体包括至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样蛋白;以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。该方法可以另外包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物。
一种评价植物根构造改变的方法,该方法包括:(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19、或21比较时,基于Clustal V比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;以及(c)评价该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法还可以包括:(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;以及(e)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
一种评价植物根构造改变的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分:(i)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)(a)(i)核酸序列的全长互补序列;(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(c)评价该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法可以另外包括:(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(e)评价该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
一种评价植物根构造改变的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样蛋白;(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(c)评价该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法可以另外包括:(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(e)评价该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
一种评价植物根构造改变的方法,该方法包括:(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19、或21比较时,基于Clustal V比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;以及(d)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
一种评价植物根构造改变的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分:(i)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)(a)(i)核酸序列的全长互补序列;(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(e)评价该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
一种评价植物根构造改变的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样蛋白;(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;(c)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(d)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。
一种评价植物农学特性改变的方法,该方法包括:(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19、或21比较时,基于Clustal V比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及(c)确定该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法还可以包括:(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;以及(e)确定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
一种评价植物农学特性改变的方法,该方法包括:(a)将包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞,该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分:(i)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、16、17或19比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)所述(i)核酸序列的全长互补序列;(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(c)确定该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可以另外包括:(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(e)确定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
一种评价植物农学特性改变的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1蛋白;(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(c)确定该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可以另外包括:(d)获得源自该转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(e)确定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
一种评价植物农学特性改变的方法,该方法包括:(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、16、17、或19比较时,基于Clustal V比对方法,该多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体;以及(d)确定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
一种评价植物农学特性改变的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分:(i)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,或(ii)所述(i)核酸序列的全长互补序列;(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(d)确定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
一种评价植物农学特性改变的方法,该方法包括:(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子),该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1蛋白;(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物,其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体;以及(d)确定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
一种产生种子(优选可以作为提供改变的根构造的产品销售的种子)的方法,该方法包括任意上述的优选方法,并且还包括从所述子代植物获得种子,其中所述种子在它们的基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。
在任意上述的优选方法中,在所述引入步骤中,所述可再生的植物细胞优选包括愈伤组织(优选胚发生的愈伤组织)、配子细胞、分生细胞或未成熟胚的细胞。可再生的植物细胞优选来自自交系玉米植物。
在任意上述的优选方法或本发明方法的任意其他实施方案中,所述再生步骤优选包括:(i)在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞直至观察到愈伤组织;(ii)将所述步骤(i)的转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成的激素的第一培养基;以及(iii)在第二培养基上继代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞,以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。
将本发明的重组DNA构建体引入植物可以通过任何合适的技术来进行,这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、病毒介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。
在任意上述的优选方法或本发明方法的任意其他实施方案中,至少一种农学特性优选选自由以下特性组成的组:绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、抗涝性、氮摄取、根倒伏、茎杆倒伏、植物高度、穗长以及收获指数;绿度、收产量、生物量、改善的根穿透、抗根倒伏性是用于改变的特别优选的农学特性(优选所述特性提高)。
在任意上述的优选方法或本发明方法的任意其他实施方案中,在与对照植物比较时,植物优选表现出至少一种与环境条件(如,水、营养物质的可利用性、昆虫或病害)无关的农学特性的改变。
将本发明的重组DNA构建体引入植物可以通过任何合适的技术来进行,这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、病毒介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。
优选的技术在下面实施例中示出。
用于转化双子叶植物(主要通过利用根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens))以及获得转基因植物的其他优选方法包括公开的用于棉花的那些(美国专利5,004,863、美国专利5,159,135、美国专利5,518,908);用于大豆的那些(美国专利5,569,834、美国专利5,416,011、McCabe等人,Bio/Technology 6:923(1988),Christou等人,Plant Physiol87:671674(1988));用于芸苔属植物(Brassica)的那些(美国专利5,463,174);用于花生的那些(Cheng等人,Plant Cell Rep.15:653657(1996),McKently等人,Plant Cell Rep.14:699703(1995));用于番木瓜的那些;以及用于豌豆的那些(Grant等人,Plant Cell Rep.15:254 258,(1995))。
用电穿孔、粒子轰击和农杆菌转化单子叶植物也已有报道并且作为优选的方法包括(例如)如在天门冬属(asparagus)中实现的转化和植物再生(Bytebier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:5354,(1987));在大麦中实现的转化和植物再生(Wan和Lemaux,Plant Physiol.104:37(1994));在玉米中实现的转化和植物再生(Rhodes等人,Science240:204(1988);Gordon-Kamm等人,Plant Cell 2:603618(1990);Fromm等人,Bio/Technology 8:833(1990);Koziel等人,Bio/Technology11:194,(1993);Armstrong等人,Crop Science 35:550-557(1995));在燕麦中实现的转化和植物再生(Somers等人,Bio/Technology 10:1589(1992));在鸭茅中实现的转化和植物再生(Horn等人,Plant Cell Rep.7:469(1988));在水稻中实现的转化和植物再生(Toriyama等人,Theor.Appl.Genet.205:34,(1986);Part等人,Plant Mol.Biol.32:1135 1148,(1996);Abedinia等人,Aust.J.Plant Physiol.24:133141(1997);Zhang和Wu,Theor.Appl.Genet.76:835(1988);Zhang等人,Plant Cell Rep.7:379,(1988);Battraw和Hall,Plant Sci.86:191 202(1992);Christou等人,Bio/Technology 9:957(1991));裸麦(De la Pena等人,Nature 325:274(1987));在甘蔗中实现的转化和植物再生(Bower和Birch,Plant J.2:409(1992));在高羊茅(tall fescue)中实现的转化和植物再生(Wang等人,Bio/Technology 10:691(1992))和在小麦中实现的转化和植物再生(Vasil等人,Bio/Technology 10:667(1992);美国专利5,631,152)。
存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。
从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach(编辑),载于:Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,Inc.San Diego,CA,(1988))。该再生和生长方法通常包括如下步骤:选择转化的细胞、培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。
含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。优选地,将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者,将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反,将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。
实施例
本发明将在下面的实施例中进一步说明,其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度,除非另外说明。应该理解,尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案,但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例,本领域的技术人员能确定本发明的基本特征,并在不脱离本发明的精神和范围的情况下,能够对本发明做出多种改变和修饰,以使其适用于多种用法和条件。因此,除了那些本文所示和描述的那些之外,根据前文所述,本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书的范围内。
实施例1
rt1表型、根倒伏和根穿透的分析
rt1纯合体植物的表型是可变的,取决于生长条件。如图20a至c所示,田间生长的rt1植物具有非常强的根系损耗,并且显示显著的根倒伏表型,然而在温室或水栽条件下生长的植物仅显示中等的根构造改变。当rt1植物在温室中使用从田间收集的硬土生长时,它们仍然显示根系损耗(图20c),指示rt1位点是冠状根穿透土壤和根与土壤交互作用必需的。rt1突变体不能穿透硬土。
抗根倒伏性可根据在多种田间条件下的机械扰动进行测量,如抗垂直根拉伸(Beck等人(1987);Crop Sci.27:356-358)、抗机械推力(Kato等人(1999)Maydica 44,167-174)或由Fouere描述的便携式电子设计(Fouere等人(1995),Agronomy J.87:1010-1024。
该设计由便携式电子装置组成,它测量每个植物的抗水平推力。该设备同时记录人造推力测试期间植物的倾斜角度和阻力扭矩。该装置由支撑件、力传感器、角度传感器、和控制头组成。通过使用基于微处理器的系统,可进行数据记录。使用RS232串行传送规程可将数据传送到计算机上。在田间条件下测试所需的时间为每株植物大约1分钟。从在三种田间环境中生长的14个玉米基因型中获取的初步结果显示易发生根倒伏的基因型特征在于它们的最大阻力扭矩的平均值较低。
例如通过比较RT1转基因植物和野生型植物在不同土壤类型中(例如耕作过的土壤对未耕作过的土壤)的出苗和/或植物生长可测量根穿透到土壤中的状况。未耕作过的土壤对根穿透具有更高抗性,因此减少出苗以及随后的植物生长。土壤类型可通过例如使用锥形透度计测量尖端阻力、套管摩擦力和/或孔隙水压力进行测量。可在植物生长的不同阶段进行测量,并记录RT1转基因品系和非转基因(野生型)品系之间的根穿透土壤的速率差异。
实施例2
基于作图的RT1的克隆
来源于MaizeGDB(Maize Genetics and Genomics Database)的遗传数据显示在玉米染色体3bin 04上的rt1突变体图谱。基于此信息我们从公共数据库中检索若干个SSR引物并将它们用于基因型88rt1植物,该植物来源于在原始rt1品系(未知发明背景,Jenkins M T,1930)和杂交品系B73之间的F2组合。对纯合rt1/rt1植物进行评分,评分根据当在田间生长30天或更长时间时的倒伏植物状况。用标准的分子生物学方法从这些植株提取DNA。发现公共的基于PCR的DNA SSR标记UMC1908(MaizeGDB)距离rt1位点1.7cM(在88个个体上的3个重组体)。
为了对rt1突变精细作图,利用分离rt1基因的两个作图群体和它们的对应玉米种子。第一个作图群体由1500种BC2S1植物组成,所述植物来源于rt1植物(来源于隔离rt1位点的上述F2群体)和自交品系B73(分离比率3∶1)间的自交。第二个作图群体由520种植物组成,所述植物来源于上述杂交与rt1植物、杂交亲本(分离比率1∶1)的回交。
为了获取递送重组体靠近rt1位点的植物,使用两个基于序列的DNA标记,它们来自已知图谱位置的杜邦专有序列。
引物MZA8757-F81(SEQ ID NO:1)和MZA8757-R593(SEQ ID NO:2)用于扩增和测序Mza8757标记位点,该位点递送在rt1亲本和B73亲本之间的SNP A/C。
引物MZA15417-F132(SEQ ID NO:3)和MZA15417-R607(SEQ IDNO:4)用于扩增和测序Mza 5417标记位点,该位点递送在rt1亲本和B73亲本之间的SNP A/G。两个标记位于名为306(杜邦Genomix数据库)的物理BAC重叠群上。
仅仅保留并自交了62种显示在两个侧接标记间的存在杂交事件(在一个标记处为纯合体,在另一个标记处为杂合体)的植物。为了确认rt1基因相对于侧接标记的位置,随后筛选那些植物的子代的表型。
使用可用的物理定位的MZA序列和BAC的BAC末端序列设计新CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Site)标记,该BAC构建围绕有标记Mza 15417(左侧)和Mza 8757(右侧)的重叠群306区域。
将CAPS引物用于包含25ng DNA的PCR反应中。使用QiagenHotStart混合物和25ng DNA在25ul PCR反应物中进行CAPS标记扩增。热循环条件是:在95℃下15分钟(1个循环),在94℃下45秒,在56℃下45秒,在72℃下45秒(35个循环),在72℃下7分钟。
将3ul扩增产物用于使用合适限制性酶的限制消化(总体积15ul)。在合适温度下进行限制反应一小时。限制性扩增产物在3%琼脂糖凝胶上进行检查。
基于克隆BAC b0541.c13的BAC末端序列设计CAPS标记b0541(b0541正向引物,SEQ ID NO:5,和b0541反向引物,SEQ ID NO:6)。该引物对扩增250bp的区域,该区域经6-切割酶EcoRI限制酶切后在B73和rt1之间显示多形性。
CAPS标记b0461(b0461正向引物,SEQ ID NO:7,和b0461反向引物,SEQ ID NO:8):基于克隆BAC b0461.g10的BAC末端序列进行设计。该引物对扩增约350bp的区域,该区域经6-切割酶NcoI限制酶切后在B73和rt1之间显示多形性。
通过筛选62个之前获取的具有CAPS b0541的重组体,仅仅发现了3个重组发生点,然而使用CAPS b0461,2个重组体在另一侧被发现。
BAC b0541.c13和BAC b0461.g10以及具有可用的指纹识别数据的公共BAC克隆显示有重叠。
实施例3
RT1基因的鉴定
为了鉴定定位于包含两个重叠BAC克隆的区域中的RT1基因,对BAC b0541.c13进行测序。用高压氮气喷吹BAC DNA,如Roe等人,1996(Roe等人,1996,“DNA isolation and Sequencing”John Wiley andSons,New York)中所描述的。
搜索所评估的165Kb的BAC b0541.c13序列是否存在开放阅读框,并且鉴定显示与基于由FGENESH(Softberry,Inc.Mount Kisco,NY,USA)执行的预测模型的基因相似的4个区域。
具体地讲,考虑对一个显示与“推定乙烯响应蛋白”同源的候选基因进行进一步评估。来源于BAC b0541.c13(B73基因型)的基因序列显示为SEQ ID NO:9(RT1乙烯响应基因7800bp),并且在图1中,从来自B73品系和rt1品系的发育玉米根中提取总RNA,使用获取自LifeTechnologies Inc.,Rockville,MD,20849(GIBCO-BRL)的
Figure G2008800226640D00471
试剂,它包含苯酚和硫氰酸胍。用cDNA进行RT-PCR,cDNA用Superscript III(Invitrogen,Carlsbad,CA)逆转录酶从1μg DNase处理的总RNA中合成。PCR在Perkin Elmer 9700热循环仪中进行,使用GC-2Advantage试剂盒(BD Biosciences),PCR程序为:94℃3分钟,接下来的27个循环为:94℃30秒,58℃30秒,68℃1分钟,最终步骤为68℃3分钟。在PCR反应中使用基于图1中所述的基因组序列,SEQ ID NO:9,设计的引物,它们分别对RT1(RT1 3006F(SEQ ID NO:10)和RT17631R(SEQ ID NO:11)的5’和3’末端是特异性的。仅有B73野生型品系生成PCR产品,这指示rt1品系缺失RT1mRNA,证实缺失RT1转录物是形成rt1表型的原因。将PCR产物克隆进
Figure G2008800226640D00472
II-
Figure G2008800226640D00473
nt载体(InvitrogenTM)中并测序以确认身份。RT1的B73cDNA在SEQ IDNO:12中示出。由SEQ ID NO:12的核苷酸50至1382(终止密码子)编码的RT1氨基酸序列在SEQ ID NO:13中示出。
实施例4
克隆RT1 cDNA
总RNA可使用
Figure G2008800226640D00474
试剂从发育玉米中提取,该试剂得自LifeTechnologies Inc.,Rockville,MD,20849(GIBCO-BRL),包含苯酚和硫氰酸胍。用mRNA纯化试剂盒从总RNA纯化出多聚腺苷酸mRNA,该mRNA纯化试剂盒得自Amersham Pharmacia Biotech Inc,Piscataway,NJ,08855,其由寡脱氧胸苷酸纤维素离心柱构成。为了制备cDNA文库,将5.5ug polyA RNA用于cDNA合成试剂盒,该试剂盒获取自Stratagene,La Jolla,CA,92037。
Figure G2008800226640D00481
逆转录酶可获取自LifeTechnologies Inc.,Rockville,MD,20849(GIBCO-BRL)。BRL cDNASize Fraction Columns(GIBCO-BRL)可用于按大小分离cDNA,所得片段可进行沉淀、重悬并与1ug Uni-ZAP XR载体连接。在连接后,可将它包装到Gigapack III
Figure G2008800226640D00482
包装提取物中,该提取物得自Stratagene,La Jolla,CA,92037。可估计未扩增的文库滴度。可使用合适的量用于扩增目的以制备扩增cDNA。
按照本领域的技术人员熟知的标准规程筛选RT1 cDNA(Ausubel等人,1993,“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley & Sons,USA,或Sambrook等人,1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press)。简而言之,可将1.5X 106个噬菌体克隆铺板,然后转移到尼龙膜上,然后将其用放射性标记的RT1探针进行杂交。分离阳性克隆,并用RT1特异性引物通过PCR检查它们的特性是否和RT1 cDNA相同。分离提供PCR反应阳性结果的最长cDNA克隆并进行测序。
实施例5
乙烯诱导RT1基因
经由PLACE数据库(Higo等人,(1999)Nucleic Acids Res.27,297-300)进行的RT1基因启动子分析揭示了两个ERELEE4乙烯响应元件(TTTGAATTT和TTTGAAAT)存在。为了确定是否RT1基因受乙烯处理诱导,B73幼苗在纸卷中生长11天,光室中湿度60%,温度28℃,光周期为16h光照,8h黑暗,然后将其转移到1.5×10-4M乙烯利溶液中(Sigma Aldrich)。对照植物在蒸馏水中生长。在暴露于乙烯以后0、1、2.5和4小时时从初生根中分离RNA,并且在相同时间点从对照植物中也分离RNA。用RT1特异性寡核苷酸引物(4405F,SEQ ID NO:14,和etr4Rnew,SEQ ID NO:15)进行PCR反应。组蛋白2A(GenebankAAB04687)用作对照物。图2显示RT1基因在处理2.5小时时的诱导。
实施例6
RT1基因的基因确定
编码用于改变根构造的RT1分离核酸片段的基因确定可通过用分离RT1克隆序列转化rt1突变体完成。
来自其它谷类的RT1同源物也能在此体系中进行测试,测试通过获取全长基因序列、连接到合适的启动子如RT1启动子并与玉米rt1突变体互补。
为了确定RT1基因可能的组织特异表达,可通过RNA印迹分析和原位杂交分析不同组织中是否存在RT1转录物。
本领域的技术人员可用的一种转化DNA进入高等植物细胞的方法是高速弹道轰击,该方法使用涂覆有所关注的核酸构建体的金属粒子(参见Klein等人,Nature(1987)(London)327:70-73,以及参见美国专利公开4,945,050)。一种Biolistic PDS-1000/He(BioRADLaboratories,Hercules,CA)可用于这些互补实验。可将粒子轰击技术用于转化RT1突变体,转化使用编码功能性RT1蛋白的克隆RT1野生型序列[SEQ ID NO:12的核苷酸50至1382(终止)]。
来自吸水链霉菌的细菌潮霉素B磷酸转移酶(Hpt II)基因可用作玉米转化的选择性标记,该基因赋予对抗生素潮霉素的抗性。在载体pML18中,Hpt II基因能与来自花椰菜花叶病毒的35S启动子和来自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶基因的终止和聚腺苷酸化信号进行工程化处理。pML18在WO 97/47731中描述,它公布于1997年12月18日,其公开内容以引用方式并入本文。
衍生的玉米胚性愈伤组织培养物就转化实验而言起到源极材料的作用。该材料能通过无菌玉米种子发芽生成,种子在愈伤组织诱导培养基(MS salts,Nitsch和Nitsch维生素,1.0mg/l,2,4-D和10μM AgNO3)中,在暗处、27-28℃条件下培养。然后将从胚芽盾片中增生的胚性愈伤组织转移到CM培养基中(N6salts,Nitsch和Nitsch维生素,1mg/l,2,4-D,Chu等人,1985,Sci.Sinica 18:659-668)。愈伤组织培养物通过每两周的常规传代培养在CM上维持,在诱导10周内用于转化。
可制备愈伤组织用于转化,所述制备通过传代培养0.5-1.0mm切片,每片距离大约1mm,排列于直径约4cm的圆形区域中,在圆形区域的中心将Whatman#541滤纸置于CM培养基上。带愈伤组织的平板在暗处,27-28℃下培养3-5天。在轰击前,将带愈伤组织的过滤器转移到补充了0.25M甘露糖醇和0.25M山梨醇的CM中,暗处培养3小时。然后在无菌纱布中将培养皿盖子保持微开状态20-45分钟以去除组织上的水分。
每个基因组DNA片段与pML 18共沉淀,它包含用于玉米转化到金颗粒表面上的选择性标记。为了完成此步骤,将总计10μg DNA,以2∶1的特定DNA:选择性标记DNA比率加入到50mL金颗粒的等分试样中,使其浓度为以60μg mL-1的浓度重悬金颗粒。然后将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺(20μL的0.1M溶液)加入到金-DNA悬浮液中,将管涡旋3分钟。金颗粒在微量离心机中离心1秒钟,移除上清液。然后用1mL纯乙醇洗涤两次,随后重悬于50mL纯乙醇中并超声处理(水浴式超声波破碎仪)一秒钟以分散金颗粒。将金悬浮液在-70℃培养五分钟,如需要的话进行超声处理(水浴式超声波破碎仪)以分散颗粒。然后将六mL涂覆有DNA的金颗粒加到聚酯薄膜大载体盘上并使得乙醇蒸发。
在干燥末期,将包含组织的培养皿置于PDS-1000/He腔室中。然后将该腔室中的空气抽出至28-29英寸汞柱的真空。利用在击波管中氦气压力达到1080-1100psi时破裂的可破裂膜,宏载体被氦气冲击波加速。将组织置于距离停止筛网大约8cm处,将所述愈伤组织轰击两次。这样二至四个平板的组织用涂覆有DNA的金颗粒轰击。在轰击后,将愈伤组织转移到未补充山梨醇和甘露糖醇的CM培养基中。
在轰击后3-5天内,将愈伤组织转移至SM培养基(包含50mg/l潮霉素的CM培养基)。为了完成此步骤,将愈伤组织从板中转移到无菌50mL圆锥管中并称重。加入40℃的熔化顶层琼脂,使用2.5mL顶层琼脂/100mg愈伤组织。将愈伤组织块破碎成直径小于2mm的碎片,这通过重复分配通过10mL吸移管。将3mL愈伤组织悬浮液的等分试样铺板于新制SM培养基上,并将板在27-28℃暗培养4周。在4周后,鉴定转基因愈伤组织事件,并将其转移到新制SM板上,在27-28℃条件下暗处另外培养2周。
然后将生长的愈伤组织转移到RM1培养基(MS盐,Nitsch和Nitsch维生素,2%蔗糖,3%山梨醇,0.4%固化剂(gelrite)+50ppm hyg B),在25℃下暗培养2周。在2周后,将愈伤组织转移到RM2培养基(MS盐,Nitsch和Nitsch维生素,3%蔗糖,0.4%固化剂(gelrite)+50ppmhyg B)并置于冷白光下(~40μEm-2s-1),光周期为12小时,温度为25℃,湿度为30-40%。在光下培养2-4周后,愈伤组织开始形成有机体并出苗。将苗从围绕的愈伤组织/培养基中移除并轻轻转移到RM3培养基(1/2×MS盐,Nitsch和Nitsch维生素,1%蔗糖+50ppm潮霉素B),phytatray中(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO),可使用如上述步骤所述相同条件继续培养。
在2-3周后,当植物已经长出足够的根和苗后,可将植物从RM3转移到包含Metro mix 350的4″罐中。可检查从转基因植物中获取的种子用于RT1突变与包含RT1基因的野生型基因组DNA的遗传互补。
实施例7
表征编码RT1同源物的cDNA克隆
使用来自表1中列出的克隆的EST序列进行的BLASTX搜索揭示由ORF编码的多肽与来自大米和拟南芥的蛋白的相似性。编码来自大米的最接近多肽RT1同源物的核苷酸序列在SEQ ID NO:16中示出,并且对应的氨基酸序列在NCBI General Identifier No:115434026,SEQ IDNO:17)中示出。编码来自拟南芥的最接近多肽RT1同源物的核苷酸序列在SEQ ID NO:18中示出,并且对应的氨基酸序列在NCBI GeneralIdentifier No:15217667,SEQ ID NO:19)中示出。来自大米和拟南芥的蛋白可分别定位于Os01g01600(TIGR)和Atlg27660(TAIR)。
表1和表2中所示的分别为单独的EST(“EST”)的文献和专利BLAST结果、包含标明的cDNA克隆的整个cDNA插入物的序列(“FIS”),由两个或更多个EST装配而成的重叠群序列(“Contig”),由FIS和一个或更多个EST装配而成的重叠群序列(“Contig*”),或编码源自FIS、重叠群或FIS和PCR的整个蛋白质的序列(“CGS”)。也示出了编码RT1及其同源物的序列的百分比同一性。
表1
BLAST结果(文献)和编码RT1及其同源物的序列的百分比同一性
Figure G2008800226640D00521
使用玉米RT1序列(SEQ ID NO:12)进行的BLASTX搜索揭示了它与来自水稻(GI No.115434026,SEQ ID NO:17)和拟南芥(GI No.15217667 SEQ ID NO:19)的RT1同源多肽的相似性,表1和2中示出的是单个EST(“EST”)、包含标明的cDNA克隆(“FIS”)的整个cDNA插入序列的序列、由两个或更多个EST装配的重叠群序列、FIS或PCR序列(“重叠群”)、或编码来源于FIS或重叠群(“CGS”)的完整或功能性蛋白的序列的BLAST结果:
表3
编码RT1同源多肽的序列的BLAST结果(专利)
Figure G2008800226640D00531
用LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的Megalign程序进行序列比对和百分比同一性计算。用带默认参数(空位罚分=10,空位长度罚分=10)的Clustal比对方法(Higgins和Sharp,1989,CABIOS.5:151-153)进行序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数为KTUPLE 1,空位罚分=3,窗口=5,DIAGONALSSAVED=5。
在杜邦专有数据库中存在另外一种玉米RT1同源物。玉米克隆cfp7n.pk6.i3(SEQ ID NO:20编码RT1样蛋白(SEQ ID NO:21),该蛋白基于Clustal比对方法具有与B73RT1蛋白(SEQ ID NO:13)47.2%的同一性。玉米RT1蛋白和大米、拟南芥以及来自克隆cfp7n.pk6.i的氨基酸序列(SEQ ID NO:13;17、19、和21)的玉米同源物的比对在图3A至3B中示出。在所有四个序列中两个序列基序(基序I,SEQ ID NO:22,和基序II,SEQ ID NO:23进行比对)是高度保守的,并且在比对中用下划线标出。
实施例8
拟南芥RT1样基因的敲除分析
为了限定拟南芥中RT1基因的功能,可从Salk Institute GenomeAnalysis Laboratory(SIGnAL)数据库中检索在Atlg27660位点(参见实施例7)中包含T-DNA插入序列的若干敲除品系。具体地讲,可检索并种植来自两个品系Salk 102156和Salk 001968的种子,所述品系分离在所述基因的第二个内含子中存在的T-DNA插入序列。可使用侧接T-DNA插入序列的引物,按照数据库提供的说明确定幼苗基因型,并且可使用软件
Figure G2008800226640D00541
(Regent Instruments Inc)确定在纯合体状态包含T-DNA插入序列的植物根的基因型。
Figure G2008800226640D00542
是一种图像分析系统,特定设计用于根测量,它在像素中使用对照以从较暗背景中辨别较亮的根(也参见实施例21)。
实施例9
制备含有RT1基因或其同源物的植物表达载体
可以使用诸如BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool);Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1993;也参见美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的万维网网址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法,鉴定与RT1基因同源的序列。RT1基因(SEQID NO:12)或RT1样基因(例如SEQ ID NO:20中所公开的基因)可以通过如下方法中的任一种来进行PCR扩增。
方法1(基于RNA的方法):基于RT1(从SEQ ID NO:12的核苷酸50延伸至1382)或RT1同源物(例如从SEQ ID NO:20的核苷酸83延伸至1540的序列)的蛋白编码区的5’和3’序列信息,可设计基因特异性引物。可以将RT-PCR用于植物RNA来获得含有RUM 1蛋白编码区的核酸片段,该RT1蛋白编码区旁侧为attB1(SEQ ID NO:24)和attB2(SEQ ID NO:25)序列。引物可以含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。
方法2(基于DNA的方法):作为另外一种选择,可PCR扩增编码RT1(SEQ ID NO:12或多肽同源物(如SEQ ID NO:20编码的RT1同源物)的克隆的完整cDNA插入序列(包含5’和3’非编码区)。可以设计正向引物和反向引物,使它们分别或者含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBluescript SK+中的cDNA插入序列,可以使用正向引物VC062(SEQ ID NO:26)和反向引物VC063(SEQ ID NO:27)。
方法1和方法2可以根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如,方法1的引物可以含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点,用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外,方法2可以涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。
可以利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与
Figure G2008800226640D00551
供体载体(例如pDONRTM/Zeo(InvitrogenTM,图5;SEQ ID NO:28)或pDONRTM221(InvitrogenTM,图6;SEQ ID NO:29)组合。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从该供体载体移除并定向地克隆了该在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。利用InvitrogenClonaseTM技术,可随后将该入门克隆的RT1或RT1样基因转移至合适的目的载体以获得用于大豆和玉米的植物表达载体,例如分别是PHP27840(图7;SEQID NO:30)或PHP23236(图8;SEQ ID NO:31)。
作为另外一种选择,可以进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSite
Figure G2008800226640D00553
LR重组反应以产生表达载体。这类反应的一个例子在实施例14中有所描述,该实施例描述了用于转化玉米品系的玉米表达载体的构建。
实施例10
制备大豆表达载体并用RT1或其同源物转化大豆
为了检查所得表型,可转化大豆植物以过表达RT1和其同源物,例如SEQ ID NO:20中示出的RT1样基因。
可以将实施例9中所述的入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体(图7,SEQ ID NO:30)中,使得该基因的表达处于SCP1启动子的控制下。
然后可以用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。
为了诱导体细胞胚,可以将子叶(长度为3-5mm,从大豆品种A2872的表面灭菌的未成熟种子解剖出来)于26℃在光下或黑暗下培养6-10周。然后切取体细胞胚(其产生次生胚)并将其置于合适的液体培养基内。在重复选择增殖为早期球形阶段胚的体细胞胚的簇后,按下面的描述保持该悬浮液。
可以将大豆胚发生悬浮培养物在26℃下在摇床(150rpm)上的35mL液体培养基中保持,荧光光照采用16∶8小时(白天/黑夜)的时间表。通过将大约35mg组织移植进35mL液体培养基中,每两周将培养物进行继代培养。
然后可以通过基因枪轰击方法(Klein等人,Nature(London)327:70-73,1987;美国专利4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。杜邦公司的BiolisticTMPDS1000/HE仪器(氦气改进型)可以用于这些转化。
可用于帮助大豆转化的可选标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人,Nature 313:810-812,1985)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌;Gritz等人,Gene 25:179-188,1983)的潮霉素磷酸转移酶基因以及胭脂碱合成酶基因的3′区构成的嵌合基因,该胭脂碱合成酶基因来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的T-DNA。可用于帮助大豆转化的另一种可选标记基因是来自大豆或拟南芥属的除草剂抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中的第一共用酶。已经鉴定出ALS中的突变导致对三类ALS抑制剂中的某些或全部具有抗性(美国专利5,013,659;藉此将其全部内容以引用的方式并入本文)。除草剂抗性ALS基因的表达可以处于SAM合成酶启动子(美国专利申请No.US-2003-0226166-A1;藉此将其全部内容以引用的方式并入本文)的控制下。
将如下物质(依次)加入50μL 60mg/mL的1μm金颗粒悬浮液:5μLDNA(1μg/μL)、20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl2(2.5M)。然后搅拌该颗粒制备物三分钟,在微量离心机(microfuge)中离心10秒并移除上清液。然后将DNA包覆的颗粒在400μL 70%乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μL无水乙醇中。可以将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次,每次一秒钟。然后将5μL该DNA-包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。
将大约300-400mg两周大的悬浮培养物置于60×15mm的空培养皿中并用吸管将残留的液体从组织移除。对于每次转化实验,大约5-10板的组织受到正常轰击。膜破裂压力设定为1100psi并将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡网大约35英寸的地方并轰击三次。轰击后,可以将组织分成两份并放回液体培养基中,如上所述进行培养。
轰击后五至七天,用新鲜培养基更换该液体培养基,并在轰击后七至十二天,用含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。可以每周更换这种选择培养基。轰击后七至八周,可以观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并将其移植进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可以将每一新品系当成是独立的转化事件。然后可以将这些悬浮培养物作为未成熟胚进行继代培养和维持,或者通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。
可以通过在土壤中栽培植株并在分析总根量前洗涤根来测量大豆增强的根构造,该测量使用
Figure G2008800226640D00571
(Regent Instruments Inc)软件,该软件是专门设计用于根测量的图像分析系统。利用像素对照来从较暗的背景辨别出根构造。
然后可以分析用RT1基因转化的大豆植株以研究相对于对照或参照植株的农学特性,例如,在多种环境条件(如氮限制条件、干旱等)下的氮利用效率、产量增强和/或稳定性。
实施例11
用RT1基因和其同源物使用粒子轰击转化玉米
可以转化玉米植株以过表达RT1和RT1样基因,以便检验所得的表型。
可以将实施例9中所述的
Figure G2008800226640D00573
入门克隆用于将每种基因定向克隆进玉米转化载体中。玉米基因的表达可以处于组成型启动子的控制下,例如玉米泛素启动子(Christensen等人,Plant Mol.Biol.12:619-632,1989,以及Christensen等人,Plant Mol.Biol.18:675-689,1992)。
然后可以通过下面的方法将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。可以从源于自交玉米系H99和LH132杂交的发育中的颖果切取未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分离胚,这时它们长为1.0至1.5mm。然后将胚以轴线侧朝下放置并与琼脂糖硬化的N6培养基(Chu等人,Sci.Sin.Peking 18:659-668,1975)接触。将胚在27℃下保持在黑暗中。从这些未成熟胚的胚鳞增生出易脆的胚发生愈伤组织,该愈伤组织由未分化的细胞块构成,在胚柄结构上长有体细胞原胚状体和胚状体。可以将从该原外植体分离的胚发生愈伤组织在N6培养基上培养,并每两至三周在这种培养基上进行继代培养。
可以将质粒p35S/Ac(得自Peter Eckes博士,Hoechst Ag,Frankfurt,Germany)用于转化实验以变提供可选标记。该质粒含有pat基因(见欧洲专利公布0242236),该基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)。酶PAT赋予对除莠谷氨酰胺合成酶的抑制剂(膦丝菌素)的抗性。p35S/Ac的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人,Nature 313:810-812(1985))和胭脂碱合成酶基因的3′区的控制下,该胭脂碱合成酶基因来自根瘤农杆菌Ti质粒的T-DNA。
可以将基因枪方法(Klein等人,Nature 327:70-73(1987))用于将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法,利用下面的技术用DNA包覆金颗粒(直径1μm)。将10μg质粒DNA加至50μL金颗粒悬浮液(每mL 60mg)中。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)加至该颗粒。再加入这些溶液过程中涡旋该悬浮液。10分钟后,将试管粗略地离心(以15,000rpm进行5秒钟)并移除上清液。将该颗粒再悬浮于200μL的无水乙醇中,再次离心并移除上清液。再次进行乙醇冲洗并将颗粒再悬浮于终体积为30μL的乙醇中。可以将DNA包覆的金颗粒等分试样(5μL)置于KaptonTM飞行圆盘(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用PDS-1000/He(Bio-RadInstruments,Hercules CA),采用1000psi的氦气压、0.5cm的间隙距离以及1.0cm的飞行距离,将颗粒加速射入玉米组织中。
对于轰击,将胚发生组织置于琼脂糖硬化的N6培养基上的滤纸上。组织布置成薄薄一层,并覆盖直径为约5cm的圆形区域。然后可以将包含组织的培养皿置于离阻挡网大约8cm的PDS-1000/He的腔室内。然后将该腔室中的空气抽出至28英寸汞柱的真空。利用在击波管中氦气压力达到1000psi时破裂的可破裂膜,宏载体被氦气冲击波加速。
轰击后七天,可以将组织转移至N6培养基中,该培养基含有双丙氨膦(每升5mg)并缺少酪蛋白或脯氨酸。组织继续在这种培养基上缓慢生长。另外两周后,可以将组织转移至含有bialophos的新鲜N6培养基上。六周后,在某些装有补充了双丙氨膦的培养基的盘上,可以辨别直径约1cm的区域上有活性生长的愈伤组织。当在选择培养基上继代培养时,这些愈伤组织可以继续生长。
通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2,4-D的N6培养基中,可以从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后,可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人,Bio/Technology 8:833-839(1990))。
可以再生出转基因的T0植株并按照下面的HTP步骤确定它们的表型。可以收集T1种子。
可以栽培T1植株并分析表型变化。利用图像分析可以定量下面的参数:可以收集并定量植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。导致与合适的对照植物比较时根构造改变的表达载体可以被认为是RT1基因在玉米中发挥功能而改变根构造的证据。
此外,可以将含有RT1基因的重组DNA构建体引入玉米品系中,该引入或者是通过直接转化或者是通过从独立转化的品系基因渗入而来。
可以对转基因植株(或者是自交的或者是杂交的)进行更有力的基于田间的实验来研究在多种环境和土壤条件下(如营养物质的改变和水的可利用性)的产量提高、改善的根穿透和/或抗根倒伏性。
还可以进行后续的产量分析以确定含有RT1基因的植株在与未包含RT1基因的对照(或参照)植株比较时是否具有产量表现的改善。在各种环境条件下,含有RT1基因的植株相对于对照植株将具有较少的产量损失,优选少于50%的产量损失,或相对于对照植株将具有增加的产量。
实施例12
农杆菌LBA4404的电穿孔
将电穿孔感受态细胞(40μL),例如根瘤农杆菌LBA4404(含有PHP10523,图9,SEQ ID NO:32)在冰上解冻(20至30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时,将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。
将DNA等分试样(0.5μL JT(US 7,087,812)亲代DNA,在低盐缓冲液或双蒸H2O中的浓度为0.2μg至1.0μg)与解冻的农杆菌细胞混合,同时仍然保持在冰上。将该混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1至2分钟。通过按下“pulse(脉冲)”键两次(理想的是获得4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后,将0.5mL 2xYT培养基(或SOCmedium)加至电穿孔管并转移至15mLFalcon管中。将细胞在28至30℃、200至250rpm下孵育3小时。
将250μL的等分试样散布在#30B(YM+50μg/mL奇放线菌素)板上并在28至30℃下孵育3天。为了增加转化体的数目,可以进行如下两个可选步骤中的其中一个:
选择1:用30μL 15mg/mL的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。
选择2:进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。
转化体的鉴定
选取四个独立的克隆并划痕接种在AB基本培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#12S培养基)上用于分离单个克隆。将平板在28℃下孵育2至3天。
对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其与4mL具有50mg/l的奇放线菌素的#60A孵育。将该混合物在28℃下摇动孵育24小时。采用Qiagen Miniprep+可选的PB洗涤,从4mL培养物分离出质粒DNA。DNA在30μL中洗提。将2μl等分试样用于如上所述电穿孔20μL DH10b+20μl ddH2O。
可任选地,可将15μL等分试样用于转化75至100μL的InvitrogenLibrary Efficiency DH5α。将细胞散布在LB培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#34T培养基)上并将其在37℃下孵育过夜。
对于每个推定的共整合体选取3至4个独立的克隆并将其接种在4mL具有50μg/mL奇放线菌素的2xYT(#60A)上。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。
Miniprep从4mL培养物分离质粒DNA,任选进行PB洗涤(在50μl中洗提)。将8μL用于用SalI消化(使用JT亲代DNA和PHP10523作为对照)。
对于4个质粒利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用亲代DNA和PHP10523作为对照),这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。
作为另一种选择,对于高通量应用,例如针对Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系(实施例16至18)所描述的,代替通过限制性酶切分析来评价所得的共整合载体,可将三个克隆同时用于感染步骤。
实施例13
农杆菌属细菌介导的玉米的转化
可以转化玉米植株以过表达RT1和RT1样基因,以便检验所得的表型。
农杆菌属细菌介导的玉米转化基本上按照Zhao等人,Meth.Mol.Biol.318:315-323(2006)中描述的方法进行(还可参见Zhao等人,Mol.Breed.8:323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840,以引用的方式将该文献并入本文)。该转化过程涉及细菌接种、共孵育、静止期、选择以及植株再生。
1.未成熟胚的制备
从颖果切取未成熟胚并置于装有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。
2.胚的农杆菌属细菌感染以及共培养
2.1感染步骤
用1mL微量吸移管移除PHI-A培养基并加入1mL农杆菌属细菌悬浮液。轻轻倒置该管进行混合。将该混合物在室温下孵育5分钟。
2.2共培养步骤
用1mL微吸移管将农杆菌属细菌悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。确定胚的朝向,使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚的平板在20℃下于黑暗中培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体,补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。
3.推定的转基因事件的选择
向100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的每平板中转移10个胚,保持朝向,并用parafilm将培养皿密封。将平板在28℃下于黑暗中孵育。预计在6-8周将看见活性生长的推定事件(作为浅黄色胚组织)。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的,并且几乎没有看见脆性组织生长。以2至3周的间隔(取决于生长速率)将推定的转基因胚组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行继代培养。记录事件。
4.T0植株的再生
将在PHI-D培养基上增殖的胚组织转移至100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚成熟培养基)进行继代培养并在28℃下,在黑暗中孵育约10至18天,直至体细胞胚成熟。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中,并且在28℃于光中(约80μE,来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在7至10天,将约10cm高的再生植株盆载于园艺混合物中,并使用标准园艺方法使其受冷而变得耐寒。
用于植物转化的培养基
1.PHI-A:4g/L的CHU基础盐、1.0mL/L的1000×Eriksson维生素混合物、0.5mg/L的盐酸硫胺素、1.5mg/L的2,4-D、0.69g/L的L-脯氨酸、68.5g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖,pH为5.2。在使用前加入100μM的乙酰丁香酮,过滤灭菌。
2.PHI-B:无葡萄糖的PHI-A,2,4-D增加至2mg/L,蔗糖减少至30g/L并且补充有0.85mg/L的硝酸银(过滤灭菌),3.0g/L的固化剂(gelrite),100μM的乙酰丁香酮(过滤灭菌),pH为5.8。
3.PHI-C:无固化剂和乙酰丁香酮的PHI-B,2,4-D减少至1.5mg/L并且补充有8.0g/L的琼脂,0.5g/L的Ms-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液,100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭菌)。
4.PHI-D:补充有3mg/L的双丙氨膦(过滤灭菌)的PHI-C。
5.PHI-E:43g/L的Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco,BRL11117-074)、0.5mg/L的烟酸、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.1g/L的肌醇、0.5mg/L的玉米素(Sigma,商品目录号:Z-0164)、1mg/L的吲哚乙酸(IAA)、26.4μg/L的脱落酸(ABA)、60g/L的蔗糖、3mg/L的双丙氨膦(过滤灭菌)、100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭菌)、8g/L的琼脂,pH为5.6。
6.PHI-F:不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E;蔗糖减少至40g/L;用1.5g/L的固化剂代替琼脂;pH为5.6。
通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2,4-D的N6培养基中,可以从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后,可以将组织转移至再生培养基(Fromm等人,(1990)Bio/Technology 8:833-839)中。
可以进行对转基因T0植株和T1植株的表型分析。
可以分析T1植株表型的变化。利用图像分析,可以在植株生长过程中在多个时间点,分析T1植株在植株面积、体积、生长速率方面的表型变化以及可以进行颜色分析。可以如实施例21中所述分析根构造的改变。
可以对农学特性的改变进行后续分析以确定含有RT1或RT1L基因的植株在与不含有R1T或RT1L基因的对照(或参照)植株比较时,是否具有至少一种农学特性的改善。还可以在多种环境条件下研究改变。
实施例14
利用农杆菌属细菌介导的转化构建具有RT1和RT1样基因的玉米 表达载体
玉米表达载体可使用RT1(SEQ ID NO:12)和RT1样基因(SEQID NO:20)在NAS2(SEQ ID NO:33)、GOS 2(SEQ ID NO:34)或泛素(UBI1ZM;SEQ ID NO:35)启动子的控制下进行制备。PINII是终止子(SEQ ID NO:36)。
使用Invitrogen’sTM
Figure G2008800226640D00631
技术,含有玉米RT1基因或玉米类RT基因的入门克隆(如实施例9中所述产生)可以用于单独的与:
1)组成型玉米GOS2启动子入门克隆PHP28408(图10,SEQ IDNO:37)和PinII终止子入门克隆PHP20234(图11,SEQ ID NO:38)的
Figure G2008800226640D00632
LR反应,形成目的载体PHP28529(图12,SEQ ID NO:39)。
2)根玉米NAS2启动子入门克隆PHP22020(图13,SEQ ID NO:40)和PinII终止子入门克隆PHP20234(图11,SEQ ID NO:38)的
Figure G2008800226640D00633
LR反应,形成目的载体PHP28529(图12,SEQ ID NO:39)。
3)组成型玉米UBI1ZM启动子入门克隆PHP23112(图14,SEQ IDNO:41)和PinII终止子入门克隆PHP20234(图11,SEQ ID NO:38)的
Figure G2008800226640D00634
LR反应,形成目的载体PHP28529(图12,SEQ ID NO:39)。
目的载体PHP28529还给每种最终载体添加:
1)RD29A启动子::黄色荧光蛋白::PinII终止子盒,用于拟南芥属种子分选。
2)泛素启动子::moPAT/红色荧光蛋白融合基因::PinII终止子盒,用于转化选择和玉米种子分选。
除了GOS2或NAS2启动子,其他启动子,例如但不限于S2A和S2B启动子、玉米ROOTMET2启动子、玉米Cyclo、CR1BIO、CRWAQ81以及玉米ZRP2.4447,可用于引导RT1和RT1样基因在玉米中的表达。此外,多种终止子,例如但不限于PINII终止子,可以用于完成所关注基因在玉米中的表达。
实施例15
利用农杆菌属细菌介导的转化用RT1和RT1样基因转化玉米品系
然后,可以将最终载体(实施例14)独立地用电穿孔法进入含有PHP10523(图9;SEQ ID NO:32,Komari等人,Plant J 10:165-174(1996),NCBI GI:59797027)的LBA4404农杆菌中以产生共整合载体用于玉米转化。该共整合载体是通过最终载体(玉米表达载体)与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。除了实施例14中所述的表达盒,该共整合载体还含有农杆菌属菌株以及农杆菌属细菌所介导的转化所需的基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)。转化玉米品系可以如实施例18所述进行。
实施例16
用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的目的载体PHP23236和 PHP29635的制备
目的载体PHP23236(图8,SEQ ID NO:31)是通过用质粒PHP23235(图15,SEQ ID NO:42)转化包含质粒PHP10523(图9,SEQ ID NO:32)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP23236可以被用于如实施例9所述的与入门克隆的重组反应,以产生用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于泛素启动子(SEQ ID NO:35)的控制之下。
PHP29635(图16,SEQ ID NO:43)是通过用质粒PIIOXS2a-FRT87(ni)m(图17,SEQ ID NO:44)转化包含质粒PHP10523的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP29635可以被用于如实施例10所述的与入门克隆的重组反应,以产生用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于S2A启动子(SEQ ID NO:45)的控制之下。
实施例17
制备包含RT1或RT1样的质粒
用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的基因
利用Invitrogen’s
Figure G2008800226640D00651
重组技术,可以产生含有RT1或RT1样基因的入门质粒,如实施例10中所述,并且将该质粒用于将每种基因定向克隆进目的载体PHP23236(实施例16)中用于在泛素启动子的控制下表达,或定向克隆进目的载体PHP29635(实施例16)中用于在S2A启动子的控制下表达。每一种表达载体都是用于农杆菌属细菌介导的玉米转化的T-DNA二元载体。
Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系可以如实施例18中所述用表达载体转化。
实施例18
用RT1和RT1样基因转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系
可以转化玉米植株以过表达RT1和RT1样基因,以便检验所得的表型。
受体植株
受体植株细胞可以来自具有短的生活周期(“快速循环”)、大小减少以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Bay Flint(GBF)品系变种的植株细胞。一种可能的候选植株品系变种是GBF×QTM(Quick Turnaround Maize(快速周转玉米),选择用于在温室条件下生长的Gaspe Bay Flint的可公开获得形式)的F1杂种,其在Tomes等人的美国专利申请公开No.2003/0221212中有所公开。从该品系获得的转基因植株具有如此小的大小使得它们可以在4英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植株所需空间的1/4)并且它们在少于2.5个月时间内成熟。(传统上,一旦转基因植株适应温室后需要3.5个月来获得转基因T0种子。)另一合适的品系是GS3(高度可转化的品系)×Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良自交系。
转化规程
任何合适的方法可以用于将转基因引入玉米细胞中,包括但不限于利用基于农杆菌载体的接种类型的步骤。转化可以在受体(靶标)植株的未成熟胚上进行。
精确的生长和植株跟踪
将由转化的玉米胚产生的转基因(T0)植株的事件群体在受控的温室环境中栽培,该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植株布局,在该布局中,实验植株被分成组(如,每组30株植株),称为块,而每株植株随块被随机分配一个位置。
对于一组30株植株,24株转化的实验植株和6株对照植株(具有设定好的表型的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中,这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列(也叫做重复组或块)。每株植株(对照植株或实验植株)随块被随机分配一个位置,所述的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个30株植株的重复组中的每一个可以栽培在相同的温室中。应该确定重复组的布局(布置方式)以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可以称为压缩的温室布局。
对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因植株。可以将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评估引入基因的表达水平。可以将不表达转基因的T0植株与表达转基因的那些植株进行比较。
在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株,并且从那些植株收集的数据自动与那些植株相关联,使得所搜集的数据可以与由该植株携带的转基因关联。例如,每个植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码),该标签包含了关于植物身份的信息,身份信息继而又与温室位置相关,使得从植物获得的数据可以自动与该植物相关联。
作为另外一种选择,可以使用任何有效的、机器可读的植物识别系统,例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID),其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国公布的专利申请No.2004/0122592,将其以引用的方式并入本文。
利用三维成像进行表型分析
对T0事件群体中的每株温室植株(包括任意对照植株)分析所关注的农学特性,并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据,该方式使得数据与该植株的辨识数据(见上面)相关联。可以利用与上述类似的实验设计,可以在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。
在植物的整个温室生活周期中,利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植株以评估所关注的性状。优选的是,将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可以在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。
由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变,最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可以通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。
在单次成像分析操纵中,进行如下事件:(1)将植株传送至分析仪区域内,旋转360度以便其机器可读标签可以被读取,并且让其保持静止直至其叶片停止移动;(2)获取侧面图像并将其输入数据库;(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动,以及(4)将该植株传送出分析仪。
每24小时的周期让植物至少6个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。
成像仪器
可以使用任何合适的成像仪器,包括但不限于可从LemnaTec GmbH(Wurselen,Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec ScanalyzerHTS LT-0001-2进行分析。该成像照相机可以配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可以利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。优选的是,对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5%,对于次要组成成像分析仪的仪器差异小于约10%。
软件
成像分析系统包括用于颜色和结构分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可以将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。多种可商购获得的软件系统(例如Matlab,其它软件)可用于定量解释图像数据,并且可将这些软件体系中的任何一种应用于所述图像数据集。
传送系统
具有植物旋转装置的传送系统可以用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如,将最多4株植物(每株最高高度为1.5m)装上汽车,该汽车在循环的传送系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下,该单位(成像分析仪和传送环线)的总占有面积为约5m×5m。
可以扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。
照明
任何合适的照明模式可用于图像采集。例如,可以在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择,可以采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择,可以变化照明以引起转基因(如,绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。
基于三维成像的生物量估计
为了更好地估计生物量,应该从至少三个轴(优选顶部视图和两个侧面(侧面1和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可以通过如下计算估计植物的体积:
Figure G2008800226640D00681
在上面的等式中,体积和面积的单位是“任意单位”。在该体系中,任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响,因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值(正-较大和负-较小两者)。大小(如面积)的任意单位可以通过将物理参照加至成像过程而轻易地转化成物理量度。例如,可以在顶部成像过程和侧面成像过程两者中都包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积,可以测定转换因子以允许从像素转换为面积单位,例如平方厘米(cm2)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如,具有已知直径和高度的盆足可以用作物理参照。
颜色分类
成像技术还可以用于确定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统,可以通过多种计算方法确定颜色分类。
对于植物大小和生长参数的测定,一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方案,包括绿色的两种或三种色调,此外,还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型,其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色),并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物,使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变,或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。
除了其在测定植物的大小、生长中的有效性,颜色分类还可以用于评估其他产量构成性状。对于这些其他产量构成性状,可以使用另外的颜色分离方案。例如,称为“保绿度(staygreen)”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可以通过颜色分类来评估,该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用于在T0或T 1植物生活周期末获取的图像,可以鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如,可以表示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可以被鉴定为携带影响这种重要农学特性的转基因。
熟练的植物学家将认识到可以指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素)的出现,以及认识到其他颜色分类方案可以提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。
植物结构分析
改变植物结构参数的转基因也可以用本发明鉴定,包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可以如下用于确定植物结构。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何结构,并且随后,基于该图像,可以进行不同结构参数的参数化识别。改变(或者是单独地或者是组合地)任意这些结构参数的基因可以通过应用此前所述的统计方法鉴定。
花粉脱落日期
花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数,并且可以通过活性雄花第一次出现在植物上来确定。为了找到雄花目标,通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花,活性花继而可以用于计算花粉脱落日期。
作为另外一种选择,花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授粉日期、第一穗丝日期)可以由负责进行植物看护的工作任人员来记录。为了使数据完整性和过程效率最大化,通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可以将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易,以及使捕捉数据的操纵者变得舒适。
植物的取向
以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的结构。也就是说,植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物,给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的最大差别。将顶部图像用于确定植物的主轴,而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。
实施例19
在氮限制条件下筛选Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系
氮利用率可通过在田间的氮消耗土壤上通过种植多列玉米、或通过在温室中使用如本文所述的实验条件进行测试。转基因植物将含有两个或三个剂量的Gaspe Flint-3与一个剂量的GS3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X),并且对于显性转基因将会以1∶1分离。将植物在Turface中栽培,每天用1mM KNO3生长培养基和2mM KNO3或更高的生长培养基浇洒四次(见图18)。在1mM KNO3培养基中培养的对照植物的绿度较小,产生较少的生物量并且在开花期具有较小的穗(关于样本数据的示例请参见图19)。
用统计学确定处理株之间所观察到的差异是否真有差异。图19示出了一种方法,该方法将字母放在数值后面。同一列中其后具有相同字母(不是字母组)的那些值不具有显著的差异。使用该方法,如果在一列中的值的后面没有字母,则该列中的任意这些值之间不存在显著的差异,换句话讲,该列中的所有这些值是均等的。
与无效转基因相比较,转基因的表达将导致植物在1mM KNO3中具有改善的植物生长。因此,将会在生长期间监控生物量和绿度并将其与无效转基因相比较。生长、绿度、开花期穗的大小的改善将表明氮耐受性增强。
实施例20
具有RT1或RT1样基因的玉米品系的产量分析
可以将含有RT1或RT1样基因的重组DNA构建体通过直接转化或从独立转化的品系的基因渗入来引入玉米品系中。
可以将转基因植物(自交系或杂种)进行更强的基于田间的试验,以研究在不同环境条件(例如改变水和营养物质可利用性)下的产量增加和/或稳定性。
可以进行后续的产量分析,以确定在各种环境条件下含有RT1或RT1样基因的植物与不含RT1或RT1样基因的对照植物相比较时是否具有改善的产量表现。可以测得这两种植物的产量都有所减少。相对于对照植物,含RT1或RT1样基因的植物的产量损失较少,优选产量损失少于50%。
实施例21
测定玉米根构造改变的测定法
测定转基因玉米植物在幼苗期、花期或成熟期的根构造改变。测量玉米植物的根构造改变的测定法包括但不限于下面概述的方法。为了便于手动或自动地测定根构造改变,可以让玉米植物在透明的盆中生长。
1)根量(干重)。让植物在Turface中生长。将烘干的根和根组织称重并计算根冠比。
2)侧根分枝的水平。侧根分枝的程度(如侧根数量、侧根长度)通过这样确定:从完整的根系进行二次取样,将样本用平面扫描器或数码相机成像并用WinRHIZOTM软件(Regent Instruments Inc.)分析。
3)根带宽度的测量。根带是植物成熟时在温室栽培盆的底部形成的根带或根量。测量成熟时根带的厚度(以mm为单位),作为对根量的粗略估计。
4)节生根的计数。从支持培养基(support medium)(如盆栽混合物(potting mix))中分离出根后,可以测定上部节位处出现的冠根数。另外,可以测量冠根和/或支柱根的角度。对节生根和节生根的分枝量的数值分析形成对上述手动方法的另一种延伸。
对提取的有关根表型的所有数据进行统计分析(通常为t-检验),以将转基因根与非转基因姊妹株植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下,还可以使用单因素方差分析。
实施例22
筛选Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系用于耐旱性
可用以下方法筛选具有耐旱性的含RT1或RT1样基因的转基因Gaspe Bay Flint衍生玉米品系。
转基因玉米植物经受供水良好条件(对照)和干旱胁迫条件。在T1阶段或更晚的时期筛选转基因玉米植物。
在播种后(DAS)10至14天或移植后7天时开始施加胁迫,持续至抽穗丝。在整个干旱胁迫处理期间通过自动系统给罐浇水,该自动系统配有定时器以提供25或50%的田间持水量的水。该胁迫的强度和持续时间将允许鉴定对植物生长的影响以及对开花-抽穗丝间隔的影响。
罐混合物:使用1/3蒙脱石(Profile Products LLC,IL,USA)、1/3沙土和1/3SB300(Sun Gro Horticulture,WA,USA)的混合物。SB300可用Fafard Fine-Germ(Conrad Fafard,Inc.,MA,USA)替代,并且可减少沙土在混合物中的比例。因此,最终罐混合物可以是3/8(37.5%)的蒙脱石、3/8(37.5%)的Fafard和1/4(25%)沙土。
田间持水量测定:测量用于一个S200罐(减去罐重量)的土壤混合物(w1)的重量。如果土壤混合物的所有组分都不是干燥的,在测定W1前在100℃下干燥土壤至恒重。罐中的土壤加水至完全饱和,并排出所有土壤重力水。测定排出土壤重力水后的土壤(w2)重量(减去罐重量)。田间持水量是获取自w2至w1的土壤中保有的水的重量。它可被描述为烘干土壤重量的百分比。
胁迫处理:在植物生长的早期阶段(10DAS至21DAS),供水良好的对照具有75%田间持水量的每日供水,而干旱胁迫处理具有25%田间持水量的每日供水,两者都是在或约10AM时的单日剂量。当植物进一步生长时(21DAS),必须将供水良好对照的每日供水量提高到全田间持水量,并将干旱胁迫处理的每日供水量提高到50%田间持水量。
营养物质溶液:用自来水稀释至1/16的改良Hoagland溶液被用于灌溉。
表4
使用以下配方制备20L改良Hoagland溶液
  组分   量/20L
  10X微量营养素溶液   16mL
  KH2PO4(分子量:136.02)   22g
  MgSO4(分子量:120.36)   77g
  KNO3(分子量:101.2)   129.5g
  组分   量/20L
  Ca(NO3)2·4H2O(分子量:236.15)   151g
  NH4NO3(分子量:80.04)   25.6g
  Sprint 330(铁螯合物)   32g
表5
使用以下配方制备1L 10X微量营养素溶液
  组分   mg/L   浓缩
  H3BO3   1854   30mM
  MnCl2·4H2O   1980   10mM
  ZnSO4·7H2O   2874   10mM
  CuSO4·5H2O   250   1mM
  H2MoO4·H2O   242   1mM
使用肥料级KNO3
在移植时或在出苗后加入半茶匙奥绿肥(Osmocote)(NPK 15:9:12)到罐中是有用的(The Scotts Miracle-Gro Company,OH,USA)。
边界植物:将一排边界植物放置在邻近温室玻璃墙的工作台边缘,或邻近其它潜在微环境变化原因(如制冷风扇)的工作台边缘。
自动操作:使用具有钻孔的PVC管进行浇水,使用虹吸装置将水系统的供给到放置的罐中。使用定时器安排灌溉时序。
统计分析:在不同胁迫处理条件下的转基因事件中记录的植物尺寸、颜色和叶绿素荧光的平均值将被输出到Spotfire(Spotfire,Inc.,MA,USA)。处理平均值将使用方差分析进行差值评估。
重复:每个事件每种处理使用八至十株植物。
进行观察:在整个生长阶段每周进行三次Lemnatec测量以捕集植物生长速率。在整个胁迫期间使用Lemnatec每周进行三次叶片颜色测定。使用Hansatech FMS2仪(LemnaTec GmbH,Wurselen,Germany),在实验期间将叶绿素荧光记录为PhiPSII(它指示光合体系II光化学的工作量子效率)和Fv’/Fm’  (它是光合体系II的最大效率)二至四次,记录在测量日的11AM开始。在胁迫期间,在开始看到干旱胁迫症状(即,叶片灰化及叶片卷曲)时开始测量,直至实验结束,并且在最幼嫩的、伸展最充分的叶片上进行测量并记录。记录每单株植物的抽穗和抽穗丝日期,并计算ASI。
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Company
 
<120>涉及RT1基因、具有改变的根构造的植物、相关的构建体和方法
 
<130>BB1590
 
<150>60/947117
<151>2007-06-29
 
<160>45
 
<170>PatentIn版本3.3
 
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>1
gcagacgcga caaagatgaa                     20
 
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>2
cgaatctcaa gctaatgagg a                   21
 
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>3
aggagcccag cgtgggcg                     18
 
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>4
caaaagaacc ccggagaagc ta                22
 
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>5
ctatcccggt catccaatat gta               23
 
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>6
gatctgccac tgggtattat gac               23
 
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>7
gctgcagctt acattgttct ctc                    23
 
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>8
caacaccaga gcctctacag tg                     22
 
<210>9
<211>7800
<212>DNA
<213>玉米
 
<400>9
ggagatgttt cagtacatgc agagccttgg tgccgcatcc ggattccctg ctcaattcca     60
tactcttgtg agtatcaaaa ttttagtccc gcatgatata tattcatctg gtctcacaca    120
tgcaatatct tctctgtgca gagacaatcg gcggcatcga acaaccctca cgcttcaccc    180
agcccttcgt cgaaccagtc tagccgccca cctcgttgat gacattgtgt tggtgacatg    240
tttgagaaac ttgttgtgag atacttgttt gtgaaacttt tgtgagagac ctatgtttgt    300
gaaacttgtt tgatgtgttg atatttgtga gatatatggt gttggtgatg catgtgttga    360
ttctgtgata tatgtgatgc ctacgatatg tatcttttgt ttgtttggat ggaatagcaa    420
aaacaaataa aaagggtatt atggccactt tgccgagtgt aactctcggc aaagaaggca    480
cacctgggat ccggtaaagc ttctttgccg agtgttgtgg tccaggcact cagcaaaggg    540
actggcaaag gggcccatta gagccacctt tgccaagagc tcgtgcatca ggcactcgac    600
aaagaagtcc gctttgccga gtgcatatca tcgcactcgg cgaaggggct ggcaaaaggg    660
gtgcctagtg ccaggatagc agacacttga caaagactcc atcaccgtca cttggtatcg    720
cgagttttct ttgccgagta ccaattgcac tcggtaaaga ctttatcaag tgtccgacaa    780
aaaagtactc ggcaaagaag ccgatctata gttcgcaaga cttctttgtc gagagtcaca    840
ctcggtaaag agtctgtcga gtgttttctg gactttgctg aagcacttgg aaaaacagtt     900
gtatccgtta gtgatgtagg gatggatttc ctaaagtctt gtaaaagaac gaataggcag     960
tgcacaactc aacaaacttg tatatacact acggagtact acacttttag agctgcagta    1020
agaaaaagga gagagaaaca gtgaacgcaa tacatgggaa agctagggtc gggcggtacg    1080
gtaaggtatc tgccgtgccc atacctggca tctcatcaca atctcctggc caagcttgtc    1140
gatctagcct ctctctctct tttgtgcagt gagacccgac atgaatgggt gtggggctca    1200
tctgatcagt ccttgtgtta ctttgtttcc ttttcctttg aatttccggg gtttgcagaa    1260
ggacagccgg gtactgcatc gatgttgggc attctccagt tttgttcttg gtcttggagg    1320
aggaaaaggc ccagggacca actttttcgc agccccccct tcttcctccc tttgcactgc    1380
tgctgccgtg gaatcataca tcacaattac cgaggccaca gaaaagagtg tttttttgct    1440
tgaggaaaag ggctagtccc tttattccaa ccacacacat gcatgcagaa aaagtcgatg    1500
gtggtggagt cgtacagtag tacaattaaa aactaactcg atcatatata tacatacttt    1560
gaaatgcaag tgccaggttc ttgagtactg tcctcagcta ctactacgta ccttgaagaa    1620
atttctagca agagacaatg gctaagaaag agaccatgca tggtgaaatt aaagagtgtt    1680
cttgacatga gaaacgtggt ttgctaactt taatcaagcc caaccaaagc tatcccaata    1740
tttaatggat gcatgggcta gccggccggg tgagagcaag gttaataata tagattataa    1800
tggcttttat gatgttgtca taccatgtat atagcaaact aaaagtccag tcatacaata    1860
actctaccat gatataagct atacatttaa tattaggact tatctttttt tttctcacac    1920
aaagtggctt agagtctatg agtaggccac ttttagctgg ctattagagc aagtttaata    1980
atataacgca tagtaagttt tataatgtta ccatgttaca tatagccaac aaaacatcta    2040
gtcatataat aactttcttg tgtatggtac aagttgtata tttaatattt attctactcc    2100
ttcctctcat aagttgtctt gtagtcagcc cacgtccagc tgactactag tgagcagccc    2160
gtttttctct ctttcttcgg tatggccata aatctgatgt gttatctctt gcagcttgtc    2220
tctgtcacct tattatactt gttcttagtg agcagtccgc ttctgtgtca ccgtaaacct    2280
gatagggcat gcacgtatta caatccgtcc acgtcatctt atcatgcttg ctctagtctt    2340
gttaaataga tctgtaataa accatatata gtccgttttt caagttggca tctttgctac    2400
ttccatttgg taccaacatg atctgacatc tctacgtcaa ctcgccagac agacaaatac    2460
ctattgcaga cgccaaagac aaacaataat tgacattact ttggccgttt tctgtagacc    2520
gttttctttt cccgagaaca atttgtacca gcagtgactg atcgatgagg cgttttagcc    2580
ctatatatgg cggctataat aatacacccg agccagaaaa gacttgtctc tttggtgcca    2640
tatgcatgtt tatggctacg ctagctttag ggcagagaga gagagagatc ctactagcta    2700
gcagaaatgt tagaatgata tgagagagag aacagagaga gcagagagag agagcttttc    2760
ttcttgcctt gaaaggagag gaacgggaac aaaggtaccc aatgctagca gatacataag    2820
gagggacgta cgggccgggt aaagcgacga agccttatgg atgggcatct ccatttctct    2880
aacccgatat gcctagctta gcttccattg gtgggggcgt gtgtgttctt tgagagattc    2940
taaaagctcg tcaccgtaga gctagcagtg cgacctttat tttcttctcc ccctcgtggg    3000
ggaagtggca tcgatcgatt aagatcccct ttacaaccac catgatggca gcctcgtcgt    3060
cgtcgtcctt caacctcagt gatcatctcg ttcaagatga cctcccgtgg cctgcttctt    3120
cttcttcttc ctcccagctg ccatttgctc cttctcatcc tcctcacggc gccattattg    3180
gaggcagcca gcaatggtgg cagcaacctc aaatgctgta agcaccttgc agctctagct    3240
agcactagta tttccttatg tttacaatta ttgtcagggt caaaatttgt tctttgtgca    3300
ttgtgagtgt tcaatcatat tcccttcctc tctctctctc aaaggaaagt aattttggag    3360
tgcattcatg cattctttgt ttttatagta ctggattctt cctaggtaga atttggagtt    3420
ttcctctgca tatgcttgtt ctctctcccc cccccccccc ccagctgctc cctgttgtct    3480
ccatggagtc tagggaatcg tagctcggca aaatgacaac tttcggcaga aacagataaa    3540
cagcacacgg atgatgatgc aacttatgtg catgactcca tccaacaatt tgttggtttc    3600
ctccgcgact ccgaaaggtc gctgtgcatg catttttctt ttttgtcatg gtcatcaatg    3660
gacggccggc atatatatac atacatacat agtgattcgt cctccacatc ttgtttaccc    3720
agcaggccag gccagccgga tgcatatgca tctatttgat tccttttact actgcagaaa    3780
ctgtgcagac cggcatccct ccgacgagct tgaggtcctc ctctcagcac aaggcagcca    3840
ccaccaccac caccatcctt cttcttcagt gatccatcct cagctaagct cgctgctaat    3900
gatgcaagac ctagggttcc aatggagcag ctgcggcagc ttcgtggaca cctcctcgtc    3960
gtcgcccatg ccaccaccac tggtgaacgg ccagcagcac gacggccaca acaagatcaa    4020
ggagtgggac cgcccgctca ctgctaataa ctcatcaagg tcatcgtgtg cgagcacagc    4080
tatggcttgc cgagatgtcg tcctcgacgg cggcggcggc ggcggcctcc ctgccatggc    4140
cgccgtcgcc gccgatcttg acgacggcac cgtgctcccg gcgagcgtca acgtcccccg    4200
gacgacgacg acgcgccaga ggccattccc ggcggcgccg ccacctctcc ccggcgacgc    4260
gttcgagata ctggcttcgt cgaggctatg caagaccctg ctgcttagcc aagcttcttc    4320
ttcggtactg ctccataatg gcacgacgat gcctttgttg agatcagagc atgtgcccta    4380
tggccctcct gctcctgctc atccccaagg accatccatc ggcaactaca agcaggtcag    4440
tcaaattaaa gtacagtgta gagcttgcgt cgttgcttga acagtacagt actctctctc    4500
tctctctctc tctcactctc agagaaggga aaggaaaagg atggatgcat gcatcaaacc    4560
gttagctgca tatgcagcag ctgctgtttt ttttttcttt ctttctttgg ctgaacagct    4620
gatgatactt atcctgcagt gtcttagaac tcaagcagta agtgtatagc cccatttgcc    4680
ctactgtctt gagacctcta gttaattgag ttcagacatt aaattgatag gagataactt    4740
aactaaaatc atttgaactc taaaagatag cataaaatct ccttttatga ttatatagtg    4800
tggcatgtaa actcaggtat atacatggta ttccatccat ccacctccag aaaactatat    4860
gcttgctgac ttgattagtc tcttgttagc caagccaaaa catgtttctt tcgtgagaga    4920
atgaactacg tgatggtata gttattgtgt atatacacgc atgtatatat atatatatat    4980
atatatatat atatatatat aggcgaagag agttcaagtc aataacagat taacagttac    5040
cagtagttct actctcccct atatatatgt gtgcatgttt tgctcatact ctctctatct    5100
atctatatgt ctatctgtcc gtgtccgtgt atatatgtgc atgcttcatt agagaaaata    5160
atggtcgatt tattttctaa gcccaaaaaa cagagtcaaa tatctatcta ctattataaa    5220
gcatcagatt cgatggtcgt cctacatcac gcgcgtaggt ctattcctct ccctttatca    5280
gtgtgggccg tgagaaacca cacaaggctc tattagtggg tcgttacctc gtagatgggc    5340
cgtgagtcaa gcctaacaac agaaagccgc atacagtgca acgcttccac atagtaccac    5400
tccactatct aaaggaggac gagctactgt gcgaactata aaaaaagagg gtaaggctca    5460
ttttcaactc ataactttct aagacctttg gctaagataa aatgtaatat tttgttcttg    5520
tgtgtcgtgg caacacatgt gtattgtact agtctgtata tacacatagg atgtatgagt    5580
acctaagcta agagggtgtg tttgtttggg attataaact gttcagacta tataatccaa    5640
cagattttga actaataagt gttagttcaa aaatttattg gattatataa tctgggcaga    5700
ttataaaccc taaacaaaac atccctatgc cacctcacgt agctagcaac atgttacata    5760
tgtacagtat gtgatagaac aacatttgca tgccaaaagg cattgcgctt tcagtgtgag    5820
gaccattaca tttagctgtt attatgtgat cgagtagtac ggacaggggc gtacgattgt    5880
gttcaagctg ctaagaggtt acagctcatt gggtttgccg gtttgcgtgc cttgcctgct    5940
agagtaccag ctacacgcgc atgatatgat gtcctactcc tactcctaat ctcatgcatg    6000
catgtcctga tggatctgca gtgtgtgctg gcagccagtc tagtgcatgc tctctcgctc    6060
tccgatgaga tcctggccga agcaaaggta gagagagagc aggtcggagc agaagctagg    6120
cccagccggg ccgggcccat gctgtacaaa gaggaggagg aggagtacaa caggccggcc    6180
gggctctccc ttttgctctg catccattgc agcagccttt tagggttgga gagtgaccgc    6240
ccggccgcgc catctttttt ccgcccaata tcgtcgtacc gcccataccc tcctccggct    6300
ctggcctcgc tgcacttgca tcgtcttcac ttaactcctc gcaggctttg ttgtgtttgc    6360
agggaactaa taaagccgtt tgcagtgctg ctggcgccct gcccgtgccc tgtcaccacc    6420
atacgactaa ttacacacac cttattcata tatataatac accctccata tagatatata    6480
tagttgatga tatagaaaag agagcatgca tgggtgacag gctttgttct gttgaagaac    6540
gcaacgtgat cttaattctt ccctagctaa gatcagcggt cctccatcgt ttctgatgaa    6600
cacgcgtgcg tgcgtgcgcc tttgcagtgc atgcagatgg gcgcgtcttg tggaggccgc    6660
gcgcagcacg aagcggcatg tcaaagcatg gcggcggcag cagcacgccc agcactgcca    6720
gtggtgccgt cgtcgaagaa gcctcgagtc gagcagcggt cctccaccat cgtcccttct    6780
ttcaaggtac tcgtatactc taggctgggt ctcgtgccgt ctcgatcgtt tcgtcatttc    6840
gatcaacgtt aattgacagt aacaccaacc taatatccaa tcatatatat atagtactaa    6900
ttctgttccc tgattaggta aggaaagaga aattagggga ccggatcgct gctcttcagc    6960
agctcgtctc accgtttggc aaggtacccg gccgtcgtca cgattattca gcattattag    7020
ggttttggag ggcaggcagg attacatata ttattaactc tctctctata tatataaata    7080
tatacctgac actaacacta ctatgtatgt gcagactgat accgcatctg tgctcatgga    7140
ggccatcggt tacatcaaat ttcttcaaga tcaagtcgag gtaaccaact agctagctgc    7200
ttatcagcca cacttggtcc atgagttcca gacatagcca cgctcgccaa gaaatactgt    7260
ttctttcttt ccatggcaag catctgctgg taggattttt ttcctcctga cagcagttct    7320
catgatcacc ctcaccctca cctgcagact ctgagccgcc cctacctgaa atcctccaga    7380
agtaagaagc ccaggccgac accgcgggta acaccatacg tctaaatcag gctcggtttc    7440
aaaatctggg ggaaactttc atgttaaatc tgatgtttgt gcacgtcgcg ttgcgtgtga    7500
atcagggttc ttcaaacgcg agcgctgggg agctggagga aacgaggcct gacctccgca    7560
gcagagggct ctgcctggtg cctctctcgt gcacgtccta cgtgaccaac gagaacggag    7620
tctgggttcc accgaatttt agggcaaact aaagtcatgt cagcgctact agagacacag    7680
cacaacagtg taccaagaac tactaatcca cggttcatct cagttcatcc acggttaata    7740
ccagttctcc gggccaaaag acacccacca tctacctctt gtgttgtctc tctttgccac    7800
 
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>10
tggcatcgat cgattaagat cccct                     25
 
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>11
tggaacccag actccgttct cgt                       23
 
<210>12
<211>1385
<212>DNA
<213>玉米
 
<400>12
ctcgtggggg aagtggcatc gatcgattaa gatccccttt acaaccacca tgatggcagc     60
ctcgtcgtcg tcgtccttca acctcagtga tcatctcgtt caagatgacc tcccgtggcc    120
tgcttcttct tcttcttcct cccagctgcc atttgctcct tctcatcctc ctcacggcgc    180
cattattgga ggcagccagc aatggtggca gcaacctcaa atgctaaact gtgcagaccg    240
gcatccctcc gacgagcttg aggtcctcct ctcagcacaa ggcagccacc accaccacca    300
ccatccttct tcttcagtga tccatcctca gctaagctcg ctgctaatga tgcaagacct    360
agggttccaa tggagcagct gcggcagctt cgtggacacc tcctcgtcgt cgcccatgcc    420
accaccactg gtgaacggcc agcagcacga cggccacaac aagatcaagg agtgggaccg    480
cccgctcact gctaataact catcaaggtc atcgtgtgcg agcacagcta tggcttgccg    540
agatgtcgtc ctcgacggcg gcggcggcgg cggcctccct gccatggccg ccgtcgccgc    600
cgatcttgac gacggcaccg tgctcccggc gagcgtcaac gtcccccgga cgacgacgac    660
gcgccagagg ccattcccgg cggcgccgcc acctctcccc ggcgacgcgt tcgagatact    720
ggcttcgtcg aggctatgca agaccctgct gcttagccaa gcttcttctt cggtactgct   780
ccataatggc acgacgatgc ctttgttgag atcagagcat gtgccctatg gccctcctgc   840
tcctgctcat ccccaaggac catccatcgg caactacaag cagtgcatgc agatgggcgc   900
gtcttgtgga ggccgcgcgc agcacgaagc ggcatgtcaa agcatggcgg cggcagcagc   960
acgcccagca ctgccagtgg tgccgtcgtc gaagaagcct cgagtcgagc agcggtcctc  1020
caccatcgtc ccttctttca aggtaaggaa agagaaatta ggggaccgga tcgctgctct  1080
tcagcagctc gtctcaccgt ttggcaagac tgataccgca tctgtgctca tggaggccat  1140
cggttacatc aaatttcttc aagatcaagt cgagactctg agccgcccct acctgaaatc  1200
ctccagaagt aagaagccca ggccgacacc gcggggttct tcaaacgcga gcgctgggga  1260
gctggaggaa acgaggcctg acctccgcag cagagggctc tgcctggtgc ctctctcgtg  1320
cacgtcctac gtgaccaacg agaacggagt ctgggttcca ccgaatttta gggcaaacta  1380
aagtc                                                              1385
 
<210>13
<211>443
<212>PRT
<213>玉米
 
<400>13
 
Met Met Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asn Leu Ser Asp His Leu
1               5                   10                  15
Val Gln Asp Asp Leu Pro Trp Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln
            20                  25                  30
Leu Pro Phe Ala Pro Ser His Pro Pro His Gly Ala Ile Ile Gly Gly
        35                  40                  45
Ser Gln Gln Trp Trp Gln Gln Pro Gln Met Leu Asn Cys Ala Asp Arg
    50                  55                  60
His Pro Ser Asp Glu Leu Glu Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Ser His
65                  70                  75                  80
His His His His His Pro Ser Ser Ser Val Ile His Pro Gln Leu Ser
                85                  90                  95
Ser Leu Leu Met Met Gln Asp Leu Gly Phe Gln Trp Ser Ser Cys Gly
            100                 105                 110
Ser Phe Val Asp Thr Ser Ser Ser Ser Pro Met Pro Pro Pro Leu Val
        115                 120                 125
Asn Gly Gln Gln His Asp Gly His Asn Lys Ile Lys Glu Trp Asp Arg
    130                 135                 140
Pro Leu Thr Ala Asn Asn Ser Ser Arg Ser Ser Cys Ala Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
Met Ala Cys Arg Asp Val Val Leu Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu
                165                 170                 175
Pro Ala Met Ala Ala Val Ala Ala Asp Leu Asp Asp Gly Thr Val Leu
            180                 185                 190
Pro Ala Ser Val Asn Val Pro Arg Thr Thr Thr Thr Arg Gln Arg Pro
        195                 200                 205
Phe Pro Ala Ala Pro Pro Pro Leu Pro Gly Asp Ala Phe Glu Ile Leu
    210                 215                 220
Ala Ser Ser Arg Leu Cys Lys Thr Leu Leu Leu Ser Gln Ala Ser Ser
225                 230                 235                 240
Ser Val Leu Leu His Asn Gly Thr Thr Met Pro Leu Leu Arg Ser Glu
                245                 250                 255
His Val Pro Tyr Gly Pro Pro Ala Pro Ala His Pro Gln Gly Pro Ser
            260                 265                 270
Ile Gly Asn Tyr Lys Gln Cys Met Gln Met Gly Ala Ser Cys Gly Gly
        275                 280                 285
Arg Ala Gln His Glu Ala Ala Cys Gln Ser Met Ala Ala Ala Ala Ala
    290                 295                 300
Arg Pro Ala Leu Pro Val Val Pro Ser Ser Lys Lys Pro Arg Val Glu
305                 310                 315                 320
Gln Arg Ser Ser Thr Ile Val Pro Ser Phe Lys Val Arg Lys Glu Lys
                325                 330                 335
Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln Leu Val Ser Pro Phe Gly
            340                 345                 350
Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Gly Tyr Ile Lys
        355                 360                 365
Phe Leu Gln Asp Gln Val Glu Thr Leu Ser Arg Pro Tyr Leu Lys Ser
    370                 375                 380
Ser Arg Ser Lys Lys Pro Arg Pro Thr Pro Arg Gly Ser Ser Asn Ala
385                 390                 395                 400
Ser Ala Gly Glu Leu Glu Glu Thr Arg Pro Asp Leu Arg Ser Arg Gly
                405                 410                 415
Leu Cys Leu Val Pro Leu Ser Cys Thr Ser Tyr Val Thr Asn Glu Asn
            420                 425                 430
Gly Val Trp Val Pro Pro Asn Phe Arg Ala Asn
        435                 440
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>14
ccaaggacca tccatcggca act                     23
 
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>15
actccgttct cgttggtcac                         20
 
<210>16
<211>1167
<212>DNA
<213>水稻
 
<400>16
atgatggcct cctcctcttc ctcctccagc ctctgtgata atcatctctt gcaagatgac     60
ctgatcccat ggccttccat gccctttgct cctgctccca acacctttgg attgaaccac    120
caatggagcc agcctccaat gctaagcagc agtactgatc agttaagctc atatgagctt    180
gaatcactcc aatcagttga aagtcagctg gcagctgctg ctcctccgac attaagcccc    240
catctgcagg ctcatcaact cagcacggtg ctaatgatgc aggagctagg gttccaatgg    300
agcagctgcg ctgcgccagc agatcaacat agtattgcaa gctccacgaa taataatagt    360
aatgtgatga tgaacgagga ggagctacgg ccacgtcctg atcaatccct aatcagcaat    420
ccaaggtcat gcagcgccac cacgcttctt cctccgccgc atctacatct ggacggcgct    480
gtgctcccga gcatcaacgt ctcgcggctg cagaagctgg ccgccggcga tgagccgctg    540
cagatatgtt gcaagaggca ggctgctgct gctgcagtgg tcggccatag cagcataaga   600
gatgagcatg tgccctgccc ctatgctggc cctcctgctc atctaattca aggaccatcc   660
aacaccctgc agatgaagag gaatacgaat gcagcagctc aagggagagg tggccgccat   720
gggagttcaa cggagcacag atcatcaaca gcgctgccgc catcgtcaaa gaagccccgg   780
ctcgagtcac actcctcctc aatgcttcct tcattcaagg taaggaaaga gaaactaggg   840
gatagaattg ccgcccttca gcaactggtc tcaccctttg gtaagactga taccgcatcg   900
gtactcatgg aggccatcgg ttacatcaaa tttcttcagg accaagttga gactttgagc   960
ggtccatacc tgagatcatc caagaacagc aagaaattag cctgcagggc agcacaacaa  1020
caacggaagg ggacgtcaaa tggaggggac gcagcagcaa agcttgacct ccgaagtaga  1080
ggactctgcc tggtgcccct gtcgtgcacc tcctacgtca ccaacgagaa tggggtttgg  1140
cctccaccca atttcagagg aaactga                                      1167
 
<210>17
<211>388
<212>PRT
<213>水稻
 
<400>17
 
Met Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Cys Asp Asn His Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Asp Asp Leu Ile Pro Trp Pro Ser Met Pro Phe Ala Pro Ala
            20                  25                  30
Pro Asn Thr Phe Gly Leu Asn His Gln Trp Ser Gln Pro Pro Met Leu
        35                  40                  45
Ser Ser Ser Thr Asp Gln Leu Ser Ser Tyr Glu Leu Glu Ser Leu Gln
    50                  55                  60
Ser Val Glu Ser Gln Leu Ala Ala Ala Ala Pro Pro Thr Leu Ser Pro
65                  70                  75                  80
His Leu Gln Ala His Gln Leu Ser Thr Val Leu Met Met Gln Glu Leu
                85                  90                  95
Gly Phe Gln Trp Ser Ser Cys Ala Ala Pro Ala Asp Gln His Ser Ile
            100                 105                 110
Ala Ser Ser Thr Asn Asn Asn Ser Asn Val Met Met Asn Glu Glu Glu
        115                 120                 125
Leu Arg Pro Arg Pro Asp Gln Ser Leu Ile Ser Asn Pro Arg Ser Cys
    130                 135                 140
Ser Ala Thr Thr Leu Leu Pro Pro Pro His Leu His Leu Asp Gly Ala
145                 150                 155                 160
Val Leu Pro Ser Ile Asn Val Ser Arg Leu Gln Lys Leu Ala Ala Gly
                165                 170                 175
Asp Glu Pro Leu Gln Ile Cys Cys Lys Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ala
            180                 185                 190
Val Val Gly His Ser Ser Ile Arg Asp Glu His Val Pro Cys Pro Tyr
        195                 200                 205
Ala Gly Pro Pro Ala His Leu Ile Gln Gly Pro Ser Asn Thr Leu Gln
    210                 215                 220
Met Lys Arg Asn Thr Asn Ala Ala Ala Gln Gly Arg Gly Gly Arg His
225                 230                 235                 240
Gly Ser Ser Thr Glu His Arg Ser Ser Thr Ala Leu Pro Pro Ser Ser
                245                 250                 255
Lys Lys Pro Arg Leu Glu Ser His Ser Ser Ser Met Leu Pro Ser Phe
            260                 265                 270
Lys Val Arg Lys Glu Lys Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln
        275                 280                 285
Leu Val Ser Pro Phe Gly Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu
    290                 295                 300
Ala Ile Gly Tyr Ile Lys Phe Leu Gln Asp Gln Val Glu Thr Leu Ser
305                 310                 315                 320
Gly Pro Tyr Leu Arg Ser Ser Lys Asn Ser Lys Lys Leu Ala Cys Arg
                325                 330                 335
Ala Ala Gln Gln Gln Arg Lys Gly Thr Ser Asn Gly Gly Asp Ala Ala
            340                 345                 350
Ala Lys Leu Asp Leu Arg Ser Arg Gly Leu Cys Leu Val Pro Leu Ser
        355                 360                 365
Cys Thr Ser Tyr Val Thr Asn Glu Asn Gly Val Trp Pro Pro Pro Asn
    370                 375                 380
Phe Arg Gly Asn
385
 
<210>18
<211>1362
<212>DNA
<213>拟南芥
 
<400>18
atggactctg ctaatctcca tcagcttcaa gatcaattac agcttgtggg gtcttcttca     60
tcttcttctt ccttagacaa taactctgac ccttcttgct atggagcttc atctgcccat    120
caatggagcc caggaggtat ttctttgaat agtgtgagct tgagtcataa ttataacaat    180
gagatgttaa acacaagagc tcacaacaac aacaacaaca acaacacaag tgaatgtatg    240
agtctctcca gcatccacaa tcactccttg atccaacaac aagactttcc tttacaatgg   300
cctcatgacc aatcttcata tcaacatcat gaaggacttc tcaagatcaa agaagagctt   360
tcctcatcaa ctatctcaga ccatcaagaa ggcatatcca agttcacaga catgttaaat   420
agtccagtga taacaaacta tttgaagatc aatgaacata aggactacac tgagaagctt   480
cttctcaaga gtatgtcttc tggattcccg atcaatggag actatggtag cagccttccc   540
tcttcttctt cttcctcttc accttcgtct cagtcgcata gaggcaactt cagtcagatt   600
tacccaagcg taaacatatc gagtttgagc gaatctcgga agatgagcat ggacgacatg   660
agtaacatct caagaccatt tgatataaac atgcaggttt ttgatggaag attgtttgaa   720
ggaaatgtat tagttcctcc ttttaacgct caagagatta gtagtcttgg gatgagcaga   780
ggaagccttc cttcttttgg cctccctttt catcatcatc tgcagcaaac acttccccac   840
ctttcttctt cccctactca tcaaatggaa atgttcagca atgaacctca aacaagtgaa   900
gggaagaggc ataacttctt gatggcaaca aaagcaggag aaaatgcttc caagaaaccg   960
cgcgtggaat cacgctcctc ttgcccaccc ttcaaggtga ggaaagaaaa gttaggagac  1020
agaatagcag ctctgcagca gttggtttca ccctttggga agacagatac agcatctgtg  1080
ttaatggaag caattggata catcaaattc ctacagagcc agatcgagac tttaagcgtc  1140
ccctacatga gagcatctag gaaccgaccc ggaaaagcct cccagctggt ctcacaatca  1200
caagaagggg atgaggaaga gacgagagat cttagaagcc gtgggctatg tctagtgccg  1260
ttatcatgca tgacttatgt taccggagat ggtggggatg gaggaggcgg tgttggtact  1320
ggtttttggc caacgccacc tggttttggt ggcggaactt ag                     1362
 
<210>19
<211>453
<212>PRT
<213>拟南芥
 
<400>19
 
Met Asp Ser Ala Asn Leu His Gln Leu Gln Asp Gln Leu Gln Leu Val
1               5                   10                  15
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asp Asn Asn Ser Asp Pro Ser
            20                  25                  30
Cys Tyr Gly Ala Ser Ser Ala His Gln Trp Ser Pro Gly Gly Ile Ser
        35                  40                  45
Leu Asn Ser Val Ser Leu Ser His Asn Tyr Asn Asn Glu Met Leu Asn
    50                  55                  60
Thr Arg Ala His Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Thr Ser Glu Cys Met
65                  70                  75                  80
Ser Leu Ser Ser Ile His Asn His Ser Leu Ile Gln Gln Gln Asp Phe
                85                  90                  95
Pro Leu Gln Trp Pro His Asp Gln Ser Ser Tyr Gln His His Glu Gly
            100                 105                 110
Leu Leu Lys Ile Lys Glu Glu Leu Ser Ser Ser Thr Ile Ser Asp His
        115                 120                 125
Gln Glu Gly Ile Ser Lys Phe Thr Asp Met Leu Asn Ser Pro Val Ile
    130                 135                 140
Thr Asn Tyr Leu Lys Ile Asn Glu His Lys Asp Tyr Thr Glu Lys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Leu Lys Ser Met Ser Ser Gly Phe Pro Ile Asn Gly Asp Tyr Gly
                165                 170                 175
Ser Ser Leu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Gln Ser
            180                 185                 190
His Arg Gly Asn Phe Ser Gln Ile Tyr Pro Ser Val Asn Ile Ser Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Glu Ser Arg Lys Met Ser Met Asp Asp Met Ser Asn Ile Ser
    210                 215                 220
Arg Pro Phe Asp Ile Asn Met Gln Val Phe Asp Gly Arg Leu Phe Glu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Val Leu Val Pro Pro Phe Asn Ala Gln Glu Ile Ser Ser Leu
                245                 250                 255
Gly Met Ser Arg Gly Ser Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Phe His His
            260                 265                 270
His Leu Gln Gln Thr Leu Pro His Leu Ser Ser Ser Pro Thr His Gln
        275                 280                 285
Met Glu Met Phe Ser Asn Glu Pro Gln Thr Ser Glu Gly Lys Arg His
    290                 295                 300
Asn Phe Leu Met Ala Thr Lys Ala Gly Glu Asn Ala Ser Lys Lys Pro
305                 310                 315                 320
Arg Val Glu Ser Arg Ser Ser Cys Pro Pro Phe Lys Val Arg Lys Glu
                325                 330                 335
Lys Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln Leu Val Ser Pro Phe
            340                 345                 350
Gly Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Gly Tyr Ile
        355                 360                 365
Lys Phe Leu Gln Ser Gln Ile Glu Thr Leu Ser Val Pro Tyr Met Arg
    370                 375                 380
Ala Ser Arg Asn Arg Pro Gly Lys Ala Ser Gln Leu Val Ser Gln Ser
385                 390                 395                 400
Gln Glu Gly Asp Glu Glu Glu Thr Arg Asp Leu Arg Ser Arg Gly Leu
                405                 410                 415
Cys Leu Val Pro Leu Ser Cys Met Thr Tyr Val Thr Gly Asp Gly Gly
            420                 425                 430
Asp Gly Gly Gly Gly Val Gly Thr Gly Phe Trp Pro Thr Pro Pro Gly
        435                 440                 445
Phe Gly Gly Gly Thr
    450
 
<210>20
<211>1759
<212>DNA
<213>玉米
 
<400>20
cgctactagc tagtgcgact ttttctttct ctccccctct tggaagtagc atcgatcgat     60
taaggccgcc tttacaacca ccatgatggc ggcttcgtca tcgtcctcca acctcagtga    120
tcacctcgcg caagatgacc tcctcccatg gccttcttct tcttcctcct ccctgccatt    180
tgctcctgct gctccccatc acagcgccat tattggaggc aacagccagc aacctctagc    240
gctaaactgc gctgaccggc atcactccga cgagcttgag gtgctcctct cagcacaagg    300
cagccaccac caccagagcc acagccacag gcacagccac cctgcttctc cggtgatccc    360
tccgcagctc agcagctctc tgctaacgat gcaagaccta gggttccaat ggagcaactg    420
cggcggcggc ttcctagaca cctcaccgtc cacgccgccg acgaacgggc agctgcagca    480
cgatggccac gacgacgaca agatcgaggc ggagggcacg cttattacta actcgtcaag    540
gccatcgtgt gcgggcacag ccacgatagc cgccagctgc cacgacgtcg tcctccacgg    600
cggcggcggc ggcggcaccg tgctcccgac cataaacatc tcgctgacga cgacgacgac    660
gacgcacacg caggcgcagc agcagcagcg accgttcctg gcggcgccgc cgcctctccc    720
gggcgacgcg ttcgagatac tactggcctc gtcgaggctg tgcaagaccc tgctgcttag   780
ccaagctgct gcttcttctt cttcttcttc ggtgctgctc cacgacgacg gcacgatcag   840
cacggtgcct tcgctgagat cggagtcgga gcatgtggcc tatggctatg gcggcggccc   900
tcctcctcct gctcctgccg ctgctcatcg tccccgagga cgacgaccat ccgttgacaa   960
ctacaagcag cagatgggcg ccgccgcctg tgccgcggga gcaggccgcc agtggagcgc  1020
ggagcacgga gggcgagccg ccgcctgtga agaaagggcg gcagcggcac cagcacgccg  1080
cccggtggtg gtgccatgga agaagcctcg actcgagcag cgctccggct ccggctccgg  1140
ctccggctcc tccaccacca tcctcccttc tttcgaggta cggaaagaga agttagggga  1200
ccggatcgct gccctccagc agctcgtctc gccattcggc aagaccgata ccgcgtctgt  1260
gctcatggag gccattggct acatcaagtt cctccaagac caagtcgaga ctttgagccg  1320
cccctacttg aagtcgtcca gaagtagcaa gaagcccagg ccgacgcacc agcgggggtg  1380
ttggaacgcc agcgctgcag gggaggagca ggagcaggag gagacgacga cgaggaggcg  1440
gcggcctgac ctccgcagca gagggctctg cctcgtgccc ctctcctgca cgtcctacgt  1500
caccaacgag aacggggcct gggttccttc ccaattttaa ttttagggga gactactagc  1560
tatagagatc agaggagcag agacaacact gtaccacgaa ctaatccacg gttaatatca  1620
cctcacatct ctgctctgct catgttgttg tctgtgtctc tttgccttgg cccttggccg  1680
taaataccag tcagtttcta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaa                                               1759
 
<210>21
<211>485
<212>PRT
<213>玉米
 
<400>21
 
Met Met Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Asn Leu Ser Asp His Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Asp Asp Leu Leu Pro Trp Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Pro
            20                  25                  30
Phe Ala Pro Ala Ala Pro His His Ser Ala Ile Ile Gly Gly Asn Ser
        35                  40                  45
Gln Gln Pro Leu Ala Leu Asn Cys Ala Asp Arg His His Ser Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Glu Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Ser His His His Gln Ser His
65                  70                  75                  80
Ser His Arg His Ser His Pro Ala Ser Pro Val Ile Pro Pro Gln Leu
                85                  90                  95
Ser Ser Ser Leu Leu Thr Met Gln Asp Leu Gly Phe Gln Trp Ser Asn
            100                 105                 110
Cys Gly Gly Gly Phe Leu Asp Thr Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn
        115                 120                 125
Gly Gln Leu Gln His Asp Gly His Asp Asp Asp Lys Ile Glu Ala Glu
    130                 135                 140
Gly Thr Leu Ile Thr Asn Ser Ser Arg Pro Ser Cys Ala Gly Thr Ala
145                 150                 155                 160
Thr Ile Ala Ala Ser Cys His Asp Val Val Leu His Gly Gly Gly Gly
                165                 170                 175
Gly Gly Thr Val Leu Pro Thr Ile Asn Ile Ser Leu Thr Thr Thr Thr
            180                 185                 190
Thr Thr His Thr Gln Ala Gln Gln Gln Gln Arg Pro Phe Leu Ala Ala
        195                 200                 205
Pro Pro Pro Leu Pro Gly Asp Ala Phe Glu Ile Leu Leu Ala Ser Ser
    210                 215                 220
Arg Leu Cys Lys Thr Leu Leu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Ser Ser Ser
225                 230                 235                 240
Ser Ser Ser Val Leu Leu His Asp Asp Gly Thr Ile Ser Thr Val Pro
                245                 250                 255
Ser Leu Arg Ser Glu Ser Glu His Val Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly Gly
            260                 265                 270
Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ala Ala Ala His Arg Pro Arg Gly Arg Arg
        275                 280                 285
Pro Ser Val Asp Asn Tyr Lys Gln Gln Met Gly Ala Ala Ala Cys Ala
    290                 295                 300
Ala Gly Ala Gly Arg Gln Trp Ser Ala Glu His Gly Gly Arg Ala Ala
305                 310                 315                 320
Ala Cys Glu Glu Arg Ala Ala Ala Ala Pro Ala Arg Arg Pro Val Val
                325                 330                 335
Val Pro Trp Lys Lys Pro Arg Leu Glu Gln Arg Ser Gly Ser Gly Ser
            340                 345                 350
Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Ile Leu Pro Ser Phe Glu Val Arg Lys
        355                 360                 365
Glu Lys Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln Leu Val Ser Pro
    370                 375                 380
Phe Gly Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Gly Tyr
385                 390                 395                 400
Ile Lys Phe Leu Gln Asp Gln Val Glu Thr Leu Ser Arg Pro Tyr Leu
                405                 410                 415
Lys Ser Ser Arg Ser Ser Lys Lys Pro Arg Pro Thr His Gln Arg Gly
            420                 425                 430
Cys Trp Asn Ala Ser Ala Ala Gly Glu Glu Gln Glu Gln Glu Glu Thr
        435                 440                 445
Thr Thr Arg Arg Arg Arg Pro Asp Leu Arg Ser Arg Gly Leu Cys Leu
    450                 455                 460
Val Pro Leu Ser Cys Thr Ser Tyr Val Thr Asn Glu Asn Gly Ala Trp
465                 470                 475                 480
Val Pro Ser Gln Phe
                485
 
<210>22
<211>47
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>基序I
 
<400>22
 
Val Arg Lys Glu Lys Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln Leu
1               5                   10                  15
Val Ser Pro Phe Gly Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu Ala
            20                  25                  30
Ile Gly Tyr Ile Lys Phe Leu Gln Ser Gln Ile Glu Thr Leu Ser
        35                  40                  45
 
<210>23
<211>14
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>基序II
 
<400>23
 
Asp Leu Arg Ser Arg Gly Leu Cys Leu Val Pro Leu Ser Cys
1               5                   10
 
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>attB1重组位点
 
<400>24
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct                                                 29
 
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>attB2重组位点
 
<400>25
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt                                                 29
 
<210>26
<211>54
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>26
ttaaacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg caattaaccc tcactaaagg gaac                     54
<210>27
<211>53
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>引物
 
<400>27
ttaaaccact ttgtacaaga aagctgggtg cgtaatacga ctcactatag ggc           53
 
<210>28
<211>4291
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>28
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga     60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga    120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca    180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc    240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta    300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc    360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa    420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg    480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa    540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac    600
ctgttcgttg caacacattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa    660
agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa    720
aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag tcactatgaa tcaactactt    780
agatggtatt agtgacctgt agtcgaccga cagccttcca aatgttcttc gggtgatgct    840
gccaacttag tcgaccgaca gccttccaaa tgttcttctc aaacggaatc gtcgtatcca     900
gcctactcgc tattgtcctc aatgccgtat taaatcataa aaagaaataa gaaaaagagg     960
tgcgagcctc ttttttgtgt gacaaaataa aaacatctac ctattcatat acgctagtgt    1020
catagtcctg aaaatcatct gcatcaagaa caatttcaca actcttatac ttttctctta    1080
caagtcgttc ggcttcatct ggattttcag cctctatact tactaaacgt gataaagttt    1140
ctgtaatttc tactgtatcg acctgcagac tggctgtgta taagggagcc tgacatttat    1200
attccccaga acatcaggtt aatggcgttt ttgatgtcat tttcgcggtg gctgagatca    1260
gccacttctt ccccgataac ggagaccggc acactggcca tatcggtggt catcatgcgc    1320
cagctttcat ccccgatatg caccaccggg taaagttcac gggagacttt atctgacagc    1380
agacgtgcac tggccagggg gatcaccatc cgtcgcccgg gcgtgtcaat aatatcactc    1440
tgtacatcca caaacagacg ataacggctc tctcttttat aggtgtaaac cttaaactgc    1500
atttcaccag cccctgttct cgtcagcaaa agagccgttc atttcaataa accgggcgac    1560
ctcagccatc ccttcctgat tttccgcttt ccagcgttcg gcacgcagac gacgggcttc    1620
attctgcatg gttgtgctta ccagaccgga gatattgaca tcatatatgc cttgagcaac    1680
tgatagctgt cgctgtcaac tgtcactgta atacgctgct tcatagcata cctctttttg    1740
acatacttcg ggtatacata tcagtatata ttcttatacc gcaaaaatca gcgcgcaaat    1800
acgcatactg ttatctggct tttagtaagc cggatccacg cggcgtttac gccccgccct    1860
gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac    1920
agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat    1980
atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa    2040
aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt    2100
tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa    2160
actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat    2220
ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg    2280
ccatacggaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat    2340
aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg    2400
tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc    2460
attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag    2520
ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt    2580
gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg    2640
gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca    2700
caggtattta ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttagtc gactacaggt    2760
cactaatacc atctaagtag ttgattcata gtgactggat atgttgtgtt ttacagtatt    2820
atgtagtctg ttttttatgc aaaatctaat ttaatatatt gatatttata tcattttacg    2880
tttctcgttc agctttcttg tacaaagttg gcattataag aaagcattgc ttatcaattt    2940
gttgcaacga acaggtcact atcagtcaaa ataaaatcat tatttgccat ccagctgata    3000
tcccctatag tgagtcgtat tacatggtca tagctgtttc ctggcagctc tggcccgtgt    3060
ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaataat atcatcatga tcagtcctgc    3120
tcctcggcca cgaagtgcac gcagttgccg gccgggtcgc gcagggcgaa ctcccgcccc    3180
cacggctgct cgccgatctc ggtcatggcc ggcccggagg cgtcccggaa gttcgtggac    3240
acgacctccg accactcggc gtacagctcg tccaggccgc gcacccacac ccaggccagg    3300
gtgttgtccg gcaccacctg gtcctggacc gcgctgatga acagggtcac gtcgtcccgg    3360
accacaccgg cgaagtcgtc ctccacgaag tcccgggaga acccgagccg gtcggtccag    3420
aactcgaccg ctccggcgac gtcgcgcgcg gtgagcaccg gaacggcact ggtcaacttg    3480
gccatggttt agttcctcac cttgtcgtat tatactatgc cgatatacta tgccgatgat    3540
taattgtcaa cacgtgctga tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagttac gcgtcgttcc    3600
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc    3660
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg    3720
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa  3780
atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc  3840
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt  3900
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa  3960
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc  4020
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc  4080
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct  4140
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat  4200
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc  4260
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt t                                 4291
 
<210>29
<211>4762
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>29
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga     60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga    120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca    180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc    240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta    300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc    360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa    420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg    480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa    540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac     600
ctgttcgttg caacacattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa     660
agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa     720
aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag tcactatgaa tcaactactt     780
agatggtatt agtgacctgt agtcgaccga cagccttcca aatgttcttc gggtgatgct     840
gccaacttag tcgaccgaca gccttccaaa tgttcttctc aaacggaatc gtcgtatcca     900
gcctactcgc tattgtcctc aatgccgtat taaatcataa aaagaaataa gaaaaagagg     960
tgcgagcctc ttttttgtgt gacaaaataa aaacatctac ctattcatat acgctagtgt    1020
catagtcctg aaaatcatct gcatcaagaa caatttcaca actcttatac ttttctctta    1080
caagtcgttc ggcttcatct ggattttcag cctctatact tactaaacgt gataaagttt    1140
ctgtaatttc tactgtatcg acctgcagac tggctgtgta taagggagcc tgacatttat    1200
attccccaga acatcaggtt aatggcgttt ttgatgtcat tttcgcggtg gctgagatca    1260
gccacttctt ccccgataac ggagaccggc acactggcca tatcggtggt catcatgcgc    1320
cagctttcat ccccgatatg caccaccggg taaagttcac gggagacttt atctgacagc    1380
agacgtgcac tggccagggg gatcaccatc cgtcgcccgg gcgtgtcaat aatatcactc    1440
tgtacatcca caaacagacg ataacggctc tctcttttat aggtgtaaac cttaaactgc    1500
atttcaccag cccctgttct cgtcagcaaa agagccgttc atttcaataa accgggcgac    1560
ctcagccatc ccttcctgat tttccgcttt ccagcgttcg gcacgcagac gacgggcttc    1620
attctgcatg gttgtgctta ccagaccgga gatattgaca tcatatatgc cttgagcaac    1680
tgatagctgt cgctgtcaac tgtcactgta atacgctgct tcatagcata cctctttttg    1740
acatacttcg ggtatacata tcagtatata ttcttatacc gcaaaaatca gcgcgcaaat    1800
acgcatactg ttatctggct tttagtaagc cggatccacg cggcgtttac gccccgccct    1860
gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac    1920
agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat    1980
atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa    2040
aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt    2100
tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa    2160
actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat    2220
ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg    2280
ccatacggaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat    2340
aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg    2400
tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc    2460
attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag    2520
ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt    2580
gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg    2640
gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca    2700
caggtattta ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttagtc gactacaggt    2760
cactaatacc atctaagtag ttgattcata gtgactggat atgttgtgtt ttacagtatt    2820
atgtagtctg ttttttatgc aaaatctaat ttaatatatt gatatttata tcattttacg    2880
tttctcgttc agctttcttg tacaaagttg gcattataag aaagcattgc ttatcaattt    2940
gttgcaacga acaggtcact atcagtcaaa ataaaatcat tatttgccat ccagctgata    3000
tcccctatag tgagtcgtat tacatggtca tagctgtttc ctggcagctc tggcccgtgt    3060
ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaataat atcatcatga acaataaaac    3120
tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt    3180
cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg    3240
ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgcttgta tgggaagccc gatgcgccag    3300
agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca    3360
gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc    3420
ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccggaaa aacagcattc caggtattag    3480
aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt    3540
tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc    3600
aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta    3660
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa acttttgcca ttctcaccgg    3720
attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat    3780
taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca    3840
tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat    3900
atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt    3960
tctaatcaga attggttaat tggttgtaac actggcagag cattacgctg acttgacggg    4020
acggcgcaag ctcatgacca aaatccctta acgtgagtta cgcgtcgttc cactgagcgt    4080
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct    4140
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc    4200
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc    4260
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc    4320
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg    4380
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt    4440
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg    4500
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg    4560
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt    4620
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag    4680
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt    4740
gctggccttt tgctcacatg tt                                             4762
<210>30
<211>9142
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>30
ttatttgtct tctggttctg actctctttc tctcgtttca atgccaggtt gcctactccc     60
acaccactca caagaagatt ctactgttag tattaaatat tttttaatgt attaaatgat    120
gaatgctttt gtaaacagaa caagactatg tctaataagt gtcttgcaac attttttaag    180
aaattaaaaa aaatatattt attatcaaaa tcaaatgtat gaaaaatcat gaataatata    240
attttataca tttttttaaa aaatctttta atttcttaat taatatctta aaaataatga    300
ttaatattta acccaaaata attagtatga ttggtaagga agatatccat gttatgtttg    360
gatgtgagtt tgatctagag caaagcttac tagagtcgac ctgcagcccc tccaccgcgg    420
tggcggccgc tctagagatc cgtcaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag    480
aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta    540
atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca    600
gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt    660
caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg    720
gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tgatcctatg    780
cgtatggtat gacgtgtgtt caagatgatg acttcaaacc tacctatgac gtatggtatg    840
acgtgtgtcg actgatgact tagatccact cgagcggcta taaatacgta cctacgcacc    900
ctgcgctacc atccctagag ctgcagctta tttttacaac aattaccaac aacaacaaac    960
aacaaacaac attacaatta ctatttacaa ttacagtcga cccatcaaca agtttgtaca   1020
aaaaagctga acgagaaacg taaaatgata taaatatcaa tatattaaat tagattttgc   1080
ataaaaaaca gactacataa tactgtaaaa cacaacatat ccagtcatat tggcggccgc   1140
attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tataatgtgt ggattttgag   1200
ttaggatccg tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg    1260
atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc    1320
agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac    1380
cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat    1440
gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt gagctggtga tatgggatag    1500
tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag    1560
tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta    1620
cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc    1680
caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt    1740
cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct    1800
ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat gtcggcagaa tgcttaatga    1860
attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa agatctggat ccggcttact    1920
aaaagccaga taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt tgcggtataa gaatatatac    1980
tgatatgtat acccgaagta tgtcaaaaag aggtatgcta tgaagcagcg tattacagtg    2040
acagttgaca gcgacagcta tcagttgctc aaggcatata tgatgtcaat atctccggtc    2100
tggtaagcac aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc tggaaagcgg    2160
aaaatcagga agggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc tcttttgctg    2220
acgagaacag gggctggtga aatgcagttt aaggtttaca cctataaaag agagagccgt    2280
tatcgtctgt ttgtggatgt acagagtgat attattgaca cgcccgggcg acggatggtg    2340
atccccctgg ccagtgcacg tctgctgtca gataaagtct cccgtgaact ttacccggtg    2400
gtgcatatcg gggatgaaag ctggcgcatg atgaccaccg atatggccag tgtgccggtc    2460
tccgttatcg gggaagaagt ggctgatctc agccaccgcg aaaatgacat caaaaacgcc    2520
attaacctga tgttctgggg aatataaatg tcaggctccc ttatacacag ccagtctgca    2580
ggtcgaccat agtgactgga tatgttgtgt tttacagtat tatgtagtct gttttttatg    2640
caaaatctaa tttaatatat tgatatttat atcattttac gtttctcgtt cagctttctt    2700
gtacaaagtg gttgataacc tagacttgtc catcttctgg attggccaac ttaattaatg    2760
tatgaaataa aaggatgcac acatagtgac atgctaatca ctataatgtg ggcatcaaag    2820
ttgtgtgtta tgtgtaatta ctagttatct gaataaaaga gaaagagatc atccatattt    2880
cttatcctaa atgaatgtca cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga tgcatttcat    2940
taaccaaatc catatacata taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa ttgggttagc    3000
aaaacaaatc tagtctaggt gtgttttgcg aattcgatat caagcttgat gggtaccggc    3060
gcgcccgatc atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta    3120
gaggccccaa ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc    3180
tttcgggctt tgttagcagc cggatcgatc caagctgtac ctcactattc ctttgccctc    3240
ggacgagtgc tggggcgtcg gtttccacta tcggcgagta cttctacaca gccatcggtc    3300
cagacggccg cgcttctgcg ggcgatttgt gtacgcccga cagtcccggc tccggatcgg    3360
acgattgcgt cgcatcgacc ctgcgcccaa gctgcatcat cgaaattgcc gtcaaccaag    3420
ctctgataga gttggtcaag accaatgcgg agcatatacg cccggagccg cggcgatcct    3480
gcaagctccg gatgcctccg ctcgaagtag cgcgtctgct gctccataca agccaaccac    3540
ggcctccaga agaagatgtt ggcgacctcg tattgggaat ccccgaacat cgcctcgctc    3600
cagtcaatga ccgctgttat gcggccattg tccgtcagga cattgttgga gccgaaatcc    3660
gcgtgcacga ggtgccggac ttcggggcag tcctcggccc aaagcatcag ctcatcgaga    3720
gcctgcgcga cggacgcact gacggtgtcg tccatcacag tttgccagtg atacacatgg    3780
ggatcagcaa tcgcgcatat gaaatcacgc catgtagtgt attgaccgat tccttgcggt    3840
ccgaatgggc cgaacccgct cgtctggcta agatcggccg cagcgatcgc atccatagcc    3900
tccgcgaccg gctgcagaac agcgggcagt tcggtttcag gcaggtcttg caacgtgaca    3960
ccctgtgcac ggcgggagat gcaataggtc aggctctcgc tgaattcccc aatgtcaagc    4020
acttccggaa tcgggagcgc ggccgatgca aagtgccgat aaacataacg atctttgtag    4080
aaaccatcgg cgcagctatt tacccgcagg acatatccac gccctcctac atcgaagctg    4140
aaagcacgag attcttcgcc ctccgagagc tgcatcaggt cggagacgct gtcgaacttt    4200
tcgatcagaa acttctcgac agacgtcgcg gtgagttcag gcttttccat gggtatatct    4260
ccttcttaaa gttaaacaaa attatttcta gagggaaacc gttgtggtct ccctatagtg    4320
agtcgtatta atttcgcggg atcgagatct gatcaacctg cattaatgaa tcggccaacg    4380
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct    4440
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt    4500
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc    4560
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga    4620
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata    4680
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac    4740
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg    4800
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc    4860
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag    4920
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt    4980
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt    5040
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg    5100
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac    5160
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca    5220
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaca ttaacctata aaaataggcg    5280
tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat    5340
gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg    5400
tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga    5460
gcagattgta ctgagagtgc accatatgga catattgtcg ttagaacgcg gctacaatta    5520
atacataacc ttatgtatca tacacatacg atttaggtga cactatagaa cggcgcgcca    5580
agctgggtct agaactagaa acgtgatgcc acttgttatt gaagtcgatt acagcatcta    5640
ttctgtttta ctatttataa ctttgccatt tctgactttt gaaaactatc tctggatttc    5700
ggtatcgctt tgtgaagatc gagcaaaaga gacgttttgt ggacgcaatg gtccaaatcc    5760
gttctacatg aacaaattgg tcacaatttc cactaaaagt aaataaatgg caagttaaaa    5820
aaggaatatg cattttactg attgcctagg tgagctccaa gagaagttga atctacacgt    5880
ctaccaaccg ctaaaaaaag aaaaacattg aatatgtaac ctgattccat tagcttttga    5940
cttcttcaac agattctcta cttagatttc taacagaaat attattacta gcacatcatt    6000
ttcagtctca ctacagcaaa aaatccaacg gcacaataca gacaacagga gatatcagac    6060
tacagagata gatagatgct actgcatgta gtaagttaaa taaaaggaaa ataaaatgtc    6120
ttgctaccaa aactactaca gactatgatg ctcaccacag gccaaatcct gcaactagga    6180
cagcattatc ttatatatat tgtacaaaac aagcatcaag gaacatttgg tctaggcaat    6240
cagtacctcg ttctaccatc accctcagtt atcacatcct tgaaggatcc attactggga    6300
atcatcggca acacatgctc ctgatggggc acaatgacat caagaaggta ggggccaggg    6360
gtgtccaaca ttctctgaat tgccgctcta agctcttcct tcttcgtcac tcgcgctgcc    6420
ggtatcccac aagcatcagc aaacttgagc atgtttggga atatctcgct ctcgctagac    6480
ggatctccaa gataggtgtg agctctattg gacttgtaga acctatcctc caactgaacc    6540
accataccca aatgctgatt gttcaacaac aatatcttaa ctgggagatt ctccactctt    6600
atagtggcca actcctgaac attcatgatg aaactaccat ccccatcaat gtcaaccaca    6660
acagccccag ggttagcaac agcagcacca atagccgcag gcaatccaaa acccatggct    6720
ccaagacccc ctgaggtcaa ccactgcctc ggtctcttgt acttgtaaaa ctgcgcagcc    6780
cacatttgat gctgcccaac cccagtacta acaatagcat ctccattagt caactcatca    6840
agaacctcga tagcatgctg cggagaaatc gcgtcctgga atgtcttgta acccaatgga    6900
aacttgtgtt tctgcacatt aatctcttct ctccaacctc caagatcaaa cttaccctcc    6960
actcctttct cctccaaaat catattaatt cccttcaagg ccaacttcaa atccgcgcaa    7020
accgacacgt gcgcctgctt gttcttccca atctcggcag aatcaatatc aatgtgaaca    7080
atcttagccc tactagcaaa agcctcaagc ttcccagtaa cacggtcatc aaaccttacc    7140
ccaaaggcaa gcaacaaatc actattgtca acagcatagt tagcataaac agtaccatgc    7200
atacccagca tctgaaggga atattcatca ccaataggaa aagttccaag acccattaaa    7260
gtgctagcaa cgggaatacc agtgagttca acaaagcgcc tcaattcagc actggaattc    7320
aaactgccac cgccgacgta gagaacgggc ttttgggcct ccatgatgag tctgacaatg    7380
tgttccaatt gggcctcggc ggggggcctg ggcagcctgg cgaggtaacc ggggaggtta    7440
acgggctcgt cccaattagg cacggcgagt tgctgctgaa cgtctttggg aatgtcgatg    7500
aggaccggac cggggcggcc ggaggtggcg acgaagaaag cctcggcgac gacgcggggg    7560
atgtcgtcga cgtcgaggat gaggtagttg tgcttcgtga tggatctgct cacctccacg    7620
atcggggttt cttggaaggc gtcggtgccg atcatccggc gggcgacctg gccggtgatg    7680
gcgacgactg ggacgctgtc cattaaagcg tcggcgaggc cgctcacgag gttggtggcg    7740
ccggggccgg aggtggcaat gcagacgccg gggaggccgg aggaacgcgc gtagccttcg    7800
gcggcgaaga cgccgccctg ctcgtggcgc gggagcacgt tgcggatggc ggcggagcgc    7860
gtgagcgcct ggtggatctc catcgacgca ccgccggggt acgcgaacac cgtcgtcacg    7920
ccctgcctct ccagcgcctc cacaaggatg tccgcgccct tgcgaggttc gccggaggcg    7980
aaccgtgaca cgaagggctc cgtggtcggc gcttccttgg tgaagggcgc cgccgtgggg    8040
ggtttggaga tggaacattt gattttgaga gcgtggttgg gtttggtgag ggtttgatga    8100
gagagaggga gggtggatct agtaatgcgt ttggggaagg tggggtgtga agaggaagaa    8160
gagaatcggg tggttctgga agcggtggcc gccattgtgt tgtgtggcat ggttatactt    8220
caaaaactgc acaacaagcc tagagttagt acctaaacag taaatttaca acagagagca    8280
aagacacatg caaaaatttc agccataaaa aaagttataa tagaatttaa agcaaaagtt    8340
tcatttttta aacatatata caaacaaact ggatttgaag gaagggatta attcccctgc    8400
tcaaagtttg aattcctatt gtgacctata ctcgaataaa attgaagcct aaggaatgta  8460
tgagaaacaa gaaaacaaaa caaaactaca gacaaacaag tacaattaca aaattcgcta  8520
aaattctgta atcaccaaac cccatctcag tcagcacaag gcccaaggtt tattttgaaa  8580
taaaaaaaaa gtgattttat ttctcataag ctaaaagaaa gaaaggcaat tatgaaatga  8640
tttcgactag atctgaaagt caaacgcgta ttccgcagat attaaagaaa gagtagagtt  8700
tcacatggat cctagatgga cccagttgag gaaaaagcaa ggcaaagcaa accagaagtg  8760
caagatccga aattgaacca cggaatctag gatttggtag agggagaaga aaagtacctt  8820
gagaggtaga agagaagaga agagcagaga gatatatgaa cgagtgtgtc ttggtctcaa  8880
ctctgaagcg atacgagttt agaggggagc attgagttcc aatttatagg gaaaccgggt  8940
ggcaggggtg agttaatgac ggaaaagccc ctaagtaacg agattggatt gtgggttaga  9000
ttcaaccgtt tgcatccgcg gcttagattg gggaagtcag agtgaatctc aaccgttgac  9060
tgagttgaaa attgaatgta gcaaccaatt gagccaaccc cagcctttgc cctttgattt  9120
tgatttgttt gttgcatact tt                                           9142
 
<210>31
<211>49911
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>31
gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta     60
taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt    120
atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca    180
gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt    240
ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg    300
caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta    360
gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct     420
ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa     480
tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta     540
aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt     600
ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca     660
cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg     720
ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag     780
gcggcctcct cctcctctca cggcacggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct     840
tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc     900
aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc     960
ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc cccccctctc taccttctct    1020
agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt    1080
tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac    1140
gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc    1200
tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt    1260
tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt    1320
tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc    1380
ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg    1440
tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata    1500
ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg    1560
gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac    1620
tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct    1680
tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat    1740
gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac    1800
cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat    1860
acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg    1920
ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact    1980
tctgcaggtc gactctagag gatccacaag tttgtacaaa aaagctgaac gagaaacgta    2040
aaatgatata aatatcaata tattaaatta gattttgcat aaaaaacaga ctacataata    2100
ctgtaaaaca caacatatcc agtcactatg gcggccgcat taggcacccc aggctttaca    2160
ctttatgctt ccggctcgta taatgtgtgg attttgagtt aggatttaaa tacgcgttga    2220
tccggcttac taaaagccag ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt ttgcggtata    2280
agaatatata ctgatatgta tacccgaagt atgtcaaaaa gaggtatgct atgaagcagc    2340
gtattacagt gacagttgac agcgacagct atcagttgct caaggcatat atgatgtcaa    2400
tatctccggt ctggtaagca caaccatgca gaatgaagcc cgtcgtctgc gtgccgaacg    2460
ctggaaagcg gaaaatcagg aagggatggc tgaggtcgcc cggtttattg aaatgaacgg    2520
ctcttttgct gacgagaaca ggggctggtg aaatgcagtt taaggtttac acctataaaa    2580
gagagagccg ttatcgtctg tttgtggatg tacagagtga tatcattgac acgcccggtc    2640
gacggatggt gatccccctg gccagtgcac gtctgctgtc agataaagtc tcccgtgaac    2700
tttacccggt ggtgcatatc ggggatgaaa gctggcgcat gatgaccacc gatatggcca    2760
gtgtgccggt ctccgttatc ggggaagaag tggctgatct cagccaccgc gaaaatgaca    2820
tcaaaaacgc cattaacctg atgttctggg gaatataaat gtcaggctcc cttatacaca    2880
gccagtctgc aggtcgacca tagtgactgg atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc    2940
tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt    3000
tcagctttct tgtacaaagt ggtgttaacc tagacttgtc catcttctgg attggccaac    3060
ttaattaatg tatgaaataa aaggatgcac acatagtgac atgctaatca ctataatgtg    3120
ggcatcaaag ttgtgtgtta tgtgtaatta ctagttatct gaataaaaga gaaagagatc    3180
atccatattt cttatcctaa atgaatgtca cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga    3240
tgcatttcat taaccaaatc catatacata taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa    3300
ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt gtgttttgcg aattgcggcc gccaccgcgg    3360
tggagctcga attccggtcc gggtcacctt tgtccaccaa gatggaactg cggccgctca    3420
ttaattaagt caggcgcgcc tctagttgaa gacacgttca tgtcttcatc gtaagaagac    3480
actcagtagt cttcggccag aatggccatc tggattcagc aggcctagaa ggccatttaa    3540
atcctgagga tctggtcttc ctaaggaccc gggatatcgg accgattaaa ctttaattcg    3600
gtccgaagct tgcatgcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa    3660
tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt    3720
gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat    3780
ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg    3840
gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg    3900
catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat    3960
tagtacatcc atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat    4020
ctattttatt ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt    4080
atttaataat ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc    4140
ctttaagaaa ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc    4200
ctgttaaacg ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc    4260
gggccaagcg aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag    4320
ttccgctcca ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg    4380
cagacgtgag ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct cacggcaccg gcagctacgg    4440
gggattcctt tcccaccgct ccttcgcttt cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca    4500
ccccctccac accctctttc cccaacctcg tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca    4560
gatctccccc aaatccaccc gtcggcacct ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc    4620
cccccccctc tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atgcatggtt agggcccggt    4680
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag    4740
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt    4800
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga    4860
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc    4920
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg    4980
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat    5040
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg    5100
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat    5160
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc    5220
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg    5280
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc    5340
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata    5400
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg    5460
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg    5520
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga    5580
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg caggtcgact ttaacttagc ctaggatcca    5640
cacgacacca tgtcccccga gcgccgcccc gtcgagatcc gcccggccac cgccgccgac    5700
atggccgccg tgtgcgacat cgtgaaccac tacatcgaga cctccaccgt gaacttccgc    5760
accgagccgc agaccccgca ggagtggatc gacgacctgg agcgcctcca ggaccgctac    5820
ccgtggctcg tggccgaggt ggagggcgtg gtggccggca tcgcctacgc cggcccgtgg    5880
aaggcccgca acgcctacga ctggaccgtg gagtccaccg tgtacgtgtc ccaccgccac    5940
cagcgcctcg gcctcggctc caccctctac acccacctcc tcaagagcat ggaggcccag    6000
ggcttcaagt ccgtggtggc cgtgatcggc ctcccgaacg acccgtccgt gcgcctccac    6060
gaggccctcg gctacaccgc ccgcggcacc ctccgcgccg ccggctacaa gcacggcggc    6120
tggcacgacg tcggcttctg gcagcgcgac ttcgagctgc cggccccgcc gcgcccggtg    6180
cgcccggtga cgcagatctg agtcgaaacc tagacttgtc catcttctgg attggccaac    6240
ttaattaatg tatgaaataa aaggatgcac acatagtgac atgctaatca ctataatgtg    6300
ggcatcaaag ttgtgtgtta tgtgtaatta ctagttatct gaataaaaga gaaagagatc    6360
atccatattt cttatcctaa atgaatgtca cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga    6420
tgcatttcat taaccaaatc catatacata taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa    6480
ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt gtgttttgcg aattgcggcc gccaccgcgg    6540
tggagctcga attcattccg attaatcgtg gcctcttgct cttcaggatg aagagctatg    6600
tttaaacgtg caagcgctac tagacaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat    6660
taagttgtct aagcgtcaat ttggtttaca ccacaatata tcctgccacc agccagccaa    6720
cagctccccg accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg atacaggcag cccatcagtc    6780
cgggacggcg tcagcgggag agccgttgta aggcggcaga ctttgctcat gttaccgatg    6840
ctattcggaa gaacggcaac taagctgccg ggtttgaaac acggatgatc tcgcggaggg    6900
tagcatgttg attgtaacga tgacagagcg ttgctgcctg tgatcaaata tcatctccct    6960
cgcagagatc cgaattatca gccttcttat tcatttctcg cttaaccgtg acaggctgtc    7020
gatcttgaga actatgccga cataatagga aatcgctgga taaagccgct gaggaagctg    7080
agtggcgcta tttctttaga agtgaacgtt gacgatcgtc gaccgtaccc cgatgaatta    7140
attcggacgt acgttctgaa cacagctgga tacttacttg ggcgattgtc atacatgaca    7200
tcaacaatgt acccgtttgt gtaaccgtct cttggaggtt cgtatgacac tagtggttcc    7260
cctcagcttg cgactagatg ttgaggccta acattttatt agagagcagg ctagttgctt    7320
agatacatga tcttcaggcc gttatctgtc agggcaagcg aaaattggcc atttatgacg    7380
accaatgccc cgcagaagct cccatctttg ccgccataga cgccgcgccc cccttttggg    7440
gtgtagaaca tccttttgcc agatgtggaa aagaagttcg ttgtcccatt gttggcaatg    7500
acgtagtagc cggcgaaagt gcgagaccca tttgcgctat atataagcct acgatttccg    7560
ttgcgactat tgtcgtaatt ggatgaacta ttatcgtagt tgctctcaga gttgtcgtaa    7620
tttgatggac tattgtcgta attgcttatg gagttgtcgt agttgcttgg agaaatgtcg    7680
tagttggatg gggagtagtc atagggaaga cgagcttcat ccactaaaac aattggcagg    7740
tcagcaagtg cctgccccga tgccatcgca agtacgaggc ttagaaccac cttcaacaga    7800
tcgcgcatag tcttccccag ctctctaacg cttgagttaa gccgcgccgc gaagcggcgt    7860
cggcttgaac gaattgttag acattatttg ccgactacct tggtgatctc gcctttcacg    7920
tagtgaacaa attcttccaa ctgatctgcg cgcgaggcca agcgatcttc ttgtccaaga    7980
taagcctgcc tagcttcaag tatgacgggc tgatactggg ccggcaggcg ctccattgcc    8040
cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt ttgccggtta ctgcgctgta ccaaatgcgg    8100
gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg ccagcccagt cgggcggcga gttccatagc    8160
gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga tcctgttcag gaaccggatc aaagagttcc    8220
tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta tgttctcttg cttttgtcag caagatagcc    8280
agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag atacctgcaa gaatgtcatt gcgctgccat    8340
tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga taacgccacg gaatgatgtc gtcgtgcaca    8400
acaatggtga cttctacagc gcggagaatc tcgctctctc caggggaagc cgaagtttcc    8460
aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt gtttcatcaa gccttacagt caccgtaacc    8520
agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg ccgccatcca ctgcggagcc gtacaaatgt    8580
acggccagca acgtcggttc gagatggcgc tcgatgacgc caactacctc tgatagttga    8640
gtcgatactt cggcgatcac cgcttccctc atgatgttta actcctgaat taagccgcgc    8700
cgcgaagcgg tgtcggcttg aatgaattgt taggcgtcat cctgtgctcc cgagaaccag    8760
taccagtaca tcgctgtttc gttcgagact tgaggtctag ttttatacgt gaacaggtca    8820
atgccgccga gagtaaagcc acattttgcg tacaaattgc aggcaggtac attgttcgtt    8880
tgtgtctcta atcgtatgcc aaggagctgt ctgcttagtg cccacttttt cgcaaattcg    8940
atgagactgt gcgcgactcc tttgcctcgg tgcgtgtgcg acacaacaat gtgttcgata    9000
gaggctagat cgttccatgt tgagttgagt tcaatcttcc cgacaagctc ttggtcgatg    9060
aatgcgccat agcaagcaga gtcttcatca gagtcatcat ccgagatgta atccttccgg    9120
taggggctca cacttctggt agatagttca aagccttggt cggataggtg cacatcgaac    9180
acttcacgaa caatgaaatg gttctcagca tccaatgttt ccgccacctg ctcagggatc    9240
accgaaatct tcatatgacg cctaacgcct ggcacagcgg atcgcaaacc tggcgcggct    9300
tttggcacaa aaggcgtgac aggtttgcga atccgttgct gccacttgtt aacccttttg    9360
ccagatttgg taactataat ttatgttaga ggcgaagtct tgggtaaaaa ctggcctaaa    9420
attgctgggg atttcaggaa agtaaacatc accttccggc tcgatgtcta ttgtagatat    9480
atgtagtgta tctacttgat cgggggatct gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg    9540
aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg    9600
ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca    9660
tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca    9720
gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa    9780
ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg    9840
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg    9900
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa    9960
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg   10020
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc   10080
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc   10140
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc   10200
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg   10260
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc   10320
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga   10380
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc   10440
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac    10500
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg    10560
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc    10620
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa    10680
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta    10740
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt    10800
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag    10860
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca    10920
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc    10980
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt    11040
tgttgccatt gctgcagggg gggggggggg gggggacttc cattgttcat tccacggaca    11100
aaaacagaga aaggaaacga cagaggccaa aaagcctcgc tttcagcacc tgtcgtttcc    11160
tttcttttca gagggtattt taaataaaaa cattaagtta tgacgaagaa gaacggaaac    11220
gccttaaacc ggaaaatttt cataaatagc gaaaacccgc gaggtcgccg ccccgtaacc    11280
tacctgtcgg atcaccggaa aggacccgta aagtgataat gattatcatc tacatatcac    11340
aacgtgcgtg gaggccatca aaccacgtca aataatcaat tatgacgcag gtatcgtatt    11400
aattgatctg catcaactta acgtaaaaac aacttcagac aatacaaatc agcgacactg    11460
aatacggggc aacctcatgt cccccccccc cccccccctg caggcatcgt ggtgtcacgc    11520
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga    11580
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt    11640
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc    11700
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa    11760
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca    11820
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca    11880
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct    11940
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc    12000
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa    12060
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt    12120
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc    12180
taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt    12240
cgtcttcaag aattcggagc ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga    12300
tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg    12360
acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga    12420
gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat    12480
gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taatcagaat tggttaattg    12540
gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac ggcggctttg ttgaataaat    12600
cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc ccgacaacgc agaccgttcc    12660
gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct acaacaaagc tctcatcaac    12720
cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc aggcctggta tgagtcagca    12780
acaccttctt cacgaggcag acctcagcgc cagaaggccg ccagagaggc cgagcgcggc    12840
cgtgaggctt ggacgctagg gcagggcatg aaaaagcccg tagcgggctg ctacgggcgt    12900
ctgacgcggt ggaaaggggg aggggatgtt gtctacatgg ctctgctgta gtgagtgggt    12960
tgcgctccgg cagcggtcct gatcaatcgt caccctttct cggtccttca acgttcctga    13020
caacgagcct ccttttcgcc aatccatcga caatcaccgc gagtccctgc tcgaacgctg    13080
cgtccggacc ggcttcgtcg aaggcgtcta tcgcggcccg caacagcggc gagagcggag    13140
cctgttcaac ggtgccgccg cgctcgccgg catcgctgtc gccggcctgc tcctcaagca    13200
cggccccaac agtgaagtag ctgattgtca tcagcgcatt gacggcgtcc ccggccgaaa    13260
aacccgcctc gcagaggaag cgaagctgcg cgtcggccgt ttccatctgc ggtgcgcccg    13320
gtcgcgtgcc ggcatggatg cgcgcgccat cgcggtaggc gagcagcgcc tgcctgaagc    13380
tgcgggcatt cccgatcaga aatgagcgcc agtcgtcgtc ggctctcggc accgaatgcg    13440
tatgattctc cgccagcatg gcttcggcca gtgcgtcgag cagcgcccgc ttgttcctga    13500
agtgccagta aagcgccggc tgctgaaccc ccaaccgttc cgccagtttg cgtgtcgtca    13560
gaccgtctac gccgacctcg ttcaacaggt ccagggcggc acggatcact gtattcggct    13620
gcaactttgt catgcttgac actttatcac tgataaacat aatatgtcca ccaacttatc    13680
agtgataaag aatccgcgcg ttcaatcgga ccagcggagg ctggtccgga ggccagacgt    13740
gaaacccaac atacccctga tcgtaattct gagcactgtc gcgctcgacg ctgtcggcat    13800
cggcctgatt atgccggtgc tgccgggcct cctgcgcgat ctggttcact cgaacgacgt    13860
caccgcccac tatggcattc tgctggcgct gtatgcgttg gtgcaatttg cctgcgcacc    13920
tgtgctgggc gcgctgtcgg atcgtttcgg gcggcggcca atcttgctcg tctcgctggc    13980
cggcgccact gtcgactacg ccatcatggc gacagcgcct ttcctttggg ttctctatat    14040
cgggcggatc gtggccggca tcaccggggc gactggggcg gtagccggcg cttatattgc    14100
cgatatcact gatggcgatg agcgcgcgcg gcacttcggc ttcatgagcg cctgtttcgg    14160
gttcgggatg gtcgcgggac ctgtgctcgg tgggctgatg ggcggtttct ccccccacgc    14220
tccgttcttc gccgcggcag ccttgaacgg cctcaatttc ctgacgggct gtttcctttt    14280
gccggagtcg cacaaaggcg aacgccggcc gttacgccgg gaggctctca acccgctcgc    14340
ttcgttccgg tgggcccggg gcatgaccgt cgtcgccgcc ctgatggcgg tcttcttcat    14400
catgcaactt gtcggacagg tgccggccgc gctttgggtc attttcggcg aggatcgctt    14460
tcactgggac gcgaccacga tcggcatttc gcttgccgca tttggcattc tgcattcact    14520
cgcccaggca atgatcaccg gccctgtagc cgcccggctc ggcgaaaggc gggcactcat    14580
gctcggaatg attgccgacg gcacaggcta catcctgctt gccttcgcga cacggggatg    14640
gatggcgttc ccgatcatgg tcctgcttgc ttcgggtggc atcggaatgc cggcgctgca    14700
agcaatgttg tccaggcagg tggatgagga acgtcagggg cagctgcaag gctcactggc    14760
ggcgctcacc agcctgacct cgatcgtcgg acccctcctc ttcacggcga tctatgcggc    14820
ttctataaca acgtggaacg ggtgggcatg gattgcaggc gctgccctct acttgctctg    14880
cctgccggcg ctgcgtcgcg ggctttggag cggcgcaggg caacgagccg atcgctgatc    14940
gtggaaacga taggcctatg ccatgcgggt caaggcgact tccggcaagc tatacgcgcc    15000
ctaggagtgc ggttggaacg ttggcccagc cagatactcc cgatcacgag caggacgccg    15060
atgatttgaa gcgcactcag cgtctgatcc aagaacaacc atcctagcaa cacggcggtc    15120
cccgggctga gaaagcccag taaggaaaca actgtaggtt cgagtcgcga gatcccccgg    15180
aaccaaagga agtaggttaa acccgctccg atcaggccga gccacgccag gccgagaaca    15240
ttggttcctg taggcatcgg gattggcgga tcaaacacta aagctactgg aacgagcaga    15300
agtcctccgg ccgccagttg ccaggcggta aaggtgagca gaggcacggg aggttgccac    15360
ttgcgggtca gcacggttcc gaacgccatg gaaaccgccc ccgccaggcc cgctgcgacg    15420
ccgacaggat ctagcgctgc gtttggtgtc aacaccaaca gcgccacgcc cgcagttccg    15480
caaatagccc ccaggaccgc catcaatcgt atcgggctac ctagcagagc ggcagagatg    15540
aacacgacca tcagcggctg cacagcgcct accgtcgccg cgaccccgcc cggcaggcgg    15600
tagaccgaaa taaacaacaa gctccagaat agcgaaatat taagtgcgcc gaggatgaag    15660
atgcgcatcc accagattcc cgttggaatc tgtcggacga tcatcacgag caataaaccc    15720
gccggcaacg cccgcagcag cataccggcg acccctcggc ctcgctgttc gggctccacg    15780
aaaacgccgg acagatgcgc cttgtgagcg tccttggggc cgtcctcctg tttgaagacc    15840
gacagcccaa tgatctcgcc gtcgatgtag gcgccgaatg ccacggcatc tcgcaaccgt    15900
tcagcgaacg cctccatggg ctttttctcc tcgtgctcgt aaacggaccc gaacatctct    15960
ggagctttct tcagggccga caatcggatc tcgcggaaat cctgcacgtc ggccgctcca    16020
agccgtcgaa tctgagcctt aatcacaatt gtcaatttta atcctctgtt tatcggcagt    16080
tcgtagagcg cgccgtgcgt cccgagcgat actgagcgaa gcaagtgcgt cgagcagtgc    16140
ccgcttgttc ctgaaatgcc agtaaagcgc tggctgctga acccccagcc ggaactgacc    16200
ccacaaggcc ctagcgtttg caatgcacca ggtcatcatt gacccaggcg tgttccacca    16260
ggccgctgcc tcgcaactct tcgcaggctt cgccgacctg ctcgcgccac ttcttcacgc    16320
gggtggaatc cgatccgcac atgaggcgga aggtttccag cttgagcggg tacggctccc    16380
ggtgcgagct gaaatagtcg aacatccgtc gggccgtcgg cgacagcttg cggtacttct    16440
cccatatgaa tttcgtgtag tggtcgccag caaacagcac gacgatttcc tcgtcgatca    16500
ggacctggca acgggacgtt ttcttgccac ggtccaggac gcggaagcgg tgcagcagcg    16560
acaccgattc caggtgccca acgcggtcgg acgtgaagcc catcgccgtc gcctgtaggc    16620
gcgacaggca ttcctcggcc ttcgtgtaat accggccatt gatcgaccag cccaggtcct    16680
ggcaaagctc gtagaacgtg aaggtgatcg gctcgccgat aggggtgcgc ttcgcgtact    16740
ccaacacctg ctgccacacc agttcgtcat cgtcggcccg cagctcgacg ccggtgtagg    16800
tgatcttcac gtccttgttg acgtggaaaa tgaccttgtt ttgcagcgcc tcgcgcggga    16860
ttttcttgtt gcgcgtggtg aacagggcag agcgggccgt gtcgtttggc atcgctcgca    16920
tcgtgtccgg ccacggcgca atatcgaaca aggaaagctg catttccttg atctgctgct    16980
tcgtgtgttt cagcaacgcg gcctgcttgg cctcgctgac ctgttttgcc aggtcctcgc    17040
cggcggtttt tcgcttcttg gtcgtcatag ttcctcgcgt gtcgatggtc atcgacttcg    17100
ccaaacctgc cgcctcctgt tcgagacgac gcgaacgctc cacggcggcc gatggcgcgg    17160
gcagggcagg gggagccagt tgcacgctgt cgcgctcgat cttggccgta gcttgctgga    17220
ccatcgagcc gacggactgg aaggtttcgc ggggcgcacg catgacggtg cggcttgcga    17280
tggtttcggc atcctcggcg gaaaaccccg cgtcgatcag ttcttgcctg tatgccttcc    17340
ggtcaaacgt ccgattcatt caccctcctt gcgggattgc cccgactcac gccggggcaa    17400
tgtgccctta ttcctgattt gacccgcctg gtgccttggt gtccagataa tccaccttat    17460
cggcaatgaa gtcggtcccg tagaccgtct ggccgtcctt ctcgtacttg gtattccgaa    17520
tcttgccctg cacgaatacc agcgacccct tgcccaaata cttgccgtgg gcctcggcct    17580
gagagccaaa acacttgatg cggaagaagt cggtgcgctc ctgcttgtcg ccggcatcgt    17640
tgcgccactc ttcattaacc gctatatcga aaattgcttg cggcttgtta gaattgccat    17700
gacgtacctc ggtgtcacgg gtaagattac cgataaactg gaactgatta tggctcatat    17760
cgaaagtctc cttgagaaag gagactctag tttagctaaa cattggttcc gctgtcaaga    17820
actttagcgg ctaaaatttt gcgggccgcg accaaaggtg cgaggggcgg cttccgctgt    17880
gtacaaccag atatttttca ccaacatcct tcgtctgctc gatgagcggg gcatgacgaa    17940
acatgagctg tcggagaggg caggggtttc aatttcgttt ttatcagact taaccaacgg    18000
taaggccaac ccctcgttga aggtgatgga ggccattgcc gacgccctgg aaactcccct    18060
acctcttctc ctggagtcca ccgaccttga ccgcgaggca ctcgcggaga ttgcgggtca    18120
tcctttcaag agcagcgtgc cgcccggata cgaacgcatc agtgtggttt tgccgtcaca    18180
taaggcgttt atcgtaaaga aatggggcga cgacacccga aaaaagctgc gtggaaggct    18240
ctgacgccaa gggttagggc ttgcacttcc ttctttagcc gctaaaacgg ccccttctct    18300
gcgggccgtc ggctcgcgca tcatatcgac atcctcaacg gaagccgtgc cgcgaatggc    18360
atcgggcggg tgcgctttga cagttgtttt ctatcagaac ccctacgtcg tgcggttcga    18420
ttagctgttt gtcttgcagg ctaaacactt tcggtatatc gtttgcctgt gcgataatgt    18480
tgctaatgat ttgttgcgta ggggttactg aaaagtgagc gggaaagaag agtttcagac    18540
catcaaggag cgggccaagc gcaagctgga acgcgacatg ggtgcggacc tgttggccgc    18600
gctcaacgac ccgaaaaccg ttgaagtcat gctcaacgcg gacggcaagg tgtggcacga    18660
acgccttggc gagccgatgc ggtacatctg cgacatgcgg cccagccagt cgcaggcgat    18720
tatagaaacg gtggccggat tccacggcaa agaggtcacg cggcattcgc ccatcctgga    18780
aggcgagttc cccttggatg gcagccgctt tgccggccaa ttgccgccgg tcgtggccgc    18840
gccaaccttt gcgatccgca agcgcgcggt cgccatcttc acgctggaac agtacgtcga    18900
ggcgggcatc atgacccgcg agcaatacga ggtcattaaa agcgccgtcg cggcgcatcg    18960
aaacatcctc gtcattggcg gtactggctc gggcaagacc acgctcgtca acgcgatcat    19020
caatgaaatg gtcgccttca acccgtctga gcgcgtcgtc atcatcgagg acaccggcga    19080
aatccagtgc gccgcagaga acgccgtcca ataccacacc agcatcgacg tctcgatgac    19140
gctgctgctc aagacaacgc tgcgtatgcg ccccgaccgc atcctggtcg gtgaggtacg    19200
tggccccgaa gcccttgatc tgttgatggc ctggaacacc gggcatgaag gaggtgccgc    19260
caccctgcac gcaaacaacc ccaaagcggg cctgagccgg ctcgccatgc ttatcagcat    19320
gcacccggat tcaccgaaac ccattgagcc gctgattggc gaggcggttc atgtggtcgt    19380
ccatatcgcc aggaccccta gcggccgtcg agtgcaagaa attctcgaag ttcttggtta    19440
cgagaacggc cagtacatca ccaaaaccct gtaaggagta tttccaatga caacggctgt    19500
tccgttccgt ctgaccatga atcgcggcat tttgttctac cttgccgtgt tcttcgttct    19560
cgctctcgcg ttatccgcgc atccggcgat ggcctcggaa ggcaccggcg gcagcttgcc    19620
atatgagagc tggctgacga acctgcgcaa ctccgtaacc ggcccggtgg ccttcgcgct    19680
gtccatcatc ggcatcgtcg tcgccggcgg cgtgctgatc ttcggcggcg aactcaacgc    19740
cttcttccga accctgatct tcctggttct ggtgatggcg ctgctggtcg gcgcgcagaa    19800
cgtgatgagc accttcttcg gtcgtggtgc cgaaatcgcg gccctcggca acggggcgct    19860
gcaccaggtg caagtcgcgg cggcggatgc cgtgcgtgcg gtagcggctg gacggctcgc    19920
ctaatcatgg ctctgcgcac gatccccatc cgtcgcgcag gcaaccgaga aaacctgttc    19980
atgggtggtg atcgtgaact ggtgatgttc tcgggcctga tggcgtttgc gctgattttc    20040
agcgcccaag agctgcgggc caccgtggtc ggtctgatcc tgtggttcgg ggcgctctat    20100
gcgttccgaa tcatggcgaa ggccgatccg aagatgcggt tcgtgtacct gcgtcaccgc    20160
cggtacaagc cgtattaccc ggcccgctcg accccgttcc gcgagaacac caatagccaa    20220
gggaagcaat accgatgatc caagcaattg cgattgcaat cgcgggcctc ggcgcgcttc    20280
tgttgttcat cctctttgcc cgcatccgcg cggtcgatgc cgaactgaaa ctgaaaaagc    20340
atcgttccaa ggacgccggc ctggccgatc tgctcaacta cgccgctgtc gtcgatgacg    20400
gcgtaatcgt gggcaagaac ggcagcttta tggctgcctg gctgtacaag ggcgatgaca    20460
acgcaagcag caccgaccag cagcgcgaag tagtgtccgc ccgcatcaac caggccctcg    20520
cgggcctggg aagtgggtgg atgatccatg tggacgccgt gcggcgtcct gctccgaact  20580
acgcggagcg gggcctgtcg gcgttccctg accgtctgac ggcagcgatt gaagaagagc  20640
gctcggtctt gccttgctcg tcggtgatgt acttcaccag ctccgcgaag tcgctcttct  20700
tgatggagcg catggggacg tgcttggcaa tcacgcgcac cccccggccg ttttagcggc  20760
taaaaaagtc atggctctgc cctcgggcgg accacgccca tcatgacctt gccaagctcg  20820
tcctgcttct cttcgatctt cgccagcagg gcgaggatcg tggcatcacc gaaccgcgcc  20880
gtgcgcgggt cgtcggtgag ccagagtttc agcaggccgc ccaggcggcc caggtcgcca  20940
ttgatgcggg ccagctcgcg gacgtgctca tagtccacga cgcccgtgat tttgtagccc  21000
tggccgacgg ccagcaggta ggccgacagg ctcatgccgg ccgccgccgc cttttcctca  21060
atcgctcttc gttcgtctgg aaggcagtac accttgatag gtgggctgcc cttcctggtt  21120
ggcttggttt catcagccat ccgcttgccc tcatctgtta cgccggcggt agccggccag  21180
cctcgcagag caggattccc gttgagcacc gccaggtgcg aataagggac agtgaagaag  21240
gaacacccgc tcgcgggtgg gcctacttca cctatcctgc ccggctgacg ccgttggata  21300
caccaaggaa agtctacacg aaccctttgg caaaatcctg tatatcgtgc gaaaaaggat  21360
ggatataccg aaaaaatcgc tataatgacc ccgaagcagg gttatgcagc ggaaaagcgc  21420
tgcttccctg ctgttttgtg gaatatctac cgactggaaa caggcaaatg caggaaatta  21480
ctgaactgag gggacaggcg agagacgatg ccaaagagct acaccgacga gctggccgag  21540
tgggttgaat cccgcgcggc caagaagcgc cggcgtgatg aggctgcggt tgcgttcctg  21600
gcggtgaggg cggatgtcga ggcggcgtta gcgtccggct atgcgctcgt caccatttgg  21660
gagcacatgc gggaaacggg gaaggtcaag ttctcctacg agacgttccg ctcgcacgcc  21720
aggcggcaca tcaaggccaa gcccgccgat gtgcccgcac cgcaggccaa ggctgcggaa  21780
cccgcgccgg cacccaagac gccggagcca cggcggccga agcagggggg caaggctgaa  21840
aagccggccc ccgctgcggc cccgaccggc ttcaccttca acccaacacc ggacaaaaag  21900
gatctactgt aatggcgaaa attcacatgg ttttgcaggg caagggcggg gtcggcaagt  21960
cggccatcgc cgcgatcatt gcgcagtaca agatggacaa ggggcagaca cccttgtgca  22020
tcgacaccga cccggtgaac gcgacgttcg agggctacaa ggccctgaac gtccgccggc  22080
tgaacatcat ggccggcgac gaaattaact cgcgcaactt cgacaccctg gtcgagctga  22140
ttgcgccgac caaggatgac gtggtgatcg acaacggtgc cagctcgttc gtgcctctgt  22200
cgcattacct catcagcaac caggtgccgg ctctgctgca agaaatgggg catgagctgg  22260
tcatccatac cgtcgtcacc ggcggccagg ctctcctgga cacggtgagc ggcttcgccc  22320
agctcgccag ccagttcccg gccgaagcgc ttttcgtggt ctggctgaac ccgtattggg  22380
ggcctatcga gcatgagggc aagagctttg agcagatgaa ggcgtacacg gccaacaagg  22440
cccgcgtgtc gtccatcatc cagattccgg ccctcaagga agaaacctac ggccgcgatt  22500
tcagcgacat gctgcaagag cggctgacgt tcgaccaggc gctggccgat gaatcgctca  22560
cgatcatgac gcggcaacgc ctcaagatcg tgcggcgcgg cctgtttgaa cagctcgacg  22620
cggcggccgt gctatgagcg accagattga agagctgatc cgggagattg cggccaagca  22680
cggcatcgcc gtcggccgcg acgacccggt gctgatcctg cataccatca acgcccggct  22740
catggccgac agtgcggcca agcaagagga aatccttgcc gcgttcaagg aagagctgga  22800
agggatcgcc catcgttggg gcgaggacgc caaggccaaa gcggagcgga tgctgaacgc  22860
ggccctggcg gccagcaagg acgcaatggc gaaggtaatg aaggacagcg ccgcgcaggc  22920
ggccgaagcg atccgcaggg aaatcgacga cggccttggc cgccagctcg cggccaaggt  22980
cgcggacgcg cggcgcgtgg cgatgatgaa catgatcgcc ggcggcatgg tgttgttcgc  23040
ggccgccctg gtggtgtggg cctcgttatg aatcgcagag gcgcagatga aaaagcccgg  23100
cgttgccggg ctttgttttt gcgttagctg ggcttgtttg acaggcccaa gctctgactg  23160
cgcccgcgct cgcgctcctg ggcctgtttc ttctcctgct cctgcttgcg catcagggcc  23220
tggtgccgtc gggctgcttc acgcatcgaa tcccagtcgc cggccagctc gggatgctcc  23280
gcgcgcatct tgcgcgtcgc cagttcctcg atcttgggcg cgtgaatgcc catgccttcc  23340
ttgatttcgc gcaccatgtc cagccgcgtg tgcagggtct gcaagcgggc ttgctgttgg  23400
gcctgctgct gctgccaggc ggcctttgta cgcggcaggg acagcaagcc gggggcattg  23460
gactgtagct gctgcaaacg cgcctgctga cggtctacga gctgttctag gcggtcctcg  23520
atgcgctcca cctggtcatg ctttgcctgc acgtagagcg caagggtctg ctggtaggtc  23580
tgctcgatgg gcgcggattc taagagggcc tgctgttccg tctcggcctc ctgggccgcc  23640
tgtagcaaat cctcgccgct gttgccgctg gactgcttta ctgccgggga ctgctgttgc  23700
cctgctcgcg ccgtcgtcgc agttcggctt gcccccactc gattgactgc ttcatttcga  23760
gccgcagcga tgcgatctcg gattgcgtca acggacgggg cagcgcggag gtgtccggct  23820
tctccttggg tgagtcggtc gatgccatag ccaaaggttt ccttccaaaa tgcgtccatt  23880
gctggaccgt gtttctcatt gatgcccgca agcatcttcg gcttgaccgc caggtcaagc  23940
gcgccttcat gggcggtcat gacggacgcc gccatgacct tgccgccgtt gttctcgatg  24000
tagccgcgta atgaggcaat ggtgccgccc atcgtcagcg tgtcatcgac aacgatgtac  24060
ttctggccgg ggatcacctc cccctcgaaa gtcgggttga acgccaggcg atgatctgaa  24120
ccggctccgg ttcgggcgac cttctcccgc tgcacaatgt ccgtttcgac ctcaaggcca  24180
aggcggtcgg ccagaacgac cgccatcatg gccggaatct tgttgttccc cgccgcctcg  24240
acggcgagga ctggaacgat gcggggcttg tcgtcgccga tcagcgtctt gagctgggca  24300
acagtgtcgt ccgaaatcag gcgctcgacc aaattaagcg ccgcttccgc gtcgccctgc  24360
ttcgcagcct ggtattcagg ctcgttggtc aaagaaccaa ggtcgccgtt gcgaaccacc  24420
ttcgggaagt ctccccacgg tgcgcgctcg gctctgctgt agctgctcaa gacgcctccc  24480
tttttagccg ctaaaactct aacgagtgcg cccgcgactc aacttgacgc tttcggcact  24540
tacctgtgcc ttgccacttg cgtcataggt gatgcttttc gcactcccga tttcaggtac  24600
tttatcgaaa tctgaccggg cgtgcattac aaagttcttc cccacctgtt ggtaaatgct  24660
gccgctatct gcgtggacga tgctgccgtc gtggcgctgc gacttatcgg ccttttgggc  24720
catatagatg ttgtaaatgc caggtttcag ggccccggct ttatctacct tctggttcgt  24780
ccatgcgcct tggttctcgg tctggacaat tctttgccca ttcatgacca ggaggcggtg  24840
tttcattggg tgactcctga cggttgcctc tggtgttaaa cgtgtcctgg tcgcttgccg  24900
gctaaaaaaa agccgacctc ggcagttcga ggccggcttt ccctagagcc gggcgcgtca  24960
aggttgttcc atctatttta gtgaactgcg ttcgatttat cagttacttt cctcccgctt  25020
tgtgtttcct cccactcgtt tccgcgtcta gccgacccct caacatagcg gcctcttctt  25080
gggctgcctt tgcctcttgc cgcgcttcgt cacgctcggc ttgcaccgtc gtaaagcgct  25140
cggcctgcct ggccgcctct tgcgccgcca acttcctttg ctcctggtgg gcctcggcgt  25200
cggcctgcgc cttcgctttc accgctgcca actccgtgcg caaactctcc gcttcgcgcc  25260
tggtggcgtc gcgctcgccg cgaagcgcct gcatttcctg gttggccgcg tccagggtct  25320
tgcggctctc ttctttgaat gcgcgggcgt cctggtgagc gtagtccagc tcggcgcgca  25380
gctcctgcgc tcgacgctcc acctcgtcgg cccgctgcgt cgccagcgcg gcccgctgct  25440
cggctcctgc cagggcggtg cgtgcttcgg ccagggcttg ccgctggcgt gcggccagct  25500
cggccgcctc ggcggcctgc tgctctagca atgtaacgcg cgcctgggct tcttccagct  25560
cgcgggcctg cgcctcgaag gcgtcggcca gctccccgcg cacggcttcc aactcgttgc  25620
gctcacgatc ccagccggct tgcgctgcct gcaacgattc attggcaagg gcctgggcgg  25680
cttgccagag ggcggccacg gcctggttgc cggcctgctg caccgcgtcc ggcacctgga  25740
ctgccagcgg ggcggcctgc gccgtgcgct ggcgtcgcca ttcgcgcatg ccggcgctgg  25800
cgtcgttcat gttgacgcgg gcggccttac gcactgcatc cacggtcggg aagttctccc  25860
ggtcgccttg ctcgaacagc tcgtccgcag ccgcaaaaat gcggtcgcgc gtctctttgt  25920
tcagttccat gttggctccg gtaattggta agaataataa tactcttacc taccttatca  25980
gcgcaagagt ttagctgaac agttctcgac ttaacggcag gttttttagc ggctgaaggg  26040
caggcaaaaa aagccccgca cggtcggcgg gggcaaaggg tcagcgggaa ggggattagc  26100
gggcgtcggg cttcttcatg cgtcggggcc gcgcttcttg ggatggagca cgacgaagcg  26160
cgcacgcgca tcgtcctcgg ccctatcggc ccgcgtcgcg gtcaggaact tgtcgcgcgc  26220
taggtcctcc ctggtgggca ccaggggcat gaactcggcc tgctcgatgt aggtccactc  26280
catgaccgca tcgcagtcga ggccgcgttc cttcaccgtc tcttgcaggt cgcggtacgc  26340
ccgctcgttg agcggctggt aacgggccaa ttggtcgtaa atggctgtcg gccatgagcg  26400
gcctttcctg ttgagccagc agccgacgac gaagccggca atgcaggccc ctggcacaac  26460
caggccgacg ccgggggcag gggatggcag cagctcgcca accaggaacc ccgccgcgat  26520
gatgccgatg ccggtcaacc agcccttgaa actatccggc cccgaaacac ccctgcgcat  26580
tgcctggatg ctgcgccgga tagcttgcaa catcaggagc cgtttctttt gttcgtcagt  26640
catggtccgc cctcaccagt tgttcgtatc ggtgtcggac gaactgaaat cgcaagagct  26700
gccggtatcg gtccagccgc tgtccgtgtc gctgctgccg aagcacggcg aggggtccgc  26760
gaacgccgca gacggcgtat ccggccgcag cgcatcgccc agcatggccc cggtcagcga  26820
gccgccggcc aggtagccca gcatggtgct gttggtcgcc ccggccacca gggccgacgt  26880
gacgaaatcg ccgtcattcc ctctggattg ttcgctgctc ggcggggcag tgcgccgcgc  26940
cggcggcgtc gtggatggct cgggttggct ggcctgcgac ggccggcgaa aggtgcgcag  27000
cagctcgtta tcgaccggct gcggcgtcgg ggccgccgcc ttgcgctgcg gtcggtgttc  27060
cttcttcggc tcgcgcagct tgaacagcat gatcgcggaa accagcagca acgccgcgcc  27120
tacgcctccc gcgatgtaga acagcatcgg attcattctt cggtcctcct tgtagcggaa  27180
ccgttgtctg tgcggcgcgg gtggcccgcg ccgctgtctt tggggatcag ccctcgatga  27240
gcgcgaccag tttcacgtcg gcaaggttcg cctcgaactc ctggccgtcg tcctcgtact  27300
tcaaccaggc atagccttcc gccggcggcc gacggttgag gataaggcgg gcagggcgct  27360
cgtcgtgctc gacctggacg atggcctttt tcagcttgtc cgggtccggc tccttcgcgc  27420
ccttttcctt ggcgtcctta ccgtcctggt cgccgtcctc gccgtcctgg ccgtcgccgg  27480
cctccgcgtc acgctcggca tcagtctggc cgttgaaggc atcgacggtg ttgggatcgc  27540
ggcccttctc gtccaggaac tcgcgcagca gcttgaccgt gccgcgcgtg atttcctggg  27600
tgtcgtcgtc aagccacgcc tcgacttcct ccgggcgctt cttgaaggcc gtcaccagct  27660
cgttcaccac ggtcacgtcg cgcacgcggc cggtgttgaa cgcatcggcg atcttctccg  27720
gcaggtccag cagcgtgacg tgctgggtga tgaacgccgg cgacttgccg atttccttgg  27780
cgatatcgcc tttcttcttg cccttcgcca gctcgcggcc aatgaagtcg gcaatttcgc  27840
gcggggtcag ctcgttgcgt tgcaggttct cgataacctg gtcggcttcg ttgtagtcgt  27900
tgtcgatgaa cgccgggatg gacttcttgc cggcccactt cgagccacgg tagcggcggg  27960
cgccgtgatt gatgatatag cggcccggct gctcctggtt ctcgcgcacc gaaatgggtg  28020
acttcacccc gcgctctttg atcgtggcac cgatttccgc gatgctctcc ggggaaaagc  28080
cggggttgtc ggccgtccgc ggctgatgcg gatcttcgtc gatcaggtcc aggtccagct  28140
cgatagggcc ggaaccgccc tgagacgccg caggagcgtc caggaggctc gacaggtcgc  28200
cgatgctatc caaccccagg ccggacggct gcgccgcgcc tgcggcttcc tgagcggccg  28260
cagcggtgtt tttcttggtg gtcttggctt gagccgcagt cattgggaaa tctccatctt  28320
cgtgaacacg taatcagcca gggcgcgaac ctctttcgat gccttgcgcg cggccgtttt  28380
cttgatcttc cagaccggca caccggatgc gagggcatcg gcgatgctgc tgcgcaggcc  28440
aacggtggcc ggaatcatca tcttggggta cgcggccagc agctcggctt ggtggcgcgc  28500
gtggcgcgga ttccgcgcat cgaccttgct gggcaccatg ccaaggaatt gcagcttggc  28560
gttcttctgg cgcacgttcg caatggtcgt gaccatcttc ttgatgccct ggatgctgta  28620
cgcctcaagc tcgatggggg acagcacata gtcggccgcg aagagggcgg ccgccaggcc  28680
gacgccaagg gtcggggccg tgtcgatcag gcacacgtcg aagccttggt tcgccagggc  28740
cttgatgttc gccccgaaca gctcgcgggc gtcgtccagc gacagccgtt cggcgttcgc  28800
cagtaccggg ttggactcga tgagggcgag gcgcgcggcc tggccgtcgc cggctgcggg  28860
tgcggtttcg gtccagccgc cggcagggac agcgccgaac agcttgcttg catgcaggcc  28920
ggtagcaaag tccttgagcg tgtaggacgc attgccctgg gggtccaggt cgatcacggc  28980
aacccgcaag ccgcgctcga aaaagtcgaa ggcaagatgc acaagggtcg aagtcttgcc  29040
gacgccgcct ttctggttgg ccgtgaccaa agttttcatc gtttggtttc ctgttttttc  29100
ttggcgtccg cttcccactt ccggacgatg tacgcctgat gttccggcag aaccgccgtt  29160
acccgcgcgt acccctcggg caagttcttg tcctcgaacg cggcccacac gcgatgcacc  29220
gcttgcgaca ctgcgcccct ggtcagtccc agcgacgttg cgaacgtcgc ctgtggcttc  29280
ccatcgacta agacgccccg cgctatctcg atggtctgct gccccacttc cagcccctgg  29340
atcgcctcct ggaactggct ttcggtaagc cgtttcttca tggataacac ccataatttg  29400
ctccgcgcct tggttgaaca tagcggtgac agccgccagc acatgagaga agtttagcta  29460
aacatttctc gcacgtcaac acctttagcc gctaaaactc gtccttggcg taacaaaaca  29520
aaagcccgga aaccgggctt tcgtctcttg ccgcttatgg ctctgcaccc ggctccatca  29580
ccaacaggtc gcgcacgcgc ttcactcggt tgcggatcga cactgccagc ccaacaaagc  29640
cggttgccgc cgccgccagg atcgcgccga tgatgccggc cacaccggcc atcgcccacc  29700
aggtcgccgc cttccggttc cattcctgct ggtactgctt cgcaatgctg gacctcggct  29760
caccataggc tgaccgctcg atggcgtatg ccgcttctcc ccttggcgta aaacccagcg  29820
ccgcaggcgg cattgccatg ctgcccgccg ctttcccgac cacgacgcgc gcaccaggct  29880
tgcggtccag accttcggcc acggcgagct gcgcaaggac ataatcagcc gccgacttgg  29940
ctccacgcgc ctcgatcagc tcttgcactc gcgcgaaatc cttggcctcc acggccgcca  30000
tgaatcgcgc acgcggcgaa ggctccgcag ggccggcgtc gtgatcgccg ccgagaatgc  30060
ccttcaccaa gttcgacgac acgaaaatca tgctgacggc tatcaccatc atgcagacgg  30120
atcgcacgaa cccgctgaat tgaacacgag cacggcaccc gcgaccacta tgccaagaat  30180
gcccaaggta aaaattgccg gccccgccat gaagtccgtg aatgccccga cggccgaagt  30240
gaagggcagg ccgccaccca ggccgccgcc ctcactgccc ggcacctggt cgctgaatgt  30300
cgatgccagc acctgcggca cgtcaatgct tccgggcgtc gcgctcgggc tgatcgccca  30360
tcccgttact gccccgatcc cggcaatggc aaggactgcc agcgctgcca tttttggggt  30420
gaggccgttc gcggccgagg ggcgcagccc ctggggggat gggaggcccg cgttagcggg  30480
ccgggagggt tcgagaaggg ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg  30540
cgcagccctg gttaaaaaca aggtttataa atattggttt aaaagcaggt taaaagacag  30600
gttagcggtg gccgaaaaac gggcggaaac ccttgcaaat gctggatttt ctgcctgtgg  30660
acagcccctc aaatgtcaat aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg  30720
tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg  30780
cacttatccc caggcttgtc cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt  30840
cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat  30900
ctgtcaacgc cgcgccgggt gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt  30960
cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg gcggccgcgg tgtctcgcac  31020
acggcttcga cggcgtttct ggcgcgtttg cagggccata gacggccgcc agcccagcgg  31080
cgagggcaac cagcccggtg agcgtcggaa aggcgctgga agccccgtag cgacgcggag  31140
aggggcgaga caagccaagg gcgcaggctc gatgcgcagc acgacatagc cggttctcgc  31200
aaggacgaga atttccctgc ggtgcccctc aagtgtcaat gaaagtttcc aacgcgagcc  31260
attcgcgaga gccttgagtc cacgctagat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt  31320
gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg  31380
atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc cacgttgtgt ctcaaaatct  31440
ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga acaataaaac tgtctgctta  31500
cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt cttgctcgac  31560
tctagagctc gttcctcgag gaacggtacc tgcggggaag cttacaataa tgtgtgttgt  31620
taagtcttgt tgcctgtcat cgtctgactg actttcgtca taaatcccgg cctccgtaac  31680
ccagctttgg gcaagctcac ggatttgatc cggcggaacg ggaatatcga gatgccgggc  31740
tgaacgctgc agttccagct ttccctttcg ggacaggtac tccagctgat tgattatctg  31800
ctgaagggtc ttggttccac ctcctggcac aatgcgaatg attacttgag cgcgatcggg  31860
catccaattt tctcccgtca ggtgcgtggt caagtgctac aaggcacctt tcagtaacga  31920
gcgaccgtcg atccgtcgcc gggatacgga caaaatggag cgcagtagtc catcgagggc  31980
ggcgaaagcc tcgccaaaag caatacgttc atctcgcaca gcctccagat ccgatcgagg  32040
gtcttcggcg taggcagata gaagcatgga tacattgctt gagagtattc cgatggactg  32100
aagtatggct tccatctttt ctcgtgtgtc tgcatctatt tcgagaaagc ccccgatgcg  32160
gcgcaccgca acgcgaattg ccatactatc cgaaagtccc agcaggcgcg cttgatagga  32220
aaaggtttca tactcggccg atcgcagacg ggcactcacg accttgaacc cttcaacttt  32280
cagggatcga tgctggttga tggtagtctc actcgacgtg gctctggtgt gttttgacat  32340
agcttcctcc aaagaaagcg gaaggtctgg atactccagc acgaaatgtg cccgggtaga  32400
cggatggaag tctagccctg ctcaatatga aatcaacagt acatttacag tcaatactga  32460
atatacttgc tacatttgca attgtcttat aacgaatgtg aaataaaaat agtgtaacaa  32520
cgcttttact catcgataat cacaaaaaca tttatacgaa caaaaataca aatgcactcc  32580
ggtttcacag gataggcggg atcagaatat gcaacttttg acgttttgtt ctttcaaagg  32640
gggtgctggc aaaaccaccg cactcatggg cctttgcgct gctttggcaa atgacggtaa  32700
acgagtggcc ctctttgatg ccgacgaaaa ccggcctctg acgcgatgga gagaaaacgc  32760
cttacaaagc agtactggga tcctcgctgt gaagtctatt ccgccgacga aatgcccctt  32820
cttgaagcag cctatgaaaa tgccgagctc gaaggatttg attatgcgtt ggccgatacg  32880
cgtggcggct cgagcgagct caacaacaca atcatcgcta gctcaaacct gcttctgatc  32940
cccaccatgc taacgccgct cgacatcgat gaggcactat ctacctaccg ctacgtcatc  33000
gagctgctgt tgagtgaaaa tttggcaatt cctacagctg ttttgcgcca acgcgtcccg  33060
gtcggccgat tgacaacatc gcaacgcagg atgtcagaga cgctagagag ccttccagtt  33120
gtaccgtctc ccatgcatga aagagatgca tttgccgcga tgaaagaacg cggcatgttg  33180
catcttacat tactaaacac gggaactgat ccgacgatgc gcctcataga gaggaatctt  33240
cggattgcga tggaggaagt cgtggtcatt tcgaaactga tcagcaaaat cttggaggct  33300
tgaagatggc aattcgcaag cccgcattgt cggtcggcga agcacggcgg cttgctggtg  33360
ctcgacccga gatccaccat cccaacccga cacttgttcc ccagaagctg gacctccagc  33420
acttgcctga aaaagccgac gagaaagacc agcaacgtga gcctctcgtc gccgatcaca  33480
tttacagtcc cgatcgacaa cttaagctaa ctgtggatgc ccttagtcca cctccgtccc  33540
cgaaaaagct ccaggttttt ctttcagcgc gaccgcccgc gcctcaagtg tcgaaaacat  33600
atgacaacct cgttcggcaa tacagtccct cgaagtcgct acaaatgatt ttaaggcgcg  33660
cgttggacga tttcgaaagc atgctggcag atggatcatt tcgcgtggcc ccgaaaagtt  33720
atccgatccc ttcaactaca gaaaaatccg ttctcgttca gacctcacgc atgttcccgg  33780
ttgcgttgct cgaggtcgct cgaagtcatt ttgatccgtt ggggttggag accgctcgag  33840
ctttcggcca caagctggct accgccgcgc tcgcgtcatt ctttgctgga gagaagccat  33900
cgagcaattg gtgaagaggg acctatcgga acccctcacc aaatattgag tgtaggtttg  33960
aggccgctgg ccgcgtcctc agtcaccttt tgagccagat aattaagagc caaatgcaat  34020
tggctcaggc tgccatcgtc cccccgtgcg aaacctgcac gtccgcgtca aagaaataac  34080
cggcacctct tgctgttttt atcagttgag ggcttgacgg atccgcctca agtttgcggc  34140
gcagccgcaa aatgagaaca tctatactcc tgtcgtaaac ctcctcgtcg cgtactcgac  34200
tggcaatgag aagttgctcg cgcgatagaa cgtcgcgggg tttctctaaa aacgcgagga  34260
gaagattgaa ctcacctgcc gtaagtttca cctcaccgcc agcttcggac atcaagcgac  34320
gttgcctgag attaagtgtc cagtcagtaa aacaaaaaga ccgtcggtct ttggagcgga  34380
caacgttggg gcgcacgcgc aaggcaaccc gaatgcgtgc aagaaactct ctcgtactaa  34440
acggcttagc gataaaatca cttgctccta gctcgagtgc aacaacttta tccgtctcct  34500
caaggcggtc gccactgata attatgattg gaatatcaga ctttgccgcc agatttcgaa  34560
cgatctcaag cccatcttca cgacctaaat ttagatcaac aaccacgaca tcgaccgtcg  34620
cggaagagag tactctagtg aactgggtgc tgtcggctac cgcggtcact ttgaaggcgt  34680
ggatcgtaag gtattcgata ataagatgcc gcatagcgac atcgtcatcg ataagaagaa  34740
cgtgtttcaa cggctcacct ttcaatctaa aatctgaacc cttgttcaca gcgcttgaga  34800
aattttcacg tgaaggatgt acaatcatct ccagctaaat gggcagttcg tcagaattgc  34860
ggctgaccgc ggatgacgaa aatgcgaacc aagtatttca attttatgac aaaagttctc  34920
aatcgttgtt acaagtgaaa cgcttcgagg ttacagctac tattgattaa ggagatcgcc  34980
tatggtctcg ccccggcgtc gtgcgtccgc cgcgagccag atctcgccta cttcataaac  35040
gtcctcatag gcacggaatg gaatgatgac atcgatcgcc gtagagagca tgtcaatcag  35100
tgtgcgatct tccaagctag caccttgggc gctacttttg acaagggaaa acagtttctt  35160
gaatccttgg attggattcg cgccgtgtat tgttgaaatc gatcccggat gtcccgagac  35220
gacttcactc agataagccc atgctgcatc gtcgcgcatc tcgccaagca atatccggtc  35280
cggccgcata cgcagacttg cttggagcaa gtgctcggcg ctcacagcac ccagcccagc  35340
accgttcttg gagtagagta gtctaacatg attatcgtgt ggaatgacga gttcgagcgt  35400
atcttctatg gtgattagcc tttcctgggg ggggatggcg ctgatcaagg tcttgctcat  35460
tgttgtcttg ccgcttccgg tagggccaca tagcaacatc gtcagtcggc tgacgacgca  35520
tgcgtgcaga aacgcttcca aatccccgtt gtcaaaatgc tgaaggatag cttcatcatc  35580
ctgattttgg cgtttccttc gtgtctgcca ctggttccac ctcgaagcat cataacggga  35640
ggagacttct ttaagaccag aaacacgcga gcttggccgt cgaatggtca agctgacggt  35700
gcccgaggga acggtcggcg gcagacagat ttgtagtcgt tcaccaccag gaagttcagt  35760
ggcgcagagg gggttacgtg gtccgacatc ctgctttctc agcgcgcccg ctaaaatagc  35820
gatatcttca agatcatcat aagagacggg caaaggcatc ttggtaaaaa tgccggcttg  35880
gcgcacaaat gcctctccag gtcgattgat cgcaatttct tcagtcttcg ggtcatcgag  35940
ccattccaaa atcggcttca gaagaaagcg tagttgcgga tccacttcca tttacaatgt  36000
atcctatctc taagcggaaa tttgaattca ttaagagcgg cggttcctcc cccgcgtggc  36060
gccgccagtc aggcggagct ggtaaacacc aaagaaatcg aggtcccgtg ctacgaaaat  36120
ggaaacggtg tcaccctgat tcttcttcag ggttggcggt atgttgatgg ttgccttaag  36180
ggctgtctca gttgtctgct caccgttatt ttgaaagctg ttgaagctca tcccgccacc  36240
cgagctgccg gcgtaggtgc tagctgcctg gaaggcgcct tgaacaacac tcaagagcat  36300
agctccgcta aaacgctgcc agaagtggct gtcgaccgag cccggcaatc ctgagcgacc  36360
gagttcgtcc gcgcttggcg atgttaacga gatcatcgca tggtcaggtg tctcggcgcg  36420
atcccacaac acaaaaacgc gcccatctcc ctgttgcaag ccacgctgta tttcgccaac  36480
aacggtggtg ccacgatcaa gaagcacgat attgttcgtt gttccacgaa tatcctgagg  36540
caagacacac tttacatagc ctgccaaatt tgtgtcgatt gcggtttgca agatgcacgg  36600
aattattgtc ccttgcgtta ccataaaatc ggggtgcggc aagagcgtgg cgctgctggg  36660
ctgcagctcg gtgggtttca tacgtatcga caaatcgttc tcgccggaca cttcgccatt  36720
cggcaaggag ttgtcgtcac gcttgccttc ttgtcttcgg cccgtgtcgc cctgaatggc  36780
gcgtttgctg accccttgat cgccgctgct atatgcaaaa atcggtgttt cttccggccg  36840
tggctcatgc cgctccggtt cgcccctcgg cggtagagga gcagcaggct gaacagcctc  36900
ttgaaccgct ggaggatccg gcggcacctc aatcggagct ggatgaaatg gcttggtgtt  36960
tgttgcgatc aaagttgacg gcgatgcgtt ctcattcacc ttcttttggc gcccacctag  37020
ccaaatgagg cttaatgata acgcgagaac gacacctccg acgatcaatt tctgagaccc  37080
cgaaagacgc cggcgatgtt tgtcggagac cagggatcca gatgcatcaa cctcatgtgc  37140
cgcttgctga ctatcgttat tcatcccttc gcccccttca ggacgcgttt cacatcgggc  37200
ctcaccgtgc ccgtttgcgg cctttggcca acgggatcgt aagcggtgtt ccagatacat  37260
agtactgtgt ggccatccct cagacgccaa cctcgggaaa ccgaagaaat ctcgacatcg  37320
ctccctttaa ctgaatagtt ggcaacagct tccttgccat caggattgat ggtgtagatg  37380
gagggtatgc gtacattgcc cggaaagtgg aataccgtcg taaatccatt gtcgaagact  37440
tcgagtggca acagcgaacg atcgccttgg gcgacgtagt gccaattact gtccgccgca  37500
ccaagggctg tgacaggctg atccaataaa ttctcagctt tccgttgata ttgtgcttcc  37560
gcgtgtagtc tgtccacaac agccttctgt tgtgcctccc ttcgccgagc cgccgcatcg  37620
tcggcggggt aggcgaattg gacgctgtaa tagagatcgg gctgctcttt atcgaggtgg  37680
gacagagtct tggaacttat actgaaaaca taacggcgca tcccggagtc gcttgcggtt  37740
agcacgatta ctggctgagg cgtgaggacc tggcttgcct tgaaaaatag ataatttccc  37800
cgcggtaggg ctgctagatc tttgctattt gaaacggcaa ccgctgtcac cgtttcgttc  37860
gtggcgaatg ttacgaccaa agtagctcca accgccgtcg agaggcgcac cacttgatcg  37920
ggattgtaag ccaaataacg catgcgcgga tctagcttgc ccgccattgg agtgtcttca  37980
gcctccgcac cagtcgcagc ggcaaataaa catgctaaaa tgaaaagtgc ttttctgatc  38040
atggttcgct gtggcctacg tttgaaacgg tatcttccga tgtctgatag gaggtgacaa  38100
ccagacctgc cgggttggtt agtctcaatc tgccgggcaa gctggtcacc ttttcgtagc  38160
gaactgtcgc ggtccacgta ctcaccacag gcattttgcc gtcaacgacg agggtccttt  38220
tatagcgaat ttgctgcgtg cttggagtta catcatttga agcgatgtgc tcgacctcca  38280
ccctgccgcg tttgccaaga atgacttgag gcgaactggg attgggatag ttgaagaatt  38340
gctggtaatc ctggcgcact gttggggcac tgaagttcga taccaggtcg taggcgtact  38400
gagcggtgtc ggcatcataa ctctcgcgca ggcgaacgta ctcccacaat gaggcgttaa  38460
cgacggcctc ctcttgagtt gcaggcaatc gcgagacaga cacctcgctg tcaacggtgc  38520
cgtccggccg tatccataga tatacgggca caagcctgct caacggcacc attgtggcta  38580
tagcgaacgc ttgagcaaca tttcccaaaa tcgcgatagc tgcgacagct gcaatgagtt  38640
tggagagacg tcgcgccgat ttcgctcgcg cggtttgaaa ggcttctact tccttatagt  38700
gctcggcaag gctttcgcgc gccactagca tggcatattc aggccccgtc atagcgtcca  38760
cccgaattgc cgagctgaag atctgacgga gtaggctgcc atcgccccac attcagcggg  38820
aagatcgggc ctttgcagct cgctaatgtg tcgtttgtct ggcagccgct caaagcgaca  38880
actaggcaca gcaggcaata cttcatagaa ttctccattg aggcgaattt ttgcgcgacc  38940
tagcctcgct caacctgagc gaagcgacgg tacaagctgc tggcagattg ggttgcgccg  39000
ctccagtaac tgcctccaat gttgccggcg atcgccggca aagcgacaat gagcgcatcc  39060
cctgtcagaa aaaacatatc gagttcgtaa agaccaatga tcttggccgc ggtcgtaccg  39120
gcgaaggtga ttacaccaag cataagggtg agcgcagtcg cttcggttag gatgacgatc  39180
gttgccacga ggtttaagag gagaagcaag agaccgtagg tgataagttg cccgatccac  39240
ttagctgcga tgtcccgcgt gcgatcaaaa atatatccga cgaggatcag aggcccgatc  39300
gcgagaagca ctttcgtgag aattccaacg gcgtcgtaaa ctccgaaggc agaccagagc  39360
gtgccgtaaa ggacccactg tgccccttgg aaagcaagga tgtcctggtc gttcatcgga  39420
ccgatttcgg atgcgatttt ctgaaaaacg gcctgggtca cggcgaacat tgtatccaac  39480
tgtgccggaa cagtctgcag aggcaagccg gttacactaa actgctgaac aaagtttggg  39540
accgtctttt cgaagatgga aaccacatag tcttggtagt tagcctgccc aacaattaga  39600
gcaacaacga tggtgaccgt gatcacccga gtgataccgc tacgggtatc gacttcgccg  39660
cgtatgacta aaataccctg aacaataatc caaagagtga cacaggcgat caatggcgca  39720
ctcaccgcct cctggatagt ctcaagcatc gagtccaagc ctgtcgtgaa ggctacatcg  39780
aagatcgtat gaatggccgt aaacggcgcc ggaatcgtga aattcatcga ttggacctga  39840
acttgactgg tttgtcgcat aatgttggat aaaatgagct cgcattcggc gaggatgcgg  39900
gcggatgaac aaatcgccca gccttagggg agggcaccaa agatgacagc ggtcttttga  39960
tgctccttgc gttgagcggc cgcctcttcc gcctcgtgaa ggccggcctg cgcggtagtc  40020
atcgttaata ggcttgtcgc ctgtacattt tgaatcattg cgtcatggat ctgcttgaga  40080
agcaaaccat tggtcacggt tgcctgcatg atattgcgag atcgggaaag ctgagcagac  40140
gtatcagcat tcgccgtcaa gcgtttgtcc atcgtttcca gattgtcagc cgcaatgcca  40200
gcgctgtttg cggaaccggt gatctgcgat cgcaacaggt ccgcttcagc atcactaccc  40260
acgactgcac gatctgtatc gctggtgatc gcacgtgccg tggtcgacat tggcattcgc  40320
ggcgaaaaca tttcattgtc taggtccttc gtcgaaggat actgattttt ctggttgagc  40380
gaagtcagta gtccagtaac gccgtaggcc gacgtcaaca tcgtaaccat cgctatagtc  40440
tgagtgagat tctccgcagt cgcgagcgca gtcgcgagcg tctcagcctc cgttgccggg  40500
tcgctaacaa caaactgcgc ccgcgcgggc tgaatatata gaaagctgca ggtcaaaact  40560
gttgcaataa gttgcgtcgt cttcatcgtt tcctacctta tcaatcttct gcctcgtggt  40620
gacgggccat gaattcgctg agccagccag atgagttgcc ttcttgtgcc tcgcgtagtc  40680
gagttgcaaa gcgcaccgtg ttggcacgcc ccgaaagcac ggcgacatat tcacgcatat  40740
cccgcagatc aaattcgcag atgacgcttc cactttctcg tttaagaaga aacttacggc  40800
tgccgaccgt catgtcttca cggatcgcct gaaattcctt ttcggtacat ttcagtccat  40860
cgacataagc cgatcgatct gcggttggtg atggatagaa aatcttcgtc atacattgcg  40920
caaccaagct ggctcctagc ggcgattcca gaacatgctc tggttgctgc gttgccagta  40980
ttagcatccc gttgtttttt cgaacggtca ggaggaattt gtcgacgaca gtcgaaaatt  41040
tagggtttaa caaataggcg cgaaactcat cgcagctcat cacaaaacgg cggccgtcga  41100
tcatggctcc aatccgatgc aggagatatg ctgcagcggg agcgcatact tcctcgtatt  41160
cgagaagatg cgtcatgtcg aagccggtaa tcgacggatc taactttact tcgtcaactt  41220
cgccgtcaaa tgcccagcca agcgcatggc cccggcacca gcgttggagc cgcgctcctg  41280
cgccttcggc gggcccatgc aacaaaaatt cacgtaaccc cgcgattgaa cgcatttgtg  41340
gatcaaacga gagctgacga tggataccac ggaccagacg gcggttctct tccggagaaa  41400
tcccaccccg accatcactc tcgatgagag ccacgatcca ttcgcgcaga aaatcgtgtg  41460
aggctgctgt gttttctagg ccacgcaacg gcgccaaccc gctgggtgtg cctctgtgaa  41520
gtgccaaata tgttcctcct gtggcgcgaa ccagcaattc gccaccccgg tccttgtcaa  41580
agaacacgac cgtacctgca cggtcgacca tgctctgttc gagcatggct agaacaaaca  41640
tcatgagcgt cgtcttaccc ctcccgatag gcccgaatat tgccgtcatg ccaacatcgt  41700
gctcatgcgg gatatagtcg aaaggcgttc cgccattggt acgaaatcgg gcaatcgcgt  41760
tgccccagtg gcctgagctg gcgccctctg gaaagttttc gaaagagaca aaccctgcga  41820
aattgcgtga agtgattgcg ccagggcgtg tgcgccactt aaaattcccc ggcaattggg  41880
accaataggc cgcttccata ccaatacctt cttggacaac cacggcacct gcatccgcca  41940
ttcgtgtccg agcccgcgcg cccctgtccc caagactatt gagatcgtct gcatagacgc  42000
aaaggctcaa atgatgtgag cccataacga attcgttgct cgcaagtgcg tcctcagcct  42060
cggataattt gccgatttga gtcacggctt tatcgccgga actcagcatc tggctcgatt  42120
tgaggctaag tttcgcgtgc gcttgcgggc gagtcaggaa cgaaaaactc tgcgtgagaa  42180
caagtggaaa atcgagggat agcagcgcgt tgagcatgcc cggccgtgtt tttgcagggt  42240
attcgcgaaa cgaatagatg gatccaacgt aactgtcttt tggcgttctg atctcgagtc  42300
ctcgcttgcc gcaaatgact ctgtcggtat aaatcgaagc gccgagtgag ccgctgacga  42360
ccggaaccgg tgtgaaccga ccagtcatga tcaaccgtag cgcttcgcca atttcggtga  42420
agagcacacc ctgcttctcg cggatgccaa gacgatgcag gccatacgct ttaagagagc  42480
cagcgacaac atgccaaaga tcttccatgt tcctgatctg gcccgtgaga tcgttttccc  42540
tttttccgct tagcttggtg aacctcctct ttaccttccc taaagccgcc tgtgggtaga  42600
caatcaacgt aaggaagtgt tcattgcgga ggagttggcc ggagagcacg cgctgttcaa  42660
aagcttcgtt caggctagcg gcgaaaacac tacggaagtg tcgcggcgcc gatgatggca  42720
cgtcggcatg acgtacgagg tgagcatata ttgacacatg atcatcagcg atattgcgca  42780
acagcgtgtt gaacgcacga caacgcgcat tgcgcatttc agtttcctca agctcgaatg  42840
caacgccatc aattctcgca atggtcatga tcgatccgtc ttcaagaagg acgatatggt  42900
cgctgaggtg gccaatataa gggagataga tctcaccgga tctttcggtc gttccactcg  42960
cgccgagcat cacaccattc ctctccctcg tgggggaacc ctaattggat ttgggctaac  43020
agtagcgccc ccccaaactg cactatcaat gcttcttccc gcggtccgca aaaatagcag  43080
gacgacgctc gccgcattgt agtctcgctc cacgatgagc cgggctgcaa accataacgg  43140
cacgagaacg acttcgtaga gcgggttctg aacgataacg atgacaaagc cggcgaacat  43200
catgaataac cctgccaatg tcagtggcac cccaagaaac aatgcgggcc gtgtggctgc  43260
gaggtaaagg gtcgattctt ccaaacgatc agccatcaac taccgccagt gagcgtttgg  43320
ccgaggaagc tcgccccaaa catgataaca atgccgccga cgacgccggc aaccagccca  43380
agcgaagccc gcccgaacat ccaggagatc ccgatagcga caatgccgag aacagcgagt  43440
gactggccga acggaccaag gataaacgtg catatattgt taaccattgt ggcggggtca  43500
gtgccgccac ccgcagattg cgctgcggcg ggtccggatg aggaaatgct ccatgcaatt  43560
gcaccgcaca agcttggggc gcagctcgat atcacgcgca tcatcgcatt cgagagcgag  43620
aggcgattta gatgtaaacg gtatctctca aagcatcgca tcaatgcgca cctccttagt  43680
ataagtcgaa taagacttga ttgtcgtctg cggatttgcc gttgtcctgg tgtggcggtg  43740
gcggagcgat taaaccgcca gcgccatcct cctgcgagcg gcgctgatat gacccccaaa  43800
catcccacgt ctcttcggat tttagcgcct cgtgatcgtc ttttggaggc tcgattaacg  43860
cgggcaccag cgattgagca gctgtttcaa cttttcgcac gtagccgttt gcaaaaccgc  43920
cgatgaaatt accggtgttg taagcggaga tcgcccgacg aagcgcaaat tgcttctcgt  43980
caatcgtttc gccgcctgca taacgacttt tcagcatgtt tgcagcggca gataatgatg  44040
tgcacgcctg gagcgcaccg tcaggtgtca gaccgagcat agaaaaattt cgagagttta  44100
tttgcatgag gccaacatcc agcgaatgcc gtgcatcgag acggtgcctg acgacttggg  44160
ttgcttggct gtgatcttgc cagtgaagcg tttcgccggt cgtgttgtca tgaatcgcta  44220
aaggatcaaa gcgactctcc accttagcta tcgccgcaag cgtagatgtc gcaactgatg  44280
gggcacactt gcgagcaaca tggtcaaact cagcagatga gagtggcgtg gcaaggctcg  44340
acgaacagaa ggagaccatc aaggcaagag aaagcgaccc cgatctctta agcatacctt  44400
atctccttag ctcgcaacta acaccgcctc tcccgttgga agaagtgcgt tgttttatgt  44460
tgaagattat cgggagggtc ggttactcga aaattttcaa ttgcttcttt atgatttcaa  44520
ttgaagcgag aaacctcgcc cggcgtcttg gaacgcaaca tggaccgaga accgcgcatc  44580
catgactaag caaccggatc gacctattca ggccgcagtt ggtcaggtca ggctcagaac  44640
gaaaatgctc ggcgaggtta cgctgtctgt aaacccattc gatgaacggg aagcttcctt  44700
ccgattgctc ttggcaggaa tattggccca tgcctgcttg cgctttgcaa atgctcttat  44760
cgcgttggta tcatatgcct tgtccgccag cagaaacgca ctctaagcga ttatttgtaa  44820
aaatgtttcg gtcatgcggc ggtcatgggc ttgacccgct gtcagcgcaa gacggatcgg  44880
tcaaccgtcg gcatcgacaa cagcgtgaat cttggtggtc aaaccgccac gggaacgtcc  44940
catacagcca tcgtcttgat cccgctgttt cccgtcgccg catgttggtg gacgcggaca  45000
caggaactgt caatcatgac gacattctat cgaaagcctt ggaaatcaca ctcagaatat  45060
gatcccagac gtctgcctca cgccatcgta caaagcgatt gtagcaggtt gtacaggaac  45120
cgtatcgatc aggaacgtct gcccagggcg ggcccgtccg gaagcgccac aagatgacat  45180
tgatcacccg cgtcaacgcg cggcacgcga cgcggcttat ttgggaacaa aggactgaac  45240
aacagtccat tcgaaatcgg tgacatcaaa gcggggacgg gttatcagtg gcctccaagt  45300
caagcctcaa tgaatcaaaa tcagaccgat ttgcaaacct gatttatgag tgtgcggcct  45360
aaatgatgaa atcgtccttc tagatcgcct ccgtggtgta gcaacacctc gcagtatcgc  45420
cgtgctgacc ttggccaggg aattgactgg caagggtgct ttcacatgac cgctcttttg  45480
gccgcgatag atgatttcgt tgctgctttg ggcacgtaga aggagagaag tcatatcgga  45540
gaaattcctc ctggcgcgag agcctgctct atcgcgacgg catcccactg tcgggaacag  45600
accggatcat tcacgaggcg aaagtcgtca acacatgcgt tataggcatc ttcccttgaa  45660
ggatgatctt gttgctgcca atctggaggt gcggcagccg caggcagatg cgatctcagc  45720
gcaacttgcg gcaaaacatc tcactcacct gaaaaccact agcgagtctc gcgatcagac  45780
gaaggccttt tacttaacga cacaatatcc gatgtctgca tcacaggcgt cgctatccca  45840
gtcaatacta aagcggtgca ggaactaaag attactgatg acttaggcgt gccacgaggc  45900
ctgagacgac gcgcgtagac agttttttga aatcattatc aaagtgatgg cctccgctga  45960
agcctatcac ctctgcgccg gtctgtcgga gagatgggca agcattatta cggtcttcgc  46020
gcccgtacat gcattggacg attgcagggt caatggatct gagatcatcc agaggattgc  46080
cgcccttacc ttccgtttcg agttggagcc agcccctaaa tgagacgaca tagtcgactt  46140
gatgtgacaa tgccaagaga gagatttgct taacccgatt tttttgctca agcgtaagcc  46200
tattgaagct tgccggcatg acgtccgcgc cgaaagaata tcctacaagt aaaacattct  46260
gcacaccgaa atgcttggtg tagacatcga ttatgtgacc aagatcctta gcagtttcgc  46320
ttggggaccg ctccgaccag aaataccgaa gtgaactgac gccaatgaca ggaatccctt  46380
ccgtctgcag ataggtacca tcgatagatc tgctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt  46440
gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc  46500
gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc  46560
atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc  46620
agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa  46680
aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc  46740
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag  46800
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa  46860
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc  46920
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc  46980
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg  47040
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt  47100
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc  47160
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc  47220
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag  47280
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg  47340
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa  47400
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag  47460
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact  47520
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa  47580
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt  47640
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag  47700
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca  47760
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc  47820
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt  47880
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg  47940
ttgttgccat tgctgcaggg gggggggggg ggggggactt ccattgttca ttccacggac  48000
aaaaacagag aaaggaaacg acagaggcca aaaagcctcg ctttcagcac ctgtcgtttc  48060
ctttcttttc agagggtatt ttaaataaaa acattaagtt atgacgaaga agaacggaaa  48120
cgccttaaac cggaaaattt tcataaatag cgaaaacccg cgaggtcgcc gccccgtagt  48180
cggatcaccg gaaaggaccc gtaaagtgat aatgattatc atctacatat cacaacgtgc  48240
gtggaggcca tcaaaccacg tcaaataatc aattatgacg caggtatcgt attaattgat  48300
ctgcatcaac ttaacgtaaa aacaacttca gacaatacaa atcagcgaca ctgaatacgg  48360
ggcaacctca tgtccccccc cccccccccc ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt  48420
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca  48480
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg  48540
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat  48600
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta  48660
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca  48720
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct  48780
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat  48840
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa  48900
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt  48960
gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa  49020
ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa  49080
ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc  49140
aagaattggt cgacgatctt gctgcgttcg gatattttcg tggagttccc gccacagacc  49200
cggattgaag gcgagatcca gcaactcgcg ccagatcatc ctgtgacgga actttggcgc  49260
gtgatgactg gccaggacgt cggccgaaag agcgacaagc agatcacgct tttcgacagc  49320
gtcggatttg cgatcgagga tttttcggcg ctgcgctacg tccgcgaccg cgttgaggga 49380
tcaagccaca gcagcccact cgaccttcta gccgacccag acgagccaag ggatcttttt 49440
ggaatgctgc tccgtcgtca ggctttccga cgtttgggtg gttgaacaga agtcattatc 49500
gtacggaatg ccaagcactc ccgaggggaa ccctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga 49560
cgaacggata aaccttttca cgccctttta aatatccgtt attctaataa acgctctttt 49620
ctcttaggtt tacccgccaa tatatcctgt caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg 49680
aaacgacaat ctgatcatga gcggagaatt aagggagtca cgttatgacc cccgccgatg 49740
acgcgggaca agccgtttta cgtttggaac tgacagaacc gcaacgttga aggagccact 49800
cagcaagctg gtacgattgt aatacgactc actatagggc gaattgagcg ctgtttaaac 49860
gctcttcaac tggaagggcg gttacccgga ccgaagcttg catgcctgca g          49911
 
<210>32
<211>36909
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>32
tctagagctc gttcctcgag gcctcgaggc ctcgaggaac ggtacctgcg gggaagctta     60
caataatgtg tgttgttaag tcttgttgcc tgtcatcgtc tgactgactt tcgtcataaa    120
tcccggcctc cgtaacccag ctttgggcaa gctcacggat ttgatccggc ggaacgggaa    180
tatcgagatg ccgggctgaa cgctgcagtt ccagctttcc ctttcgggac aggtactcca    240
gctgattgat tatctgctga agggtcttgg ttccacctcc tggcacaatg cgaatgatta    300
cttgagcgcg atcgggcatc caattttctc ccgtcaggtg cgtggtcaag tgctacaagg    360
cacctttcag taacgagcga ccgtcgatcc gtcgccggga tacggacaaa atggagcgca    420
gtagtccatc gagggcggcg aaagcctcgc caaaagcaat acgttcatct cgcacagcct    480
ccagatccga tcgagggtct tcggcgtagg cagatagaag catggataca ttgcttgaga    540
gtattccgat ggactgaagt atggcttcca tcttttctcg tgtgtctgca tctatttcga     600
gaaagccccc gatgcggcgc accgcaacgc gaattgccat actatccgaa agtcccagca     660
ggcgcgcttg ataggaaaag gtttcatact cggccgatcg cagacgggca ctcacgacct     720
tgaacccttc aactttcagg gatcgatgct ggttgatggt agtctcactc gacgtggctc     780
tggtgtgttt tgacatagct tcctccaaag aaagcggaag gtctggatac tccagcacga     840
aatgtgcccg ggtagacgga tggaagtcta gccctgctca atatgaaatc aacagtacat     900
ttacagtcaa tactgaatat acttgctaca tttgcaattg tcttataacg aatgtgaaat     960
aaaaatagtg taacaacgct tttactcatc gataatcaca aaaacattta tacgaacaaa    1020
aatacaaatg cactccggtt tcacaggata ggcgggatca gaatatgcaa cttttgacgt    1080
tttgttcttt caaagggggt gctggcaaaa ccaccgcact catgggcctt tgcgctgctt    1140
tggcaaatga cggtaaacga gtggccctct ttgatgccga cgaaaaccgg cctctgacgc    1200
gatggagaga aaacgcctta caaagcagta ctgggatcct cgctgtgaag tctattccgc    1260
cgacgaaatg ccccttcttg aagcagccta tgaaaatgcc gagctcgaag gatttgatta    1320
tgcgttggcc gatacgcgtg gcggctcgag cgagctcaac aacacaatca tcgctagctc    1380
aaacctgctt ctgatcccca ccatgctaac gccgctcgac atcgatgagg cactatctac    1440
ctaccgctac gtcatcgagc tgctgttgag tgaaaatttg gcaattccta cagctgtttt    1500
gcgccaacgc gtcccggtcg gccgattgac aacatcgcaa cgcaggatgt cagagacgct    1560
agagagcctt ccagttgtac cgtctcccat gcatgaaaga gatgcatttg ccgcgatgaa    1620
agaacgcggc atgttgcatc ttacattact aaacacggga actgatccga cgatgcgcct    1680
catagagagg aatcttcgga ttgcgatgga ggaagtcgtg gtcatttcga aactgatcag    1740
caaaatcttg gaggcttgaa gatggcaatt cgcaagcccg cattgtcggt cggcgaagca    1800
cggcggcttg ctggtgctcg acccgagatc caccatccca acccgacact tgttccccag    1860
aagctggacc tccagcactt gcctgaaaaa gccgacgaga aagaccagca acgtgagcct    1920
ctcgtcgccg atcacattta cagtcccgat cgacaactta agctaactgt ggatgccctt    1980
agtccacctc cgtccccgaa aaagctccag gtttttcttt cagcgcgacc gcccgcgcct    2040
caagtgtcga aaacatatga caacctcgtt cggcaataca gtccctcgaa gtcgctacaa    2100
atgattttaa ggcgcgcgtt ggacgatttc gaaagcatgc tggcagatgg atcatttcgc    2160
gtggccccga aaagttatcc gatcccttca actacagaaa aatccgttct cgttcagacc    2220
tcacgcatgt tcccggttgc gttgctcgag gtcgctcgaa gtcattttga tccgttgggg    2280
ttggagaccg ctcgagcttt cggccacaag ctggctaccg ccgcgctcgc gtcattcttt    2340
gctggagaga agccatcgag caattggtga agagggacct atcggaaccc ctcaccaaat    2400
attgagtgta ggtttgaggc cgctggccgc gtcctcagtc accttttgag ccagataatt    2460
aagagccaaa tgcaattggc tcaggctgcc atcgtccccc cgtgcgaaac ctgcacgtcc    2520
gcgtcaaaga aataaccggc acctcttgct gtttttatca gttgagggct tgacggatcc    2580
gcctcaagtt tgcggcgcag ccgcaaaatg agaacatcta tactcctgtc gtaaacctcc    2640
tcgtcgcgta ctcgactggc aatgagaagt tgctcgcgcg atagaacgtc gcggggtttc    2700
tctaaaaacg cgaggagaag attgaactca cctgccgtaa gtttcacctc accgccagct    2760
tcggacatca agcgacgttg cctgagatta agtgtccagt cagtaaaaca aaaagaccgt    2820
cggtctttgg agcggacaac gttggggcgc acgcgcaagg caacccgaat gcgtgcaaga    2880
aactctctcg tactaaacgg cttagcgata aaatcacttg ctcctagctc gagtgcaaca    2940
actttatccg tctcctcaag gcggtcgcca ctgataatta tgattggaat atcagacttt    3000
gccgccagat ttcgaacgat ctcaagccca tcttcacgac ctaaatttag atcaacaacc    3060
acgacatcga ccgtcgcgga agagagtact ctagtgaact gggtgctgtc ggctaccgcg    3120
gtcactttga aggcgtggat cgtaaggtat tcgataataa gatgccgcat agcgacatcg    3180
tcatcgataa gaagaacgtg tttcaacggc tcacctttca atctaaaatc tgaacccttg    3240
ttcacagcgc ttgagaaatt ttcacgtgaa ggatgtacaa tcatctccag ctaaatgggc    3300
agttcgtcag aattgcggct gaccgcggat gacgaaaatg cgaaccaagt atttcaattt    3360
tatgacaaaa gttctcaatc gttgttacaa gtgaaacgct tcgaggttac agctactatt    3420
gattaaggag atcgcctatg gtctcgcccc ggcgtcgtgc gtccgccgcg agccagatct    3480
cgcctacttc ataaacgtcc tcataggcac ggaatggaat gatgacatcg atcgccgtag    3540
agagcatgtc aatcagtgtg cgatcttcca agctagcacc ttgggcgcta cttttgacaa    3600
gggaaaacag tttcttgaat ccttggattg gattcgcgcc gtgtattgtt gaaatcgatc    3660
ccggatgtcc cgagacgact tcactcagat aagcccatgc tgcatcgtcg cgcatctcgc    3720
caagcaatat ccggtccggc cgcatacgca gacttgcttg gagcaagtgc tcggcgctca    3780
cagcacccag cccagcaccg ttcttggagt agagtagtct aacatgatta tcgtgtggaa    3840
tgacgagttc gagcgtatct tctatggtga ttagcctttc ctgggggggg atggcgctga    3900
tcaaggtctt gctcattgtt gtcttgccgc ttccggtagg gccacatagc aacatcgtca    3960
gtcggctgac gacgcatgcg tgcagaaacg cttccaaatc cccgttgtca aaatgctgaa    4020
ggatagcttc atcatcctga ttttggcgtt tccttcgtgt ctgccactgg ttccacctcg    4080
aagcatcata acgggaggag acttctttaa gaccagaaac acgcgagctt ggccgtcgaa    4140
tggtcaagct gacggtgccc gagggaacgg tcggcggcag acagatttgt agtcgttcac    4200
caccaggaag ttcagtggcg cagagggggt tacgtggtcc gacatcctgc tttctcagcg    4260
cgcccgctaa aatagcgata tcttcaagat catcataaga gacgggcaaa ggcatcttgg    4320
taaaaatgcc ggcttggcgc acaaatgcct ctccaggtcg attgatcgca atttcttcag    4380
tcttcgggtc atcgagccat tccaaaatcg gcttcagaag aaagcgtagt tgcggatcca    4440
cttccattta caatgtatcc tatctctaag cggaaatttg aattcattaa gagcggcggt    4500
tcctcccccg cgtggcgccg ccagtcaggc ggagctggta aacaccaaag aaatcgaggt    4560
cccgtgctac gaaaatggaa acggtgtcac cctgattctt cttcagggtt ggcggtatgt    4620
tgatggttgc cttaagggct gtctcagttg tctgctcacc gttattttga aagctgttga    4680
agctcatccc gccacccgag ctgccggcgt aggtgctagc tgcctggaag gcgccttgaa    4740
caacactcaa gagcatagct ccgctaaaac gctgccagaa gtggctgtcg accgagcccg    4800
gcaatcctga gcgaccgagt tcgtccgcgc ttggcgatgt taacgagatc atcgcatggt    4860
caggtgtctc ggcgcgatcc cacaacacaa aaacgcgccc atctccctgt tgcaagccac    4920
gctgtatttc gccaacaacg gtggtgccac gatcaagaag cacgatattg ttcgttgttc    4980
cacgaatatc ctgaggcaag acacacttta catagcctgc caaatttgtg tcgattgcgg    5040
tttgcaagat gcacggaatt attgtccctt gcgttaccat aaaatcgggg tgcggcaaga    5100
gcgtggcgct gctgggctgc agctcggtgg gtttcatacg tatcgacaaa tcgttctcgc    5160
cggacacttc gccattcggc aaggagttgt cgtcacgctt gccttcttgt cttcggcccg    5220
tgtcgccctg aatggcgcgt ttgctgaccc cttgatcgcc gctgctatat gcaaaaatcg    5280
gtgtttcttc cggccgtggc tcatgccgct ccggttcgcc cctcggcggt agaggagcag    5340
caggctgaac agcctcttga accgctggag gatccggcgg cacctcaatc ggagctggat    5400
gaaatggctt ggtgtttgtt gcgatcaaag ttgacggcga tgcgttctca ttcaccttct    5460
tttggcgccc acctagccaa atgaggctta atgataacgc gagaacgaca cctccgacga    5520
tcaatttctg agaccccgaa agacgccggc gatgtttgtc ggagaccagg gatccagatg    5580
catcaacctc atgtgccgct tgctgactat cgttattcat cccttcgccc ccttcaggac    5640
gcgtttcaca tcgggcctca ccgtgcccgt ttgcggcctt tggccaacgg gatcgtaagc    5700
ggtgttccag atacatagta ctgtgtggcc atccctcaga cgccaacctc gggaaaccga    5760
agaaatctcg acatcgctcc ctttaactga atagttggca acagcttcct tgccatcagg    5820
attgatggtg tagatggagg gtatgcgtac attgcccgga aagtggaata ccgtcgtaaa    5880
tccattgtcg aagacttcga gtggcaacag cgaacgatcg ccttgggcga cgtagtgcca    5940
attactgtcc gccgcaccaa gggctgtgac aggctgatcc aataaattct cagctttccg    6000
ttgatattgt gcttccgcgt gtagtctgtc cacaacagcc ttctgttgtg cctcccttcg    6060
ccgagccgcc gcatcgtcgg cggggtaggc gaattggacg ctgtaataga gatcgggctg    6120
ctctttatcg aggtgggaca gagtcttgga acttatactg aaaacataac ggcgcatccc    6180
ggagtcgctt gcggttagca cgattactgg ctgaggcgtg aggacctggc ttgccttgaa    6240
aaatagataa tttccccgcg gtagggctgc tagatctttg ctatttgaaa cggcaaccgc    6300
tgtcaccgtt tcgttcgtgg cgaatgttac gaccaaagta gctccaaccg ccgtcgagag    6360
gcgcaccact tgatcgggat tgtaagccaa ataacgcatg cgcggatcta gcttgcccgc    6420
cattggagtg tcttcagcct ccgcaccagt cgcagcggca aataaacatg ctaaaatgaa    6480
aagtgctttt ctgatcatgg ttcgctgtgg cctacgtttg aaacggtatc ttccgatgtc    6540
tgataggagg tgacaaccag acctgccggg ttggttagtc tcaatctgcc gggcaagctg    6600
gtcacctttt cgtagcgaac tgtcgcggtc cacgtactca ccacaggcat tttgccgtca    6660
acgacgaggg tccttttata gcgaatttgc tgcgtgcttg gagttacatc atttgaagcg    6720
atgtgctcga cctccaccct gccgcgtttg ccaagaatga cttgaggcga actgggattg    6780
ggatagttga agaattgctg gtaatcctgg cgcactgttg gggcactgaa gttcgatacc    6840
aggtcgtagg cgtactgagc ggtgtcggca tcataactct cgcgcaggcg aacgtactcc    6900
cacaatgagg cgttaacgac ggcctcctct tgagttgcag gcaatcgcga gacagacacc    6960
tcgctgtcaa cggtgccgtc cggccgtatc catagatata cgggcacaag cctgctcaac    7020
ggcaccattg tggctatagc gaacgcttga gcaacatttc ccaaaatcgc gatagctgcg    7080
acagctgcaa tgagtttgga gagacgtcgc gccgatttcg ctcgcgcggt ttgaaaggct    7140
tctacttcct tatagtgctc ggcaaggctt tcgcgcgcca ctagcatggc atattcaggc    7200
cccgtcatag cgtccacccg aattgccgag ctgaagatct gacggagtag gctgccatcg    7260
ccccacattc agcgggaaga tcgggccttt gcagctcgct aatgtgtcgt ttgtctggca    7320
gccgctcaaa gcgacaacta ggcacagcag gcaatacttc atagaattct ccattgaggc    7380
gaatttttgc gcgacctagc ctcgctcaac ctgagcgaag cgacggtaca agctgctggc    7440
agattgggtt gcgccgctcc agtaactgcc tccaatgttg ccggcgatcg ccggcaaagc    7500
gacaatgagc gcatcccctg tcagaaaaaa catatcgagt tcgtaaagac caatgatctt    7560
ggccgcggtc gtaccggcga aggtgattac accaagcata agggtgagcg cagtcgcttc    7620
ggttaggatg acgatcgttg ccacgaggtt taagaggaga agcaagagac cgtaggtgat    7680
aagttgcccg atccacttag ctgcgatgtc ccgcgtgcga tcaaaaatat atccgacgag    7740
gatcagaggc ccgatcgcga gaagcacttt cgtgagaatt ccaacggcgt cgtaaactcc    7800
gaaggcagac cagagcgtgc cgtaaaggac ccactgtgcc ccttggaaag caaggatgtc    7860
ctggtcgttc atcggaccga tttcggatgc gattttctga aaaacggcct gggtcacggc    7920
gaacattgta tccaactgtg ccggaacagt ctgcagaggc aagccggtta cactaaactg    7980
ctgaacaaag tttgggaccg tcttttcgaa gatggaaacc acatagtctt ggtagttagc    8040
ctgcccaaca attagagcaa caacgatggt gaccgtgatc acccgagtga taccgctacg    8100
ggtatcgact tcgccgcgta tgactaaaat accctgaaca ataatccaaa gagtgacaca    8160
ggcgatcaat ggcgcactca ccgcctcctg gatagtctca agcatcgagt ccaagcctgt    8220
cgtgaaggct acatcgaaga tcgtatgaat ggccgtaaac ggcgccggaa tcgtgaaatt    8280
catcgattgg acctgaactt gactggtttg tcgcataatg ttggataaaa tgagctcgca    8340
ttcggcgagg atgcgggcgg atgaacaaat cgcccagcct taggggaggg caccaaagat    8400
gacagcggtc ttttgatgct ccttgcgttg agcggccgcc tcttccgcct cgtgaaggcc    8460
ggcctgcgcg gtagtcatcg ttaataggct tgtcgcctgt acattttgaa tcattgcgtc    8520
atggatctgc ttgagaagca aaccattggt cacggttgcc tgcatgatat tgcgagatcg    8580
ggaaagctga gcagacgtat cagcattcgc cgtcaagcgt ttgtccatcg tttccagatt    8640
gtcagccgca atgccagcgc tgtttgcgga accggtgatc tgcgatcgca acaggtccgc    8700
ttcagcatca ctacccacga ctgcacgatc tgtatcgctg gtgatcgcac gtgccgtggt    8760
cgacattggc attcgcggcg aaaacatttc attgtctagg tccttcgtcg aaggatactg    8820
atttttctgg ttgagcgaag tcagtagtcc agtaacgccg taggccgacg tcaacatcgt    8880
aaccatcgct atagtctgag tgagattctc cgcagtcgcg agcgcagtcg cgagcgtctc    8940
agcctccgtt gccgggtcgc taacaacaaa ctgcgcccgc gcgggctgaa tatatagaaa    9000
gctgcaggtc aaaactgttg caataagttg cgtcgtcttc atcgtttcct accttatcaa    9060
tcttctgcct cgtggtgacg ggccatgaat tcgctgagcc agccagatga gttgccttct    9120
tgtgcctcgc gtagtcgagt tgcaaagcgc accgtgttgg cacgccccga aagcacggcg    9180
acatattcac gcatatcccg cagatcaaat tcgcagatga cgcttccact ttctcgttta     9240
agaagaaact tacggctgcc gaccgtcatg tcttcacgga tcgcctgaaa ttccttttcg     9300
gtacatttca gtccatcgac ataagccgat cgatctgcgg ttggtgatgg atagaaaatc     9360
ttcgtcatac attgcgcaac caagctggct cctagcggcg attccagaac atgctctggt     9420
tgctgcgttg ccagtattag catcccgttg ttttttcgaa cggtcaggag gaatttgtcg     9480
acgacagtcg aaaatttagg gtttaacaaa taggcgcgaa actcatcgca gctcatcaca     9540
aaacggcggc cgtcgatcat ggctccaatc cgatgcagga gatatgctgc agcgggagcg     9600
catacttcct cgtattcgag aagatgcgtc atgtcgaagc cggtaatcga cggatctaac     9660
tttacttcgt caacttcgcc gtcaaatgcc cagccaagcg catggccccg gcaccagcgt     9720
tggagccgcg ctcctgcgcc ttcggcgggc ccatgcaaca aaaattcacg taaccccgcg     9780
attgaacgca tttgtggatc aaacgagagc tgacgatgga taccacggac cagacggcgg     9840
ttctcttccg gagaaatccc accccgacca tcactctcga tgagagccac gatccattcg     9900
cgcagaaaat cgtgtgaggc tgctgtgttt tctaggccac gcaacggcgc caacccgctg     9960
ggtgtgcctc tgtgaagtgc caaatatgtt cctcctgtgg cgcgaaccag caattcgcca    10020
ccccggtcct tgtcaaagaa cacgaccgta cctgcacggt cgaccatgct ctgttcgagc    10080
atggctagaa caaacatcat gagcgtcgtc ttacccctcc cgataggccc gaatattgcc    10140
gtcatgccaa catcgtgctc atgcgggata tagtcgaaag gcgttccgcc attggtacga    10200
aatcgggcaa tcgcgttgcc ccagtggcct gagctggcgc cctctggaaa gttttcgaaa    10260
gagacaaacc ctgcgaaatt gcgtgaagtg attgcgccag ggcgtgtgcg ccacttaaaa    10320
ttccccggca attgggacca ataggccgct tccataccaa taccttcttg gacaaccacg    10380
gcacctgcat ccgccattcg tgtccgagcc cgcgcgcccc tgtccccaag actattgaga    10440
tcgtctgcat agacgcaaag gctcaaatga tgtgagccca taacgaattc gttgctcgca    10500
agtgcgtcct cagcctcgga taatttgccg atttgagtca cggctttatc gccggaactc    10560
agcatctggc tcgatttgag gctaagtttc gcgtgcgctt gcgggcgagt caggaacgaa    10620
aaactctgcg tgagaacaag tggaaaatcg agggatagca gcgcgttgag catgcccggc    10680
cgtgtttttg cagggtattc gcgaaacgaa tagatggatc caacgtaact gtcttttggc    10740
gttctgatct cgagtcctcg cttgccgcaa atgactctgt cggtataaat cgaagcgccg    10800
agtgagccgc tgacgaccgg aaccggtgtg aaccgaccag tcatgatcaa ccgtagcgct    10860
tcgccaattt cggtgaagag cacaccctgc ttctcgcgga tgccaagacg atgcaggcca    10920
tacgctttaa gagagccagc gacaacatgc caaagatctt ccatgttcct gatctggccc    10980
gtgagatcgt tttccctttt tccgcttagc ttggtgaacc tcctctttac cttccctaaa    11040
gccgcctgtg ggtagacaat caacgtaagg aagtgttcat tgcggaggag ttggccggag    11100
agcacgcgct gttcaaaagc ttcgttcagg ctagcggcga aaacactacg gaagtgtcgc    11160
ggcgccgatg atggcacgtc ggcatgacgt acgaggtgag catatattga cacatgatca    11220
tcagcgatat tgcgcaacag cgtgttgaac gcacgacaac gcgcattgcg catttcagtt    11280
tcctcaagct cgaatgcaac gccatcaatt ctcgcaatgg tcatgatcga tccgtcttca    11340
agaaggacga tatggtcgct gaggtggcca atataaggga gatagatctc accggatctt    11400
tcggtcgttc cactcgcgcc gagcatcaca ccattcctct ccctcgtggg ggaaccctaa    11460
ttggatttgg gctaacagta gcgccccccc aaactgcact atcaatgctt cttcccgcgg    11520
tccgcaaaaa tagcaggacg acgctcgccg cattgtagtc tcgctccacg atgagccggg    11580
ctgcaaacca taacggcacg agaacgactt cgtagagcgg gttctgaacg ataacgatga    11640
caaagccggc gaacatcatg aataaccctg ccaatgtcag tggcacccca agaaacaatg    11700
cgggccgtgt ggctgcgagg taaagggtcg attcttccaa acgatcagcc atcaactacc    11760
gccagtgagc gtttggccga ggaagctcgc cccaaacatg ataacaatgc cgccgacgac    11820
gccggcaacc agcccaagcg aagcccgccc gaacatccag gagatcccga tagcgacaat    11880
gccgagaaca gcgagtgact ggccgaacgg accaaggata aacgtgcata tattgttaac    11940
cattgtggcg gggtcagtgc cgccacccgc agattgcgct gcggcgggtc cggatgagga    12000
aatgctccat gcaattgcac cgcacaagct tggggcgcag ctcgatatca cgcgcatcat    12060
cgcattcgag agcgagaggc gatttagatg taaacggtat ctctcaaagc atcgcatcaa    12120
tgcgcacctc cttagtataa gtcgaataag acttgattgt cgtctgcgga tttgccgttg    12180
tcctggtgtg gcggtggcgg agcgattaaa ccgccagcgc catcctcctg cgagcggcgc    12240
tgatatgacc cccaaacatc ccacgtctct tcggatttta gcgcctcgtg atcgtctttt    12300
ggaggctcga ttaacgcggg caccagcgat tgagcagctg tttcaacttt tcgcacgtag    12360
ccgtttgcaa aaccgccgat gaaattaccg gtgttgtaag cggagatcgc ccgacgaagc    12420
gcaaattgct tctcgtcaat cgtttcgccg cctgcataac gacttttcag catgtttgca    12480
gcggcagata atgatgtgca cgcctggagc gcaccgtcag gtgtcagacc gagcatagaa    12540
aaatttcgag agtttatttg catgaggcca acatccagcg aatgccgtgc atcgagacgg    12600
tgcctgacga cttgggttgc ttggctgtga tcttgccagt gaagcgtttc gccggtcgtg    12660
ttgtcatgaa tcgctaaagg atcaaagcga ctctccacct tagctatcgc cgcaagcgta    12720
gatgtcgcaa ctgatggggc acacttgcga gcaacatggt caaactcagc agatgagagt    12780
ggcgtggcaa ggctcgacga acagaaggag accatcaagg caagagaaag cgaccccgat    12840
ctcttaagca taccttatct ccttagctcg caactaacac cgcctctccc gttggaagaa    12900
gtgcgttgtt ttatgttgaa gattatcggg agggtcggtt actcgaaaat tttcaattgc    12960
ttctttatga tttcaattga agcgagaaac ctcgcccggc gtcttggaac gcaacatgga    13020
ccgagaaccg cgcatccatg actaagcaac cggatcgacc tattcaggcc gcagttggtc    13080
aggtcaggct cagaacgaaa atgctcggcg aggttacgct gtctgtaaac ccattcgatg    13140
aacgggaagc ttccttccga ttgctcttgg caggaatatt ggcccatgcc tgcttgcgct    13200
ttgcaaatgc tcttatcgcg ttggtatcat atgccttgtc cgccagcaga aacgcactct    13260
aagcgattat ttgtaaaaat gtttcggtca tgcggcggtc atgggcttga cccgctgtca    13320
gcgcaagacg gatcggtcaa ccgtcggcat cgacaacagc gtgaatcttg gtggtcaaac    13380
cgccacggga acgtcccata cagccatcgt cttgatcccg ctgtttcccg tcgccgcatg    13440
ttggtggacg cggacacagg aactgtcaat catgacgaca ttctatcgaa agccttggaa    13500
atcacactca gaatatgatc ccagacgtct gcctcacgcc atcgtacaaa gcgattgtag    13560
caggttgtac aggaaccgta tcgatcagga acgtctgccc agggcgggcc cgtccggaag    13620
cgccacaaga tgacattgat cacccgcgtc aacgcgcggc acgcgacgcg gcttatttgg    13680
gaacaaagga ctgaacaaca gtccattcga aatcggtgac atcaaagcgg ggacgggtta    13740
tcagtggcct ccaagtcaag cctcaatgaa tcaaaatcag accgatttgc aaacctgatt    13800
tatgagtgtg cggcctaaat gatgaaatcg tccttctaga tcgcctccgt ggtgtagcaa    13860
cacctcgcag tatcgccgtg ctgaccttgg ccagggaatt gactggcaag ggtgctttca    13920
catgaccgct cttttggccg cgatagatga tttcgttgct gctttgggca cgtagaagga    13980
gagaagtcat atcggagaaa ttcctcctgg cgcgagagcc tgctctatcg cgacggcatc    14040
ccactgtcgg gaacagaccg gatcattcac gaggcgaaag tcgtcaacac atgcgttata    14100
ggcatcttcc cttgaaggat gatcttgttg ctgccaatct ggaggtgcgg cagccgcagg    14160
cagatgcgat ctcagcgcaa cttgcggcaa aacatctcac tcacctgaaa accactagcg    14220
agtctcgcga tcagacgaag gccttttact taacgacaca atatccgatg tctgcatcac    14280
aggcgtcgct atcccagtca atactaaagc ggtgcaggaa ctaaagatta ctgatgactt    14340
aggcgtgcca cgaggcctga gacgacgcgc gtagacagtt ttttgaaatc attatcaaag    14400
tgatggcctc cgctgaagcc tatcacctct gcgccggtct gtcggagaga tgggcaagca    14460
ttattacggt cttcgcgccc gtacatgcat tggacgattg cagggtcaat ggatctgaga    14520
tcatccagag gattgccgcc cttaccttcc gtttcgagtt ggagccagcc cctaaatgag    14580
acgacatagt cgacttgatg tgacaatgcc aagagagaga tttgcttaac ccgatttttt    14640
tgctcaagcg taagcctatt gaagcttgcc ggcatgacgt ccgcgccgaa agaatatcct    14700
acaagtaaaa cattctgcac accgaaatgc ttggtgtaga catcgattat gtgaccaaga    14760
tccttagcag tttcgcttgg ggaccgctcc gaccagaaat accgaagtga actgacgcca    14820
atgacaggaa tcccttccgt ctgcagatag gtaccatcga tagatctgct gcctcgcgcg    14880
tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg    14940
tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg    15000
gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac    15060
tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac    15120
agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg    15180
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg    15240
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag    15300
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac    15360
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga    15420
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt    15480
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc    15540
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc    15600
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta    15660
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat    15720
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca    15780
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct    15840
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt    15900
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct    15960
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc    16020
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa    16080
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta    16140
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc    16200
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat    16260
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta    16320
tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt    16380
aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct gcaggggggg gggggggggg gttccattgt  16440
tcattccacg gacaaaaaca gagaaaggaa acgacagagg ccaaaaagct cgctttcagc  16500
acctgtcgtt tcctttcttt tcagagggta ttttaaataa aaacattaag ttatgacgaa  16560
gaagaacgga aacgccttaa accggaaaat tttcataaat agcgaaaacc cgcgaggtcg  16620
ccgccccgta acctgtcgga tcaccggaaa ggacccgtaa agtgataatg attatcatct  16680
acatatcaca acgtgcgtgg aggccatcaa accacgtcaa ataatcaatt atgacgcagg  16740
tatcgtatta attgatctgc atcaacttaa cgtaaaaaca acttcagaca atacaaatca  16800
gcgacactga atacggggca acctcatgtc cccccccccc ccccccctgc aggcatcgtg  16860
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga  16920
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt  16980
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct  17040
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca  17100
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat  17160
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga  17220
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc  17280
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg  17340
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc  17400
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt  17460
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca  17520
cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg  17580
aggccctttc gtcttcaaga attcggagct tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac  17640
tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat  17700
tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg  17760
cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa  17820
tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aatcagaatt    17880
ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg gcggctttgt    17940
tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc cgacaacgca    18000
gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta caacaaagct    18060
ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg gggcgattca ggcctggtat    18120
gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcagcgcc agaaggccgc cagagaggcc    18180
gagcgcggcc gtgaggcttg gacgctaggg cagggcatga aaaagcccgt agcgggctgc    18240
tacgggcgtc tgacgcggtg gaaaggggga ggggatgttg tctacatggc tctgctgtag    18300
tgagtgggtt gcgctccggc agcggtcctg atcaatcgtc accctttctc ggtccttcaa    18360
cgttcctgac aacgagcctc cttttcgcca atccatcgac aatcaccgcg agtccctgct    18420
cgaacgctgc gtccggaccg gcttcgtcga aggcgtctat cgcggcccgc aacagcggcg    18480
agagcggagc ctgttcaacg gtgccgccgc gctcgccggc atcgctgtcg ccggcctgct    18540
cctcaagcac ggccccaaca gtgaagtagc tgattgtcat cagcgcattg acggcgtccc    18600
cggccgaaaa acccgcctcg cagaggaagc gaagctgcgc gtcggccgtt tccatctgcg    18660
gtgcgcccgg tcgcgtgccg gcatggatgc gcgcgccatc gcggtaggcg agcagcgcct    18720
gcctgaagct gcgggcattc ccgatcagaa atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca    18780
ccgaatgcgt atgattctcc gccagcatgg cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct    18840
tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc    18900
gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt tcaacaggtc cagggcggca cggatcactg    18960
tattcggctg caactttgtc atgcttgaca ctttatcact gataaacata atatgtccac    19020
caacttatca gtgataaaga atccgcgcgt tcaatcggac cagcggaggc tggtccggag    19080
gccagacgtg aaacccaaca tacccctgat cgtaattctg agcactgtcg cgctcgacgc    19140
tgtcggcatc ggcctgatta tgccggtgct gccgggcctc ctgcgcgatc tggttcactc    19200
gaacgacgtc accgcccact atggcattct gctggcgctg tatgcgttgg tgcaatttgc    19260
ctgcgcacct gtgctgggcg cgctgtcgga tcgtttcggg cggcggccaa tcttgctcgt  19320
ctcgctggcc ggcgccactg tcgactacgc catcatggcg acagcgcctt tcctttgggt  19380
tctctatatc gggcggatcg tggccggcat caccggggcg actggggcgg tagccggcgc  19440
ttatattgcc gatatcactg atggcgatga gcgcgcgcgg cacttcggct tcatgagcgc  19500
ctgtttcggg ttcgggatgg tcgcgggacc tgtgctcggt gggctgatgg gcggtttctc  19560
cccccacgct ccgttcttcg ccgcggcagc cttgaacggc ctcaatttcc tgacgggctg  19620
tttccttttg ccggagtcgc acaaaggcga acgccggccg ttacgccggg aggctctcaa  19680
cccgctcgct tcgttccggt gggcccgggg catgaccgtc gtcgccgccc tgatggcggt  19740
cttcttcatc atgcaacttg tcggacaggt gccggccgcg ctttgggtca ttttcggcga  19800
ggatcgcttt cactgggacg cgaccacgat cggcatttcg cttgccgcat ttggcattct  19860
gcattcactc gcccaggcaa tgatcaccgg ccctgtagcc gcccggctcg gcgaaaggcg  19920
ggcactcatg ctcggaatga ttgccgacgg cacaggctac atcctgcttg ccttcgcgac  19980
acggggatgg atggcgttcc cgatcatggt cctgcttgct tcgggtggca tcggaatgcc  20040
ggcgctgcaa gcaatgttgt ccaggcaggt ggatgaggaa cgtcaggggc agctgcaagg  20100
ctcactggcg gcgctcacca gcctgacctc gatcgtcgga cccctcctct tcacggcgat  20160
ctatgcggct tctataacaa cgtggaacgg gtgggcatgg attgcaggcg ctgccctcta  20220
cttgctctgc ctgccggcgc tgcgtcgcgg gctttggagc ggcgcagggc aacgagccga  20280
tcgctgatcg tggaaacgat aggcctatgc catgcgggtc aaggcgactt ccggcaagct  20340
atacgcgccc taggagtgcg gttggaacgt tggcccagcc agatactccc gatcacgagc  20400
aggacgccga tgatttgaag cgcactcagc gtctgatcca agaacaacca tcctagcaac  20460
acggcggtcc ccgggctgag aaagcccagt aaggaaacaa ctgtaggttc gagtcgcgag  20520
atcccccgga accaaaggaa gtaggttaaa cccgctccga tcaggccgag ccacgccagg  20580
ccgagaacat tggttcctgt aggcatcggg attggcggat caaacactaa agctactgga  20640
acgagcagaa gtcctccggc cgccagttgc caggcggtaa aggtgagcag aggcacggga  20700
ggttgccact tgcgggtcag cacggttccg aacgccatgg aaaccgcccc cgccaggccc  20760
gctgcgacgc cgacaggatc tagcgctgcg tttggtgtca acaccaacag cgccacgccc  20820
gcagttccgc aaatagcccc caggaccgcc atcaatcgta tcgggctacc tagcagagcg  20880
gcagagatga acacgaccat cagcggctgc acagcgccta ccgtcgccgc gaccccgccc  20940
ggcaggcggt agaccgaaat aaacaacaag ctccagaata gcgaaatatt aagtgcgccg  21000
aggatgaaga tgcgcatcca ccagattccc gttggaatct gtcggacgat catcacgagc  21060
aataaacccg ccggcaacgc ccgcagcagc ataccggcga cccctcggcc tcgctgttcg  21120
ggctccacga aaacgccgga cagatgcgcc ttgtgagcgt ccttggggcc gtcctcctgt  21180
ttgaagaccg acagcccaat gatctcgccg tcgatgtagg cgccgaatgc cacggcatct  21240
cgcaaccgtt cagcgaacgc ctccatgggc tttttctcct cgtgctcgta aacggacccg  21300
aacatctctg gagctttctt cagggccgac aatcggatct cgcggaaatc ctgcacgtcg  21360
gccgctccaa gccgtcgaat ctgagcctta atcacaattg tcaattttaa tcctctgttt  21420
atcggcagtt cgtagagcgc gccgtgcgtc ccgagcgata ctgagcgaag caagtgcgtc  21480
gagcagtgcc cgcttgttcc tgaaatgcca gtaaagcgct ggctgctgaa cccccagccg  21540
gaactgaccc cacaaggccc tagcgtttgc aatgcaccag gtcatcattg acccaggcgt  21600
gttccaccag gccgctgcct cgcaactctt cgcaggcttc gccgacctgc tcgcgccact  21660
tcttcacgcg ggtggaatcc gatccgcaca tgaggcggaa ggtttccagc ttgagcgggt  21720
acggctcccg gtgcgagctg aaatagtcga acatccgtcg ggccgtcggc gacagcttgc  21780
ggtacttctc ccatatgaat ttcgtgtagt ggtcgccagc aaacagcacg acgatttcct  21840
cgtcgatcag gacctggcaa cgggacgttt tcttgccacg gtccaggacg cggaagcggt  21900
gcagcagcga caccgattcc aggtgcccaa cgcggtcgga cgtgaagccc atcgccgtcg  21960
cctgtaggcg cgacaggcat tcctcggcct tcgtgtaata ccggccattg atcgaccagc  22020
ccaggtcctg gcaaagctcg tagaacgtga aggtgatcgg ctcgccgata ggggtgcgct  22080
tcgcgtactc caacacctgc tgccacacca gttcgtcatc gtcggcccgc agctcgacgc  22140
cggtgtaggt gatcttcacg tccttgttga cgtggaaaat gaccttgttt tgcagcgcct  22200
cgcgcgggat tttcttgttg cgcgtggtga acagggcaga gcgggccgtg tcgtttggca  22260
tcgctcgcat cgtgtccggc cacggcgcaa tatcgaacaa ggaaagctgc atttccttga  22320
tctgctgctt cgtgtgtttc agcaacgcgg cctgcttggc ctcgctgacc tgttttgcca  22380
ggtcctcgcc ggcggttttt cgcttcttgg tcgtcatagt tcctcgcgtg tcgatggtca  22440
tcgacttcgc caaacctgcc gcctcctgtt cgagacgacg cgaacgctcc acggcggccg  22500
atggcgcggg cagggcaggg ggagccagtt gcacgctgtc gcgctcgatc ttggccgtag  22560
cttgctggac catcgagccg acggactgga aggtttcgcg gggcgcacgc atgacggtgc  22620
ggcttgcgat ggtttcggca tcctcggcgg aaaaccccgc gtcgatcagt tcttgcctgt  22680
atgccttccg gtcaaacgtc cgattcattc accctccttg cgggattgcc ccgactcacg  22740
ccggggcaat gtgcccttat tcctgatttg acccgcctgg tgccttggtg tccagataat  22800
ccaccttatc ggcaatgaag tcggtcccgt agaccgtctg gccgtccttc tcgtacttgg  22860
tattccgaat cttgccctgc acgaatacca gcgacccctt gcccaaatac ttgccgtggg  22920
cctcggcctg agagccaaaa cacttgatgc ggaagaagtc ggtgcgctcc tgcttgtcgc  22980
cggcatcgtt gcgccactct tcattaaccg ctatatcgaa aattgcttgc ggcttgttag  23040
aattgccatg acgtacctcg gtgtcacggg taagattacc gataaactgg aactgattat  23100
ggctcatatc gaaagtctcc ttgagaaagg agactctagt ttagctaaac attggttccg  23160
ctgtcaagaa ctttagcggc taaaattttg cgggccgcga ccaaaggtgc gaggggcggc  23220
ttccgctgtg tacaaccaga tatttttcac caacatcctt cgtctgctcg atgagcgggg  23280
catgacgaaa catgagctgt cggagagggc aggggtttca atttcgtttt tatcagactt  23340
aaccaacggt aaggccaacc cctcgttgaa ggtgatggag gccattgccg acgccctgga  23400
aactccccta cctcttctcc tggagtccac cgaccttgac cgcgaggcac tcgcggagat  23460
tgcgggtcat cctttcaaga gcagcgtgcc gcccggatac gaacgcatca gtgtggtttt  23520
gccgtcacat aaggcgttta tcgtaaagaa atggggcgac gacacccgaa aaaagctgcg  23580
tggaaggctc tgacgccaag ggttagggct tgcacttcct tctttagccg ctaaaacggc  23640
cccttctctg cgggccgtcg gctcgcgcat catatcgaca tcctcaacgg aagccgtgcc  23700
gcgaatggca tcgggcgggt gcgctttgac agttgttttc tatcagaacc cctacgtcgt  23760
gcggttcgat tagctgtttg tcttgcaggc taaacacttt cggtatatcg tttgcctgtg  23820
cgataatgtt gctaatgatt tgttgcgtag gggttactga aaagtgagcg ggaaagaaga  23880
gtttcagacc atcaaggagc gggccaagcg caagctggaa cgcgacatgg gtgcggacct  23940
gttggccgcg ctcaacgacc cgaaaaccgt tgaagtcatg ctcaacgcgg acggcaaggt  24000
gtggcacgaa cgccttggcg agccgatgcg gtacatctgc gacatgcggc ccagccagtc  24060
gcaggcgatt atagaaacgg tggccggatt ccacggcaaa gaggtcacgc ggcattcgcc  24120
catcctggaa ggcgagttcc ccttggatgg cagccgcttt gccggccaat tgccgccggt  24180
cgtggccgcg ccaacctttg cgatccgcaa gcgcgcggtc gccatcttca cgctggaaca  24240
gtacgtcgag gcgggcatca tgacccgcga gcaatacgag gtcattaaaa gcgccgtcgc  24300
ggcgcatcga aacatcctcg tcattggcgg tactggctcg ggcaagacca cgctcgtcaa  24360
cgcgatcatc aatgaaatgg tcgccttcaa cccgtctgag cgcgtcgtca tcatcgagga  24420
caccggcgaa atccagtgcg ccgcagagaa cgccgtccaa taccacacca gcatcgacgt  24480
ctcgatgacg ctgctgctca agacaacgct gcgtatgcgc cccgaccgca tcctggtcgg  24540
tgaggtacgt ggccccgaag cccttgatct gttgatggcc tggaacaccg ggcatgaagg  24600
aggtgccgcc accctgcacg caaacaaccc caaagcgggc ctgagccggc tcgccatgct  24660
tatcagcatg cacccggatt caccgaaacc cattgagccg ctgattggcg aggcggttca  24720
tgtggtcgtc catatcgcca ggacccctag cggccgtcga gtgcaagaaa ttctcgaagt  24780
tcttggttac gagaacggcc agtacatcac caaaaccctg taaggagtat ttccaatgac  24840
aacggctgtt ccgttccgtc tgaccatgaa tcgcggcatt ttgttctacc ttgccgtgtt  24900
cttcgttctc gctctcgcgt tatccgcgca tccggcgatg gcctcggaag gcaccggcgg  24960
cagcttgcca tatgagagct ggctgacgaa cctgcgcaac tccgtaaccg gcccggtggc  25020
cttcgcgctg tccatcatcg gcatcgtcgt cgccggcggc gtgctgatct tcggcggcga  25080
actcaacgcc ttcttccgaa ccctgatctt cctggttctg gtgatggcgc tgctggtcgg  25140
cgcgcagaac gtgatgagca ccttcttcgg tcgtggtgcc gaaatcgcgg ccctcggcaa  25200
cggggcgctg caccaggtgc aagtcgcggc ggcggatgcc gtgcgtgcgg tagcggctgg  25260
acggctcgcc taatcatggc tctgcgcacg atccccatcc gtcgcgcagg caaccgagaa  25320
aacctgttca tgggtggtga tcgtgaactg gtgatgttct cgggcctgat ggcgtttgcg  25380
ctgattttca gcgcccaaga gctgcgggcc accgtggtcg gtctgatcct gtggttcggg  25440
gcgctctatg cgttccgaat catggcgaag gccgatccga agatgcggtt cgtgtacctg  25500
cgtcaccgcc ggtacaagcc gtattacccg gcccgctcga ccccgttccg cgagaacacc  25560
aatagccaag ggaagcaata ccgatgatcc aagcaattgc gattgcaatc gcgggcctcg  25620
gcgcgcttct gttgttcatc ctctttgccc gcatccgcgc ggtcgatgcc gaactgaaac  25680
tgaaaaagca tcgttccaag gacgccggcc tggccgatct gctcaactac gccgctgtcg  25740
tcgatgacgg cgtaatcgtg ggcaagaacg gcagctttat ggctgcctgg ctgtacaagg  25800
gcgatgacaa cgcaagcagc accgaccagc agcgcgaagt agtgtccgcc cgcatcaacc  25860
aggccctcgc gggcctggga agtgggtgga tgatccatgt ggacgccgtg cggcgtcctg  25920
ctccgaacta cgcggagcgg ggcctgtcgg cgttccctga ccgtctgacg gcagcgattg  25980
aagaagagcg ctcggtcttg ccttgctcgt cggtgatgta cttcaccagc tccgcgaagt  26040
cgctcttctt gatggagcgc atggggacgt gcttggcaat cacgcgcacc ccccggccgt  26100
tttagcggct aaaaaagtca tggctctgcc ctcgggcgga ccacgcccat catgaccttg  26160
ccaagctcgt cctgcttctc ttcgatcttc gccagcaggg cgaggatcgt ggcatcaccg  26220
aaccgcgccg tgcgcgggtc gtcggtgagc cagagtttca gcaggccgcc caggcggccc  26280
aggtcgccat tgatgcgggc cagctcgcgg acgtgctcat agtccacgac gcccgtgatt  26340
ttgtagccct ggccgacggc cagcaggtag gccgacaggc tcatgccggc cgccgccgcc  26400
ttttcctcaa tcgctcttcg ttcgtctgga aggcagtaca ccttgatagg tgggctgccc  26460
ttcctggttg gcttggtttc atcagccatc cgcttgccct catctgttac gccggcggta  26520
gccggccagc ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg ccaggtgcga ataagggaca  26580
gtgaagaagg aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac ctatcctgcc cggctgacgc  26640
cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc aaaatcctgt atatcgtgcg  26700
aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc cgaagcaggg ttatgcagcg  26760
gaaaagcgct gcttccctgc tgttttgtgg aatatctacc gactggaaac aggcaaatgc  26820
aggaaattac tgaactgagg ggacaggcga gagacgatgc caaagagcta caccgacgag  26880
ctggccgagt gggttgaatc ccgcgcggcc aagaagcgcc ggcgtgatga ggctgcggtt  26940
gcgttcctgg cggtgagggc ggatgtcgag gcggcgttag cgtccggcta tgcgctcgtc  27000
accatttggg agcacatgcg ggaaacgggg aaggtcaagt tctcctacga gacgttccgc  27060
tcgcacgcca ggcggcacat caaggccaag cccgccgatg tgcccgcacc gcaggccaag  27120
gctgcggaac ccgcgccggc acccaagacg ccggagccac ggcggccgaa gcaggggggc  27180
aaggctgaaa agccggcccc cgctgcggcc ccgaccggct tcaccttcaa cccaacaccg  27240
gacaaaaagg atctactgta atggcgaaaa ttcacatggt tttgcagggc aagggcgggg  27300
tcggcaagtc ggccatcgcc gcgatcattg cgcagtacaa gatggacaag gggcagacac  27360
ccttgtgcat cgacaccgac ccggtgaacg cgacgttcga gggctacaag gccctgaacg  27420
tccgccggct gaacatcatg gccggcgacg aaattaactc gcgcaacttc gacaccctgg  27480
tcgagctgat tgcgccgacc aaggatgacg tggtgatcga caacggtgcc agctcgttcg  27540
tgcctctgtc gcattacctc atcagcaacc aggtgccggc tctgctgcaa gaaatggggc  27600
atgagctggt catccatacc gtcgtcaccg gcggccaggc tctcctggac acggtgagcg  27660
gcttcgccca gctcgccagc cagttcccgg ccgaagcgct tttcgtggtc tggctgaacc  27720
cgtattgggg gcctatcgag catgagggca agagctttga gcagatgaag gcgtacacgg  27780
ccaacaaggc ccgcgtgtcg tccatcatcc agattccggc cctcaaggaa gaaacctacg  27840
gccgcgattt cagcgacatg ctgcaagagc ggctgacgtt cgaccaggcg ctggccgatg  27900
aatcgctcac gatcatgacg cggcaacgcc tcaagatcgt gcggcgcggc ctgtttgaac  27960
agctcgacgc ggcggccgtg ctatgagcga ccagattgaa gagctgatcc gggagattgc  28020
ggccaagcac ggcatcgccg tcggccgcga cgacccggtg ctgatcctgc ataccatcaa  28080
cgcccggctc atggccgaca gtgcggccaa gcaagaggaa atccttgccg cgttcaagga  28140
agagctggaa gggatcgccc atcgttgggg cgaggacgcc aaggccaaag cggagcggat  28200
gctgaacgcg gccctggcgg ccagcaagga cgcaatggcg aaggtaatga aggacagcgc  28260
cgcgcaggcg gccgaagcga tccgcaggga aatcgacgac ggccttggcc gccagctcgc  28320
ggccaaggtc gcggacgcgc ggcgcgtggc gatgatgaac atgatcgccg gcggcatggt  28380
gttgttcgcg gccgccctgg tggtgtgggc ctcgttatga atcgcagagg cgcagatgaa  28440
aaagcccggc gttgccgggc tttgtttttg cgttagctgg gcttgtttga caggcccaag  28500
ctctgactgc gcccgcgctc gcgctcctgg gcctgtttct tctcctgctc ctgcttgcgc  28560
atcagggcct ggtgccgtcg ggctgcttca cgcatcgaat cccagtcgcc ggccagctcg  28620
ggatgctccg cgcgcatctt gcgcgtcgcc agttcctcga tcttgggcgc gtgaatgccc  28680
atgccttcct tgatttcgcg caccatgtcc agccgcgtgt gcagggtctg caagcgggct  28740
tgctgttggg cctgctgctg ctgccaggcg gcctttgtac gcggcaggga cagcaagccg  28800
ggggcattgg actgtagctg ctgcaaacgc gcctgctgac ggtctacgag ctgttctagg  28860
cggtcctcga tgcgctccac ctggtcatgc tttgcctgca cgtagagcgc aagggtctgc  28920
tggtaggtct gctcgatggg cgcggattct aagagggcct gctgttccgt ctcggcctcc  28980
tgggccgcct gtagcaaatc ctcgccgctg ttgccgctgg actgctttac tgccggggac  29040
tgctgttgcc ctgctcgcgc cgtcgtcgca gttcggcttg cccccactcg attgactgct  29100
tcatttcgag ccgcagcgat gcgatctcgg attgcgtcaa cggacggggc agcgcggagg  29160
tgtccggctt ctccttgggt gagtcggtcg atgccatagc caaaggtttc cttccaaaat  29220
gcgtccattg ctggaccgtg tttctcattg atgcccgcaa gcatcttcgg cttgaccgcc  29280
aggtcaagcg cgccttcatg ggcggtcatg acggacgccg ccatgacctt gccgccgttg  29340
ttctcgatgt agccgcgtaa tgaggcaatg gtgccgccca tcgtcagcgt gtcatcgaca  29400
acgatgtact tctggccggg gatcacctcc ccctcgaaag tcgggttgaa cgccaggcga  29460
tgatctgaac cggctccggt tcgggcgacc ttctcccgct gcacaatgtc cgtttcgacc  29520
tcaaggccaa ggcggtcggc cagaacgacc gccatcatgg ccggaatctt gttgttcccc  29580
gccgcctcga cggcgaggac tggaacgatg cggggcttgt cgtcgccgat cagcgtcttg  29640
agctgggcaa cagtgtcgtc cgaaatcagg cgctcgacca aattaagcgc cgcttccgcg  29700
tcgccctgct tcgcagcctg gtattcaggc tcgttggtca aagaaccaag gtcgccgttg  29760
cgaaccacct tcgggaagtc tccccacggt gcgcgctcgg ctctgctgta gctgctcaag  29820
acgcctccct ttttagccgc taaaactcta acgagtgcgc ccgcgactca acttgacgct  29880
ttcggcactt acctgtgcct tgccacttgc gtcataggtg atgcttttcg cactcccgat  29940
ttcaggtact ttatcgaaat ctgaccgggc gtgcattaca aagttcttcc ccacctgttg  30000
gtaaatgctg ccgctatctg cgtggacgat gctgccgtcg tggcgctgcg acttatcggc  30060
cttttgggcc atatagatgt tgtaaatgcc aggtttcagg gccccggctt tatctacctt  30120
ctggttcgtc catgcgcctt ggttctcggt ctggacaatt ctttgcccat tcatgaccag  30180
gaggcggtgt ttcattgggt gactcctgac ggttgcctct ggtgttaaac gtgtcctggt  30240
cgcttgccgg ctaaaaaaaa gccgacctcg gcagttcgag gccggctttc cctagagccg  30300
ggcgcgtcaa ggttgttcca tctattttag tgaactgcgt tcgatttatc agttactttc  30360
ctcccgcttt gtgtttcctc ccactcgttt ccgcgtctag ccgacccctc aacatagcgg  30420
cctcttcttg ggctgccttt gcctcttgcc gcgcttcgtc acgctcggct tgcaccgtcg  30480
taaagcgctc ggcctgcctg gccgcctctt gcgccgccaa cttcctttgc tcctggtggg  30540
cctcggcgtc ggcctgcgcc ttcgctttca ccgctgccaa ctccgtgcgc aaactctccg  30600
cttcgcgcct ggtggcgtcg cgctcgccgc gaagcgcctg catttcctgg ttggccgcgt  30660
ccagggtctt gcggctctct tctttgaatg cgcgggcgtc ctggtgagcg tagtccagct  30720
cggcgcgcag ctcctgcgct cgacgctcca cctcgtcggc ccgctgcgtc gccagcgcgg  30780
cccgctgctc ggctcctgcc agggcggtgc gtgcttcggc cagggcttgc cgctggcgtg  30840
cggccagctc ggccgcctcg gcggcctgct gctctagcaa tgtaacgcgc gcctgggctt  30900
cttccagctc gcgggcctgc gcctcgaagg cgtcggccag ctccccgcgc acggcttcca  30960
actcgttgcg ctcacgatcc cagccggctt gcgctgcctg caacgattca ttggcaaggg  31020
cctgggcggc ttgccagagg gcggccacgg cctggttgcc ggcctgctgc accgcgtccg  31080
gcacctggac tgccagcggg gcggcctgcg ccgtgcgctg gcgtcgccat tcgcgcatgc  31140
cggcgctggc gtcgttcatg ttgacgcggg cggccttacg cactgcatcc acggtcggga  31200
agttctcccg gtcgccttgc tcgaacagct cgtccgcagc cgcaaaaatg cggtcgcgcg  31260
tctctttgtt cagttccatg ttggctccgg taattggtaa gaataataat actcttacct  31320
accttatcag cgcaagagtt tagctgaaca gttctcgact taacggcagg ttttttagcg  31380
gctgaagggc aggcaaaaaa agccccgcac ggtcggcggg ggcaaagggt cagcgggaag  31440
gggattagcg ggcgtcgggc ttcttcatgc gtcggggccg cgcttcttgg gatggagcac  31500
gacgaagcgc gcacgcgcat cgtcctcggc cctatcggcc cgcgtcgcgg tcaggaactt  31560
gtcgcgcgct aggtcctccc tggtgggcac caggggcatg aactcggcct gctcgatgta  31620
ggtccactcc atgaccgcat cgcagtcgag gccgcgttcc ttcaccgtct cttgcaggtc  31680
gcggtacgcc cgctcgttga gcggctggta acgggccaat tggtcgtaaa tggctgtcgg  31740
ccatgagcgg cctttcctgt tgagccagca gccgacgacg aagccggcaa tgcaggcccc  31800
tggcacaacc aggccgacgc cgggggcagg ggatggcagc agctcgccaa ccaggaaccc  31860
cgccgcgatg atgccgatgc cggtcaacca gcccttgaaa ctatccggcc ccgaaacacc  31920
cctgcgcatt gcctggatgc tgcgccggat agcttgcaac atcaggagcc gtttcttttg  31980
ttcgtcagtc atggtccgcc ctcaccagtt gttcgtatcg gtgtcggacg aactgaaatc  32040
gcaagagctg ccggtatcgg tccagccgct gtccgtgtcg ctgctgccga agcacggcga  32100
ggggtccgcg aacgccgcag acggcgtatc cggccgcagc gcatcgccca gcatggcccc  32160
ggtcagcgag ccgccggcca ggtagcccag catggtgctg ttggtcgccc cggccaccag  32220
ggccgacgtg acgaaatcgc cgtcattccc tctggattgt tcgctgctcg gcggggcagt  32280
gcgccgcgcc ggcggcgtcg tggatggctc gggttggctg gcctgcgacg gccggcgaaa  32340
ggtgcgcagc agctcgttat cgaccggctg cggcgtcggg gccgccgcct tgcgctgcgg  32400
tcggtgttcc ttcttcggct cgcgcagctt gaacagcatg atcgcggaaa ccagcagcaa  32460
cgccgcgcct acgcctcccg cgatgtagaa cagcatcgga ttcattcttc ggtcctcctt  32520
gtagcggaac cgttgtctgt gcggcgcggg tggcccgcgc cgctgtcttt ggggatcagc  32580
cctcgatgag cgcgaccagt ttcacgtcgg caaggttcgc ctcgaactcc tggccgtcgt  32640
cctcgtactt caaccaggca tagccttccg ccggcggccg acggttgagg ataaggcggg  32700
cagggcgctc gtcgtgctcg acctggacga tggccttttt cagcttgtcc gggtccggct  32760
ccttcgcgcc cttttccttg gcgtccttac cgtcctggtc gccgtcctcg ccgtcctggc  32820
cgtcgccggc ctccgcgtca cgctcggcat cagtctggcc gttgaaggca tcgacggtgt  32880
tgggatcgcg gcccttctcg tccaggaact cgcgcagcag cttgaccgtg ccgcgcgtga  32940
tttcctgggt gtcgtcgtca agccacgcct cgacttcctc cgggcgcttc ttgaaggccg  33000
tcaccagctc gttcaccacg gtcacgtcgc gcacgcggcc ggtgttgaac gcatcggcga  33060
tcttctccgg caggtccagc agcgtgacgt gctgggtgat gaacgccggc gacttgccga  33120
tttccttggc gatatcgcct ttcttcttgc ccttcgccag ctcgcggcca atgaagtcgg  33180
caatttcgcg cggggtcagc tcgttgcgtt gcaggttctc gataacctgg tcggcttcgt  33240
tgtagtcgtt gtcgatgaac gccgggatgg acttcttgcc ggcccacttc gagccacggt  33300
agcggcgggc gccgtgattg atgatatagc ggcccggctg ctcctggttc tcgcgcaccg  33360
aaatgggtga cttcaccccg cgctctttga tcgtggcacc gatttccgcg atgctctccg  33420
gggaaaagcc ggggttgtcg gccgtccgcg gctgatgcgg atcttcgtcg atcaggtcca  33480
ggtccagctc gatagggccg gaaccgccct gagacgccgc aggagcgtcc aggaggctcg  33540
acaggtcgcc gatgctatcc aaccccaggc cggacggctg cgccgcgcct gcggcttcct  33600
gagcggccgc agcggtgttt ttcttggtgg tcttggcttg agccgcagtc attgggaaat  33660
ctccatcttc gtgaacacgt aatcagccag ggcgcgaacc tctttcgatg ccttgcgcgc  33720
ggccgttttc ttgatcttcc agaccggcac accggatgcg agggcatcgg cgatgctgct  33780
gcgcaggcca acggtggccg gaatcatcat cttggggtac gcggccagca gctcggcttg  33840
gtggcgcgcg tggcgcggat tccgcgcatc gaccttgctg ggcaccatgc caaggaattg  33900
cagcttggcg ttcttctggc gcacgttcgc aatggtcgtg accatcttct tgatgccctg  33960
gatgctgtac gcctcaagct cgatggggga cagcacatag tcggccgcga agagggcggc  34020
cgccaggccg acgccaaggg tcggggccgt gtcgatcagg cacacgtcga agccttggtt  34080
cgccagggcc ttgatgttcg ccccgaacag ctcgcgggcg tcgtccagcg acagccgttc  34140
ggcgttcgcc agtaccgggt tggactcgat gagggcgagg cgcgcggcct ggccgtcgcc  34200
ggctgcgggt gcggtttcgg tccagccgcc ggcagggaca gcgccgaaca gcttgcttgc  34260
atgcaggccg gtagcaaagt ccttgagcgt gtaggacgca ttgccctggg ggtccaggtc  34320
gatcacggca acccgcaagc cgcgctcgaa aaagtcgaag gcaagatgca caagggtcga  34380
agtcttgccg acgccgcctt tctggttggc cgtgaccaaa gttttcatcg tttggtttcc  34440
tgttttttct tggcgtccgc ttcccacttc cggacgatgt acgcctgatg ttccggcaga  34500
accgccgtta cccgcgcgta cccctcgggc aagttcttgt cctcgaacgc ggcccacacg  34560
cgatgcaccg cttgcgacac tgcgcccctg gtcagtccca gcgacgttgc gaacgtcgcc  34620
tgtggcttcc catcgactaa gacgccccgc gctatctcga tggtctgctg ccccacttcc  34680
agcccctgga tcgcctcctg gaactggctt tcggtaagcc gtttcttcat ggataacacc  34740
cataatttgc tccgcgcctt ggttgaacat agcggtgaca gccgccagca catgagagaa  34800
gtttagctaa acatttctcg cacgtcaaca cctttagccg ctaaaactcg tccttggcgt  34860
aacaaaacaa aagcccggaa accgggcttt cgtctcttgc cgcttatggc tctgcacccg  34920
gctccatcac caacaggtcg cgcacgcgct tcactcggtt gcggatcgac actgccagcc  34980
caacaaagcc ggttgccgcc gccgccagga tcgcgccgat gatgccggcc acaccggcca  35040
tcgcccacca ggtcgccgcc ttccggttcc attcctgctg gtactgcttc gcaatgctgg  35100
acctcggctc accataggct gaccgctcga tggcgtatgc cgcttctccc cttggcgtaa  35160
aacccagcgc cgcaggcggc attgccatgc tgcccgccgc tttcccgacc acgacgcgcg  35220
caccaggctt gcggtccaga ccttcggcca cggcgagctg cgcaaggaca taatcagccg  35280
ccgacttggc tccacgcgcc tcgatcagct cttgcactcg cgcgaaatcc ttggcctcca  35340
cggccgccat gaatcgcgca cgcggcgaag gctccgcagg gccggcgtcg tgatcgccgc  35400
cgagaatgcc cttcaccaag ttcgacgaca cgaaaatcat gctgacggct atcaccatca  35460
tgcagacgga tcgcacgaac ccgctgaatt gaacacgagc acggcacccg cgaccactat  35520
gccaagaatg cccaaggtaa aaattgccgg ccccgccatg aagtccgtga atgccccgac  35580
ggccgaagtg aagggcaggc cgccacccag gccgccgccc tcactgcccg gcacctggtc  35640
gctgaatgtc gatgccagca cctgcggcac gtcaatgctt ccgggcgtcg cgctcgggct  35700
gatcgcccat cccgttactg ccccgatccc ggcaatggca aggactgcca gcgctgccat  35760
ttttggggtg aggccgttcg cggccgaggg gcgcagcccc tggggggatg ggaggcccgc  35820
gttagcgggc cgggagggtt cgagaagggg gggcaccccc cttcggcgtg cgcggtcacg  35880
cgcacagggc gcagccctgg ttaaaaacaa ggtttataaa tattggttta aaagcaggtt  35940
aaaagacagg ttagcggtgg ccgaaaaacg ggcggaaacc cttgcaaatg ctggattttc  36000
tgcctgtgga cagcccctca aatgtcaata ggtgcgcccc tcatctgtca gcactctgcc  36060
cctcaagtgt caaggatcgc gcccctcatc tgtcagtagt cgcgcccctc aagtgtcaat  36120
accgcagggc acttatcccc aggcttgtcc acatcatctg tgggaaactc gcgtaaaatc  36180
aggcgttttc gccgatttgc gaggctggcc agctccacgt cgccggccga aatcgagcct  36240
gcccctcatc tgtcaacgcc gcgccgggtg agtcggcccc tcaagtgtca acgtccgccc  36300
ctcatctgtc agtgagggcc aagttttccg cgaggtatcc acaacgccgg cggccgcggt  36360
gtctcgcaca cggcttcgac ggcgtttctg gcgcgtttgc agggccatag acggccgcca  36420
gcccagcggc gagggcaacc agcccggtga gcgtcggaaa ggcgctggaa gccccgtagc  36480
gacgcggaga ggggcgagac aagccaaggg cgcaggctcg atgcgcagca cgacatagcc  36540
ggttctcgca aggacgagaa tttccctgcg gtgcccctca agtgtcaatg aaagtttcca 36600
acgcgagcca ttcgcgagag ccttgagtcc acgctagatg agagctttgt tgtaggtgga 36660
ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg tctgcgttgt cgggaagatg 36720
cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt tcgatttatt caacaaagcc acgttgtgtc 36780
tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgaa caataaaact 36840
gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 36900
ttgctcgac                                                         36909
 
<210>33
<211>825
<212>DNA
<213>玉米
 
<400>33
aaatccttac agaattgctg tagtttcata gtgctagatg tggacagcaa agcgccgctg     60
tatgcttctg cttttctttt ttggtgtgtg tagccacatc ctttgttcct gcccggcgcc    120
atcccacttg gttgtttttt tttatgattg aaagccttca tgcttcctcg gtcaatcacc    180
ggtgcgcact gggagcatcg ccggaaaaaa aattcttcgg ctaagagtaa cttctttctc    240
cttttcttct ctgatctcgc gagcagtgct gataacgtgt tgtaatctac ttagcggtaa    300
cgagattgag agagacaaaa tgacagaact attgtcttta ttgcagagtg tcatgtattt    360
atacagggga tacaaagtct cccaaggggt gtgtcccttg ggagtaactg ccagttgatc    420
acaggacaat attttgtaac aaaacgtaca catcgtcaaa atagcgaggc atgaaactgg    480
ccttggccat ggacgcgtga agcgcgccat gcgttggata tgtggtcaat aagtatatac    540
aatacaatgt ttaacagagc tgatagtact gctttggcac atttttgtcc acgcttcatg    600
agagataaaa cacctgcacg taaattcaca tgctgcactg aaggcccgat cactgaggag    660
cgaactgccg taactccctt ctatatatac ccccagtccc tgtttcagtt ttcgtcaagc    720
tagcagcacc aagttgtcga tcacttgcct gctcttgagc tcgattaagc tatcatcagc    780
tacagcatcc gatcccaaac tgcaactgta gcagcgacaa ctgcc                     825
 
<210>34
<211>860
<212>DNA
<213>玉米
 
<400>34
ctggtaatta ttggctgtag gattctaaac agagcctaaa tagctggaat agctctagcc    60
ctcaatccaa actaatgata tctatactta tgcaactcta aatttttatt ctaaaagtaa   120
tatttcattt ttgtcaacga gattctctac tctattccac aatcttttga agcaatattt   180
accttaaatc tgtactctat accaataatc atatattcta ttatttattt ttatctctct   240
cctaaggagc atccccctat gtctgcatgg cccccgcctc gggtcccaat ctcttgctct   300
gctagtagca cagaagaaaa cactagaaat gacttgcttg acttagagta tcagataaac   360
atcatgttta cttaacttta atttgtatcg gtttctacta tttttataat atttttgtct   420
ctatagatac tacgtgcaac agtataatca acctagttta atccagagcg aaggattttt   480
tactaagtac gtgactccat atgcacagcg ttccttttat ggttcctcac tgggcacagc   540
ataaacgaac cctgtccaat gttttcagcg cgaacaaaca gaaattccat cagcgaacaa   600
acaacataca tgcgagatga aaataaataa taaaaaaagc tccgtctcga taggccggca   660
cgaatcgaga gcctccatag ccagtttttt ccatcggaac ggcggttcgc gcacctaatt   720
atatgcacca cacgcctata aagccaacca acccgtcgga ggggcgcaag ccagacagaa   780
gacagcccgt cagcccctct cgtttttcat ccgccttcgc ctccaaccgc gtgcgctcca   840
cgcctcctcc aggaaagcga                                               860
 
<210>35
<211>896
<212>DNA
<213>玉米
 
<400>35
gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta     60
taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt  120
atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca  180
gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt  240
ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg  300
caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta  360
gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct  420
ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa  480
tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta  540
aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt  600
ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca  660
cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg  720
ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag  780
gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc  840
ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctt      896
 
<210>36
<211>318
<212>DNA
<213>玉米
 
<400>36
agacttgtcc atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca     60
catagtgaca tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac    120
tagttatctg aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac    180
gtgtctttat aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat    240
aaatattaat catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg    300
tgttttgcga attgcggc                                                  318
<210>37
<211>4678
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>37
gaaaggccca gtcttccgac tgagcctttc gttttatttg atgcctggca gttccctact     60
ctcgcgttaa cgctagcatg gatgttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt    120
cttaagctcg ggcccgcgtt aacgctacca tggagctcca aataatgatt ttattttgac    180
tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg ataagcaatg cttttttata atgccaactt    240
tgtatagaaa agttgggccg aattcgagct cggtacggcc agaatggccc ggaccgggtt    300
accgaattcg agctcggtac cctgggatcc ctggtaatta ttggctgtag gattctaaac    360
agagcctaaa tagctggaat agctctagcc ctcaatccaa actaatgata tctatactta    420
tgcaactcta aatttttatt ctaaaagtaa tatttcattt ttgtcaacga gattctctac    480
tctattccac aatcttttga agcaatattt accttaaatc tgtactctat accaataatc    540
atatattcta ttatttattt ttatctctct cctaaggagc atccccctat gtctgcatgg    600
cccccgcctc gggtcccaat ctcttgctct gctagtagca cagaagaaaa cactagaaat    660
gacttgcttg acttagagta tcagataaac atcatgttta cttaacttta atttgtatcg    720
gtttctacta tttttataat atttttgtct ctatagatac tacgtgcaac agtataatca    780
acctagttta atccagagcg aaggattttt tactaagtac gtgactccat atgcacagcg    840
ttccttttat ggttcctcac tgggcacagc ataaacgaac cctgtccaat gttttcagcg    900
cgaacaaaca gaaattccat cagcgaacaa acaacataca tgcgagatga aaataaataa    960
taaaaaaagc tccgtctcga taggccggca cgaatcgaga gcctccatag ccagtttttt   1020
ccatcggaac ggcggttcgc gcacctaatt atatgcacca cacgcctata aagccaacca   1080
acccgtcgga ggggcgcaag ccagacagaa gacagcccgt cagcccctct cgtttttcat   1140
ccgccttcgc ctccaaccgc gtgcgctcca cgcctcctcc aggaaagcga ggatctcccc   1200
caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc    1260
tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct    1320
gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg    1380
gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg    1440
aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt    1500
cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt    1560
gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc    1620
ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg    1680
gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat    1740
atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc    1800
tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga    1860
tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg    1920
tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag    1980
gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat    2040
tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat    2100
tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc    2160
cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt    2220
tgtttggtgt tacttctgca ggtcgactct agaagcttgg tcacccggtc cgggcctaga    2280
aggccagctt caagtttgta caaaaaagtt gaacgagaaa cgtaaaatga tataaatatc    2340
aatatattaa attagatttt gcataaaaaa cagactacat aatactgtaa aacacaacat    2400
atgcagtcac tatgaatcaa ctacttagat ggtattagtg acctgtagaa ttcgagctct    2460
agagctgcag ggcggccgcg atatccccta tagtgagtcg tattacatgg tcatagctgt    2520
ttcctggcag ctctggcccg tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa    2580
tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat    2640
gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt    2700
atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgctt    2760
gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa    2820
tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac    2880
catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg    2940
aaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc    3000
gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag    3060
cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc    3120
gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca    3180
taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa    3240
ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc    3300
agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt    3360
acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt    3420
tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt aacactggca    3480
gagcattacg ctgacttgac gggacggcgc aagctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag    3540
ttacgcgtcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga    3600
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt    3660
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag    3720
agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa    3780
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag    3840
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca    3900
gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac    3960
cgaactgaga tacctacagc gtgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa    4020
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc    4080
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 4140
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 4200
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 4260
ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 4320
ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 4380
accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 4440
ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatacgcgt accgctagcc aggaagagtt 4500
tgtagaaacg caaaaaggcc atccgtcagg atggccttct gcttagtttg atgcctggca 4560
gtttatggcg ggcgtcctgc ccgccaccct ccgggccgtt gcttcacaac gttcaaatcc 4620
gctcccggcg gatttgtcct actcaggaga gcgttcaccg acaaacaaca gataaaac   4678
 
<210>38
<211>2991
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>38
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga   60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga  120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca  180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc  240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta  300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc  360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa  420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg  480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa  540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctg cagctctaga gctcgaattc tacaggtcac     600
taataccatc taagtagttg gttcatagtg actgcatatg ttgtgtttta cagtattatg     660
tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt     720
ctcgttcaac tttcttgtac aaagtggccg ttaacggatc cagacttgtc catcttctgg     780
attggccaac ttaattaatg tatgaaataa aaggatgcac acatagtgac atgctaatca     840
ctataatgtg ggcatcaaag ttgtgtgtta tgtgtaatta ctagttatct gaataaaaga     900
gaaagagatc atccatattt cttatcctaa atgaatgtca cgtgtcttta taattctttg     960
atgaaccaga tgcatttcat taaccaaatc catatacata taaatattaa tcatatataa    1020
ttaatatcaa ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt gtgttttgcg aattgcggca    1080
agcttgcggc cgccccgggc aactttatta tacaaagttg gcattataaa aaagcattgc    1140
ttatcaattt gttgcaacga acaggtcact atcagtcaaa ataaaatcat tatttggagc    1200
tccatggtag cgttaacgcg gccgcgatat cccctatagt gagtcgtatt acatggtcat    1260
agctgtttcc tggcagctct ggcccgtgtc tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga    1320
taaaaatata tcatcatgaa caataaaact gtctgcttac ataaacagta atacaagggg    1380
tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc    1440
tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta    1500
tcgcttgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt    1560
tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct    1620
tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat    1680
ccccggaaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt    1740
tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt    1800
taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt    1860
tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga    1920
aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact    1980
tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg  2040
aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc  2100
ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt  2160
gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaatcagaa ttggttaatt ggttgtaaca  2220
ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcgcaagc tcatgaccaa aatcccttaa  2280
cgtgagttac gcgtcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc  2340
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc  2400
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt  2460
cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt  2520
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc  2580
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa  2640
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac  2700
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg  2760
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga  2820
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact  2880
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa  2940
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt t           2991
 
<210>39
<211>13807
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>39
aagctggtac gattgtaata cgactcacta tagggcgaat tgagcgctgt ttaaacgctc     60
ttcaactgga agagcggtta ccagagctgg tcacctttgt ccaccaagat ggaactgcgg    120
ccgctcatta attaagtcag gcgcgcctct agttgaagac acgttcatgt cttcatcgta     180
agaagacact cagtagtctt cggccagaat ggccgtaggt gaattaagag gagagaggag     240
gtaaacattt tcttctattt tttcatattt tcaggataaa ttattgtaaa agtttacaag     300
atttccattt gactagtgta aatgaggaat attctctagt aagatcatta tttcatctac     360
ttcttttatc ttctaccagt agaggaataa acaatattta gctcctttgt aaatacaaat     420
taattttcgt tcttgacatc attcaatttt aattttacgt ataaaataaa agatcatacc     480
tattagaacg attaaggaga aatacaattc gaatgagaag gatgtgccgt ttgttataat     540
aaacagccac acgacgtaaa cgtaaaatga ccacatgatg ggccaataga catggaccga     600
ctactaataa tagtaagtta cattttagga tggaataaat atcataccga catcagtttg     660
aaagaaaagg gaaaaaaaga aaaaataaat aaaagatata ctaccgacat gagttccaaa     720
aagcaaaaaa aaagatcaag ccgacacaga cacgcgtaga gagcaaaatg actttgacgt     780
cacaccacga aaacagacgc ttcatacgtg tccctttatc tctctcagtc tctctataaa     840
cttagtgaga ccctcctctg ttttactcag gatccccggg taccgagctc gaattcaccg     900
gtcgccacca tggcccacag caagcacggc ctgaaggagg agatgaccat gaagtaccac     960
atggagggct gcgtgaacgg ccacaagttc gtgatcaccg gcgagggcat cggctacccc    1020
ttcaagggca agcagaccat caacctgtgc gtgatcgagg gcggccccct gcccttcagc    1080
gaggacatcc tgagcgccgg cttcaagtac ggcgaccgga tcttcaccga gtacccccag    1140
gacatcgtgg actacttcaa gaacagctgc cccgccggct acacctgggg ccggagcttc    1200
ctgttcgagg acggcgccgt gtgcatctgt aacgtggaca tcaccgtgag cgtgaaggag    1260
aactgcatct accacaagag catcttcaac ggcgtgaact tccccgccga cggccccgtg    1320
atgaagaaga tgaccaccaa ctgggaggcc agctgcgaga agatcatgcc cgtgcctaag    1380
cagggcatcc tgaagggcga cgtgagcatg tacctgctgc tgaaggacgg cggccggtac    1440
cggtgccagt tcgacaccgt gtacaaggcc aagagcgtgc ccagcaagat gcccgagtgg    1500
cacttcatcc agcacaagct gctgcgggag gaccggagcg acgccaagaa ccagaagtgg    1560
cagctgaccg agcacgccat cgccttcccc agcgccctgg cctgaagcgg cccatggata    1620
ttcgaacgcg taggtaccac atggttaacc tagacttgtc catcttctgg attggccaac    1680
ttaattaatg tatgaaataa aaggatgcac acatagtgac atgctaatca ctataatgtg    1740
ggcatcaaag ttgtgtgtta tgtgtaatta ctagttatct gaataaaaga gaaagagatc    1800
atccatattt cttatcctaa atgaatgtca cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga    1860
tgcatttcat taaccaaatc catatacata taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa    1920
ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt gtgttttgcg aatgcggcca ttggcctaga    1980
aggccattta aatcctgagg atctggtctt cctaaggacc cgggatatcg ctatcaactt    2040
tgtatagaaa agttgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata ttaaattaga    2100
ttttgcataa aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag tcactatggt    2160
cgacctgcag actggctgtg tataagggag cctgacattt atattcccca gaacatcagg    2220
ttaatggcgt ttttgatgtc attttcgcgg tggctgagat cagccacttc ttccccgata    2280
acggagaccg gcacactggc catatcggtg gtcatcatgc gccagctttc atccccgata    2340
tgcaccaccg ggtaaagttc acgggggact ttatctgaca gcagacgtgc actggccagg    2400
gggatcacca tccgtcgccc gggcgtgtca ataatatcac tctgtacatc cacaaacaga    2460
cgataacggc tctctctttt ataggtgtaa accttaaact gcatttcacc agcccctgtt    2520
ctcgtcggca aaagagccgt tcatttcaat aaaccgggcg acctcagcca tcccttcctg    2580
attttccgct ttccagcgtt cggcacgcag acgacgggct tcattctgca tggttgtgct    2640
taccgaaccg gagatattga catcatatat gccttgagca actgatagct gtcgctgtca    2700
actgtcactg taatacgctg cttcatagca tacctctttt tgacatactt cgggtataca    2760
tatcagtata tattcttata ccgcaaaaat cagcgcgcaa atacgcatac tgttatctgg    2820
cttttagtaa gccggatcct ctagattacg ccccgcctgc cactcatcgc agtactgttg    2880
taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat gaacctgaat    2940
cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg    3000
ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg    3060
attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc    3120
accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta    3180
ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg    3240
aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaatt ccggatgagc    3300
attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt    3360
tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc    3420
aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat caacggtggt    3480
atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc tcgacggatc    3540
ctaactcaaa atccacacat tatacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc    3600
ctaatgcggc cgccatagtg actggatatg ttgtgtttta cagtattatg tagtctgttt    3660
tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt ctcgttcaac    3720
tttattatac aaagttgata gatatcggac cgattaaact ttaattcggt ccgaagcttg    3780
catgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat    3840
gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt    3900
atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac    3960
aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca    4020
attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc    4080
tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat    4140
ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct    4200
attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt    4260
agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt    4320
aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc    4380
gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa    4440
gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc    4500
gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc    4560
ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc    4620
ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac    4680
cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa    4740
atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc cccccctctc    4800
taccttctct agatcggcgt tccggtccat gcatggttag ggcccggtag ttctacttct    4860
gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg    4920
gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg    4980
aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt    5040
cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt    5100
gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc    5160
ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg    5220
gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat    5280
atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc    5340
tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga    5400
tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg    5460
tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag    5520
gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat    5580
tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat    5640
tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc    5700
cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt    5760
tgtttggtgt tacttctgca ggtcgacttt aacttagcct aggatccaca cgacaccatg    5820
tcccccgagc gccgccccgt cgagatccgc ccggccaccg ccgccgacat ggccgccgtg    5880
tgcgacatcg tgaaccacta catcgagacc tccaccgtga acttccgcac cgagccgcag    5940
accccgcagg agtggatcga cgacctggag cgcctccagg accgctaccc gtggctcgtg    6000
gccgaggtgg agggcgtggt ggccggcatc gcctacgccg gcccgtggaa ggcccgcaac    6060
gcctacgact ggaccgtgga gtccaccgtg tacgtgtccc accgccacca gcgcctcggc    6120
ctcggctcca ccctctacac ccacctcctc aagagcatgg aggcccaggg cttcaagtcc    6180
gtggtggccg tgatcggcct cccgaacgac ccgtccgtgc gcctccacga ggccctcggc    6240
tacaccgccc gcggcaccct ccgcgccgcc ggctacaagc acggcggctg gcacgacgtc    6300
ggcttctggc agcgcgactt cgagctgccg gccccgccgc gcccggtgcg cccggtgacg    6360
cagatctccg gtggaggcgg cagcggtggc ggaggctccg gaggcggtgg ctccatggcc    6420
tcctccgagg acgtcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcgcatgga gggctccgtg    6480
aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag    6540
accgccaagc tgaaggtgac caagggcggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc    6600
ccccagttcc agtacggctc caaggtgtac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac    6660
aagaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc    6720
ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gctccttcat ctacaaggtg    6780
aagttcatcg gcgtgaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa gactatgggc    6840
tgggaggcct ccaccgagcg cctgtacccc cgcgacggcg tgctgaaggg cgagatccac    6900
aaggccctga agctgaagga cggcggccac tacctggtgg agttcaagtc catctacatg    6960
gccaagaagc ccgtgcagct gcccggctac tactacgtgg actccaagct ggacatcacc    7020
tcccacaacg aggactacac catcgtggag cagtacgagc gcgccgaggg ccgccaccac    7080
ctgttcctgt agtcaggatc tgagtcgaaa cctagacttg tccatcttct ggattggcca    7140
acttaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc acacatagtg acatgctaat cactataatg    7200
tgggcatcaa agttgtgtgt tatgtgtaat tactagttat ctgaataaaa gagaaagaga    7260
tcatccatat ttcttatcct aaatgaatgt cacgtgtctt tataattctt tgatgaacca    7320
gatgcatttc attaaccaaa tccatataca tataaatatt aatcatatat aattaatatc    7380
aattgggtta gcaaaacaaa tctagtctag gtgtgttttg cgaatgcggc cgccaccgcg    7440
gtggagctcg aattcattcc gattaatcgt ggcctcttgc tcttcaggat gaagagctat    7500
gtttaaacgt gcaagcgcta ctagacaatt cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta    7560
ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tcctgccacc agccagccaa    7620
cagctccccg accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg atacaggcag cccatcagtc    7680
cgggacggcg tcagcgggag agccgttgta aggcggcaga ctttgctcat gttaccgatg    7740
ctattcggaa gaacggcaac taagctgccg ggtttgaaac acggatgatc tcgcggaggg    7800
tagcatgttg attgtaacga tgacagagcg ttgctgcctg tgatcaaata tcatctccct    7860
cgcagagatc cgaattatca gccttcttat tcatttctcg cttaaccgtg acaggctgtc    7920
gatcttgaga actatgccga cataatagga aatcgctgga taaagccgct gaggaagctg    7980
agtggcgcta tttctttaga agtgaacgtt gacgatcgtc gaccgtaccc cgatgaatta    8040
attcggacgt acgttctgaa cacagctgga tacttacttg ggcgattgtc atacatgaca    8100
tcaacaatgt acccgtttgt gtaaccgtct cttggaggtt cgtatgacac tagtggttcc    8160
cctcagcttg cgactagatg ttgaggccta acattttatt agagagcagg ctagttgctt    8220
agatacatga tcttcaggcc gttatctgtc agggcaagcg aaaattggcc atttatgacg    8280
accaatgccc cgcagaagct cccatctttg ccgccataga cgccgcgccc cccttttggg    8340
gtgtagaaca tccttttgcc agatgtggaa aagaagttcg ttgtcccatt gttggcaatg    8400
acgtagtagc cggcgaaagt gcgagaccca tttgcgctat atataagcct acgatttccg    8460
ttgcgactat tgtcgtaatt ggatgaacta ttatcgtagt tgctctcaga gttgtcgtaa    8520
tttgatggac tattgtcgta attgcttatg gagttgtcgt agttgcttgg agaaatgtcg    8580
tagttggatg gggagtagtc atagggaaga cgagcttcat ccactaaaac aattggcagg    8640
tcagcaagtg cctgccccga tgccatcgca agtacgaggc ttagaaccac cttcaacaga    8700
tcgcgcatag tcttccccag ctctctaacg cttgagttaa gccgcgccgc gaagcggcgt    8760
cggcttgaac gaattgttag acattatttg ccgactacct tggtgatctc gcctttcacg    8820
tagtgaacaa attcttccaa ctgatctgcg cgcgaggcca agcgatcttc ttgtccaaga    8880
taagcctgcc tagcttcaag tatgacgggc tgatactggg ccggcaggcg ctccattgcc    8940
cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt ttgccggtta ctgcgctgta ccaaatgcgg    9000
gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg ccagcccagt cgggcggcga gttccatagc    9060
gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga tcctgttcag gaaccggatc aaagagttcc    9120
tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta tgttctcttg cttttgtcag caagatagcc    9180
agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag atacctgcaa gaatgtcatt gcgctgccat    9240
tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga taacgccacg gaatgatgtc gtcgtgcaca    9300
acaatggtga cttctacagc gcggagaatc tcgctctctc caggggaagc cgaagtttcc    9360
aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt gtttcatcaa gccttacagt caccgtaacc    9420
agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg ccgccatcca ctgcggagcc gtacaaatgt    9480
acggccagca acgtcggttc gagatggcgc tcgatgacgc caactacctc tgatagttga    9540
gtcgatactt cggcgatcac cgcttccctc atgatgttta actcctgaat taagccgcgc    9600
cgcgaagcgg tgtcggcttg aatgaattgt taggcgtcat cctgtgctcc cgagaaccag    9660
taccagtaca tcgctgtttc gttcgagact tgaggtctag ttttatacgt gaacaggtca    9720
atgccgccga gagtaaagcc acattttgcg tacaaattgc aggcaggtac attgttcgtt    9780
tgtgtctcta atcgtatgcc aaggagctgt ctgcttagtg cccacttttt cgcaaattcg    9840
atgagactgt gcgcgactcc tttgcctcgg tgcgtgtgcg acacaacaat gtgttcgata    9900
gaggctagat cgttccatgt tgagttgagt tcaatcttcc cgacaagctc ttggtcgatg    9960
aatgcgccat agcaagcaga gtcttcatca gagtcatcat ccgagatgta atccttccgg   10020
taggggctca cacttctggt agatagttca aagccttggt cggataggtg cacatcgaac   10080
acttcacgaa caatgaaatg gttctcagca tccaatgttt ccgccacctg ctcagggatc   10140
accgaaatct tcatatgacg cctaacgcct ggcacagcgg atcgcaaacc tggcgcggct   10200
tttggcacaa aaggcgtgac aggtttgcga atccgttgct gccacttgtt aacccttttg    10260
ccagatttgg taactataat ttatgttaga ggcgaagtct tgggtaaaaa ctggcctaaa    10320
attgctgggg atttcaggaa agtaaacatc accttccggc tcgatgtcta ttgtagatat    10380
atgtagtgta tctacttgat cgggggatct gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg    10440
aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg    10500
ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca    10560
tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca    10620
gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa    10680
ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg    10740
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg    10800
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa    10860
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg    10920
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc    10980
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc    11040
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc    11100
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg    11160
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc    11220
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga    11280
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc    11340
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac    11400
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg    11460
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc    11520
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa    11580
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta    11640
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt    11700
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag    11760
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca    11820
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc    11880
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt    11940
tgttgccatt gctgcagggg gggggggggg gggggacttc cattgttcat tccacggaca    12000
aaaacagaga aaggaaacga cagaggccaa aaagcctcgc tttcagcacc tgtcgtttcc    12060
tttcttttca gagggtattt taaataaaaa cattaagtta tgacgaagaa gaacggaaac    12120
gccttaaacc ggaaaatttt cataaatagc gaaaacccgc gaggtcgccg ccccgtaacc    12180
tgtcggatca ccggaaagga cccgtaaagt gataatgatt atcatctaca tatcacaacg    12240
tgcgtggagg ccatcaaacc acgtcaaata atcaattatg acgcaggtat cgtattaatt    12300
gatctgcatc aacttaacgt aaaaacaact tcagacaata caaatcagcg acactgaata    12360
cggggcaacc tcatgtcccc cccccccccc cccctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt    12420
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc    12480
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt    12540
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc    12600
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt    12660
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata    12720
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga    12780
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag    12840
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa    12900
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt    12960
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga    13020
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag    13080
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc  13140
ttcaagaatt ggtcgacgat cttgctgcgt tcggatattt tcgtggagtt cccgccacag  13200
acccggattg aaggcgagat ccagcaactc gcgccagatc atcctgtgac ggaactttgg  13260
cgcgtgatga ctggccagga cgtcggccga aagagcgaca agcagatcac gcttttcgac  13320
agcgtcggat ttgcgatcga ggatttttcg gcgctgcgct acgtccgcga ccgcgttgag  13380
ggatcaagcc acagcagccc actcgacctt ctagccgacc cagacgagcc aagggatctt  13440
tttggaatgc tgctccgtcg tcaggctttc cgacgtttgg gtggttgaac agaagtcatt  13500
atcgtacgga atgccaagca ctcccgaggg gaaccctgtg gttggcatgc acatacaaat  13560
ggacgaacgg ataaaccttt tcacgccctt ttaaatatcc gttattctaa taaacgctct  13620
tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc  13680
gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg  13740
atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgt tgaaggagcc  13800
actcagc                                                            13807
 
<210>40
<211>3505
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>40
gatccccggg taccgagctc gaattcggcc caagtttgta caaaaaagtt gaacgagaaa     60
cgtaaaatga tataaatatc aatatattaa attagatttt gcataaaaaa cagactacat    120
aatactgtaa aacacaacat atgcagtcac tatgaatcaa ctacttagat ggtattagtg    180
acctgtagaa ttcgagctct agagctgcag ggcggccgcg atatccccta tagtgagtcg    240
tattacatgg tcatagctgt ttcctggcag ctctggcccg tgtctcaaaa tctctgatgt    300
tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac    360
agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc gcgattaaat     420
tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca     480
ggtgcgacaa tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat     540
ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg     600
gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta     660
ctcaccactg cgatccccgg aaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca     720
ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt     780
tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg     840
aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa     900
caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat     960
ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat    1020
gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc    1080
ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct    1140
gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt    1200
aattggttgt aacactggca gagcattacg ctgacttgac gggacggcgc aagctcatga    1260
ccaaaatccc ttaacgtgag ttacgcgtcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag    1320
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa    1380
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg    1440
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag    1500
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg    1560
ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga    1620
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc    1680
ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagcattg agaaagcgcc    1740
acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga    1800
gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt    1860
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg    1920
aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac    1980
atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga    2040
gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg    2100
gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc    2160
tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatacgcgt    2220
accgctagcc aggaagagtt tgtagaaacg caaaaaggcc atccgtcagg atggccttct    2280
gcttagtttg atgcctggca gtttatggcg ggcgtcctgc ccgccaccct ccgggccgtt    2340
gcttcacaac gttcaaatcc gctcccggcg gatttgtcct actcaggaga gcgttcaccg    2400
acaaacaaca gataaaacga aaggcccagt cttccgactg agcctttcgt tttatttgat    2460
gcctggcagt tccctactct cgcgttaacg ctagcatgga tgttttccca gtcacgacgt    2520
tgtaaaacga cggccagtct taagctcggg cccgcgttaa cgctaccatg gagctccaaa    2580
taatgatttt attttgactg atagtgacct gttcgttgca acaaattgat aagcaatgct    2640
tttttataat gccaactttg tatagaaaag ttgaagctta aatccttaca gaattgctgt    2700
agtttcatag tgctagatgt ggacagcaaa gcgccgctgt atgcttctgc ttttcttttt    2760
tggtgtgtgt agccacatcc tttgttcctg cccggcgcca tcccacttgg ttgttttttt    2820
ttatgattga aagccttcat gcttcctcgg tcaatcaccg gtgcgcactg ggagcatcgc    2880
cggaaaaaaa attcttcggc taagagtaac ttctttctcc ttttcttctc tgatctcgcg    2940
agcagtgctg ataacgtgtt gtaatctact tagcggtaac gagattgaga gagacaaaat    3000
gacagaacta ttgtctttat tgcagagtgt catgtattta tacaggggat acaaagtctc    3060
ccaaggggtg tgtcccttgg gagtaactgc cagttgatca caggacaata ttttgtaaca    3120
aaacgtacac atcgtcaaaa tagcgaggca tgaaactggc cttggccatg gacgcgtgaa    3180
gcgcgccatg cgttggatat gtggtcaata agtatataca atacaatgtt taacagagct    3240
gatagtactg ctttggcaca tttttgtcca cgcttcatga gagataaaac acctgcacgt  3300
aaattcacat gctgcactga aggcccgatc actgaggagc gaactgccgt aactcccttc  3360
tatatatacc cccagtccct gtttcagttt tcgtcaagct agcagcacca agttgtcgat  3420
cacttgcctg ctcttgagct cgattaagct atcatcagct acagcatccg atcccaaact  3480
gcaactgtag cagcgacaac tgccg                                        3505
 
<210>41
<211>4778
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>41
tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat     60
gcatggttac tcaccactgc gatccccgga aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat    120
cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg    180
attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa    240
tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg    300
cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc    360
gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt    420
tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg    480
aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt    540
gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca    600
gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcgca    660
agctcatgac caaaatccct taacgtgagt tacgcgtcgt tccactgagc gtcagacccc    720
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg    780
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact    840
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg     900
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg     960
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac    1020
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca    1080
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga    1140
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc    1200
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct    1260
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg    1320
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct    1380
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc    1440
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc    1500
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat    1560
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt    1620
aatacgcgta ccgctagcca ggaagagttt gtagaaacgc aaaaaggcca tccgtcagga    1680
tggccttctg cttagtttga tgcctggcag tttatggcgg gcgtcctgcc cgccaccctc    1740
cgggccgttg cttcacaacg ttcaaatccg ctcccggcgg atttgtccta ctcaggagag    1800
cgttcaccga caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc ttccgactga gcctttcgtt    1860
ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc gcgttaacgc tagcatggat gttttcccag    1920
tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtctt aagctcgggc ccgcgttaac gctaccatgg    1980
agctccaaat aatgatttta ttttgactga tagtgacctg ttcgttgcaa caaattgata    2040
agcaatgctt ttttataatg ccaactttgt atagaaaagt tgggccgaat tcgagctcgg    2100
tacggccaga atggcccgga ccgggttacc gaattcgagc tcggtaccct gggatcagct    2160
tgcatgcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc    2220
atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt    2280
ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact    2340
acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga    2400
caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct    2460
cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc    2520
atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt    2580
ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat    2640
ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa    2700
ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg    2760
ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg    2820
aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca    2880
ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag    2940
ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct cacggcaccg gcagctacgg gggattcctt    3000
tcccaccgct ccttcgcttt cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac    3060
accctctttc cccaacctcg tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc    3120
aaatccaccc gtcggcacct ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc cccccccctc    3180
tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atgcatggtt agggcccggt agttctactt    3240
ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca    3300
cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg    3360
ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt    3420
ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt    3480
ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg    3540
gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt    3600
tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa    3660
atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat    3720
gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta  3780
gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg  3840
tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat  3900
aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct  3960
attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt  4020
attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta  4080
gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct  4140
gttgtttggt gttacttctg caggtcgact ctagaggatc agcttggtca cccggtccgg  4200
gcctagaagg ccagcttcaa gtttgtacaa aaaagttgaa cgagaaacgt aaaatgatat  4260
aaatatcaat atattaaatt agattttgca taaaaaacag actacataat actgtaaaac  4320
acaacatatg cagtcactat gaatcaacta cttagatggt attagtgacc tgtagaattc  4380
gagctctaga gctgcagggc ggccgcgata tcccctatag tgagtcgtat tacatggtca  4440
tagctgtttc ctggcagctc tggcccgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag  4500
ataaaaatat atcatcatga acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg  4560
gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg  4620
ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct  4680
atcgcttgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg  4740
ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaac                          4778
 
<210>42
<211>13019
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>42
gttacccgga ccgaagctta gcccgggcat gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc    60
cctctctaga gataatgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt    120
ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc    180
tacgaataat ataatctata gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat    240
gaacagttag acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt    300
tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata    360
cttcatccat tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta    420
atttttttag tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc    480
tattttagtt tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa    540
aattaaacaa atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga    600
gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac    660
cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg    720
gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat    780
tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg    840
cacggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc    900
gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca    960
cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc   1020
cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt   1080
tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc   1140
cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa   1200
cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat   1260
cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt   1320
caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt   1380
gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact   1440
acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg   1500
aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt    1560
tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg    1620
ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt    1680
tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg    1740
atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac    1800
atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat    1860
aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc    1920
agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt    1980
tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcaggtcgac tctagaggat    2040
ccacaagttt gtacaaaaaa gctgaacgag aaacgtaaaa tgatataaat atcaatatat    2100
taaattagat tttgcataaa aaacagacta cataatactg taaaacacaa catatccagt    2160
cactatggcg gccgcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtataa    2220
tgtgtggatt ttgagttagg atttaaatac gcgttgatcc ggcttactaa aagccagata    2280
acagtatgcg tatttgcgcg ctgatttttg cggtataaga atatatactg atatgtatac    2340
ccgaagtatg tcaaaaagag gtatgctatg aagcagcgta ttacagtgac agttgacagc    2400
gacagctatc agttgctcaa ggcatatatg atgtcaatat ctccggtctg gtaagcacaa    2460
ccatgcagaa tgaagcccgt cgtctgcgtg ccgaacgctg gaaagcggaa aatcaggaag    2520
ggatggctga ggtcgcccgg tttattgaaa tgaacggctc ttttgctgac gagaacaggg    2580
gctggtgaaa tgcagtttaa ggtttacacc tataaaagag agagccgtta tcgtctgttt    2640
gtggatgtac agagtgatat cattgacacg cccggtcgac ggatggtgat ccccctggcc    2700
agtgcacgtc tgctgtcaga taaagtctcc cgtgaacttt acccggtggt gcatatcggg    2760
gatgaaagct ggcgcatgat gaccaccgat atggccagtg tgccggtctc cgttatcggg    2820
gaagaagtgg ctgatctcag ccaccgcgaa aatgacatca aaaacgccat taacctgatg    2880
ttctggggaa tataaatgtc aggctccctt atacacagcc agtctgcagg tcgaccatag    2940
tgactggata tgttgtgttt tacagtatta tgtagtctgt tttttatgca aaatctaatt    3000
taatatattg atatttatat cattttacgt ttctcgttca gctttcttgt acaaagtggt    3060
gttaacctag acttgtccat cttctggatt ggccaactta attaatgtat gaaataaaag    3120
gatgcacaca tagtgacatg ctaatcacta taatgtgggc atcaaagttg tgtgttatgt    3180
gtaattacta gttatctgaa taaaagagaa agagatcatc catatttctt atcctaaatg    3240
aatgtcacgt gtctttataa ttctttgatg aaccagatgc atttcattaa ccaaatccat    3300
atacatataa atattaatca tatataatta atatcaattg ggttagcaaa acaaatctag    3360
tctaggtgtg ttttgcgaat tgcggccgcc accgcggtgg agctcgaatt ccggtccggg    3420
tcacctttgt ccaccaagat ggaactgcgg ccgctcatta attaagtcag gcgcgcctct    3480
agttgaagac acgttcatgt cttcatcgta agaagacact cagtagtctt cggccagaat    3540
ggccatctgg attcagcagg cctagaaggc catttaaatc ctgaggatct ggtcttccta    3600
aggacccggg atatcggacc gattaaactt taattcggtc cgaagcttgc atgcctgcag    3660
tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat    3720
aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta    3780
tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag    3840
tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt    3900
tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc    3960
aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag    4020
ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc    4080
taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat    4140
agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa    4200
ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc    4260
taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac    4320
ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc    4380
tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg    4440
cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct    4500
tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc    4560
aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc    4620
ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc ccccctctct accttctcta    4680
gatcggcgtt ccggtccatg catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg    4740
tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg    4800
tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat    4860
ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg    4920
gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc    4980
ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag    5040
atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt    5100
gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg    5160
ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc    5220
ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa    5280
tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca    5340
tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt    5400
gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct    5460
aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga    5520
tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat    5580
acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt    5640
acttctgcag gtcgacttta acttagccta ggatccacac gacaccatgt cccccgagcg    5700
ccgccccgtc gagatccgcc cggccaccgc cgccgacatg gccgccgtgt gcgacatcgt    5760
gaaccactac atcgagacct ccaccgtgaa cttccgcacc gagccgcaga ccccgcagga    5820
gtggatcgac gacctggagc gcctccagga ccgctacccg tggctcgtgg ccgaggtgga    5880
gggcgtggtg gccggcatcg cctacgccgg cccgtggaag gcccgcaacg cctacgactg    5940
gaccgtggag tccaccgtgt acgtgtccca ccgccaccag cgcctcggcc tcggctccac    6000
cctctacacc cacctcctca agagcatgga ggcccagggc ttcaagtccg tggtggccgt    6060
gatcggcctc ccgaacgacc cgtccgtgcg cctccacgag gccctcggct acaccgcccg    6120
cggcaccctc cgcgccgccg gctacaagca cggcggctgg cacgacgtcg gcttctggca    6180
gcgcgacttc gagctgccgg ccccgccgcg cccggtgcgc ccggtgacgc agatctgagt    6240
cgaaacctag acttgtccat cttctggatt ggccaactta attaatgtat gaaataaaag    6300
gatgcacaca tagtgacatg ctaatcacta taatgtgggc atcaaagttg tgtgttatgt    6360
gtaattacta gttatctgaa taaaagagaa agagatcatc catatttctt atcctaaatg    6420
aatgtcacgt gtctttataa ttctttgatg aaccagatgc atttcattaa ccaaatccat    6480
atacatataa atattaatca tatataatta atatcaattg ggttagcaaa acaaatctag    6540
tctaggtgtg ttttgcgaat tgcggccgcc accgcggtgg agctcgaatt cattccgatt    6600
aatcgtggcc tcttgctctt caggatgaag agctatgttt aaacgtgcaa gcgctactag    6660
acaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg    6720
tttacaccac aatatatcct gccaccagcc agccaacagc tccccgaccg gcagctcggc    6780
acaaaatcac cactcgatac aggcagccca tcagtccggg acggcgtcag cgggagagcc    6840
gttgtaaggc ggcagacttt gctcatgtta ccgatgctat tcggaagaac ggcaactaag    6900
ctgccgggtt tgaaacacgg atgatctcgc ggagggtagc atgttgattg taacgatgac    6960
agagcgttgc tgcctgtgat caaatatcat ctccctcgca gagatccgaa ttatcagcct    7020
tcttattcat ttctcgctta accgtgacag gctgtcgatc ttgagaacta tgccgacata    7080
ataggaaatc gctggataaa gccgctgagg aagctgagtg gcgctatttc tttagaagtg    7140
aacgttgacg atcgtcgacc gtaccccgat gaattaattc ggacgtacgt tctgaacaca    7200
gctggatact tacttgggcg attgtcatac atgacatcaa caatgtaccc gtttgtgtaa    7260
ccgtctcttg gaggttcgta tgacactagt ggttcccctc agcttgcgac tagatgttga    7320
ggcctaacat tttattagag agcaggctag ttgcttagat acatgatctt caggccgtta    7380
tctgtcaggg caagcgaaaa ttggccattt atgacgacca atgccccgca gaagctccca    7440
tctttgccgc catagacgcc gcgcccccct tttggggtgt agaacatcct tttgccagat    7500
gtggaaaaga agttcgttgt cccattgttg gcaatgacgt agtagccggc gaaagtgcga    7560
gacccatttg cgctatatat aagcctacga tttccgttgc gactattgtc gtaattggat    7620
gaactattat cgtagttgct ctcagagttg tcgtaatttg atggactatt gtcgtaattg    7680
cttatggagt tgtcgtagtt gcttggagaa atgtcgtagt tggatgggga gtagtcatag    7740
ggaagacgag cttcatccac taaaacaatt ggcaggtcag caagtgcctg ccccgatgcc    7800
atcgcaagta cgaggcttag aaccaccttc aacagatcgc gcatagtctt ccccagctct    7860
ctaacgcttg agttaagccg cgccgcgaag cggcgtcggc ttgaacgaat tgttagacat    7920
tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt gaacaaattc ttccaactga    7980
tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttgt ccaagataag cctgcctagc ttcaagtatg    8040
acgggctgat actgggccgg caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac atccttcggc    8100
gcgattttgc cggttactgc gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac tacatttcgc    8160
tcatcgccag cccagtcggg cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca    8220
aatagatcct gttcaggaac cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc taccaaggca    8280
acgctatgtt ctcttgcttt tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat cgtggctggc    8340
tcgaagatac ctgcaagaat gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag ttcgcgctta    8400
gctggataac gccacggaat gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc tacagcgcgg    8460
agaatctcgc tctctccagg ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc    8520
cgcgttgttt catcaagcct tacagtcacc gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc    8580
ttcaggccgc catccactgc ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga    8640
tggcgctcga tgacgccaac tacctctgat agttgagtcg atacttcggc gatcaccgct    8700
tccctcatga tgtttaactc ctgaattaag ccgcgccgcg aagcggtgtc ggcttgaatg    8760
aattgttagg cgtcatcctg tgctcccgag aaccagtacc agtacatcgc tgtttcgttc    8820
gagacttgag gtctagtttt atacgtgaac aggtcaatgc cgccgagagt aaagccacat    8880
tttgcgtaca aattgcaggc aggtacattg ttcgtttgtg tctctaatcg tatgccaagg    8940
agctgtctgc ttagtgccca ctttttcgca aattcgatga gactgtgcgc gactcctttg    9000
cctcggtgcg tgtgcgacac aacaatgtgt tcgatagagg ctagatcgtt ccatgttgag    9060
ttgagttcaa tcttcccgac aagctcttgg tcgatgaatg cgccatagca agcagagtct    9120
tcatcagagt catcatccga gatgtaatcc ttccggtagg ggctcacact tctggtagat    9180
agttcaaagc cttggtcgga taggtgcaca tcgaacactt cacgaacaat gaaatggttc    9240
tcagcatcca atgtttccgc cacctgctca gggatcaccg aaatcttcat atgacgccta    9300
acgcctggca cagcggatcg caaacctggc gcggcttttg gcacaaaagg cgtgacaggt    9360
ttgcgaatcc gttgctgcca cttgttaacc cttttgccag atttggtaac tataatttat    9420
gttagaggcg aagtcttggg taaaaactgg cctaaaattg ctggggattt caggaaagta    9480
aacatcacct tccggctcga tgtctattgt agatatatgt agtgtatcta cttgatcggg    9540
ggatctgctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc    9600
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg    9660
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg    9720
gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat    9780
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc    9840
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca    9900
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg    9960
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca   10020
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa   10080
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc   10140
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc    10200
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct    10260
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg    10320
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag    10380
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta    10440
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg    10500
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt    10560
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt    10620
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag    10680
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat    10740
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc    10800
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat    10860
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc    10920
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag    10980
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag    11040
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg cagggggggg    11100
gggggggggg gacttccatt gttcattcca cggacaaaaa cagagaaagg aaacgacaga    11160
ggccaaaaag cctcgctttc agcacctgtc gtttcctttc ttttcagagg gtattttaaa    11220
taaaaacatt aagttatgac gaagaagaac ggaaacgcct taaaccggaa aattttcata    11280
aatagcgaaa acccgcgagg tcgccgcccc gtaacctgtc ggatcaccgg aaaggacccg    11340
taaagtgata atgattatca tctacatatc acaacgtgcg tggaggccat caaaccacgt    11400
caaataatca attatgacgc aggtatcgta ttaattgatc tgcatcaact taacgtaaaa    11460
acaacttcag acaatacaaa tcagcgacac tgaatacggg gcaacctcat gtcccccccc    11520
cccccccccc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct    11580
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta    11640
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg    11700
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga    11760
ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt    11820
gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca    11880
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt    11940
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt    12000
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga    12060
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt    12120
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc    12180
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa    12240
cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattggtc gacgatcttg    12300
ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggattgaagg cgagatccag    12360
caactcgcgc cagatcatcc tgtgacggaa ctttggcgcg tgatgactgg ccaggacgtc    12420
ggccgaaaga gcgacaagca gatcacgctt ttcgacagcg tcggatttgc gatcgaggat    12480
ttttcggcgc tgcgctacgt ccgcgaccgc gttgagggat caagccacag cagcccactc    12540
gaccttctag ccgacccaga cgagccaagg gatctttttg gaatgctgct ccgtcgtcag    12600
gctttccgac gtttgggtgg ttgaacagaa gtcattatcg tacggaatgc caagcactcc    12660
cgaggggaac cctgtggttg gcatgcacat acaaatggac gaacggataa accttttcac    12720
gcccttttaa atatccgtta ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat    12780
atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgatcatgag    12840
cggagaatta agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa gccgttttac    12900
gtttggaact gacagaaccg caacgttgaa ggagccactc agcaagctgg tacgattgta    12960
atacgactca ctatagggcg aattgagcgc tgtttaaacg ctcttcaact ggaagagcg     13019
<210>43
<211>49765
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
 
<400>43
gggggggggg ggggggggtt ccattgttca ttccacggac aaaaacagag aaaggaaacg    60
acagaggcca aaaagctcgc tttcagcacc tgtcgtttcc tttcttttca gagggtattt   120
taaataaaaa cattaagtta tgacgaagaa gaacggaaac gccttaaacc ggaaaatttt   180
cataaatagc gaaaacccgc gaggtcgccg ccccgtaacc tgtcggatca ccggaaagga   240
cccgtaaagt gataatgatt atcatctaca tatcacaacg tgcgtggagg ccatcaaacc   300
acgtcaaata atcaattatg acgcaggtat cgtattaatt gatctgcatc aacttaacgt   360
aaaaacaact tcagacaata caaatcagcg acactgaata cggggcaacc tcatgtcccc   420
cccccccccc cccctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc   480
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg   540
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc   600
atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct   660
gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc   720
tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc   780
atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc   840
agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc   900
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca   960
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt  1020
tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt  1080
ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca  1140
ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagaatt cggagctttt    1200
gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt    1260
tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata    1320
ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg    1380
gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat    1440
gctcgatgag tttttctaat cagaattggt taattggttg taacactggc agagcattac    1500
gctgacttga cgggacggcg gctttgttga ataaatcgaa cttttgctga gttgaaggat    1560
cagatcacgc atcttcccga caacgcagac cgttccgtgg caaagcaaaa gttcaaaatc    1620
accaactggt ccacctacaa caaagctctc atcaaccgtg gctccctcac tttctggctg    1680
gatgatgggg cgattcaggc ctggtatgag tcagcaacac cttcttcacg aggcagacct    1740
cagcgccaga aggccgccag agaggccgag cgcggccgtg aggcttggac gctagggcag    1800
ggcatgaaaa agcccgtagc gggctgctac gggcgtctga cgcggtggaa agggggaggg    1860
gatgttgtct acatggctct gctgtagtga gtgggttgcg ctccggcagc ggtcctgatc    1920
aatcgtcacc ctttctcggt ccttcaacgt tcctgacaac gagcctcctt ttcgccaatc    1980
catcgacaat caccgcgagt ccctgctcga acgctgcgtc cggaccggct tcgtcgaagg    2040
cgtctatcgc ggcccgcaac agcggcgaga gcggagcctg ttcaacggtg ccgccgcgct    2100
cgccggcatc gctgtcgccg gcctgctcct caagcacggc cccaacagtg aagtagctga    2160
ttgtcatcag cgcattgacg gcgtccccgg ccgaaaaacc cgcctcgcag aggaagcgaa    2220
gctgcgcgtc ggccgtttcc atctgcggtg cgcccggtcg cgtgccggca tggatgcgcg    2280
cgccatcgcg gtaggcgagc agcgcctgcc tgaagctgcg ggcattcccg atcagaaatg    2340
agcgccagtc gtcgtcggct ctcggcaccg aatgcgtatg attctccgcc agcatggctt    2400
cggccagtgc gtcgagcagc gcccgcttgt tcctgaagtg ccagtaaagc gccggctgct    2460
gaacccccaa ccgttccgcc agtttgcgtg tcgtcagacc gtctacgccg acctcgttca    2520
acaggtccag ggcggcacgg atcactgtat tcggctgcaa ctttgtcatg cttgacactt    2580
tatcactgat aaacataata tgtccaccaa cttatcagtg ataaagaatc cgcgcgttca    2640
atcggaccag cggaggctgg tccggaggcc agacgtgaaa cccaacatac ccctgatcgt    2700
aattctgagc actgtcgcgc tcgacgctgt cggcatcggc ctgattatgc cggtgctgcc    2760
gggcctcctg cgcgatctgg ttcactcgaa cgacgtcacc gcccactatg gcattctgct    2820
ggcgctgtat gcgttggtgc aatttgcctg cgcacctgtg ctgggcgcgc tgtcggatcg    2880
tttcgggcgg cggccaatct tgctcgtctc gctggccggc gccactgtcg actacgccat    2940
catggcgaca gcgcctttcc tttgggttct ctatatcggg cggatcgtgg ccggcatcac    3000
cggggcgact ggggcggtag ccggcgctta tattgccgat atcactgatg gcgatgagcg    3060
cgcgcggcac ttcggcttca tgagcgcctg tttcgggttc gggatggtcg cgggacctgt    3120
gctcggtggg ctgatgggcg gtttctcccc ccacgctccg ttcttcgccg cggcagcctt    3180
gaacggcctc aatttcctga cgggctgttt ccttttgccg gagtcgcaca aaggcgaacg    3240
ccggccgtta cgccgggagg ctctcaaccc gctcgcttcg ttccggtggg cccggggcat    3300
gaccgtcgtc gccgccctga tggcggtctt cttcatcatg caacttgtcg gacaggtgcc    3360
ggccgcgctt tgggtcattt tcggcgagga tcgctttcac tgggacgcga ccacgatcgg    3420
catttcgctt gccgcatttg gcattctgca ttcactcgcc caggcaatga tcaccggccc    3480
tgtagccgcc cggctcggcg aaaggcgggc actcatgctc ggaatgattg ccgacggcac    3540
aggctacatc ctgcttgcct tcgcgacacg gggatggatg gcgttcccga tcatggtcct    3600
gcttgcttcg ggtggcatcg gaatgccggc gctgcaagca atgttgtcca ggcaggtgga    3660
tgaggaacgt caggggcagc tgcaaggctc actggcggcg ctcaccagcc tgacctcgat    3720
cgtcggaccc ctcctcttca cggcgatcta tgcggcttct ataacaacgt ggaacgggtg    3780
ggcatggatt gcaggcgctg ccctctactt gctctgcctg ccggcgctgc gtcgcgggct    3840
ttggagcggc gcagggcaac gagccgatcg ctgatcgtgg aaacgatagg cctatgccat    3900
gcgggtcaag gcgacttccg gcaagctata cgcgccctag gagtgcggtt ggaacgttgg    3960
cccagccaga tactcccgat cacgagcagg acgccgatga tttgaagcgc actcagcgtc    4020
tgatccaaga acaaccatcc tagcaacacg gcggtccccg ggctgagaaa gcccagtaag    4080
gaaacaactg taggttcgag tcgcgagatc ccccggaacc aaaggaagta ggttaaaccc    4140
gctccgatca ggccgagcca cgccaggccg agaacattgg ttcctgtagg catcgggatt    4200
ggcggatcaa acactaaagc tactggaacg agcagaagtc ctccggccgc cagttgccag    4260
gcggtaaagg tgagcagagg cacgggaggt tgccacttgc gggtcagcac ggttccgaac    4320
gccatggaaa ccgcccccgc caggcccgct gcgacgccga caggatctag cgctgcgttt    4380
ggtgtcaaca ccaacagcgc cacgcccgca gttccgcaaa tagcccccag gaccgccatc    4440
aatcgtatcg ggctacctag cagagcggca gagatgaaca cgaccatcag cggctgcaca    4500
gcgcctaccg tcgccgcgac cccgcccggc aggcggtaga ccgaaataaa caacaagctc    4560
cagaatagcg aaatattaag tgcgccgagg atgaagatgc gcatccacca gattcccgtt    4620
ggaatctgtc ggacgatcat cacgagcaat aaacccgccg gcaacgcccg cagcagcata    4680
ccggcgaccc ctcggcctcg ctgttcgggc tccacgaaaa cgccggacag atgcgccttg    4740
tgagcgtcct tggggccgtc ctcctgtttg aagaccgaca gcccaatgat ctcgccgtcg    4800
atgtaggcgc cgaatgccac ggcatctcgc aaccgttcag cgaacgcctc catgggcttt    4860
ttctcctcgt gctcgtaaac ggacccgaac atctctggag ctttcttcag ggccgacaat    4920
cggatctcgc ggaaatcctg cacgtcggcc gctccaagcc gtcgaatctg agccttaatc    4980
acaattgtca attttaatcc tctgtttatc ggcagttcgt agagcgcgcc gtgcgtcccg    5040
agcgatactg agcgaagcaa gtgcgtcgag cagtgcccgc ttgttcctga aatgccagta    5100
aagcgctggc tgctgaaccc ccagccggaa ctgaccccac aaggccctag cgtttgcaat    5160
gcaccaggtc atcattgacc caggcgtgtt ccaccaggcc gctgcctcgc aactcttcgc    5220
aggcttcgcc gacctgctcg cgccacttct tcacgcgggt ggaatccgat ccgcacatga    5280
ggcggaaggt ttccagcttg agcgggtacg gctcccggtg cgagctgaaa tagtcgaaca    5340
tccgtcgggc cgtcggcgac agcttgcggt acttctccca tatgaatttc gtgtagtggt    5400
cgccagcaaa cagcacgacg atttcctcgt cgatcaggac ctggcaacgg gacgttttct    5460
tgccacggtc caggacgcgg aagcggtgca gcagcgacac cgattccagg tgcccaacgc    5520
ggtcggacgt gaagcccatc gccgtcgcct gtaggcgcga caggcattcc tcggccttcg    5580
tgtaataccg gccattgatc gaccagccca ggtcctggca aagctcgtag aacgtgaagg    5640
tgatcggctc gccgataggg gtgcgcttcg cgtactccaa cacctgctgc cacaccagtt    5700
cgtcatcgtc ggcccgcagc tcgacgccgg tgtaggtgat cttcacgtcc ttgttgacgt    5760
ggaaaatgac cttgttttgc agcgcctcgc gcgggatttt cttgttgcgc gtggtgaaca    5820
gggcagagcg ggccgtgtcg tttggcatcg ctcgcatcgt gtccggccac ggcgcaatat    5880
cgaacaagga aagctgcatt tccttgatct gctgcttcgt gtgtttcagc aacgcggcct    5940
gcttggcctc gctgacctgt tttgccaggt cctcgccggc ggtttttcgc ttcttggtcg    6000
tcatagttcc tcgcgtgtcg atggtcatcg acttcgccaa acctgccgcc tcctgttcga    6060
gacgacgcga acgctccacg gcggccgatg gcgcgggcag ggcaggggga gccagttgca    6120
cgctgtcgcg ctcgatcttg gccgtagctt gctggaccat cgagccgacg gactggaagg    6180
tttcgcgggg cgcacgcatg acggtgcggc ttgcgatggt ttcggcatcc tcggcggaaa    6240
accccgcgtc gatcagttct tgcctgtatg ccttccggtc aaacgtccga ttcattcacc    6300
ctccttgcgg gattgccccg actcacgccg gggcaatgtg cccttattcc tgatttgacc    6360
cgcctggtgc cttggtgtcc agataatcca ccttatcggc aatgaagtcg gtcccgtaga    6420
ccgtctggcc gtccttctcg tacttggtat tccgaatctt gccctgcacg aataccagcg    6480
accccttgcc caaatacttg ccgtgggcct cggcctgaga gccaaaacac ttgatgcgga    6540
agaagtcggt gcgctcctgc ttgtcgccgg catcgttgcg ccactcttca ttaaccgcta    6600
tatcgaaaat tgcttgcggc ttgttagaat tgccatgacg tacctcggtg tcacgggtaa    6660
gattaccgat aaactggaac tgattatggc tcatatcgaa agtctccttg agaaaggaga    6720
ctctagttta gctaaacatt ggttccgctg tcaagaactt tagcggctaa aattttgcgg    6780
gccgcgacca aaggtgcgag gggcggcttc cgctgtgtac aaccagatat ttttcaccaa    6840
catccttcgt ctgctcgatg agcggggcat gacgaaacat gagctgtcgg agagggcagg    6900
ggtttcaatt tcgtttttat cagacttaac caacggtaag gccaacccct cgttgaaggt    6960
gatggaggcc attgccgacg ccctggaaac tcccctacct cttctcctgg agtccaccga    7020
ccttgaccgc gaggcactcg cggagattgc gggtcatcct ttcaagagca gcgtgccgcc    7080
cggatacgaa cgcatcagtg tggttttgcc gtcacataag gcgtttatcg taaagaaatg    7140
gggcgacgac acccgaaaaa agctgcgtgg aaggctctga cgccaagggt tagggcttgc    7200
acttccttct ttagccgcta aaacggcccc ttctctgcgg gccgtcggct cgcgcatcat    7260
atcgacatcc tcaacggaag ccgtgccgcg aatggcatcg ggcgggtgcg ctttgacagt    7320
tgttttctat cagaacccct acgtcgtgcg gttcgattag ctgtttgtct tgcaggctaa    7380
acactttcgg tatatcgttt gcctgtgcga taatgttgct aatgatttgt tgcgtagggg    7440
ttactgaaaa gtgagcggga aagaagagtt tcagaccatc aaggagcggg ccaagcgcaa    7500
gctggaacgc gacatgggtg cggacctgtt ggccgcgctc aacgacccga aaaccgttga    7560
agtcatgctc aacgcggacg gcaaggtgtg gcacgaacgc cttggcgagc cgatgcggta    7620
catctgcgac atgcggccca gccagtcgca ggcgattata gaaacggtgg ccggattcca    7680
cggcaaagag gtcacgcggc attcgcccat cctggaaggc gagttcccct tggatggcag    7740
ccgctttgcc ggccaattgc cgccggtcgt ggccgcgcca acctttgcga tccgcaagcg    7800
cgcggtcgcc atcttcacgc tggaacagta cgtcgaggcg ggcatcatga cccgcgagca    7860
atacgaggtc attaaaagcg ccgtcgcggc gcatcgaaac atcctcgtca ttggcggtac    7920
tggctcgggc aagaccacgc tcgtcaacgc gatcatcaat gaaatggtcg ccttcaaccc    7980
gtctgagcgc gtcgtcatca tcgaggacac cggcgaaatc cagtgcgccg cagagaacgc    8040
cgtccaatac cacaccagca tcgacgtctc gatgacgctg ctgctcaaga caacgctgcg    8100
tatgcgcccc gaccgcatcc tggtcggtga ggtacgtggc cccgaagccc ttgatctgtt    8160
gatggcctgg aacaccgggc atgaaggagg tgccgccacc ctgcacgcaa acaaccccaa    8220
agcgggcctg agccggctcg ccatgcttat cagcatgcac ccggattcac cgaaacccat    8280
tgagccgctg attggcgagg cggttcatgt ggtcgtccat atcgccagga cccctagcgg    8340
ccgtcgagtg caagaaattc tcgaagttct tggttacgag aacggccagt acatcaccaa    8400
aaccctgtaa ggagtatttc caatgacaac ggctgttccg ttccgtctga ccatgaatcg    8460
cggcattttg ttctaccttg ccgtgttctt cgttctcgct ctcgcgttat ccgcgcatcc    8520
ggcgatggcc tcggaaggca ccggcggcag cttgccatat gagagctggc tgacgaacct    8580
gcgcaactcc gtaaccggcc cggtggcctt cgcgctgtcc atcatcggca tcgtcgtcgc    8640
cggcggcgtg ctgatcttcg gcggcgaact caacgccttc ttccgaaccc tgatcttcct    8700
ggttctggtg atggcgctgc tggtcggcgc gcagaacgtg atgagcacct tcttcggtcg    8760
tggtgccgaa atcgcggccc tcggcaacgg ggcgctgcac caggtgcaag tcgcggcggc    8820
ggatgccgtg cgtgcggtag cggctggacg gctcgcctaa tcatggctct gcgcacgatc    8880
cccatccgtc gcgcaggcaa ccgagaaaac ctgttcatgg gtggtgatcg tgaactggtg    8940
atgttctcgg gcctgatggc gtttgcgctg attttcagcg cccaagagct gcgggccacc    9000
gtggtcggtc tgatcctgtg gttcggggcg ctctatgcgt tccgaatcat ggcgaaggcc    9060
gatccgaaga tgcggttcgt gtacctgcgt caccgccggt acaagccgta ttacccggcc    9120
cgctcgaccc cgttccgcga gaacaccaat agccaaggga agcaataccg atgatccaag    9180
caattgcgat tgcaatcgcg ggcctcggcg cgcttctgtt gttcatcctc tttgcccgca    9240
tccgcgcggt cgatgccgaa ctgaaactga aaaagcatcg ttccaaggac gccggcctgg    9300
ccgatctgct caactacgcc gctgtcgtcg atgacggcgt aatcgtgggc aagaacggca    9360
gctttatggc tgcctggctg tacaagggcg atgacaacgc aagcagcacc gaccagcagc    9420
gcgaagtagt gtccgcccgc atcaaccagg ccctcgcggg cctgggaagt gggtggatga    9480
tccatgtgga cgccgtgcgg cgtcctgctc cgaactacgc ggagcggggc ctgtcggcgt    9540
tccctgaccg tctgacggca gcgattgaag aagagcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg    9600
tgatgtactt caccagctcc gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct    9660
tggcaatcac gcgcaccccc cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc    9720
gggcggacca cgcccatcat gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc    9780
agcagggcga ggatcgtggc atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag     9840
agtttcagca ggccgcccag gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg     9900
tgctcatagt ccacgacgcc cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc     9960
gacaggctca tgccggccgc cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg    10020
cagtacacct tgataggtgg gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc    10080
ttgccctcat ctgttacgcc ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg    10140
agcaccgcca ggtgcgaata agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct    10200
acttcaccta tcctgcccgg ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc    10260
ctttggcaaa atcctgtata tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata    10320
atgaccccga agcagggtta tgcagcggaa aagcgctgct tccctgctgt tttgtggaat    10380
atctaccgac tggaaacagg caaatgcagg aaattactga actgagggga caggcgagag    10440
acgatgccaa agagctacac cgacgagctg gccgagtggg ttgaatcccg cgcggccaag    10500
aagcgccggc gtgatgaggc tgcggttgcg ttcctggcgg tgagggcgga tgtcgaggcg    10560
gcgttagcgt ccggctatgc gctcgtcacc atttgggagc acatgcggga aacggggaag    10620
gtcaagttct cctacgagac gttccgctcg cacgccaggc ggcacatcaa ggccaagccc    10680
gccgatgtgc ccgcaccgca ggccaaggct gcggaacccg cgccggcacc caagacgccg    10740
gagccacggc ggccgaagca ggggggcaag gctgaaaagc cggcccccgc tgcggccccg    10800
accggcttca ccttcaaccc aacaccggac aaaaaggatc tactgtaatg gcgaaaattc    10860
acatggtttt gcagggcaag ggcggggtcg gcaagtcggc catcgccgcg atcattgcgc    10920
agtacaagat ggacaagggg cagacaccct tgtgcatcga caccgacccg gtgaacgcga    10980
cgttcgaggg ctacaaggcc ctgaacgtcc gccggctgaa catcatggcc ggcgacgaaa    11040
ttaactcgcg caacttcgac accctggtcg agctgattgc gccgaccaag gatgacgtgg    11100
tgatcgacaa cggtgccagc tcgttcgtgc ctctgtcgca ttacctcatc agcaaccagg    11160
tgccggctct gctgcaagaa atggggcatg agctggtcat ccataccgtc gtcaccggcg    11220
gccaggctct cctggacacg gtgagcggct tcgcccagct cgccagccag ttcccggccg    11280
aagcgctttt cgtggtctgg ctgaacccgt attgggggcc tatcgagcat gagggcaaga    11340
gctttgagca gatgaaggcg tacacggcca acaaggcccg cgtgtcgtcc atcatccaga    11400
ttccggccct caaggaagaa acctacggcc gcgatttcag cgacatgctg caagagcggc    11460
tgacgttcga ccaggcgctg gccgatgaat cgctcacgat catgacgcgg caacgcctca    11520
agatcgtgcg gcgcggcctg tttgaacagc tcgacgcggc ggccgtgcta tgagcgacca    11580
gattgaagag ctgatccggg agattgcggc caagcacggc atcgccgtcg gccgcgacga    11640
cccggtgctg atcctgcata ccatcaacgc ccggctcatg gccgacagtg cggccaagca    11700
agaggaaatc cttgccgcgt tcaaggaaga gctggaaggg atcgcccatc gttggggcga    11760
ggacgccaag gccaaagcgg agcggatgct gaacgcggcc ctggcggcca gcaaggacgc    11820
aatggcgaag gtaatgaagg acagcgccgc gcaggcggcc gaagcgatcc gcagggaaat    11880
cgacgacggc cttggccgcc agctcgcggc caaggtcgcg gacgcgcggc gcgtggcgat    11940
gatgaacatg atcgccggcg gcatggtgtt gttcgcggcc gccctggtgg tgtgggcctc    12000
gttatgaatc gcagaggcgc agatgaaaaa gcccggcgtt gccgggcttt gtttttgcgt    12060
tagctgggct tgtttgacag gcccaagctc tgactgcgcc cgcgctcgcg ctcctgggcc    12120
tgtttcttct cctgctcctg cttgcgcatc agggcctggt gccgtcgggc tgcttcacgc    12180
atcgaatccc agtcgccggc cagctcggga tgctccgcgc gcatcttgcg cgtcgccagt    12240
tcctcgatct tgggcgcgtg aatgcccatg ccttccttga tttcgcgcac catgtccagc    12300
cgcgtgtgca gggtctgcaa gcgggcttgc tgttgggcct gctgctgctg ccaggcggcc    12360
tttgtacgcg gcagggacag caagccgggg gcattggact gtagctgctg caaacgcgcc    12420
tgctgacggt ctacgagctg ttctaggcgg tcctcgatgc gctccacctg gtcatgcttt    12480
gcctgcacgt agagcgcaag ggtctgctgg taggtctgct cgatgggcgc ggattctaag    12540
agggcctgct gttccgtctc ggcctcctgg gccgcctgta gcaaatcctc gccgctgttg    12600
ccgctggact gctttactgc cggggactgc tgttgccctg ctcgcgccgt cgtcgcagtt    12660
cggcttgccc ccactcgatt gactgcttca tttcgagccg cagcgatgcg atctcggatt    12720
gcgtcaacgg acggggcagc gcggaggtgt ccggcttctc cttgggtgag tcggtcgatg    12780
ccatagccaa aggtttcctt ccaaaatgcg tccattgctg gaccgtgttt ctcattgatg    12840
cccgcaagca tcttcggctt gaccgccagg tcaagcgcgc cttcatgggc ggtcatgacg    12900
gacgccgcca tgaccttgcc gccgttgttc tcgatgtagc cgcgtaatga ggcaatggtg    12960
ccgcccatcg tcagcgtgtc atcgacaacg atgtacttct ggccggggat cacctccccc    13020
tcgaaagtcg ggttgaacgc caggcgatga tctgaaccgg ctccggttcg ggcgaccttc    13080
tcccgctgca caatgtccgt ttcgacctca aggccaaggc ggtcggccag aacgaccgcc    13140
atcatggccg gaatcttgtt gttccccgcc gcctcgacgg cgaggactgg aacgatgcgg    13200
ggcttgtcgt cgccgatcag cgtcttgagc tgggcaacag tgtcgtccga aatcaggcgc    13260
tcgaccaaat taagcgccgc ttccgcgtcg ccctgcttcg cagcctggta ttcaggctcg    13320
ttggtcaaag aaccaaggtc gccgttgcga accaccttcg ggaagtctcc ccacggtgcg    13380
cgctcggctc tgctgtagct gctcaagacg cctccctttt tagccgctaa aactctaacg    13440
agtgcgcccg cgactcaact tgacgctttc ggcacttacc tgtgccttgc cacttgcgtc    13500
ataggtgatg cttttcgcac tcccgatttc aggtacttta tcgaaatctg accgggcgtg    13560
cattacaaag ttcttcccca cctgttggta aatgctgccg ctatctgcgt ggacgatgct    13620
gccgtcgtgg cgctgcgact tatcggcctt ttgggccata tagatgttgt aaatgccagg    13680
tttcagggcc ccggctttat ctaccttctg gttcgtccat gcgccttggt tctcggtctg    13740
gacaattctt tgcccattca tgaccaggag gcggtgtttc attgggtgac tcctgacggt    13800
tgcctctggt gttaaacgtg tcctggtcgc ttgccggcta aaaaaaagcc gacctcggca    13860
gttcgaggcc ggctttccct agagccgggc gcgtcaaggt tgttccatct attttagtga    13920
actgcgttcg atttatcagt tactttcctc ccgctttgtg tttcctccca ctcgtttccg    13980
cgtctagccg acccctcaac atagcggcct cttcttgggc tgcctttgcc tcttgccgcg    14040
cttcgtcacg ctcggcttgc accgtcgtaa agcgctcggc ctgcctggcc gcctcttgcg    14100
ccgccaactt cctttgctcc tggtgggcct cggcgtcggc ctgcgccttc gctttcaccg    14160
ctgccaactc cgtgcgcaaa ctctccgctt cgcgcctggt ggcgtcgcgc tcgccgcgaa    14220
gcgcctgcat ttcctggttg gccgcgtcca gggtcttgcg gctctcttct ttgaatgcgc    14280
gggcgtcctg gtgagcgtag tccagctcgg cgcgcagctc ctgcgctcga cgctccacct    14340
cgtcggcccg ctgcgtcgcc agcgcggccc gctgctcggc tcctgccagg gcggtgcgtg    14400
cttcggccag ggcttgccgc tggcgtgcgg ccagctcggc cgcctcggcg gcctgctgct    14460
ctagcaatgt aacgcgcgcc tgggcttctt ccagctcgcg ggcctgcgcc tcgaaggcgt    14520
cggccagctc cccgcgcacg gcttccaact cgttgcgctc acgatcccag ccggcttgcg    14580
ctgcctgcaa cgattcattg gcaagggcct gggcggcttg ccagagggcg gccacggcct    14640
ggttgccggc ctgctgcacc gcgtccggca cctggactgc cagcggggcg gcctgcgccg    14700
tgcgctggcg tcgccattcg cgcatgccgg cgctggcgtc gttcatgttg acgcgggcgg    14760
ccttacgcac tgcatccacg gtcgggaagt tctcccggtc gccttgctcg aacagctcgt    14820
ccgcagccgc aaaaatgcgg tcgcgcgtct ctttgttcag ttccatgttg gctccggtaa    14880
ttggtaagaa taataatact cttacctacc ttatcagcgc aagagtttag ctgaacagtt    14940
ctcgacttaa cggcaggttt tttagcggct gaagggcagg caaaaaaagc cccgcacggt    15000
cggcgggggc aaagggtcag cgggaagggg attagcgggc gtcgggcttc ttcatgcgtc    15060
ggggccgcgc ttcttgggat ggagcacgac gaagcgcgca cgcgcatcgt cctcggccct    15120
atcggcccgc gtcgcggtca ggaacttgtc gcgcgctagg tcctccctgg tgggcaccag    15180
gggcatgaac tcggcctgct cgatgtaggt ccactccatg accgcatcgc agtcgaggcc    15240
gcgttccttc accgtctctt gcaggtcgcg gtacgcccgc tcgttgagcg gctggtaacg    15300
ggccaattgg tcgtaaatgg ctgtcggcca tgagcggcct ttcctgttga gccagcagcc    15360
gacgacgaag ccggcaatgc aggcccctgg cacaaccagg ccgacgccgg gggcagggga    15420
tggcagcagc tcgccaacca ggaaccccgc cgcgatgatg ccgatgccgg tcaaccagcc    15480
cttgaaacta tccggccccg aaacacccct gcgcattgcc tggatgctgc gccggatagc    15540
ttgcaacatc aggagccgtt tcttttgttc gtcagtcatg gtccgccctc accagttgtt    15600
cgtatcggtg tcggacgaac tgaaatcgca agagctgccg gtatcggtcc agccgctgtc    15660
cgtgtcgctg ctgccgaagc acggcgaggg gtccgcgaac gccgcagacg gcgtatccgg    15720
ccgcagcgca tcgcccagca tggccccggt cagcgagccg ccggccaggt agcccagcat    15780
ggtgctgttg gtcgccccgg ccaccagggc cgacgtgacg aaatcgccgt cattccctct    15840
ggattgttcg ctgctcggcg gggcagtgcg ccgcgccggc ggcgtcgtgg atggctcggg    15900
ttggctggcc tgcgacggcc ggcgaaaggt gcgcagcagc tcgttatcga ccggctgcgg    15960
cgtcggggcc gccgccttgc gctgcggtcg gtgttccttc ttcggctcgc gcagcttgaa    16020
cagcatgatc gcggaaacca gcagcaacgc cgcgcctacg cctcccgcga tgtagaacag    16080
catcggattc attcttcggt cctccttgta gcggaaccgt tgtctgtgcg gcgcgggtgg    16140
cccgcgccgc tgtctttggg gatcagccct cgatgagcgc gaccagtttc acgtcggcaa    16200
ggttcgcctc gaactcctgg ccgtcgtcct cgtacttcaa ccaggcatag ccttccgccg    16260
gcggccgacg gttgaggata aggcgggcag ggcgctcgtc gtgctcgacc tggacgatgg    16320
cctttttcag cttgtccggg tccggctcct tcgcgccctt ttccttggcg tccttaccgt    16380
cctggtcgcc gtcctcgccg tcctggccgt cgccggcctc cgcgtcacgc tcggcatcag    16440
tctggccgtt gaaggcatcg acggtgttgg gatcgcggcc cttctcgtcc aggaactcgc    16500
gcagcagctt gaccgtgccg cgcgtgattt cctgggtgtc gtcgtcaagc cacgcctcga    16560
cttcctccgg gcgcttcttg aaggccgtca ccagctcgtt caccacggtc acgtcgcgca    16620
cgcggccggt gttgaacgca tcggcgatct tctccggcag gtccagcagc gtgacgtgct    16680
gggtgatgaa cgccggcgac ttgccgattt ccttggcgat atcgcctttc ttcttgccct    16740
tcgccagctc gcggccaatg aagtcggcaa tttcgcgcgg ggtcagctcg ttgcgttgca    16800
ggttctcgat aacctggtcg gcttcgttgt agtcgttgtc gatgaacgcc gggatggact    16860
tcttgccggc ccacttcgag ccacggtagc ggcgggcgcc gtgattgatg atatagcggc    16920
ccggctgctc ctggttctcg cgcaccgaaa tgggtgactt caccccgcgc tctttgatcg    16980
tggcaccgat ttccgcgatg ctctccgggg aaaagccggg gttgtcggcc gtccgcggct    17040
gatgcggatc ttcgtcgatc aggtccaggt ccagctcgat agggccggaa ccgccctgag    17100
acgccgcagg agcgtccagg aggctcgaca ggtcgccgat gctatccaac cccaggccgg    17160
acggctgcgc cgcgcctgcg gcttcctgag cggccgcagc ggtgtttttc ttggtggtct    17220
tggcttgagc cgcagtcatt gggaaatctc catcttcgtg aacacgtaat cagccagggc    17280
gcgaacctct ttcgatgcct tgcgcgcggc cgttttcttg atcttccaga ccggcacacc    17340
ggatgcgagg gcatcggcga tgctgctgcg caggccaacg gtggccggaa tcatcatctt    17400
ggggtacgcg gccagcagct cggcttggtg gcgcgcgtgg cgcggattcc gcgcatcgac    17460
cttgctgggc accatgccaa ggaattgcag cttggcgttc ttctggcgca cgttcgcaat    17520
ggtcgtgacc atcttcttga tgccctggat gctgtacgcc tcaagctcga tgggggacag    17580
cacatagtcg gccgcgaaga gggcggccgc caggccgacg ccaagggtcg gggccgtgtc    17640
gatcaggcac acgtcgaagc cttggttcgc cagggccttg atgttcgccc cgaacagctc    17700
gcgggcgtcg tccagcgaca gccgttcggc gttcgccagt accgggttgg actcgatgag    17760
ggcgaggcgc gcggcctggc cgtcgccggc tgcgggtgcg gtttcggtcc agccgccggc    17820
agggacagcg ccgaacagct tgcttgcatg caggccggta gcaaagtcct tgagcgtgta    17880
ggacgcattg ccctgggggt ccaggtcgat cacggcaacc cgcaagccgc gctcgaaaaa    17940
gtcgaaggca agatgcacaa gggtcgaagt cttgccgacg ccgcctttct ggttggccgt    18000
gaccaaagtt ttcatcgttt ggtttcctgt tttttcttgg cgtccgcttc ccacttccgg    18060
acgatgtacg cctgatgttc cggcagaacc gccgttaccc gcgcgtaccc ctcgggcaag    18120
ttcttgtcct cgaacgcggc ccacacgcga tgcaccgctt gcgacactgc gcccctggtc    18180
agtcccagcg acgttgcgaa cgtcgcctgt ggcttcccat cgactaagac gccccgcgct    18240
atctcgatgg tctgctgccc cacttccagc ccctggatcg cctcctggaa ctggctttcg    18300
gtaagccgtt tcttcatgga taacacccat aatttgctcc gcgccttggt tgaacatagc    18360
ggtgacagcc gccagcacat gagagaagtt tagctaaaca tttctcgcac gtcaacacct    18420
ttagccgcta aaactcgtcc ttggcgtaac aaaacaaaag cccggaaacc gggctttcgt    18480
ctcttgccgc ttatggctct gcacccggct ccatcaccaa caggtcgcgc acgcgcttca    18540
ctcggttgcg gatcgacact gccagcccaa caaagccggt tgccgccgcc gccaggatcg    18600
cgccgatgat gccggccaca ccggccatcg cccaccaggt cgccgccttc cggttccatt    18660
cctgctggta ctgcttcgca atgctggacc tcggctcacc ataggctgac cgctcgatgg    18720
cgtatgccgc ttctcccctt ggcgtaaaac ccagcgccgc aggcggcatt gccatgctgc    18780
ccgccgcttt cccgaccacg acgcgcgcac caggcttgcg gtccagacct tcggccacgg    18840
cgagctgcgc aaggacataa tcagccgccg acttggctcc acgcgcctcg atcagctctt    18900
gcactcgcgc gaaatccttg gcctccacgg ccgccatgaa tcgcgcacgc ggcgaaggct    18960
ccgcagggcc ggcgtcgtga tcgccgccga gaatgccctt caccaagttc gacgacacga    19020
aaatcatgct gacggctatc accatcatgc agacggatcg cacgaacccg ctgaattgaa    19080
cacgagcacg gcacccgcga ccactatgcc aagaatgccc aaggtaaaaa ttgccggccc    19140
cgccatgaag tccgtgaatg ccccgacggc cgaagtgaag ggcaggccgc cacccaggcc    19200
gccgccctca ctgcccggca cctggtcgct gaatgtcgat gccagcacct gcggcacgtc    19260
aatgcttccg ggcgtcgcgc tcgggctgat cgcccatccc gttactgccc cgatcccggc    19320
aatggcaagg actgccagcg ctgccatttt tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg    19380
cagcccctgg ggggatggga ggcccgcgtt agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg    19440
cacccccctt cggcgtgcgc ggtcacgcgc acagggcgca gccctggtta aaaacaaggt    19500
ttataaatat tggtttaaaa gcaggttaaa agacaggtta gcggtggccg aaaaacgggc    19560
ggaaaccctt gcaaatgctg gattttctgc ctgtggacag cccctcaaat gtcaataggt    19620
gcgcccctca tctgtcagca ctctgcccct caagtgtcaa ggatcgcgcc cctcatctgt    19680
cagtagtcgc gcccctcaag tgtcaatacc gcagggcact tatccccagg cttgtccaca    19740
tcatctgtgg gaaactcgcg taaaatcagg cgttttcgcc gatttgcgag gctggccagc    19800
tccacgtcgc cggccgaaat cgagcctgcc cctcatctgt caacgccgcg ccgggtgagt    19860
cggcccctca agtgtcaacg tccgcccctc atctgtcagt gagggccaag ttttccgcga    19920
ggtatccaca acgccggcgg ccgcggtgtc tcgcacacgg cttcgacggc gtttctggcg    19980
cgtttgcagg gccatagacg gccgccagcc cagcggcgag ggcaaccagc ccggtgagcg    20040
tcggaaaggc gctggaagcc ccgtagcgac gcggagaggg gcgagacaag ccaagggcgc    20100
aggctcgatg cgcagcacga catagccggt tctcgcaagg acgagaattt ccctgcggtg    20160
cccctcaagt gtcaatgaaa gtttccaacg cgagccattc gcgagagcct tgagtccacg    20220
ctagatgaga gctttgttgt aggtggacca gttggtgatt ttgaactttt gctttgccac    20280
ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt gatctgatcc ttcaactcag caaaagttcg    20340
atttattcaa caaagccacg ttgtgtctca aaatctctga tgttacattg cacaagataa    20400
aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt    20460
tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctcgactcta gagctcgttc ctcgaggcct    20520
cgaggcctcg aggaacggta cctgcgggga agcttacaat aatgtgtgtt gttaagtctt    20580
gttgcctgtc atcgtctgac tgactttcgt cataaatccc ggcctccgta acccagcttt    20640
gggcaagctc acggatttga tccggcggaa cgggaatatc gagatgccgg gctgaacgct    20700
gcagttccag ctttcccttt cgggacaggt actccagctg attgattatc tgctgaaggg    20760
tcttggttcc acctcctggc acaatgcgaa tgattacttg agcgcgatcg ggcatccaat    20820
tttctcccgt caggtgcgtg gtcaagtgct acaaggcacc tttcagtaac gagcgaccgt    20880
cgatccgtcg ccgggatacg gacaaaatgg agcgcagtag tccatcgagg gcggcgaaag    20940
cctcgccaaa agcaatacgt tcatctcgca cagcctccag atccgatcga gggtcttcgg    21000
cgtaggcaga tagaagcatg gatacattgc ttgagagtat tccgatggac tgaagtatgg    21060
cttccatctt ttctcgtgtg tctgcatcta tttcgagaaa gcccccgatg cggcgcaccg    21120
caacgcgaat tgccatacta tccgaaagtc ccagcaggcg cgcttgatag gaaaaggttt    21180
catactcggc cgatcgcaga cgggcactca cgaccttgaa cccttcaact ttcagggatc    21240
gatgctggtt gatggtagtc tcactcgacg tggctctggt gtgttttgac atagcttcct    21300
ccaaagaaag cggaaggtct ggatactcca gcacgaaatg tgcccgggta gacggatgga  21360
agtctagccc tgctcaatat gaaatcaaca gtacatttac agtcaatact gaatatactt  21420
gctacatttg caattgtctt ataacgaatg tgaaataaaa atagtgtaac aacgctttta  21480
ctcatcgata atcacaaaaa catttatacg aacaaaaata caaatgcact ccggtttcac  21540
aggataggcg ggatcagaat atgcaacttt tgacgttttg ttctttcaaa gggggtgctg  21600
gcaaaaccac cgcactcatg ggcctttgcg ctgctttggc aaatgacggt aaacgagtgg  21660
ccctctttga tgccgacgaa aaccggcctc tgacgcgatg gagagaaaac gccttacaaa  21720
gcagtactgg gatcctcgct gtgaagtcta ttccgccgac gaaatgcccc ttcttgaagc  21780
agcctatgaa aatgccgagc tcgaaggatt tgattatgcg ttggccgata cgcgtggcgg  21840
ctcgagcgag ctcaacaaca caatcatcgc tagctcaaac ctgcttctga tccccaccat  21900
gctaacgccg ctcgacatcg atgaggcact atctacctac cgctacgtca tcgagctgct  21960
gttgagtgaa aatttggcaa ttcctacagc tgttttgcgc caacgcgtcc cggtcggccg  22020
attgacaaca tcgcaacgca ggatgtcaga gacgctagag agccttccag ttgtaccgtc  22080
tcccatgcat gaaagagatg catttgccgc gatgaaagaa cgcggcatgt tgcatcttac  22140
attactaaac acgggaactg atccgacgat gcgcctcata gagaggaatc ttcggattgc  22200
gatggaggaa gtcgtggtca tttcgaaact gatcagcaaa atcttggagg cttgaagatg  22260
gcaattcgca agcccgcatt gtcggtcggc gaagcacggc ggcttgctgg tgctcgaccc  22320
gagatccacc atcccaaccc gacacttgtt ccccagaagc tggacctcca gcacttgcct  22380
gaaaaagccg acgagaaaga ccagcaacgt gagcctctcg tcgccgatca catttacagt  22440
cccgatcgac aacttaagct aactgtggat gcccttagtc cacctccgtc cccgaaaaag  22500
ctccaggttt ttctttcagc gcgaccgccc gcgcctcaag tgtcgaaaac atatgacaac  22560
ctcgttcggc aatacagtcc ctcgaagtcg ctacaaatga ttttaaggcg cgcgttggac  22620
gatttcgaaa gcatgctggc agatggatca tttcgcgtgg ccccgaaaag ttatccgatc  22680
ccttcaacta cagaaaaatc cgttctcgtt cagacctcac gcatgttccc ggttgcgttg  22740
ctcgaggtcg ctcgaagtca ttttgatccg ttggggttgg agaccgctcg agctttcggc  22800
cacaagctgg ctaccgccgc gctcgcgtca ttctttgctg gagagaagcc atcgagcaat  22860
tggtgaagag ggacctatcg gaacccctca ccaaatattg agtgtaggtt tgaggccgct  22920
ggccgcgtcc tcagtcacct tttgagccag ataattaaga gccaaatgca attggctcag  22980
gctgccatcg tccccccgtg cgaaacctgc acgtccgcgt caaagaaata accggcacct  23040
cttgctgttt ttatcagttg agggcttgac ggatccgcct caagtttgcg gcgcagccgc  23100
aaaatgagaa catctatact cctgtcgtaa acctcctcgt cgcgtactcg actggcaatg  23160
agaagttgct cgcgcgatag aacgtcgcgg ggtttctcta aaaacgcgag gagaagattg  23220
aactcacctg ccgtaagttt cacctcaccg ccagcttcgg acatcaagcg acgttgcctg  23280
agattaagtg tccagtcagt aaaacaaaaa gaccgtcggt ctttggagcg gacaacgttg  23340
gggcgcacgc gcaaggcaac ccgaatgcgt gcaagaaact ctctcgtact aaacggctta  23400
gcgataaaat cacttgctcc tagctcgagt gcaacaactt tatccgtctc ctcaaggcgg  23460
tcgccactga taattatgat tggaatatca gactttgccg ccagatttcg aacgatctca  23520
agcccatctt cacgacctaa atttagatca acaaccacga catcgaccgt cgcggaagag  23580
agtactctag tgaactgggt gctgtcggct accgcggtca ctttgaaggc gtggatcgta  23640
aggtattcga taataagatg ccgcatagcg acatcgtcat cgataagaag aacgtgtttc  23700
aacggctcac ctttcaatct aaaatctgaa cccttgttca cagcgcttga gaaattttca  23760
cgtgaaggat gtacaatcat ctccagctaa atgggcagtt cgtcagaatt gcggctgacc  23820
gcggatgacg aaaatgcgaa ccaagtattt caattttatg acaaaagttc tcaatcgttg  23880
ttacaagtga aacgcttcga ggttacagct actattgatt aaggagatcg cctatggtct  23940
cgccccggcg tcgtgcgtcc gccgcgagcc agatctcgcc tacttcataa acgtcctcat  24000
aggcacggaa tggaatgatg acatcgatcg ccgtagagag catgtcaatc agtgtgcgat  24060
cttccaagct agcaccttgg gcgctacttt tgacaaggga aaacagtttc ttgaatcctt  24120
ggattggatt cgcgccgtgt attgttgaaa tcgatcccgg atgtcccgag acgacttcac  24180
tcagataagc ccatgctgca tcgtcgcgca tctcgccaag caatatccgg tccggccgca  24240
tacgcagact tgcttggagc aagtgctcgg cgctcacagc acccagccca gcaccgttct  24300
tggagtagag tagtctaaca tgattatcgt gtggaatgac gagttcgagc gtatcttcta  24360
tggtgattag cctttcctgg ggggggatgg cgctgatcaa ggtcttgctc attgttgtct  24420
tgccgcttcc ggtagggcca catagcaaca tcgtcagtcg gctgacgacg catgcgtgca  24480
gaaacgcttc caaatccccg ttgtcaaaat gctgaaggat agcttcatca tcctgatttt  24540
ggcgtttcct tcgtgtctgc cactggttcc acctcgaagc atcataacgg gaggagactt  24600
ctttaagacc agaaacacgc gagcttggcc gtcgaatggt caagctgacg gtgcccgagg  24660
gaacggtcgg cggcagacag atttgtagtc gttcaccacc aggaagttca gtggcgcaga  24720
gggggttacg tggtccgaca tcctgctttc tcagcgcgcc cgctaaaata gcgatatctt  24780
caagatcatc ataagagacg ggcaaaggca tcttggtaaa aatgccggct tggcgcacaa  24840
atgcctctcc aggtcgattg atcgcaattt cttcagtctt cgggtcatcg agccattcca  24900
aaatcggctt cagaagaaag cgtagttgcg gatccacttc catttacaat gtatcctatc  24960
tctaagcgga aatttgaatt cattaagagc ggcggttcct cccccgcgtg gcgccgccag  25020
tcaggcggag ctggtaaaca ccaaagaaat cgaggtcccg tgctacgaaa atggaaacgg  25080
tgtcaccctg attcttcttc agggttggcg gtatgttgat ggttgcctta agggctgtct  25140
cagttgtctg ctcaccgtta ttttgaaagc tgttgaagct catcccgcca cccgagctgc  25200
cggcgtaggt gctagctgcc tggaaggcgc cttgaacaac actcaagagc atagctccgc  25260
taaaacgctg ccagaagtgg ctgtcgaccg agcccggcaa tcctgagcga ccgagttcgt  25320
ccgcgcttgg cgatgttaac gagatcatcg catggtcagg tgtctcggcg cgatcccaca  25380
acacaaaaac gcgcccatct ccctgttgca agccacgctg tatttcgcca acaacggtgg  25440
tgccacgatc aagaagcacg atattgttcg ttgttccacg aatatcctga ggcaagacac  25500
actttacata gcctgccaaa tttgtgtcga ttgcggtttg caagatgcac ggaattattg  25560
tcccttgcgt taccataaaa tcggggtgcg gcaagagcgt ggcgctgctg ggctgcagct  25620
cggtgggttt catacgtatc gacaaatcgt tctcgccgga cacttcgcca ttcggcaagg  25680
agttgtcgtc acgcttgcct tcttgtcttc ggcccgtgtc gccctgaatg gcgcgtttgc  25740
tgaccccttg atcgccgctg ctatatgcaa aaatcggtgt ttcttccggc cgtggctcat  25800
gccgctccgg ttcgcccctc ggcggtagag gagcagcagg ctgaacagcc tcttgaaccg  25860
ctggaggatc cggcggcacc tcaatcggag ctggatgaaa tggcttggtg tttgttgcga  25920
tcaaagttga cggcgatgcg ttctcattca ccttcttttg gcgcccacct agccaaatga  25980
ggcttaatga taacgcgaga acgacacctc cgacgatcaa tttctgagac cccgaaagac  26040
gccggcgatg tttgtcggag accagggatc cagatgcatc aacctcatgt gccgcttgct  26100
gactatcgtt attcatccct tcgccccctt caggacgcgt ttcacatcgg gcctcaccgt  26160
gcccgtttgc ggcctttggc caacgggatc gtaagcggtg ttccagatac atagtactgt  26220
gtggccatcc ctcagacgcc aacctcggga aaccgaagaa atctcgacat cgctcccttt  26280
aactgaatag ttggcaacag cttccttgcc atcaggattg atggtgtaga tggagggtat  26340
gcgtacattg cccggaaagt ggaataccgt cgtaaatcca ttgtcgaaga cttcgagtgg  26400
caacagcgaa cgatcgcctt gggcgacgta gtgccaatta ctgtccgccg caccaagggc  26460
tgtgacaggc tgatccaata aattctcagc tttccgttga tattgtgctt ccgcgtgtag  26520
tctgtccaca acagccttct gttgtgcctc ccttcgccga gccgccgcat cgtcggcggg  26580
gtaggcgaat tggacgctgt aatagagatc gggctgctct ttatcgaggt gggacagagt  26640
cttggaactt atactgaaaa cataacggcg catcccggag tcgcttgcgg ttagcacgat  26700
tactggctga ggcgtgagga cctggcttgc cttgaaaaat agataatttc cccgcggtag  26760
ggctgctaga tctttgctat ttgaaacggc aaccgctgtc accgtttcgt tcgtggcgaa  26820
tgttacgacc aaagtagctc caaccgccgt cgagaggcgc accacttgat cgggattgta  26880
agccaaataa cgcatgcgcg gatctagctt gcccgccatt ggagtgtctt cagcctccgc  26940
accagtcgca gcggcaaata aacatgctaa aatgaaaagt gcttttctga tcatggttcg  27000
ctgtggccta cgtttgaaac ggtatcttcc gatgtctgat aggaggtgac aaccagacct  27060
gccgggttgg ttagtctcaa tctgccgggc aagctggtca ccttttcgta gcgaactgtc  27120
gcggtccacg tactcaccac aggcattttg ccgtcaacga cgagggtcct tttatagcga  27180
atttgctgcg tgcttggagt tacatcattt gaagcgatgt gctcgacctc caccctgccg  27240
cgtttgccaa gaatgacttg aggcgaactg ggattgggat agttgaagaa ttgctggtaa  27300
tcctggcgca ctgttggggc actgaagttc gataccaggt cgtaggcgta ctgagcggtg  27360
tcggcatcat aactctcgcg caggcgaacg tactcccaca atgaggcgtt aacgacggcc  27420
tcctcttgag ttgcaggcaa tcgcgagaca gacacctcgc tgtcaacggt gccgtccggc  27480
cgtatccata gatatacggg cacaagcctg ctcaacggca ccattgtggc tatagcgaac  27540
gcttgagcaa catttcccaa aatcgcgata gctgcgacag ctgcaatgag tttggagaga  27600
cgtcgcgccg atttcgctcg cgcggtttga aaggcttcta cttccttata gtgctcggca  27660
aggctttcgc gcgccactag catggcatat tcaggccccg tcatagcgtc cacccgaatt  27720
gccgagctga agatctgacg gagtaggctg ccatcgcccc acattcagcg ggaagatcgg  27780
gcctttgcag ctcgctaatg tgtcgtttgt ctggcagccg ctcaaagcga caactaggca  27840
cagcaggcaa tacttcatag aattctccat tgaggcgaat ttttgcgcga cctagcctcg  27900
ctcaacctga gcgaagcgac ggtacaagct gctggcagat tgggttgcgc cgctccagta  27960
actgcctcca atgttgccgg cgatcgccgg caaagcgaca atgagcgcat cccctgtcag  28020
aaaaaacata tcgagttcgt aaagaccaat gatcttggcc gcggtcgtac cggcgaaggt  28080
gattacacca agcataaggg tgagcgcagt cgcttcggtt aggatgacga tcgttgccac  28140
gaggtttaag aggagaagca agagaccgta ggtgataagt tgcccgatcc acttagctgc  28200
gatgtcccgc gtgcgatcaa aaatatatcc gacgaggatc agaggcccga tcgcgagaag  28260
cactttcgtg agaattccaa cggcgtcgta aactccgaag gcagaccaga gcgtgccgta  28320
aaggacccac tgtgcccctt ggaaagcaag gatgtcctgg tcgttcatcg gaccgatttc  28380
ggatgcgatt ttctgaaaaa cggcctgggt cacggcgaac attgtatcca actgtgccgg  28440
aacagtctgc agaggcaagc cggttacact aaactgctga acaaagtttg ggaccgtctt  28500
ttcgaagatg gaaaccacat agtcttggta gttagcctgc ccaacaatta gagcaacaac  28560
gatggtgacc gtgatcaccc gagtgatacc gctacgggta tcgacttcgc cgcgtatgac  28620
taaaataccc tgaacaataa tccaaagagt gacacaggcg atcaatggcg cactcaccgc  28680
ctcctggata gtctcaagca tcgagtccaa gcctgtcgtg aaggctacat cgaagatcgt  28740
atgaatggcc gtaaacggcg ccggaatcgt gaaattcatc gattggacct gaacttgact  28800
ggtttgtcgc ataatgttgg ataaaatgag ctcgcattcg gcgaggatgc gggcggatga  28860
acaaatcgcc cagccttagg ggagggcacc aaagatgaca gcggtctttt gatgctcctt  28920
gcgttgagcg gccgcctctt ccgcctcgtg aaggccggcc tgcgcggtag tcatcgttaa  28980
taggcttgtc gcctgtacat tttgaatcat tgcgtcatgg atctgcttga gaagcaaacc  29040
attggtcacg gttgcctgca tgatattgcg agatcgggaa agctgagcag acgtatcagc  29100
attcgccgtc aagcgtttgt ccatcgtttc cagattgtca gccgcaatgc cagcgctgtt  29160
tgcggaaccg gtgatctgcg atcgcaacag gtccgcttca gcatcactac ccacgactgc  29220
acgatctgta tcgctggtga tcgcacgtgc cgtggtcgac attggcattc gcggcgaaaa  29280
catttcattg tctaggtcct tcgtcgaagg atactgattt ttctggttga gcgaagtcag  29340
tagtccagta acgccgtagg ccgacgtcaa catcgtaacc atcgctatag tctgagtgag  29400
attctccgca gtcgcgagcg cagtcgcgag cgtctcagcc tccgttgccg ggtcgctaac  29460
aacaaactgc gcccgcgcgg gctgaatata tagaaagctg caggtcaaaa ctgttgcaat  29520
aagttgcgtc gtcttcatcg tttcctacct tatcaatctt ctgcctcgtg gtgacgggcc  29580
atgaattcgc tgagccagcc agatgagttg ccttcttgtg cctcgcgtag tcgagttgca  29640
aagcgcaccg tgttggcacg ccccgaaagc acggcgacat attcacgcat atcccgcaga  29700
tcaaattcgc agatgacgct tccactttct cgtttaagaa gaaacttacg gctgccgacc  29760
gtcatgtctt cacggatcgc ctgaaattcc ttttcggtac atttcagtcc atcgacataa  29820
gccgatcgat ctgcggttgg tgatggatag aaaatcttcg tcatacattg cgcaaccaag  29880
ctggctccta gcggcgattc cagaacatgc tctggttgct gcgttgccag tattagcatc  29940
ccgttgtttt ttcgaacggt caggaggaat ttgtcgacga cagtcgaaaa tttagggttt  30000
aacaaatagg cgcgaaactc atcgcagctc atcacaaaac ggcggccgtc gatcatggct  30060
ccaatccgat gcaggagata tgctgcagcg ggagcgcata cttcctcgta ttcgagaaga  30120
tgcgtcatgt cgaagccggt aatcgacgga tctaacttta cttcgtcaac ttcgccgtca  30180
aatgcccagc caagcgcatg gccccggcac cagcgttgga gccgcgctcc tgcgccttcg  30240
gcgggcccat gcaacaaaaa ttcacgtaac cccgcgattg aacgcatttg tggatcaaac  30300
gagagctgac gatggatacc acggaccaga cggcggttct cttccggaga aatcccaccc  30360
cgaccatcac tctcgatgag agccacgatc cattcgcgca gaaaatcgtg tgaggctgct  30420
gtgttttcta ggccacgcaa cggcgccaac ccgctgggtg tgcctctgtg aagtgccaaa  30480
tatgttcctc ctgtggcgcg aaccagcaat tcgccacccc ggtccttgtc aaagaacacg  30540
accgtacctg cacggtcgac catgctctgt tcgagcatgg ctagaacaaa catcatgagc  30600
gtcgtcttac ccctcccgat aggcccgaat attgccgtca tgccaacatc gtgctcatgc  30660
gggatatagt cgaaaggcgt tccgccattg gtacgaaatc gggcaatcgc gttgccccag  30720
tggcctgagc tggcgccctc tggaaagttt tcgaaagaga caaaccctgc gaaattgcgt  30780
gaagtgattg cgccagggcg tgtgcgccac ttaaaattcc ccggcaattg ggaccaatag  30840
gccgcttcca taccaatacc ttcttggaca accacggcac ctgcatccgc cattcgtgtc  30900
cgagcccgcg cgcccctgtc cccaagacta ttgagatcgt ctgcatagac gcaaaggctc  30960
aaatgatgtg agcccataac gaattcgttg ctcgcaagtg cgtcctcagc ctcggataat  31020
ttgccgattt gagtcacggc tttatcgccg gaactcagca tctggctcga tttgaggcta  31080
agtttcgcgt gcgcttgcgg gcgagtcagg aacgaaaaac tctgcgtgag aacaagtgga  31140
aaatcgaggg atagcagcgc gttgagcatg cccggccgtg tttttgcagg gtattcgcga  31200
aacgaataga tggatccaac gtaactgtct tttggcgttc tgatctcgag tcctcgcttg  31260
ccgcaaatga ctctgtcggt ataaatcgaa gcgccgagtg agccgctgac gaccggaacc  31320
ggtgtgaacc gaccagtcat gatcaaccgt agcgcttcgc caatttcggt gaagagcaca  31380
ccctgcttct cgcggatgcc aagacgatgc aggccatacg ctttaagaga gccagcgaca  31440
acatgccaaa gatcttccat gttcctgatc tggcccgtga gatcgttttc cctttttccg  31500
cttagcttgg tgaacctcct ctttaccttc cctaaagccg cctgtgggta gacaatcaac  31560
gtaaggaagt gttcattgcg gaggagttgg ccggagagca cgcgctgttc aaaagcttcg  31620
ttcaggctag cggcgaaaac actacggaag tgtcgcggcg ccgatgatgg cacgtcggca  31680
tgacgtacga ggtgagcata tattgacaca tgatcatcag cgatattgcg caacagcgtg  31740
ttgaacgcac gacaacgcgc attgcgcatt tcagtttcct caagctcgaa tgcaacgcca  31800
tcaattctcg caatggtcat gatcgatccg tcttcaagaa ggacgatatg gtcgctgagg  31860
tggccaatat aagggagata gatctcaccg gatctttcgg tcgttccact cgcgccgagc  31920
atcacaccat tcctctccct cgtgggggaa ccctaattgg atttgggcta acagtagcgc  31980
ccccccaaac tgcactatca atgcttcttc ccgcggtccg caaaaatagc aggacgacgc  32040
tcgccgcatt gtagtctcgc tccacgatga gccgggctgc aaaccataac ggcacgagaa  32100
cgacttcgta gagcgggttc tgaacgataa cgatgacaaa gccggcgaac atcatgaata  32160
accctgccaa tgtcagtggc accccaagaa acaatgcggg ccgtgtggct gcgaggtaaa  32220
gggtcgattc ttccaaacga tcagccatca actaccgcca gtgagcgttt ggccgaggaa  32280
gctcgcccca aacatgataa caatgccgcc gacgacgccg gcaaccagcc caagcgaagc  32340
ccgcccgaac atccaggaga tcccgatagc gacaatgccg agaacagcga gtgactggcc  32400
gaacggacca aggataaacg tgcatatatt gttaaccatt gtggcggggt cagtgccgcc  32460
acccgcagat tgcgctgcgg cgggtccgga tgaggaaatg ctccatgcaa ttgcaccgca  32520
caagcttggg gcgcagctcg atatcacgcg catcatcgca ttcgagagcg agaggcgatt  32580
tagatgtaaa cggtatctct caaagcatcg catcaatgcg cacctcctta gtataagtcg  32640
aataagactt gattgtcgtc tgcggatttg ccgttgtcct ggtgtggcgg tggcggagcg  32700
attaaaccgc cagcgccatc ctcctgcgag cggcgctgat atgaccccca aacatcccac  32760
gtctcttcgg attttagcgc ctcgtgatcg tcttttggag gctcgattaa cgcgggcacc  32820
agcgattgag cagctgtttc aacttttcgc acgtagccgt ttgcaaaacc gccgatgaaa  32880
ttaccggtgt tgtaagcgga gatcgcccga cgaagcgcaa attgcttctc gtcaatcgtt  32940
tcgccgcctg cataacgact tttcagcatg tttgcagcgg cagataatga tgtgcacgcc  33000
tggagcgcac cgtcaggtgt cagaccgagc atagaaaaat ttcgagagtt tatttgcatg  33060
aggccaacat ccagcgaatg ccgtgcatcg agacggtgcc tgacgacttg ggttgcttgg  33120
ctgtgatctt gccagtgaag cgtttcgccg gtcgtgttgt catgaatcgc taaaggatca  33180
aagcgactct ccaccttagc tatcgccgca agcgtagatg tcgcaactga tggggcacac  33240
ttgcgagcaa catggtcaaa ctcagcagat gagagtggcg tggcaaggct cgacgaacag  33300
aaggagacca tcaaggcaag agaaagcgac cccgatctct taagcatacc ttatctcctt  33360
agctcgcaac taacaccgcc tctcccgttg gaagaagtgc gttgttttat gttgaagatt  33420
atcgggaggg tcggttactc gaaaattttc aattgcttct ttatgatttc aattgaagcg  33480
agaaacctcg cccggcgtct tggaacgcaa catggaccga gaaccgcgca tccatgacta  33540
agcaaccgga tcgacctatt caggccgcag ttggtcaggt caggctcaga acgaaaatgc  33600
tcggcgaggt tacgctgtct gtaaacccat tcgatgaacg ggaagcttcc ttccgattgc  33660
tcttggcagg aatattggcc catgcctgct tgcgctttgc aaatgctctt atcgcgttgg  33720
tatcatatgc cttgtccgcc agcagaaacg cactctaagc gattatttgt aaaaatgttt  33780
cggtcatgcg gcggtcatgg gcttgacccg ctgtcagcgc aagacggatc ggtcaaccgt  33840
cggcatcgac aacagcgtga atcttggtgg tcaaaccgcc acgggaacgt cccatacagc  33900
catcgtcttg atcccgctgt ttcccgtcgc cgcatgttgg tggacgcgga cacaggaact  33960
gtcaatcatg acgacattct atcgaaagcc ttggaaatca cactcagaat atgatcccag  34020
acgtctgcct cacgccatcg tacaaagcga ttgtagcagg ttgtacagga accgtatcga  34080
tcaggaacgt ctgcccaggg cgggcccgtc cggaagcgcc acaagatgac attgatcacc  34140
cgcgtcaacg cgcggcacgc gacgcggctt atttgggaac aaaggactga acaacagtcc  34200
attcgaaatc ggtgacatca aagcggggac gggttatcag tggcctccaa gtcaagcctc  34260
aatgaatcaa aatcagaccg atttgcaaac ctgatttatg agtgtgcggc ctaaatgatg  34320
aaatcgtcct tctagatcgc ctccgtggtg tagcaacacc tcgcagtatc gccgtgctga  34380
ccttggccag ggaattgact ggcaagggtg ctttcacatg accgctcttt tggccgcgat  34440
agatgatttc gttgctgctt tgggcacgta gaaggagaga agtcatatcg gagaaattcc  34500
tcctggcgcg agagcctgct ctatcgcgac ggcatcccac tgtcgggaac agaccggatc  34560
attcacgagg cgaaagtcgt caacacatgc gttataggca tcttcccttg aaggatgatc  34620
ttgttgctgc caatctggag gtgcggcagc cgcaggcaga tgcgatctca gcgcaacttg  34680
cggcaaaaca tctcactcac ctgaaaacca ctagcgagtc tcgcgatcag acgaaggcct  34740
tttacttaac gacacaatat ccgatgtctg catcacaggc gtcgctatcc cagtcaatac  34800
taaagcggtg caggaactaa agattactga tgacttaggc gtgccacgag gcctgagacg  34860
acgcgcgtag acagtttttt gaaatcatta tcaaagtgat ggcctccgct gaagcctatc  34920
acctctgcgc cggtctgtcg gagagatggg caagcattat tacggtcttc gcgcccgtac  34980
atgcattgga cgattgcagg gtcaatggat ctgagatcat ccagaggatt gccgccctta  35040
ccttccgttt cgagttggag ccagccccta aatgagacga catagtcgac ttgatgtgac  35100
aatgccaaga gagagatttg cttaacccga tttttttgct caagcgtaag cctattgaag  35160
cttgccggca tgacgtccgc gccgaaagaa tatcctacaa gtaaaacatt ctgcacaccg  35220
aaatgcttgg tgtagacatc gattatgtga ccaagatcct tagcagtttc gcttggggac  35280
cgctccgacc agaaataccg aagtgaactg acgccaatga caggaatccc ttccgtctgc  35340
agataggtac catcgataga tctgctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct  35400
ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag  35460
acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca  35520
gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta  35580
ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc  35640
atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg  35700
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac  35760
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg  35820
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca  35880
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc  35940
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc  36000
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag  36060
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc  36120
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca  36180
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg  36240
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg  36300
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct  36360
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa  36420
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa  36480
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa  36540
tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc  36600
ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga  36660
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca  36720
atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc  36780
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat  36840
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc  36900
attgctgcag gggggggggg ggggggggac ttccattgtt cattccacgg acaaaaacag  36960
agaaaggaaa cgacagaggc caaaaagcct cgctttcagc acctgtcgtt tcctttcttt  37020
tcagagggta ttttaaataa aaacattaag ttatgacgaa gaagaacgga aacgccttaa  37080
accggaaaat tttcataaat agcgaaaacc cgcgaggtcg ccgccccgta acctgtcgga  37140
tcaccggaaa ggacccgtaa agtgataatg attatcatct acatatcaca acgtgcgtgg  37200
aggccatcaa accacgtcaa ataatcaatt atgacgcagg tatcgtatta attgatctgc  37260
atcaacttaa cgtaaaaaca acttcagaca atacaaatca gcgacactga atacggggca  37320
acctcatgtc cccccccccc ccccccctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg  37380
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt  37440
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc  37500
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt  37560
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg  37620
gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac  37680
tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc  37740
gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt  37800
tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg  37860
aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag  37920
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa  37980
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat  38040
tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga  38100
attggtcgac gatcttgctg cgttcggata ttttcgtgga gttcccgcca cagacccgga  38160
ttgaaggcga gatccagcaa ctcgcgccag atcatcctgt gacggaactt tggcgcgtga  38220
tgactggcca ggacgtcggc cgaaagagcg acaagcagat cacgcttttc gacagcgtcg  38280
gatttgcgat cgaggatttt tcggcgctgc gctacgtccg cgaccgcgtt gagggatcaa  38340
gccacagcag cccactcgac cttctagccg acccagacga gccaagggat ctttttggaa  38400
tgctgctccg tcgtcaggct ttccgacgtt tgggtggttg aacagaagtc attatcgtac  38460
ggaatgccaa gcactcccga ggggaaccct gtggttggca tgcacataca aatggacgaa  38520
cggataaacc ttttcacgcc cttttaaata tccgttattc taataaacgc tcttttctct  38580
taggtttacc cgccaatata tcctgtcaaa cactgatagt ttaaactgaa ggcgggaaac  38640
gacaatctga tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt atgacccccg ccgatgacgc  38700
gggacaagcc gttttacgtt tggaactgac agaaccgcaa cgttgaagga gccactcagc  38760
aagctggtac gattgtaata cgactcacta tagggcgaat tgagcgctgt ttaaacgctc  38820
ttcaactgga agagcggtta cccggaccga agcttgaagt tcctattccg aagttcctat  38880
tctctagaaa gtataggaac ttcagatctc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc  38940
tgcaggtcga ctctagagga tccaccatga gcccagaacg acgcccggcc gacatccgcc  39000
gtgccaccga ggcggacatg ccggcggtct gcaccatcgt caaccactac atcgagacaa  39060
gcacggtcaa cttccgtacc gagccgcagg aaccgcagga ctggacggac gacctcgtcc  39120
gtctgcggga gcgctatccc tggctcgtcg ccgaggtgga cggcgaggtc gccggcatcg  39180
cctacgcggg cccctggaag gcacgcaacg cctacgactg gacggccgag tcgaccgtgt  39240
acgtctcccc ccgccaccag cggacgggac tgggctccac gctctacacc cacctgctga  39300
agtccctgga ggcacagggc ttcaagagcg tggtcgctgt catcgggctg cccaacgacc  39360
cgagcgtgcg catgcacgag gcgctcggat atgccccccg cggcatgctg cgggcggccg  39420
gcttcaagca cgggaactgg catgacgtgg gtttctggca gctggacttc agcctgccgg  39480
taccgccccg tccggtcctg cccgtcaccg agatctgatc cgtcgaccaa cctagacttg  39540
tccatcttct ggattggcca acttaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc acacatagtg  39600
acatgctaat cactataatg tgggcatcaa agttgtgtgt tatgtgtaat tactagttat  39660
ctgaataaaa gagaaagaga tcatccatat ttcttatcct aaatgaatgt cacgtgtctt  39720
tataattctt tgatgaacca gatgcatttc attaaccaaa tccatataca tataaatatt  39780
aatcatatat aattaatatc aattgggtta gcaaaacaaa tctagtctag gtgtgttttg  39840
cgaattgcgg ccgcgatctg gggaattccc atggacaccg gtaattccca tgatcttctc  39900
tccttcatca atggatgcca tgtttcataa caataacacc aaatgtttga tgagctacca  39960
acaattgcgc aaagactatg gctaagctcg agctcgctcg ctacaagttg ttgactttca  40020
aatacaagtt tgtttttgga acaccaaata ttctacatga tctttcacta agttgcgcac  40080
cactatcaaa agattatcta ggccattatt caagtaaaga gtgaacacgt ctaagaccca  40140
caaccacacc aaatagaata cgcatacatg caacatattg tgcaagaagt atccaactgg  40200
actcccatgt attctaaaac tattttcgta gagttaaagt tatgacaaac ttatcaaata  40260
aaaatttgaa cgctggacca aaactttcat ctttcaaatc caccatcgtc tatcctcata  40320
aattgttttg attataacac atctacgtaa atcatttgtt ttgaacaata ctaatttaat  40380
tttattaagt caaataacct gcttagaaaa taatccctcc acctcattta acaatttctt  40440
gtcaaacaca caccaagaaa aaaattaatg aaagagaaaa gaaatgaaaa ggacatggag  40500
ttgaatacta gcaaaattga ttgaaggaag attcacaatt gaaattgaaa ccatttaatt  40560
tattttcggg tccataataa taaattggta agaataaaaa cccgatcaag tccggtacag  40620
tacaattcca ctccaccaac tccttactta aacccctatt tatacccact ctcatcctca  40680
ctcttccttc acctctcaca ctctcttctc tctctcaaaa ccctcacaca aacgctgcgt  40740
ttagtgtaag aaattcaatc cggcgccttg gcgcgccgat catccacaag tttgtacaaa  40800
aaagctgaac gagaaacgta aaatgatata aatatcaata tattaaatta gattttgcat  40860
aaaaaacaga ctacataata ctgtaaaaca caacatatcc agtcactatg gcggccgcat  40920
taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta taatgtgtgg attttgagtt  40980
aggatttaaa tacgcgttga tccggcttac taaaagccag ataacagtat gcgtatttgc  41040
gcgctgattt ttgcggtata agaatatata ctgatatgta tacccgaagt atgtcaaaaa  41100
gaggtatgct atgaagcagc gtattacagt gacagttgac agcgacagct atcagttgct  41160
caaggcatat atgatgtcaa tatctccggt ctggtaagca caaccatgca gaatgaagcc  41220
cgtcgtctgc gtgccgaacg ctggaaagcg gaaaatcagg aagggatggc tgaggtcgcc  41280
cggtttattg aaatgaacgg ctcttttgct gacgagaaca ggggctggtg aaatgcagtt  41340
taaggtttac acctataaaa gagagagccg ttatcgtctg tttgtggatg tacagagtga  41400
tatcattgac acgcccggtc gacggatggt gatccccctg gccagtgcac gtctgctgtc  41460
agataaagtc tcccgtgaac tttacccggt ggtgcatatc ggggatgaaa gctggcgcat  41520
gatgaccacc gatatggcca gtgtgccggt ctccgttatc ggggaagaag tggctgatct  41580
cagccaccgc gaaaatgaca tcaaaaacgc cattaacctg atgttctggg gaatataaat  41640
gtcaggctcc cttatacaca gccagtctgc aggtcgacca tagtgactgg atatgttgtg  41700
ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta  41760
tatcatttta cgtttctcgt tcagctttct tgtacaaagt ggtgttaacc tagacttgtc  41820
catcttctgg attggccaac ttaattaatg tatgaaataa aaggatgcac acatagtgac  41880
atgctaatca ctataatgtg ggcatcaaag ttgtgtgtta tgtgtaatta ctagttatct  41940
gaataaaaga gaaagagatc atccatattt cttatcctaa atgaatgtca cgtgtcttta  42000
taattctttg atgaaccaga tgcatttcat taaccaaatc catatacata taaatattaa  42060
tcatatataa ttaatatcaa ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt gtgttttgcg  42120
aattgcggcc gccaccgcgg tggagctcga attccggtcc gggtcacctt tgtccaccaa  42180
gatggaactg cggccgctca ttaattaagt caggcgcgcc tctagttgaa gacacgttca  42240
tgtcttcatc gtaagaagac actcagtagt cttcggccag aatggccatc tggattcagc  42300
aggcctagaa ggccatttaa atcctgagga tctggtcttc ctaaggaccc gggatatcgg  42360
accgattaaa ctttaattcg gtccgaagct tgaagttcct attccgaagt tcctattctc  42420
cagaaagtat aggaacttcg catgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct  42480
agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac  42540
acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat  42600
aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt  42660
tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt  42720
ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc  42780
cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt  42840
tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta  42900
gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa  42960
caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata  43020
atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc  43080
gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct  43140
ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg  43200
cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc  43260
agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata  43320
aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca  43380
cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg  43440
tcctcccccc cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat gcatggttag  43500
ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt  43560
gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt  43620
gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga  43680
tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa  43740
tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg  43800
atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc  43860
tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat  43920
tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac  43980
tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc  44040
ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat  44100
taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg  44160
gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg  44220
atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa  44280
caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc  44340
tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct  44400
tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca ggtcgacttt aacttagcct  44460
aggatccaca cgacaccatg atagaggtga aaccgattaa cgcagaggat acctatgaac  44520
taaggcatag aatactcaga ccaaaccagc cgatagaagc gtgtatgttt gaaagcgatt  44580
tacttcgtgg tgcatttcac ttaggcggct attacggggg caaactgatt tccatagctt  44640
cattccacca ggccgagcac tcagaactcc aaggccagaa acagtaccag ctccgaggta  44700
tggctacctt ggaaggttat cgtgagcaga aggcgggatc gagtctaatt aaacacgctg  44760
aagaaattct tcgtaagagg ggggcggact tgctttggtg taatgcgcgg acatccgcct  44820
caggctacta caaaaagtta ggcttcagcg agcagggaga ggtattcgac acgccgccag  44880
taggacctca catcctgatg tataaaagga tcacataact agctagtcag ttaacctaga  44940
cttgtccatc ttctggattg gccaacttaa ttaatgtatg aaataaaagg atgcacacat  45000
agtgacatgc taatcactat aatgtgggca tcaaagttgt gtgttatgtg taattactag  45060
ttatctgaat aaaagagaaa gagatcatcc atatttctta tcctaaatga atgtcacgtg  45120
tctttataat tctttgatga accagatgca tttcattaac caaatccata tacatataaa  45180
tattaatcat atataattaa tatcaattgg gttagcaaaa caaatctagt ctaggtgtgt  45240
tttgcgaatt cagagctcga attcattccg attaatcgtg gcctcttgct cttcaggatg  45300
aagagctatg tttaaacgtg caagcgctac tagacaattc agtacattaa aaacgtccgc  45360
aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca  45420
gccagccaac agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc  45480
ccatcagtcc gggacggcgt cagcgggaga gccgttgtaa ggcggcagac tttgctcatg  45540
ttaccgatgc tattcggaag aacggcaact aagctgccgg gtttgaaaca cggatgatct  45600
cgcggagggt agcatgttga ttgtaacgat gacagagcgt tgctgcctgt gatcaaatat  45660
catctccctc gcagagatcc gaattatcag ccttcttatt catttctcgc ttaaccgtga  45720
caggctgtcg atcttgagaa ctatgccgac ataataggaa atcgctggat aaagccgctg  45780
aggaagctga gtggcgctat ttctttagaa gtgaacgttg acgatcgtcg accgtacccc  45840
gatgaattaa ttcggacgta cgttctgaac acagctggat acttacttgg gcgattgtca  45900
tacatgacat caacaatgta cccgtttgtg taaccgtctc ttggaggttc gtatgacact  45960
agtggttccc ctcagcttgc gactagatgt tgaggcctaa cattttatta gagagcaggc  46020
tagttgctta gatacatgat cttcaggccg ttatctgtca gggcaagcga aaattggcca  46080
tttatgacga ccaatgcccc gcagaagctc ccatctttgc cgccatagac gccgcgcccc  46140
ccttttgggg tgtagaacat ccttttgcca gatgtggaaa agaagttcgt tgtcccattg  46200
ttggcaatga cgtagtagcc ggcgaaagtg cgagacccat ttgcgctata tataagccta  46260
cgatttccgt tgcgactatt gtcgtaattg gatgaactat tatcgtagtt gctctcagag  46320
ttgtcgtaat ttgatggact attgtcgtaa ttgcttatgg agttgtcgta gttgcttgga  46380
gaaatgtcgt agttggatgg ggagtagtca tagggaagac gagcttcatc cactaaaaca  46440
attggcaggt cagcaagtgc ctgccccgat gccatcgcaa gtacgaggct tagaaccacc  46500
ttcaacagat cgcgcatagt cttccccagc tctctaacgc ttgagttaag ccgcgccgcg  46560
aagcggcgtc ggcttgaacg aattgttaga cattatttgc cgactacctt ggtgatctcg  46620
cctttcacgt agtgaacaaa ttcttccaac tgatctgcgc gcgaggccaa gcgatcttct  46680
tgtccaagat aagcctgcct agcttcaagt atgacgggct gatactgggc cggcaggcgc  46740
tccattgccc agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt tgccggttac tgcgctgtac  46800
caaatgcggg acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc cagcccagtc gggcggcgag  46860
ttccatagcg ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat cctgttcagg aaccggatca  46920
aagagttcct ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat gttctcttgc ttttgtcagc  46980
aagatagcca gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga tacctgcaag aatgtcattg  47040
cgctgccatt ctccaaattg cagttcgcgc ttagctggat aacgccacgg aatgatgtcg  47100
tcgtgcacaa caatggtgac ttctacagcg cggagaatct cgctctctcc aggggaagcc  47160
gaagtttcca aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg tttcatcaag ccttacagtc  47220
accgtaacca gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc cgccatccac tgcggagccg  47280
tacaaatgta cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct cgatgacgcc aactacctct  47340
gatagttgag tcgatacttc ggcgatcacc gcttccctca tgatgtttaa ctcctgaatt  47400
aagccgcgcc gcgaagcggt gtcggcttga atgaattgtt aggcgtcatc ctgtgctccc  47460
gagaaccagt accagtacat cgctgtttcg ttcgagactt gaggtctagt tttatacgtg  47520
aacaggtcaa tgccgccgag agtaaagcca cattttgcgt acaaattgca ggcaggtaca  47580
ttgttcgttt gtgtctctaa tcgtatgcca aggagctgtc tgcttagtgc ccactttttc  47640
gcaaattcga tgagactgtg cgcgactcct ttgcctcggt gcgtgtgcga cacaacaatg  47700
tgttcgatag aggctagatc gttccatgtt gagttgagtt caatcttccc gacaagctct  47760
tggtcgatga atgcgccata gcaagcagag tcttcatcag agtcatcatc cgagatgtaa  47820
tccttccggt aggggctcac acttctggta gatagttcaa agccttggtc ggataggtgc  47880
acatcgaaca cttcacgaac aatgaaatgg ttctcagcat ccaatgtttc cgccacctgc  47940
tcagggatca ccgaaatctt catatgacgc ctaacgcctg gcacagcgga tcgcaaacct  48000
ggcgcggctt ttggcacaaa aggcgtgaca ggtttgcgaa tccgttgctg ccacttgtta  48060
acccttttgc cagatttggt aactataatt tatgttagag gcgaagtctt gggtaaaaac  48120
tggcctaaaa ttgctgggga tttcaggaaa gtaaacatca ccttccggct cgatgtctat  48180
tgtagatata tgtagtgtat ctacttgatc gggggatctg ctgcctcgcg cgtttcggtg  48240
atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag  48300
cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg  48360
gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc  48420
atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt  48480
aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc  48540
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac  48600
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa  48660
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 48720
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 48780
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 48840
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 48900
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 48960
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 49020
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 49080
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 49140
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 49200
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 49260
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 49320
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 49380
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 49440
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 49500
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 49560
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 49620
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 49680
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 49740
gcgcaacgtt gttgccattg ctgca                                       49765
 
<210>44
<211>12856
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>载体
<400>44
cgccttggcg cgccgatcat ccacaagttt gtacaaaaaa gctgaacgag aaacgtaaaa     60
tgatataaat atcaatatat taaattagat tttgcataaa aaacagacta cataatactg    120
taaaacacaa catatccagt cactatggcg gccgcattag gcaccccagg ctttacactt    180
tatgcttccg gctcgtataa tgtgtggatt ttgagttagg atttaaatac gcgttgatcc    240
ggcttactaa aagccagata acagtatgcg tatttgcgcg ctgatttttg cggtataaga    300
atatatactg atatgtatac ccgaagtatg tcaaaaagag gtatgctatg aagcagcgta    360
ttacagtgac agttgacagc gacagctatc agttgctcaa ggcatatatg atgtcaatat    420
ctccggtctg gtaagcacaa ccatgcagaa tgaagcccgt cgtctgcgtg ccgaacgctg    480
gaaagcggaa aatcaggaag ggatggctga ggtcgcccgg tttattgaaa tgaacggctc    540
ttttgctgac gagaacaggg gctggtgaaa tgcagtttaa ggtttacacc tataaaagag    600
agagccgtta tcgtctgttt gtggatgtac agagtgatat cattgacacg cccggtcgac    660
ggatggtgat ccccctggcc agtgcacgtc tgctgtcaga taaagtctcc cgtgaacttt    720
acccggtggt gcatatcggg gatgaaagct ggcgcatgat gaccaccgat atggccagtg    780
tgccggtctc cgttatcggg gaagaagtgg ctgatctcag ccaccgcgaa aatgacatca    840
aaaacgccat taacctgatg ttctggggaa tataaatgtc aggctccctt atacacagcc    900
agtctgcagg tcgaccatag tgactggata tgttgtgttt tacagtatta tgtagtctgt    960
tttttatgca aaatctaatt taatatattg atatttatat cattttacgt ttctcgttca   1020
gctttcttgt acaaagtggt gttaacctag acttgtccat cttctggatt ggccaactta   1080
attaatgtat gaaataaaag gatgcacaca tagtgacatg ctaatcacta taatgtgggc   1140
atcaaagttg tgtgttatgt gtaattacta gttatctgaa taaaagagaa agagatcatc   1200
catatttctt atcctaaatg aatgtcacgt gtctttataa ttctttgatg aaccagatgc   1260
atttcattaa ccaaatccat atacatataa atattaatca tatataatta atatcaattg   1320
ggttagcaaa acaaatctag tctaggtgtg ttttgcgaat tgcggccgcc accgcggtgg   1380
agctcgaatt ccggtccggg tcacctttgt ccaccaagat ggaactgcgg ccgctcatta   1440
attaagtcag gcgcgcctct agttgaagac acgttcatgt cttcatcgta agaagacact    1500
cagtagtctt cggccagaat ggccatctgg attcagcagg cctagaaggc catttaaatc    1560
ctgaggatct ggtcttccta aggacccggg atatcggacc gattaaactt taattcggtc    1620
cgaagcttga agttcctatt ccgaagttcc tattctccag aaagtatagg aacttcgcat    1680
gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc    1740
taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc    1800
tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat    1860
aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt    1920
gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt    1980
ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta    2040
gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt    2100
ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga    2160
tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa    2220
aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc    2280
gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca    2340
gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt    2400
ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc    2460
acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat tcctttccca    2520
ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc tccacaccct    2580
ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct cccccaaatc    2640
cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc ccctctctac    2700
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatgca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt    2760
catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat    2820
gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat    2880
cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt    2940
tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc    3000
gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt    3060
cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat    3120
ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc    3180
gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt    3240
ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg    3300
gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt    3360
gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta    3420
tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca    3480
tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt    3540
gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct    3600
gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt    3660
ttggtgttac ttctgcaggt cgactttaac ttagcctagg atccacacga caccatgata    3720
gaggtgaaac cgattaacgc agaggatacc tatgaactaa ggcatagaat actcagacca    3780
aaccagccga tagaagcgtg tatgtttgaa agcgatttac ttcgtggtgc atttcactta    3840
ggcggctatt acgggggcaa actgatttcc atagcttcat tccaccaggc cgagcactca    3900
gaactccaag gccagaaaca gtaccagctc cgaggtatgg ctaccttgga aggttatcgt    3960
gagcagaagg cgggatcgag tctaattaaa cacgctgaag aaattcttcg taagaggggg    4020
gcggacttgc tttggtgtaa tgcgcggaca tccgcctcag gctactacaa aaagttaggc    4080
ttcagcgagc agggagaggt attcgacacg ccgccagtag gacctcacat cctgatgtat    4140
aaaaggatca cataactagc tagtcagtta acctagactt gtccatcttc tggattggcc    4200
aacttaatta atgtatgaaa taaaaggatg cacacatagt gacatgctaa tcactataat    4260
gtgggcatca aagttgtgtg ttatgtgtaa ttactagtta tctgaataaa agagaaagag    4320
atcatccata tttcttatcc taaatgaatg tcacgtgtct ttataattct ttgatgaacc    4380
agatgcattt cattaaccaa atccatatac atataaatat taatcatata taattaatat    4440
caattgggtt agcaaaacaa atctagtcta ggtgtgtttt gcgaattcag agctcgaatt    4500
cattccgatt aatcgtggcc tcttgctctt caggatgaag agctatgttt aaacgtgcaa    4560
gcgctactag acaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat gtgttattaa gttgtctaag    4620
cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc agccaacagc tccccgaccg    4680
gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac aggcagccca tcagtccggg acggcgtcag    4740
cgggagagcc gttgtaaggc ggcagacttt gctcatgtta ccgatgctat tcggaagaac    4800
ggcaactaag ctgccgggtt tgaaacacgg atgatctcgc ggagggtagc atgttgattg    4860
taacgatgac agagcgttgc tgcctgtgat caaatatcat ctccctcgca gagatccgaa    4920
ttatcagcct tcttattcat ttctcgctta accgtgacag gctgtcgatc ttgagaacta    4980
tgccgacata ataggaaatc gctggataaa gccgctgagg aagctgagtg gcgctatttc    5040
tttagaagtg aacgttgacg atcgtcgacc gtaccccgat gaattaattc ggacgtacgt    5100
tctgaacaca gctggatact tacttgggcg attgtcatac atgacatcaa caatgtaccc    5160
gtttgtgtaa ccgtctcttg gaggttcgta tgacactagt ggttcccctc agcttgcgac    5220
tagatgttga ggcctaacat tttattagag agcaggctag ttgcttagat acatgatctt    5280
caggccgtta tctgtcaggg caagcgaaaa ttggccattt atgacgacca atgccccgca    5340
gaagctccca tctttgccgc catagacgcc gcgcccccct tttggggtgt agaacatcct    5400
tttgccagat gtggaaaaga agttcgttgt cccattgttg gcaatgacgt agtagccggc    5460
gaaagtgcga gacccatttg cgctatatat aagcctacga tttccgttgc gactattgtc    5520
gtaattggat gaactattat cgtagttgct ctcagagttg tcgtaatttg atggactatt    5580
gtcgtaattg cttatggagt tgtcgtagtt gcttggagaa atgtcgtagt tggatgggga    5640
gtagtcatag ggaagacgag cttcatccac taaaacaatt ggcaggtcag caagtgcctg    5700
ccccgatgcc atcgcaagta cgaggcttag aaccaccttc aacagatcgc gcatagtctt    5760
ccccagctct ctaacgcttg agttaagccg cgccgcgaag cggcgtcggc ttgaacgaat    5820
tgttagacat tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt gaacaaattc    5880
ttccaactga tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttgt ccaagataag cctgcctagc    5940
ttcaagtatg acgggctgat actgggccgg caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac    6000
atccttcggc gcgattttgc cggttactgc gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac    6060
tacatttcgc tcatcgccag cccagtcggg cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt    6120
tagcgcctca aatagatcct gttcaggaac cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc    6180
taccaaggca acgctatgtt ctcttgcttt tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat    6240
cgtggctggc tcgaagatac ctgcaagaat gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag    6300
ttcgcgctta gctggataac gccacggaat gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc    6360
tacagcgcgg agaatctcgc tctctccagg ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat    6420
caaagctcgc cgcgttgttt catcaagcct tacagtcacc gtaaccagca aatcaatatc    6480
actgtgtggc ttcaggccgc catccactgc ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt    6540
cggttcgaga tggcgctcga tgacgccaac tacctctgat agttgagtcg atacttcggc    6600
gatcaccgct tccctcatga tgtttaactc ctgaattaag ccgcgccgcg aagcggtgtc    6660
ggcttgaatg aattgttagg cgtcatcctg tgctcccgag aaccagtacc agtacatcgc    6720
tgtttcgttc gagacttgag gtctagtttt atacgtgaac aggtcaatgc cgccgagagt    6780
aaagccacat tttgcgtaca aattgcaggc aggtacattg ttcgtttgtg tctctaatcg    6840
tatgccaagg agctgtctgc ttagtgccca ctttttcgca aattcgatga gactgtgcgc    6900
gactcctttg cctcggtgcg tgtgcgacac aacaatgtgt tcgatagagg ctagatcgtt    6960
ccatgttgag ttgagttcaa tcttcccgac aagctcttgg tcgatgaatg cgccatagca    7020
agcagagtct tcatcagagt catcatccga gatgtaatcc ttccggtagg ggctcacact    7080
tctggtagat agttcaaagc cttggtcgga taggtgcaca tcgaacactt cacgaacaat    7140
gaaatggttc tcagcatcca atgtttccgc cacctgctca gggatcaccg aaatcttcat    7200
atgacgccta acgcctggca cagcggatcg caaacctggc gcggcttttg gcacaaaagg    7260
cgtgacaggt ttgcgaatcc gttgctgcca cttgttaacc cttttgccag atttggtaac    7320
tataatttat gttagaggcg aagtcttggg taaaaactgg cctaaaattg ctggggattt    7380
caggaaagta aacatcacct tccggctcga tgtctattgt agatatatgt agtgtatcta    7440
cttgatcggg ggatctgctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac    7500
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc    7560
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt    7620
agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag    7680
tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc    7740
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg    7800
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa    7860
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg    7920
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga    7980
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg    8040
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg    8100
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc    8160
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg    8220
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca    8280
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt    8340
ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag    8400
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg    8460
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc    8520
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt    8580
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt    8640
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca    8700
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg    8760
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac    8820
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg    8880
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc    8940
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg    9000
cagggggggg gggggggggg gacttccatt gttcattcca cggacaaaaa cagagaaagg    9060
aaacgacaga ggccaaaaag cctcgctttc agcacctgtc gtttcctttc ttttcagagg    9120
gtattttaaa taaaaacatt aagttatgac gaagaagaac ggaaacgcct taaaccggaa    9180
aattttcata aatagcgaaa acccgcgagg tcgccgcccc gtaacctgtc ggatcaccgg    9240
aaaggacccg taaagtgata atgattatca tctacatatc acaacgtgcg tggaggccat    9300
caaaccacgt caaataatca attatgacgc aggtatcgta ttaattgatc tgcatcaact    9360
taacgtaaaa acaacttcag acaatacaaa tcagcgacac tgaatacggg gcaacctcat    9420
gtcccccccc cccccccccc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct    9480
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa    9540
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta    9600
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc    9660
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg    9720
agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa    9780
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg    9840
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc    9900
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg    9960
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat   10020
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata   10080
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc  10140
atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattggtc  10200
gacgatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggattgaagg  10260
cgagatccag caactcgcgc cagatcatcc tgtgacggaa ctttggcgcg tgatgactgg  10320
ccaggacgtc ggccgaaaga gcgacaagca gatcacgctt ttcgacagcg tcggatttgc  10380
gatcgaggat ttttcggcgc tgcgctacgt ccgcgaccgc gttgagggat caagccacag  10440
cagcccactc gaccttctag ccgacccaga cgagccaagg gatctttttg gaatgctgct  10500
ccgtcgtcag gctttccgac gtttgggtgg ttgaacagaa gtcattatcg tacggaatgc  10560
caagcactcc cgaggggaac cctgtggttg gcatgcacat acaaatggac gaacggataa  10620
accttttcac gcccttttaa atatccgtta ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt  10680
acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc  10740
tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa  10800
gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgttgaa ggagccactc agcaagctgg  10860
tacgattgta atacgactca ctatagggcg aattgagcgc tgtttaaacg ctcttcaact  10920
ggaagagcgg ttacccggac cgaagcttga agttcctatt ccgaagttcc tattctctag  10980
aaagtatagg aacttcagat ctcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggt  11040
cgactctaga ggatccacca tgagcccaga acgacgcccg gccgacatcc gccgtgccac  11100
cgaggcggac atgccggcgg tctgcaccat cgtcaaccac tacatcgaga caagcacggt  11160
caacttccgt accgagccgc aggaaccgca ggactggacg gacgacctcg tccgtctgcg  11220
ggagcgctat ccctggctcg tcgccgaggt ggacggcgag gtcgccggca tcgcctacgc  11280
gggcccctgg aaggcacgca acgcctacga ctggacggcc gagtcgaccg tgtacgtctc  11340
cccccgccac cagcggacgg gactgggctc cacgctctac acccacctgc tgaagtccct  11400
ggaggcacag ggcttcaaga gcgtggtcgc tgtcatcggg ctgcccaacg acccgagcgt  11460
gcgcatgcac gaggcgctcg gatatgcccc ccgcggcatg ctgcgggcgg ccggcttcaa  11520
gcacgggaac tggcatgacg tgggtttctg gcagctggac ttcagcctgc cggtaccgcc  11580
ccgtccggtc ctgcccgtca ccgagatctg atccgtcgac caacctagac ttgtccatct  11640
tctggattgg ccaacttaat taatgtatga aataaaagga tgcacacata gtgacatgct  11700
aatcactata atgtgggcat caaagttgtg tgttatgtgt aattactagt tatctgaata  11760
aaagagaaag agatcatcca tatttcttat cctaaatgaa tgtcacgtgt ctttataatt  11820
ctttgatgaa ccagatgcat ttcattaacc aaatccatat acatataaat attaatcata  11880
tataattaat atcaattggg ttagcaaaac aaatctagtc taggtgtgtt ttgcgaattg  11940
cggccgcgat ctggggaatt cccatggaca ccggtaattc ccatgatctt ctctccttca  12000
tcaatggatg ccatgtttca taacaataac accaaatgtt tgatgagcta ccaacaattg  12060
cgcaaagact atggctaagc tcgagctcgc tcgctacaag ttgttgactt tcaaatacaa  12120
gtttgttttt ggaacaccaa atattctaca tgatctttca ctaagttgcg caccactatc  12180
aaaagattat ctaggccatt attcaagtaa agagtgaaca cgtctaagac ccacaaccac  12240
accaaataga atacgcatac atgcaacata ttgtgcaaga agtatccaac tggactccca  12300
tgtattctaa aactattttc gtagagttaa agttatgaca aacttatcaa ataaaaattt  12360
gaacgctgga ccaaaacttt catctttcaa atccaccatc gtctatcctc ataaattgtt  12420
ttgattataa cacatctacg taaatcattt gttttgaaca atactaattt aattttatta  12480
agtcaaataa cctgcttaga aaataatccc tccacctcat ttaacaattt cttgtcaaac  12540
acacaccaag aaaaaaatta atgaaagaga aaagaaatga aaaggacatg gagttgaata  12600
ctagcaaaat tgattgaagg aagattcaca attgaaattg aaaccattta atttattttc  12660
gggtccataa taataaattg gtaagaataa aaacccgatc aagtccggta cagtacaatt  12720
ccactccacc aactccttac ttaaacccct atttataccc actctcatcc tcactcttcc  12780
ttcacctctc acactctctt ctctctctca aaaccctcac acaaacgctg cgtttagtgt  12840
aagaaattca atccgg                                                  12856
<210>45
<211>879
<212>DNA
<213>紫花苜蓿
 
<400>45
aattcccatg atcttctctc cttcatcaat ggatgccatg tttcataaca ataacaccaa     60
atgtttgatg agctaccaac aattgcgcaa agactatggc taagctcgag ctcgctcgct    120
acaagttgtt gactttcaaa tacaagtttg tttttggaac accaaatatt ctacatgatc    180
tttcactaag ttgcgcacca ctatcaaaag attatctagg ccattattca agtaaagagt    240
gaacacgtct aagacccaca accacaccaa atagaatacg catacatgca acatattgtg    300
caagaagtat ccaactggac tcccatgtat tctaaaacta ttttcgtaga gttaaagtta    360
tgacaaactt atcaaataaa aatttgaacg ctggaccaaa actttcatct ttcaaatcca    420
ccatcgtcta tcctcataaa ttgttttgat tataacacat ctacgtaaat catttgtttt    480
gaacaatact aatttaattt tattaagtca aataacctgc ttagaaaata atccctccac    540
ctcatttaac aatttcttgt caaacacaca ccaagaaaaa aattaatgaa agagaaaaga    600
aatgaaaagg acatggagtt gaatactagc aaaattgatt gaaggaagat tcacaattga    660
aattgaaacc atttaattta ttttcgggtc cataataata aattggtaag aataaaaacc    720
cgatcaagtc cggtacagta caattccact ccaccaactc cttacttaaa cccctattta    780
tacccactct catcctcact cttccttcac ctctcacact ctcttctctc tctcaaaacc    840
ctcacacaaa cgctgcgttt agtgtaagaa attcaatcc                           879

Claims (53)

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物,所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
2.权利要求1的植物,其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
3.植物,所述植物在其基因组中包含:
重组DNA构建体,所述重组DNA构建体包含:
(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或
(b)抑制DNA构建体,所述构建体包含至少一种调控元件,所述调控元件可操作地连接至:
(i)以下序列的全部或部分:
(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或
(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽,并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时,所述植物表现出至少一种农学特性的改变。
4.权利要求3的植物,其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
5.权利要求3的植物,其中在不同的环境条件下与所述未包含所述重组DNA构建体的所述对照植物比较时,所述植物表现出至少一种农学特性的所述改变。
6.权利要求5的植物,其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。
7.权利要求5的植物,其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
8.权利要求6的植物,其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
9.权利要求7的植物,其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
10.权利要求3的植物,其中所述至少一种农学特性选自:绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根穿透、根倒伏、茎倒状、植株高度、穗长和收获指数。
11.权利要求10的植物,其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
12.权利要求3的植物,其中在与所述对照植物相比较时,所述植物表现出所述至少一种农学特性的增强。
13.权利要求12的植物,其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
14.改变植物根构造的方法,所述方法包括:
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,当与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;以及
(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体,并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
15.权利要求14的方法,所述方法还包括:
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体,并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。
16.评价植物根构造的方法,所述方法包括:
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,当与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;
(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及
(c)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较,所述转基因植物的根构造。
17.权利要求16的方法,所述方法还包括:
(d)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及
(e)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较,所述子代植物的根构造。
18.评价植物根构造的方法,所述方法包括:
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,当与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;
(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及
(d)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较,所述子代植物的根构造。
19.测定植物农学特性改变的方法,所述方法包括:
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,当与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;
(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及
(c)测定所述转基因植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
20.权利要求19的方法,所述方法还包括:
(d)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及
(e)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
21.权利要求19的方法,其中所述测定步骤包括:测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
22.权利要求20的方法,其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。
23.权利要求20的方法,其中步骤(e)包括:测定所述子代植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
24.权利要求23的方法,其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。
25.测定植物农学特性改变的方法,所述方法包括:
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码多肽,当与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性;
(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体;以及
(d)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
26.权利要求25的方法,其中步骤(d)包括:测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
27.测定植物农学特性改变的方法,所述方法包括:
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件,所述调控元件可操作地连接至:
(i)如下序列的全部或部分:
(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或
(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;
(b)在步骤(a)之后,从可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体;以及
(c)测定所述转基因植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
28.权利要求27的方法,其中所述测定步骤包括:测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
29.权利要求28的方法,其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。
30.权利要求27的方法,所述方法还包括:
(d)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体;以及
(e)测定所述子代植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
31.权利要求30的方法,其中步骤(e)包括:测定所述子代植物在不同的环境条件下与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
32.权利要求31的方法,其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。
33.测定植物农学特性改变的方法,所述方法包括:
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件,所述调控元件可操作地连接至:
(i)如下序列的全部或部分:
(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或
(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;
(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体,并且当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造;
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体;以及
(d)测定所述子代植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
34.权利要求33的方法,其中步骤(d)包括:测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
35.权利要求34的方法,其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。
36.改变植物根构造的方法,所述方法包括:
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件,所述调控元件可操作地连接至:
(i)如下序列的全部或部分:
(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或
(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;以及
(b)在步骤(a)之后,从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体,并且其中当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时,所述转基因植物表现出改变的根构造。
37.权利要求36的方法,所述方法还包括:
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体,并且其中当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时,所述子代植物表现出改变的根构造。
38.评价植物根构造的方法,所述方法包括:
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件,所述调控元件可操作地连接至:
(i)如下序列的全部或部分:
(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或
(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;
(b)在步骤(a)之后,从可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体;以及
(c)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比较时,所述转基因植物的根构造。
39.权利要求38的方法,所述方法还包括:
(d)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体;以及
(e)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时,所述子代植物的根构造。
40.评价植物根构造的方法,所述方法包括:
(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中,所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件,所述调控元件可操作地连接至:
(i)如下序列的全部或部分:
(A)编码多肽的核酸序列,在与SEQ ID NO:13、17、19或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性,或
(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列;或
(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域,当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时,基于Clustal V比对方法,所述区域的核酸序列具有至少50%的序列同一性,并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽;
(b)在步骤(a)之后,从可再生的植物细胞再生出转基因植物,其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体;
(c)获得源自所述转基因植物的子代植物,其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体;以及
(d)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时,所述子代植物的根构造。
41.分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含:
(i)编码多肽的核酸序列,当与SEQ ID NO:13或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性;或
(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。
42.分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含:
(i)编码多肽的核酸,当与SEQ ID NO:13或21比较时,基于ClustalV比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少85%的序列同一性或
(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。
43.分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含:
(i)编码多肽的核酸序列,当与SEQ ID NO:13或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性;或
(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。
44.分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含:
(i)编码多肽的核酸序列,当与SEQ ID NO:13或21比较时,基于Clustal V比对方法,所述多肽的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性;或
(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。
45.权利要求41的多核苷酸,其中所述多肽序列包含SEQ ID NO:13或21。
46.权利要求41的多核苷酸,其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:12或20。
47.载体,所述载体包含权利要求41的多核苷酸。
48.重组DNA构建体,所述重组DNA构建体包含与至少一种调控序列可操作地连接的权利要求41的多核苷酸。
49.用于转化细胞的方法,所述方法包括用权利要求41的多核苷酸转化细胞。
50.细胞,所述细胞包含权利要求48的重组DNA构建体。
51.用于生产植物的方法,所述方法包括使用权利要求41的所述多核苷酸转化植物细胞以及从转化过的植物细胞再生植物。
52.权利要求41的分离的多核苷酸,其中所述多肽序列包含至少一种选自SEQ ID NO:22和23的基序,其中所述基序是基本上保守的亚序列。
53.编码多肽的分离的多核苷酸,其中所述多肽的表达导致改变的根构造,并且其中所述多肽序列包含至少一种选自SEQ ID NO:22和23的基序,其中所述基序是基本上保守的亚序列。
CN200880022664A 2007-06-29 2008-06-27 涉及rt1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物 Pending CN101827938A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94711707P 2007-06-29 2007-06-29
US60/947,117 2007-06-29
PCT/US2008/068526 WO2009006276A1 (en) 2007-06-29 2008-06-27 Plants with altered root architecture, involving the rt1 gene, related constructs and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101827938A true CN101827938A (zh) 2010-09-08

Family

ID=39846621

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880022664A Pending CN101827938A (zh) 2007-06-29 2008-06-27 涉及rt1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20090044293A1 (zh)
EP (1) EP2162543A1 (zh)
CN (1) CN101827938A (zh)
BR (1) BRPI0811792A2 (zh)
CA (1) CA2687442A1 (zh)
MX (1) MX2009013884A (zh)
WO (1) WO2009006276A1 (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2742684A1 (en) 2008-12-17 2010-07-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plants having altered agronomic characteristics under nitrogen limiting conditions and related constructs and methods involving genes encoding lnt9 polypeptides
WO2010075243A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotide sequences encoding gsh1 polypeptides and methods of use
MX2011009378A (es) 2009-03-09 2011-10-03 Du Pont Plantas tolerantes a la sequia y metodos que implican el uso de genes que codifican polipeptidos de la familia de dedos de zinc ring de tipo c3hc4.
WO2010111568A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plants having altered agronomic characteristics under nitrogen limiting conditions and related constructs and methods involving genes encoding snf2 domain-containing polypeptides
CA2775563A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding self-incompatibility protein related polypeptides
US8916746B2 (en) 2009-10-30 2014-12-23 Japan Tobacco, Inc. Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding DTP21 polypeptides
WO2011097215A2 (en) 2010-02-02 2011-08-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plants with altered root architecture, related constructs and methods involving genes encoding lectin protein kinase (lpk) polypeptides and homologs thereof
WO2011136909A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 E.I. Dupont De Nemours And Company Alteration of plant architecture characteristics in plants
CN103261422B (zh) 2010-10-28 2015-11-25 纳幕尔杜邦公司 涉及编码dtp6多肽的基因的耐旱植物以及相关构建体和方法
EP2655405A2 (en) 2010-12-20 2013-10-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding mate-efflux polypeptides
US9499831B2 (en) 2012-01-17 2016-11-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
BR112014032080A2 (pt) 2012-06-20 2017-06-27 Cold Spring Harbor Laboratory gene de terminação de flor (tmf) e métodos de uso.
WO2014120884A2 (en) 2013-01-31 2014-08-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Slm1, a suppressor of lesion mimic phenotypes
US20160002658A1 (en) 2013-03-11 2016-01-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to enhance mechanical stalk strength in plants
WO2014151213A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding dtp32 polypeptides
WO2015038926A1 (en) * 2013-09-12 2015-03-19 University Of Delaware Manipulation of plasmodesmal connectivity to improve plant yield and fitness
CA2935703A1 (en) 2013-12-30 2015-07-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding dtp4 polypeptides
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
CA2970138A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of yep6 gene expression to increase yield and other related traits in plants
MX2018011298A (es) 2016-03-18 2019-03-07 Pioneer Hi Bred Int Metodos y composiciones para producir gametos clonados, sin reducir, sin recombinar.
CN106971394B (zh) * 2017-04-12 2019-11-12 东北农业大学 一种快速分离粘连玉米种子的图像分割方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3249046B1 (en) * 2002-09-18 2020-07-08 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
ATE438713T1 (de) * 2004-02-02 2009-08-15 Du Pont Veränderung der wurzelstruktur während der pflanzenentwicklung

Also Published As

Publication number Publication date
MX2009013884A (es) 2010-01-27
WO2009006276A1 (en) 2009-01-08
EP2162543A1 (en) 2010-03-17
CA2687442A1 (en) 2009-01-08
US20090044293A1 (en) 2009-02-12
BRPI0811792A2 (pt) 2014-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101827938A (zh) 涉及rt1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物
KR102147005B1 (ko) Fad2 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질
CN101815432A (zh) 涉及编码核苷二磷酸激酶(ndk)多肽及其同源物的基因的用于修改植物根构造的方法
CN101939434B (zh) 用于在大豆中提高种子贮藏油脂的生成和改变脂肪酸谱的来自解脂耶氏酵母的dgat基因
DK2087105T3 (da) Delta 17-desaturase og anvendelse heraf ved fremstilling af flerumættede fedtsyrer
CN101365788B (zh) Δ-9延伸酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
KR101447300B1 (ko) 안트라닐레이트 신타제의 엽록체를 표적으로 하는 발현에 의한 고-트립토판 옥수수의 생산
DK2623594T3 (da) Antistof mod human prostaglandin-E2-receptor EP4
CA2683497C (en) .delta.8 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
DK2324120T3 (en) Manipulating SNF1 protein kinase OF REVISION OF OIL CONTENT IN OLEAGINOUS ORGANISMS
CN101646766B (zh) △17去饱和酶及其用于制备多不饱和脂肪酸的用途
CN108026556A (zh) 在具有经改造的输入/输出的微生物宿主中人乳寡糖的产生
KR20070085669A (ko) 고농도의 아라키돈산을 생성하는 야로위아 리폴리티카 균주
KR20130132405A (ko) 형질전환 빈도를 증가시키기 위해 변형된 아그로박테리움 균주
BRPI0806354A2 (pt) plantas oleaginosas transgências, sementes, óleos, produtos alimentìcios ou análogos a alimento, produtos alimentìcios medicinais ou análogos alimentìcios medicinais, produtos farmacêuticos, bebidas fórmulas para bebês, suplementos nutricionais, rações para animais domésticos, alimentos para aquacultura, rações animais, produtos de sementes inteiras, produtos de óleos misturados, produtos, subprodutos e subprodutos parcialmente processados
CN101918560B (zh) 在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物以及涉及编码lnt2多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法
CA2856001A1 (en) Plant galactinol synthase homologs
CN101868545B (zh) 具有改变的根构造的植物、涉及编码富含亮氨酸重复序列激酶(llrk)多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法
US20140196178A1 (en) Plant self nitrogen fixation by mimicking prokaryotic pathways
CN113621642A (zh) 一种用于农作物杂交育种制种的遗传智能化育制种系统及其应用
CN115927299A (zh) 增加双链rna产生的方法和组合物
CN101883843A (zh) 破坏过氧化物酶体生物合成因子蛋白(pex)以改变含油真核生物中多不饱和脂肪酸和总脂质含量
CN101848931B (zh) 具有改变的根构造的植物、涉及编码exostosin家族多肽及其同源物的基因的相关的构建体和方法
BRPI0616533A2 (pt) polinucleotìdeo isolado, fragmento de ácido nucléico isolado, construções de dna recombinante, plantas, sementes, células vegetais, tecidos vegetais, método de isolamento de fragmentos de ácidos nucléico, método de mapeamento de variações genéticas, método de cultivo molecular, plantas de milho, métodos de alteração do transporte de nitrogênio das plantas e variantes de hat de plantas alteradas
AU2017252409A1 (en) Compositions and methods for nucleic acid expression and protein secretion in bacteroides

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100908