MX2011009378A - Plantas tolerantes a la sequia y metodos que implican el uso de genes que codifican polipeptidos de la familia de dedos de zinc ring de tipo c3hc4. - Google Patents

Plantas tolerantes a la sequia y metodos que implican el uso de genes que codifican polipeptidos de la familia de dedos de zinc ring de tipo c3hc4.

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Abstract

La presente invenci6n describe polinucleótidos y polipéptidos aislados y constructos de ADN recombinante útiles para conferir tolerancia a la sequía, composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de ADN recombinante y métodos que usan estos constructos de ADN recombinante. El constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a un promotor funcional en una planta, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4).

Description

PLANTAS TOLERANTES A LA SEQUIA Y METODOS QUE IMPLICAN EL USO DE GENES QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS DE LA FAMILIA DE DEDOS DE ZINC RING DE TIPO C3HC4 CAMPO DE LA INVENCION El campo de la invención se relaciona con el cultivo y la genética de plantas y, particularmente, se relaciona con constructos de ADN recombinante útiles en! plantas para conferir tolerancia a la sequía.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los estresores abióticos limitan considerablemente la producción de cultivos en todo el mundo. Se calcula que estos factores, acumulativamente, son responsables de una reducción promedio del 70 % en la producción agrícola (Bresson, 1999) .
El estrés de la sequía, particularmente, produce una reducción en el rendimiento promedio de los cultivos y, i además, causa inestabilidad a través de la alta variabilidad i interanual de la producción. Aproximadamente 35 a 40 % de la tierra arable en el mundo está clasificada coJno tierra árida o semiárida. Aun en regiones no áridas, en donde los suelos son ricos en nutrientes, el estrés de la sequía se produce regularmente durante periodos breves o en niveles moderados.
Además, se prevé que los patrones de precipitaciones cambiarán en los próximos años y serán más variables debido REF. : 222387 a las mayores temperaturas mundiales Estudios realizados en los Estados Unidos han demostrado que los diez tipos más importantes de plantas cultivadas (maíz, frijol de soya, trigo, tomates, etc.) generaron anualmente, en promedio, sólo aproximadamente 50 % de la producción genéticamente posible; dos tercios de las pérdidas se debieron a la combinación frecuente entre el estrés térm 1i,co y la escasez de agua (G. Schütte, S. Stirn y V. Beusmann, Tr^nsgene Pflanzen - Sicherheitsforschung, Risikoabsch tzung und Nachzulassungs¦ Monitoring . Birkh user Verlag AG, Basel-Boston-Berlín, 2001) .
Las plantas son sésiles y deben adaptarse a las condiciones ambientales reinantes en su entorno. En consecuencia, han desarrollado una gran plasticidad para la regulación génica, morfogénesis y metabolismo. jLas estrategias de adaptación y defensa implican la activación de proteínas que codifican genes importantes para la aclimatación o defensa frente a los distintos estresores . Algunas respuestas moleculares a los factores de estrés abióticoj tales como la sequía, son específicas, pero se ha demostrado, además, que varios estresores activan genes similares (Royal Society of London, Transgenic Plants and World Agri^ulture, 2000, National Academy Press, Washington, que aproximadamente el 15 por ciento del genoma di una planta se ocupa de la percepción del estrés y la adaptación a él (véase, por e emplo, Cushman y Bohnert, 2000) . ¡ Un trabajo anterior sobre los aspectos | moleculares de las respuestas al estrés abiótico se realizp por medio de análisis diferencial y/o de sustracción (véase, por ejemplo, Bray, 1993, Shinozaki y Yamaguchi-ShinozakiJ 1997, Zhu et al., 1997, Thomashow, 1999) . Otros métodds incluyen la selección de genes candidatos (por ejemplo, a selección de genes a partir de un módulo particular conocido y el análisis de la expresión de el gen o su producto activo bajo estrés, o mediante la complementación funcional en un sistema estresor bien definido; véase Xiong y Zhu, 2001) . Además, se han usado estudios genéticos directos e inversos que implican la identificación y el aislamiento de mutaciones en genes reguladores para proporcionar evidencia de los cambios observados en la expresión de j los genes bajó estrés o exposición (Xiong y Zhu, 2001) . J Se puede usar la rotulación de la ajctivación para identificar genes con la capacidad de afectarj un rasgo. Esta planteamiento se ha usado en la especie modelo de planta Arabidopsis thaliana ( eigel et al., Plant ???ß???. 122:1003-1013 (2000) ) . Las inserciones de elementos potenciadores de la transcripción pueden, en forma dominante, activar y/o aumentar la expresión de genes endógenos jcercanos . Este método puede usarse para seleccionar genes implicados en los fenotipos agronómicamente importantes incluyen la tolerancia al estrés.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención incluye: En una modalidad, una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33, y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante.
En otra modalidad un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el! polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de : aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, er. base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a l|a sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante ; y opcionalmenj_.e , (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde esa planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
En otra modalidad un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta comprende (a) introducijr en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacional nente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2¿, 27, 29, 31 o 33; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a)¡, en donde la i planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) evaluar la planta tr'ansgénica para determinar la tolerancia a la sequía cuando se ¡compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante; y opcionalmente, (d) obtener una lanta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la ¡planta progenie i comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y opcionalmente, (e) evaluar la planta progenie |para determinar la tolerancia a la sequía cuando se compara ccjn una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
En otra modalidad un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionaljmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde elj polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de j aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, eri base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2!5, 27, 29, 31 o 33; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; yj (d) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control qúe no comprende el constructo de ADN recombinante. j En otra modalidad la presente invención incluye cualquiera de los métodos de la presente invención, en doride la planta es i una planta de maíz o una planta de frijol de soya.
En otra modalidad la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) , en dondej el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con una de las sec. con núm. de ident.: 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33 o (b) un complemento total de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento total y la secuencia de nuclecjtidos consisten del mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios. El polipéptido podría comprender la secuencia! de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, o 33. La secuencia de nucleótidos podría comprender la í secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. j de ident.: 16, 18, 26, 28, 30 o 32. j En otra modalidad la presente invención ! trata sobre un constructo de ADN recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención unidos operacionalmente a por. lo menos una secuenciá reguladora, y una célula, una planta y una semilla que! comprende el constructo de ADN recombinante. ¦ En otra modalidad la presente invención incluye un vector que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención.
En otra modalidad la presente invención se refiere a una célula, planta o semilla que comprende cualquiera de constructos de ADN recombinante de la presente invención. La célula podría ser eucariota, por ejemplo, uní célula de una planta, un insecto o una levadura, o pjrocariota, por ejemplo, una bacteria.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS invención se puede entender mejor con la siguiente descripción detallada y las figuras acompañan es y listado de secuencias, los cuales forman parte de esta solicitud La Figura 1 muestra un esquema del constructo de rotulación de la activación de pHSbarENDs2 (sec. con núm. de ident.:l) que se usa para elaborar las poblaciones de Arabidopsis .
La Figura 2 muestra un mapa del vector pjDONR™/Zeo (sec. con núm. de ident.:2). El sitio attPl se encuentra en los nucleótídos 570-801; el sitio attP2 se encuentra en los nucleótidos 2754-2985 (cadena complementaria) .
La Figura 3 muestra un mapa del vector pDONR™221 (sec. con núm. de ident . :3) . El sitio attPl se er.cuentra en los nucleótidos 570-801; el sitio attP2 se encuentra en los nucleótidos 2754-2985 (cadena complementaria).
La Figura 4 muestra un mapa del vector pBC-amarillo (sec. con núm. de ident. :4) , un vector de destino para usar en el constructo de vectores de expresión para Arabidopsis .
El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 11276-11399 (cadena complementaria) ; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 9695-9819 (cadena complementaria)! La Figura 5 muestra un mapa de PHP27840 (sec. con núm. de ident . :5) , un vector de destino para usar en el constructo de vectores de expresión para frijol de soya. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 7310-7434; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 8890-9014.
La Figura 6 muestra un mapa de PHP23236 (sec. con núm. de ident. :6), un vector de destino para usar en el constructo de vectores de expresión para líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 2006- 2130; el sitio attR2 se encuentra en los nucleót}.idos 2899-3023.
La Figura 7 muestra un mapa de PHP10523 (sec. con núm. de ident.: 7), un ADN plasmídico presente en la cepa de Agrojbacterium LBA4404 (Komari et al., Plant* J. 10:165-174 i (1996) ; identificador general del NCBI núm. 59797027) .
La Figura 8 muestra un mapa de PHP23235 ^ (sec. con núm. de ident. : 8) , un vector que se usa para construir el vector de destino PHP23236.
La Figura 9 muestra un mapa de PHP28647 j (sec. con núm.
I de ident.: 9), un vector de destino para usar con líneas i endogámicas derivadas de maíz. El sitio attR¡l se encuentra en los nucleótidos 2289-2413; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 3869-3993. ? La Figura 10 muestra la evaluación de ¡líneas de maíz individuales transformadas con PHP31373.
La Figura 11 muestra la sensibilidad del ABA durante la germinación de las semillas de Arabidopsis transgénicas de tipo silvestre (Col: Aquilegia) y semillas de Arabidopsis transgénicas T2 que contienen el polipéptidoj de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3rtC4) (núm. 27, At2g01150) (panel izquierdo) . La inhibición producida por el ABA en el crecimiento posterior a la germinación aumentó considerablemente en las líneas transgénicas que sobreexpresan At2g01150 (panel derecho) . Col = Aquilegia; núm. 27 = At2g01150.
La Figura 12 muestra el programa de tratamiento para el ensayo de plantas con una mayor tolerancia a la sequía.
Las Figuras 13A-13B muestran el alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) de la sec . con núm. de ident.: 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33. Los residuos que son idénticos al residuo.de la séc. con núm. de ident.: 17 en una posición determinada están dentro de una caja.
La Figura 14 muestra el porcentaje dé identidad de secuencia y los valores de divergencia paria cada par de secuencias de aminoácidos del polipéptido de' la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) lustrado en las Figuras 13A-13B.
La Figura 15 muestra una planta de Arabidopsis de tipo silvestre (WT) y transgénica que contiene el polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING de¡l tipo C3HC4) (RHA2b) a las 0, 2, 4 horas y durante la noche (ON) después de reirrigar las. plantas.
La Figura 16 muestra el rendimiento promedio de plantas transgénicas de maíz cultivadas en campo contra las plantas no transgénicas (control) expuestas a un estrés de la sequía gradual (panel izquierdo) o a un estrés de la sequía rápido (panel derecho) .
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La sec . con núm. de. ident . :1 es la secuencia nucleótidos del vector de rotulación de la activación pHSbarENDs2.
La sec. con núm. de ident. :2 es la secuencia de nucleótidos del vector donante pDONR™/Zeo GATEWAY® La sec. con núm. de ident. :3 es la secuencia de nucleótidos del vector donante pDONR™221 GATEWAY® .
La sec. con núm. de ident. :4 es la secuencia de nucleótidos de pBC-amarillo, un vector de deátino para usar con Arabidopsis .
La sec. con núm. de ident. :5 es la secuencia de nucleótidos de PHP27840, un vector de destino para usar con el frijol de soya.
La sec. con núm. de ident. :6 es la secuencia de nucleótidos de PHP23236, un vector de destinó para usar con líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint. j La sec. con núm. de ident .: 8 es lJ secuencia de nucleótidos de PHP23235, un vector de destino para usar con líneas derivadas de Gaspe Flint.
La sec. con núm. de ident. :9 es la! secuencia de I nucleótidos de PHP28647, un vector de destincp para usar con líneas endogámicas derivadas de maíz.
La sec. con núm. de ident.: 10 es la secuencia de nucleótidos del sitio attBl.
La sec. con núm. de ident. :11 es lá secuencia de l nucleótidos del sitio attB2. ! La sec. con núm. de ident.: 12 es la! secuencia de nucleótidos del cebador directo At2g0ll|50-5 ' attB que contiene la secuencia attBl usada para amplificar la región codificante de proteínas At2g01150. j La sec. con núm. de ident.: 13 es la secuencia de nucleótidos del cebador inverso At2g01150-3 ' attB que contiene la secuencia attB2 usada para amplificar la región codificante de proteínas At2g01150.
La sec. con núm. de ident .: 14 es lal secuencia de nucleótidos del cebador VC062 que contiene el| promotor T3 y el sitio attBl útil para amplificar insertos de ADNc clonados en un vector BLUESCRIPT® II SK(+) (Stratagene) .
La sec . con núm. de ident. :15 es la secuencia de nucleótidos del cebador VC063 que contiene eL promotor T7 y el sitio attB2 útil para amplificar insertos de ADNc clonados en un vector BLUESCRIPT® II SK(+) (Stratagene) .
La sec. con núm. de ident. :16 corresponde al ident if icador general del NCBI núm. 98960S89 que es la secuencia de nucleótidos de ADNc del locus At2g01150 que codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) de Arabidopsis (RHA2B) . Esta secuencia se obtuvo mediante amplificación por PCR del ADNc de Arabidopsis con la sec. con núm. de ident. :12 jy sec. con núm. de ident. :13 como cebadores de la PCR. ^ La sec. con núm. de ident. : 17 corresponde^ a la secuencia I de aminoácidos codificada por la sec. con núm de ident . : 16.
La sec. con núm. de ident. :18 corresponde al identif icador general del NCBI núm. : 156896364 (Bra núm.
S40765917; gb=EX097840; ug=Bra.5893) que es uña secuencia de nucleótidos de ADNc de Brassica rapa subesp. Pekinensis .
La sec. con núm. de ident. : 19 corresponde a la secuencia de aminoácidos prevista codificada ¿>or la sec. con i núm. de ident. :34 (Bra núm. S40765917) .
La sec. con núm. de ident. :20 corresponde a una secuencia de polipéptidos prevista ( jgi_Ara]Jyl_484022) del ADN genómico de Arabidopsis lyrata ensamblada por Joint Genome Institute (JGI) con las predicciones de FGENESH .
La sec . con núm. de ident . :21 corresponde a una secuencia de polipéptidos prevista ((Jlymal0g41480.1) ensamblada por Joint Genome Ins.titute (JGI) aj partir del ADN genómico del frijol de soya, locus Glymal0g41480.1.
La sec. con núm. de ident. :22 corresponde al identificador general del NCBI núm. 225424108 que es la secuencia de aminoácidos de una proteína hipotética de Vitisj vinifera .
La sec. con núm. de ident. :23 corresponde al identificador general del NCBI núm. 224101783 que es la secuencia de aminoácidos de una proteína prevista de Populus trichocarpa.
La sec. con núm. de ident.: 24 corresponde al identificador general del NCBI núm. 224108389 que es lá secuencia de aminoácidos de una proteína prevista de Populus trichocarpa .
La sec. con núm. de ident.: 25 corresponde al identificador general del NCBI núm. 255570699 que es la secuencia de aminoácidos de una proteina hipotética conservada de Ricinus communis . j La sec. con núm. de ident.: 26 corresponde al identificador general del NCBI núm. : 158947513 (Rsa núm. S42024301; gb=EX909789; ug=Rsa .15663 ) que es |a secuencia de nucleótidos del ADNc de RS3CT64JQ RS3 (RT) de Rá 3pj hanus sativus.
La sec. con núm. de ident. :27 corresponde secuencia de aminoácidos prevista codificada por la sec. con núm. de ident.: 26.
La sec. con núm. de ident.: 28 corresponde al identificador general del NCBI núm. : 167441352 (Rsa núm. S43018457; gb=FD946889 ; ug=Rsa .25923 ) que es lia secuencia de nucleótidos del ADNc de RS2GG53TF RS2.(RS) de Raphanus sativus.
La sec. con núm. de ident. :29 corresponde a la secuencia de aminoácidos prevista codificada por la sec. con núm. de ident. :28 (Rsa núm. S43018457).
La sec. con núm. de ident. :30 iorresponde al identificador general del NCBI núm. : 151207511 (Bna núm. S39191941; gb=EV120552 ; ug=Bna.9890) que es una secuencia de nucleótidos del ADNc de Brassica napus .
La sec. con núm. de ident. :31 corresponde^ a la secuencia de aminoácidos prevista codificada por la sec. con núm. de ident. :30 (Bna núm. S39191941) .
I La sec. con núm. de ident. :32 dorresponde al identificador general del NCBI núm.: 156952314 (Bra núm. S40797032; gb=EX127956; ug=Bra.5294) que es uña secuencia de nucleótidos del ADNc de Brassica rapa.
La sec. con núm. de ident. :33 corresponde a la secuencia de aminoácidos prevista codificada por la sec. con núm. de ident. :32 (Bra_S40797032 ) .
La sec. con núm. de ident. :34 cjorresponde al identificador general del NCBI núm.: 30684171 que es la secuencia de nucleótidos del ADNc de Arabidopsis thaliana i que codifica un polipéptido de unión a proteínas / ubiquitina-proteína ligasa/ unión al ion zinc (RHA2A) .
La sec . con núm. de ident. :35 corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la sec. con núm. de ident . : 34 Las descripciones y el listado de secuencias adjuntos a la presente cumplen las reglas que determinan las descripciones de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos eiji solicitudes de patente como se describe en 37 C.F.R. §1.821-1.^25.
El listado de secuencias contiene el código de una sola I letra para los caracteres de la secuencia d† nucleótidos y los códigos de tres letras para aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de IUPAC-^EUBMB descritos en Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) y ¡ en Biochemical J. 219 {núm. 2):345-373 (1984) que se incorporan en la I presente descripción como referencia. Los ¡símbolos y el formato que se usan para los datos de lasj secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen con las! reglas que se describen en el Título 37 del C.F.R. , §1.822. ! DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La descripción de cada referencia indicada en la presente descripción se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.
Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen la referencia del plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una pluralidad de tales plantas, la referencia a "una célula" incluye una o más células y los equivalentes de éstas que conoce un experimentado en la técnica, etc. j Como se usan en la presente descripción: ' Los siguientes términos se usan indistintamente en la presente invención: "Polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4 ) " , "RHA2B" , "RHA2b" , "PROTEÍNA 2B DEL DEDO RING-H2" , " At-C3HC4_ZF" j "Polipéptido de la familia de dedos de pinc (dedo RING del tipo C3HC4)" se refiere a un dedo de zinc del tipo C3HC4 (dedo RING) que es un dominio rico en cisterna de 40 a 60 residuos que coordina dos iones zinc y que tiejne la secuencia consenso: C-X2-C-X (9-39) -C-X (1-3) -H-X (2-3) -C-lx2-C-X (4-48) -C-X2-C en donde X es cualquier aminoácido (Borden KL y Freemont PS. 1996 Curr. Opin. Struct . Biol . 6 : 39J5-401) . Muchas proteínas que contienen un dedo RING tiene una función principal en la ruta de la ubiquitinationa (Lorick KL, et al. 1999. Proc. Nati. Acad. Sci. 96:11364-11369). j Los dominios de dedos de zinc (Znf) son motivos de proteínas relativamente pequeñas que unen uno q ' más átomos de zinc y que usualmente contienen múltiples proyecciones de tipo dedo que generan contactos en tándem con su molécula objetivo.
Un dedo RING (en inglés, Really Interesting New Gene (gen nuevo realmente interesante) ) se refiere a un tipo de dedo de zinc especial de 40 a 60 residuos que¡ une dos átomos de zinc, definido por el motivo 1 entrelazado 1 C-X2-C-X(9-39) -C-X(l-3) - H-X(2-3) - (N/C/H) -X2 -C-X (4 -48 ) C-X2 -C , . implicado probablemente en la mediación de las interacciones entre proteínas ((Borden KL y Freemont PS . 1996 Curr Opin Struct Biol. 1996 Jun; 6 (3) : 395-401) . Un dedo RING tiene dos variantes, el tipo C3HC4 y un tipo (dedo RING-H2) que tiene un patrón de cisteína/histidina diferente.
Una "etiqueta de secuencia expresada" (j"EST", por sus siglas en inglés) es una secuencia de ADN derivada de una genoteca de ADNc y, por lo tanto, es una secuencia que ha sido transcrita. Una EST se obtiene, típicamente, irediante un paso de secuenciamiento único de un inserto de ADNc. La secuencia de todo el inserto de ADNc se denomina "secuencia de inserto completo" ("FIS", por sus siglas en inglés). Una secuencia de i "cóntigos" es una secuencia integrada de dos q más secuencias que se pueden seleccionar de, pero no se limitan a, el grupo que consiste de una EST, una FIS y una secuencia de PCR. Una secuencia que codifica una proteína entera jo funcional se denomina "secuencia completa de genes" ("CGS",j por sus siglas en inglés) y puede derivarse de una FIS o un contigo.
Un "rasgo" se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o de una célula o material vegetal determinado. En algunos casos, esta característica se puede observar a simple vista, tal como el tamaño de la semilla o la planta, o puede medirse por medio de 1 técnicas bioquímicas, tales como la detección del contenido de proteínas, almidón o aceite de la semilla o las hoj,as o mediante la observación de un proceso metabólic<p o fisiológico, por ejemplo, por medio de la medición de la jtolerancia a la privación de agua o concentraciones específicas de sal o azúcar, o por medio de la observación del nivel de expresión de uno o varios genes, o mediante observaciones agrícolas, tales como la producción o la tolerancia al estrés osmótico.
"Característica agronómica" es un parámetro medible que incluye, pero no se limita a, verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno én la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno | en un tejido vegetativo, contenido total de aminoácidos j libres en la planta, contenido de aminoácidos libres ejn los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, toléremela a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés por temperaturas bajas.
La biomasa aumentada puede medirse, por ejemplo, como un aumento en la altura de la planta, área total de la hoja de la planta, peso fresco de la planta, peso seco de la planta o producción de la semilla de la pllnta, cuando se compara con plantas de control.
La capacidad para aumentar la biomasa o el tamaño de una planta tendría varias aplicacionejs comerciales importantes. Se podrían generar especies dé cultivos que produzcan cultivares más grandes y, por lo tanto, una mayor producción, por ejemplo, de las plantas cuya porción vegetal es útil como alimento, biocombustible o ambos j El tamaño aumentado de la hoja podría ser de especial interés. El aumento en la biomasa de la hoj;a puede usarse para incrementar la producción de productos j industriales o farmacéuticos derivados de las plantas. Un j aumento en la fotosíntesis total de la planta se obtiene, típicamente, por medio del aumento del área de la hoja de la j planta. Podría usarse una capacidad fotosintética adicionalj para aumentar la producción derivada de un tejido vegetal I específico que incluye las hojas, raíces, frutos o semillas, o permitir el crecimiento de una planta con una intensidad) de luz menor o con una intensidad de luz alta. | La modificación de la biomasa de otro tejado, tal como el tejido de la raíz, podría ser útil para mejorjar la capacidad í de la planta para crecer en condiciones ambieritales rigurosas que incluyen la sequía o la privación de nutrijentes, debido a que las raíces más largas podrían llegar con jmayor facilidad al agua o a los nutrientes o captar agua o nutijientes.
Sería altamente deseable que algunas plantas ornamentales pudieran proporcionar variedades más grandes. En el caso de varias plantas que incluyen árboles frutales, árboles usados para la producción de maderja o árboles y arbustos útiles como pantalla frente al viento o que tapan la visión, una altura mayor proporciona más beneficios en forma de una mayor producción o una mayor protección.
"Transgénico" se refiere a cualquier j célula, línea celular, callo, tejido, parte de la planta ¡o planta, cuyo i genoma se ha alterado mediante la presencia de un ácido i nucleico heterólogo, tal como un constructo de ADN i recombinante , que incluye los eventos transgé icos iniciales así como los creados mediante cruces sexualeé o propagación asexual a partir del evento transgénico inicial. Como se usa í en la presente descripción, el término "transgénico" no abarca la alteración del genoma (dromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo de vegetales o por eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante , transformación bacterial no recombinante , transposición no recombinante o mutación espontánea.
El término "genoma", como se aplica ja las células vegetales, abarca no sólo el ADN cromosómico que se encuentra dentro del núcleo, sino también el ADN del organelo que se encuentra en los componentes subcelulares (por ejemplo, mitocondrial , plástido) de la c lula.
"Planta" incluye lo referente a plar.tas completas, órganos de plantas, tejidos de plantas, semillas, células vegetales y progenie de éstas. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivosj en suspensión, embriones, regiones meristemáticas , tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas.
"Progenie" comprende cualquier generación subsiguiente de una planta. ; "Planta transgénica" incluye lo referente a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. Por ejemplo, el polinucleótido heterólogo está integrado de manera estable dentro del genoma de manera tal que el polinucleótido se transmita a generaciones! sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un constructo de ADN recombinante.
"Heteróloga" , con respecto a una secuencia, se refiere a una secuencia que se origina de una especie foránea o de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma natural en composición y/o locus genómico p^r intervención humana intencional . j i Los términos "polinucleótido", "secuelicia de ácido nucleico" , "secuencia nucleótida" o "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que, opcionalmente, contiene bases nucleótidas sintéticas, no naturales o alteradas. Se hace referencia a los nucleótidos (que se encuentran usualmente en su forma 5 ' -monofosfato) por su designación con una única letra de la siguiente manera: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para ARN o ADN respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para las purinas (A o G) , "Y" para las pirimidinas (C o T) , "K" jpara G o T, "H" i para A, C o T, "I" para adenosina, y "N" j para cualquier nucleótido. j Los términos "polipéptido" , "péptido" , ! "secuencia de aminoácidos" y la presente descri os de aminoácido. de aminoácidos en o son un análo do correspondiente de aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido" , "péptido" , "secuencia de aminoácidos" y "proteína" también son inclusivos de modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, unión lipídica, sulfación, gamacarboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación del ADP. j "ARN mensajero (ARNm) " se refiere al ARNj sin intrones y se puede traducir en proteína por medio de la célula.
"ADNc" se refiere a un ADN complementario a y sintetizado a partir de un molde de ARNm med ante el uso de la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o se puede convertir a la forma bicatenaria con el uso del fragmento Klenow de la ADN polimerajsa I.
Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado j después de la traducción, es decir, un polipéptido del cual se eliminó alguno de los pre o propéptidos presentes en el producto primario de traducción. I Proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción del ARNm; es decir, cuando los pre o propéptidos aún están presentes. Los pre y propéptidos pueden ser, pero no se limitan a, señales intracelulares de localización.
"Aislados" se refiere a materiales tales , como moléculas de ácidos nucleicos y/o proteínas sustancialmente libres o eliminados de algún modo de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con los materiales en | un ambiente de origen natural. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar a partir de una célula huésped donde se originan naturalmente. Se puede usar métodos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos para los expertos para obtener polinucleótidos aislados. El término también abarca polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente. | "Recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de una secuencia separados de alguna manera, por ejemplo, por síntesis química o jnanipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. "Recombinante" también incluye lo referente a una célula o vector que ha ¿ido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una célula derivada de una célula ya modifjicada, pero no abarca la alteración de la célula o vector mediante eventos de origen natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural) tales como los , ocurridos sin intervención humana intencional.
"Constructo de ADN recombinante" se refiere a una combinación de fragmentos de ácidos nucleicos que, normalmente, no se encuentran juntos en la naturaleza. Por lo tanto, un constructo de ADN recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, peijO dispuestas de una manera diferente a como se encuentran en lja naturaleza.
Los términos "clon de entrada" y "vectorj de entrada" se usan indistintamente en la presente descripción.
"Secuencias reguladoras" se refiere a las secuencias de nucleótidos que están ubicadas 5' (secjuencias 5' no codificantes), dentro o corriente abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del A N o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación . Los términos "secuencia reguladora" y "elementoj regulador" se usan indistintamente en la presente descripción.
"Promotor" se refiere a un fragmento de j ácido nucleico con la capacidad de controlar la transcripción de otro fragmento de ácido nucleico.
! I "Promotor funcional en una planta" es un¡ promotor capaz de controlar la transcripción en células vegetales independientemente de que se origine en una célula vegetal.
Los términos "promotor específico para el tejido" y "promotor preferido del tejido" se usan indistintamente y se refieren a un promotor que se expresa predominantemente, pero no necesariamente exclusivamente, en un tejido u órgano, pero que también se puede expresar en una célula específica.
"Promotor regulado por el desarrollo" s|e refiere a un promotor cuya actividad esta determinada por ¡los eventos del desarrollo .
"Operacionalmente unido" se refiere a lá asociación de fragmentos de ácidos nucleicos en un solo fragmento de modo que la función de uno es regulada por la fuijición del otro. Por ejemplo, un promotor está operacionalmente unido con un fragmento de ácido nucleico cuando puede regular la transcripción de ese fragmento de ácido nucleico.
La "expresión" se refiere a la producción de un producto funcional. Por ejemplo, la expiresión de un fragmento de ácido nucleico se puede referir a la transcripción del fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, la transcripción resultante en ARNm o ARN funcional) y/o la traducción de ARNm en una proteína precursora o madura.
"Fenotipo" se refiere a las características perceptibles de una célula u organismo.
"Introducido",, en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) en una célula, significa "transíección" , "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica, en donde el fragmento de ácido nucleico se puede incorporar en el genon(ia de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídicp, plástido o mitocondrial ) , convertido en un replicón autónomo o expresado transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectajdo) .
Una "célula transformada" es cualquier célula en la cual se ha introducido un fragmento de ácido j nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) .
"Transformación" , como se usa en la presente descripción, se refiere tanto a la transfojrmación estable como a la transitoria.
"Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un genoma de un organismo huésped que produce una herencia genéticamente estable. Una vez transformado de manera estable, el fragmento de ácido nucleico se integra establemente en el genom^ del organismo huésped y cualquier generación posterior.
"Transformación transitoria" se refiere a la introducción de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u orgánulo que contiene ADN, de un organismo huésped que resulta en una expresión genética sin herencia genéticamente e!stable.
El "alelo" es una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus determinado en un cromosoma. Cuando los alelos presentes en un locus dado en un par de cromosomas homólogos en una planta diploide son iguales, esa planta es homocigota para ese locus. Si los apelos presentes en un locus dado en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide difieren, esa planta es heterocigota para ese locus . Si un transgén está presente en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide, esa planta es hemicigota para ese locus.
Un "péptido de tránsito al cloroplasto" es. una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al cloroplasto u otros tipoj de plástidos presentes en la célula en la cual se elabora la proteína. "Secuencia de tránsito al cloroplasto" se j refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una prote:ína y dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeels (lf991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol . 42:21-53) . Si la proteína se dirigierá a una vacuola, también se puede añadiir una señal de dirección vacuolar (más arrijba) , y si se dirig¡irá al retículo endoplásmico, se podría añadir una señal de] retención del retículo endoplásmico {más arriba) . Si l proteína se dirigierá al núcleo, cualquier péptido señéLl presente se debería eliminar e incluir en su lugar luna señal de I localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632) . Un "péptido señal mitocondrial" es una secuencia de aminoácidos que dirige una proteína prejcursora a la mitocondria (Zhang y Glaser (2002) Trends Plañí Sci 7:14-21) .
Los cálculos de alineamientos de secuencias y porcentajes de identidad se pueden determinar por medio del uso de una variedad de métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas, que incluye , pero no se limitan a, el programa MEGALIGN® del paquete bioinformático LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI ) . A¡ menos que se indique de otra manera, se realizaron múltiples alineamientos de las secuencias proporcionadas en la í presente invención con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros predeterminados (PENALIZACION DE IjNTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACION DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10 ) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y para el cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el método Clustal V son KTUPLE=1, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS= 5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN=5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las ! secuencias, el programa Clustal V se puede usar para obteLer valores de i "porcentaje de identidad" y "divergencia"| mediante la lectura de la tabla de "distancias de secuencias" del mismo programa; a menos que se indique de otra manera, los porcentajes de identidad y divergencias proporcionados y i reivindicados en la presente invención se calcularon de esta forma. I Las técnicas estándar de clonación molecular y de DNA recombinante usadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen con mayor detalle eij Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratjory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante, "SamjDrook' Ahora, en cuanto a las modalidades: Las modalidades incluyen polinucleótidos y polipéptidos aislados, constructos de ADN recombinante útilés para conferir tolerancia a la sequía, composiciones (tales j como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de ADN recombinante y métodos que usan estos constructos de ADN recjombinante .
Polinucleótidos y polipéptidos aislados: j La presente invención incluye los siguientes polinucleótidos y polipéptidos aislados: í Un polinucleótido aislado que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido c¿ )n una secuenci de aminoácidos de por lo menos 50 % , 51 %, 52 % , 53 %, 54 % 55 %, 56 %, 57 %, 58 o, o / 59 %, 60 ¾ / 56 %, 62 % , 63 %, 64 % 65 %, 66 %, 67 %, 68 Q. %, 69 %, 70 ¾ / 71 %, 72 % , 73 %, 74 % 75 o¾, , 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 o. o , 81 %, 82 Q.
"O , 83 %, 84 % 85 %, 86 % , 87 %, 88 "o / 89 %, 90 g, "O / 91 %, 92 % , 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 % , 99 % o 100 ¾ de identidad de secuencia en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, ¡22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 33; o (ii) un complemento total de | la secuencia de ácido nucleico de (i) , en donde el complemento total y la secuencia de ácido nucleico de (i) consisten cjel mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios. Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinarjte (incluso las constructos de ADN supresor) de la presentej invención. El polipéptido es, preferentemente, un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4). treferentemente, el polipéptido tiene actividad de tolerancia a ja sequía.
Un polipéptido aislado con una secuencial de aminoácidos de por lo menos 50 % 51 % 52 53 54 55 56 % 57 58 59 60 56 , 62 63 64 %, 65 66 % 67 68 69 70 71 , 72 73 74 %, 75 76 % 77 78 79 80 81 , 82 %, 83 84 85 86 % 87 88 , 89 90 91 , 92 93 94 ¾ 95 96 % 97 98 , 99 o 100 % de identidad de secuencia , en bas al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21., 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33. El polipéptido es, preferentemente, un polipéptido de la familia de dedos de zinc '(dedo RING del tipo C3HC4). Preferentemente, el polipéptido iiene actividad i de tolerancia a la sequía. 1 Un polinucleótido aislado que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50^ %, 51 %, 52 %, 28, 30 o 32.; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) . Cualquiera de los ¡polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante (incluso las constructos de ADN supresor) de la presente invención. Preferentemente, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4). preferentemente, el polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) tiene actividad de tolerancia a la sequía .
Constructos de ADN recombinante y constructos de ADN supresor: En un aspecto, la presente invención incluye constructos de ADN recombinante (incluso constructos de ADN supresor) .
En una modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo i menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el : polinucleótido i comprende (i) una secuencia de ácido nucleido que codifica una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 92 93 "o / 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 9 9 % o 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento I Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) .
En otra modalidad un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinucleótido comprende (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 o ¾ , 51 o , 52 "o / 53 "o / 54 ° ; 55 56 %, 57 ·» / 58 %, 59 o / 60 ¾ / 56 % , 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 71 , 72 %, 73 %, 74 %, 75 76 %, 77 %, 78 %, 79 ° f 80 81 o, *S , 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 ¦o , 90 o, 91 , 92 93 94 %, 95 %, 96 %, 97 1, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuenci , en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara cón la sec. con núm. de ident. : 16, 18, 26, 28, 30 32; (ÍÍ: un complemento total de la secuencia de ácido nucllee:ico de (i) . t En otra modalidad un constructo de AE)N recombinante comprende un polinucleótido unido operacionaüjmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejempljo, un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido de la familia de dedojs de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) . Preferentemente, el poLipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) tiene actividad de tolerancia a la sequía. El poljipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) podría ser de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja y Glycine tomentella.
En otro aspecto la presente invención incluye constructos de ADN supresor.
Un constructo de ADN supresor podría co†prender por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a (a) todo o parte de: (i) una secuencia de ácido nucleico jque codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 51 "o , 52 ° / 53 o / 54 o / 55 o 56 %, 57 0 í 58 ? Í 59 %, 60 56 , 62 %, 63 64 65 o / 66 %, 67 "ó , 68 o / 69 o / 70 %, 71 "5 , 72 "S , 73 %, 74 %, 75 76 .%, 77 %, 78 79 %, 80 "O / 81 % , 82 ¦o , 83 ¦s , 84 0 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 o / 93 o ; 94 95 ° f 96 %, 97 : > , 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia , en base al mé odo de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33, o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; o (b) una región derivada de todo o parte de un secuenciador o cadena no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de' ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 % 57 %, 58 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 % 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 % 77 %, 78 %, 79 ° / 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 85 %, 86 % 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 95 %, 96 % 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de sec al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de donde se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4); o (c) todo ó parte de: (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 51 52 , 53 54 55 56 57 58 59¡%, 60 %, 56 62 , 63 64 65 66 67 %, 68 %, 69 I %, 70 %, 71 72 % , 73 %, 74 75 76 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 , 83 %, 84 %, 85 %, 86 87 88 89 ,%, 90 %, 91 %, 92 , 93 94 %, 95 % , 96 97 % , 98 99 % o 100 de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento I Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm . de ident . : 16, 18, 26, 28, 30 o 32, o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (c) (i) . El coristructo de ADN supresor podría comprender un constructo cosupresor, un constructo no codificante, un constructo de supresión viral, un constructo supresor de horquilla, un constructo supresor de tallo-lazo, un constructo productor de AR | bicatenario, un constructo iAR o un constructo de ARN pequeño (por ejemplo, un constructo ARNip o un. constructo miARN) .
Se entiende, tal como apreciarán aquellos con experiencia en la técnica, que la invención abarca otras secuencias además de las secuencias ilustrativas específicas. En la técnica se conocen bien las alteraciones de un fragmento dé ácido nucleico que resultan en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado pero que no afectan la propiedades funcionales del polipéptido codificado. Por ejemplo, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como la glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como la valina, la leucina o la isoleucina . De manera similar, también se puede esperar cambios que j resultan en la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico para ácido glutámico, o un | residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por I arginina, para producir un producto funcionalmente equivalente^. Además, no se espera cambios de nucleótidos que resultan en lia alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de polipéptido para alterar la actividad del polipéptido. Cada una de las modificaciones propuestas permanece dentjro de la rutina de la técnica, como lo hace la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados.
"Constructo de ADN supresor" es un constructo de ADN recombinante que al transformarse o integrarse de manera estable en el genoma de. la planta, resulta en el supres n de los n veles del ARNm o jproteína enzima expresada por el gen objetivo y/o el nivel ¿e la actividad enzimática o de la funcionalidad proteica] Los términos I ¦ "supresión", "suprimir" y "silenciamiento", usados indistintamente en la presente descripción i: cluyen: bajar, reducir, decaer, disminuir, inhibir, eliminar o evitar.
"Silenciamiento" o "silenciamiento génico" nci especifica el i mecanismo y es inclusivo y no se limita a no codificación, i I cosupresion, supresión viral, supresión de horquillas, I I supresión de tallo-lazo, aproximaciones basadas en iARN y métodos basados en AR pequeños.
I Un constructo de ADN supresor puede jcomprender una región derivada de un gen objetivo de interés y puede comprender total o parcialmente la secuencia de ácido nucleico del secuenciador (o cadena no codificante) del gen objetivo de interés. Dependiendo del método a usar, la región 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 "o / 91 %, 92 %, 93 % , 9 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica) a tod( 3 o parte del secuenciador (o cadena no codificante) del geni de interés.
Los constructos de ADN supresor se conocen bien en la técnica, se construyen fácilmente una vez se seleccione el gen objetivo de interés e incluyen, pero no se limitan a, constructos cosupresores , constructos no codificantes , constructos de supresión viral, constructos supresores de horquilla, constructos supresores de tallo- lajz.o, constructos productores de ARN bicatenario y, más generalmente , constructos de iAR (ARN de interferencia) y constructos de ARN pequeños tales como constructos de ARNip (ARN de interferencia corta) y constructos de miARN (microARN) .
"Inhibición no codificante" se refiere a la producción de transcritos de ARN no codificante con la capacidad de suprimir la expresión del gen objetivo o producto génico. "ARN no 5,107,065). La complementariedad de un ARN no codificante puede ser con cualquier porción del transcrito genético específico, es decir, en la secuencia 5 codificante, secuencia 3' no codificante, intrones o secuencia codificante.
"Cosupresión" se refiere a la producción! de transcritos de ARN mensajero con la capacidad de suprimir La expresión del gen objetivo o producto génico. ARN "mensajero" se refiere al transcrito de ARN que incluye el ARNm y que puede traducirse en proteína dentro de una célula o in vitro. Anteriormente, se han diseñado constructos cosupresores en las plantas mediante el enfoque de la sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico con homología a un ARNm nativo, enj el sentido de orientación, que reduce todo el ARN con homología a la secuencia sobreexpresada (véase Vaucheret et al., Plant J. 16:651-659 (1998); y Gura, Nature 404 : 804-808 (¡2000)).
Otra variación describe el uso de las secuencias virales de las plantas para dirigir la supjresión de mRNA proximal que codifica secuencias (Publicación PCT núm. WO 98/36083 publicada el 20 de agosto de 1998) . ; j La interferencia del ARN se refiere jal proceso de silenciamiento génico postranscripcional jespecífico de secuencia en los animales, mediado por ^R cortos de interferencia (ARNip) (Fire et al., Nature 3^1:806 (1998)). El proceso correspondiente en plantas | se denomina, comúnmente, silenciamiento génico postranscripjcional (SGPT) o silenciamiento de ARN, así como represión en hongos . Se cree que el proceso de silenciamiento de1 genes post transcripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente usado para prevenir la expresión de genes foráneos y es comúnmente compartido por .diversos flora y phylo. (Fire y col., Trends Genet . 15:358 (1999)).
Los ARN pequeños juegan un papel importante en el control de la expresión genética. La regulación de varios procesos del desarrollo, que incluyen la floración, está coritrolada por ARN pequeños. Ahora es posible crear cambios en la expresión genética de los genes vegetales mediante el usó de constructos transgénicos que producen ARN pequeños en la pianta.
Al parecer, los ARN pequeños funcionan por apareamiento de bases con ARN complementario o con secuencias objetivo de ADN. Al unirse con ARN, los ARN pequeños accionan ya sea el clivaje del ARN o la inhibición de traducción de la secuencia objetivo. Al unirse con secuenciás objetivo de ADN, se piensa que los ARN pequeños pueden mediar la metilación de ADN de la secuencia objetivo. La consecuencia de estos eventos, independientemente del mecanismo específico, es que la expresión genética se inhibe.
Los microRNA (miRNA) son RNA no codificantes de 19 a 24 nucleótidos (nt) de largo que se han identificado tanto en animales como en plantas (Lagos-Quintana yj col., Science 294:853-858 (2001), Lagos-Quintana y col., Currj. Biol . 12:735- 739 (2002); Lau et al., Science 294:858-862 (2001) ; Lee y Ambros, Science 294:862-864 (2001); Llave et jal., Plant Cell 14:1605-1619 (2002); Mourelatos et al., Genes. Dev. 16:720-728 (2002); Park y col., Curr. Biol. 12:1484-1495 j[2002); einhart y col., Genes. Dev. 16:1616-1626 (2002)). Estcjs s.e procesan a partir de transcritos precursores más largos que en tamaño se encuentran en el intervalo de aproximadamentej 70 a 200 nt y estos transcritos precursores tienen la capacidad de formar estructuras de horquilla estables.
Los microRA (miRNA) son RNA no codificantes de 19 a 24 nucleótidos (nt) de largo que se han identificado tanto en animales como en plantas (Lagos-Quintana y col., Science 294:853-858 (2001), Lagos-Quintana y col., Curr. Biol. 12:735- 739 (2002); Lau et al., Science 294:858-862 (2001) ; Lee y Ambros, Science 294:862-864 (2001); Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 (2002); Mourelatos et al., Genes. ¡Dev. 16:720-728 I (2002); Park y col., Curr. Biol. 12:1484-1495 (2002); Reinhart y col., Genes. Dev. 16:1616-1626 (2002)) . Estos se procesan a partir de transcritos precursores más largos que en tamaño se encuentran en el intervalo desde aproximadamente 70 hasta 200 nt y estos transcritos precursores tienen .a capacidad de formar estructuras de horquilla estables.
Secuencias reguladoras: j Un constructo de ADN recombinante (que incluye un constructo de ADN supresor) de la presente invención podría comprender por lo menos una secuencia reguladqra.
Una secuencia reguladora podría ser un prjomotor.
Se puede usar una gran variedad de promotores en los constructos de ADN recombinante de la presente invención. Los promotores se pueden seleccionar en baáe al resultado deseado y podrían incluir los promotores j constitutivos, específicos del tejido, inducibles u otros promotores para la expresión en el organismo huésped. j Los promotores que hacen que un gen sej exprese en la mayoría de los tipos de células, la mayoría ¿le las veces se denominan comúnmente "promotores constitutivos" .
La expresión constitutiva de alto nivel del gen candidato bajo control del promotor 35S o IJBI puede tener efectos pleiotrópicos , aunque la eficacia de| gen candidato se puede determinar cuando lo acciona! un promotor constitutivo. El uso de promotores específicos para el tejido y/o el estrés podría eliminar lcLs efectos no deseados, pero retener la capacidad de mejorair la tolerancia a la sequía. Este efecto se ha observado en Arabidopsis (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol . 17:287-91).
Los promotores constitutivos adecuados para usar en una célula de la planta huésped incluyen, por ejemplo, el promotor I mínimo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. WO 99/43838 y eri la patente de I los Estados Unidos núm. 6,072,050; el promotor [mínimo CaMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985) ) ; áctina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (199^)) ) ; ubiquitina (Christensen et al . , Plant Mol. Biol . 12:619-632 (1989) y Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992) ) ; pEMU (Last et al., Theor. Appl . Genet . 81:581-58^8 (1991) ) ; MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984) )j; promotor ALS (patente de los Estados Unidos núm. 5,659,02†>) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, pojr ejemplo, los mencionados en las patentes de los Estados Unidos núms . 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,5^7; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611.
Al seleccionar un promotor para ser usado en los métodos de la invención, puede que se prefiera un promotor específico para el tejido o regulado por el desarrollo.
Un promotor específico para el tejido o regulado por el desarrollo es una secuencia de ADN que regula ¡la expresión de una secuencia de ADN selectivamente en las células/tej idos de una planta, crítico para el desarrollo de la panoja, las semillas o ambos y limita la expresión de la secuencia de ADN al período de desarrollo de la panoja o a la maduración de las semillas en la planta. En los métodos jde la presente invención se puede usar cualquier promotor identificable que cause la expresión temporal y espacial deseada1 Los promotores específicos de las semilla^ o embriones y í que podrían ser útiles en la invención incluyen jel inhibidor de tripsina Kunitz del frijol de soya (Kti3, Jofüku y Goldberg, Plant Cell 1:1079-1093 (1989)), patatina (tubé'rculos de papa) (Rocha-Sosa, . , et al. (1989) EMBO J. 8:23-2^), convicilina, vicilina y legumina (cotiledones de chícharos) [(Rerie, .G., et al. (1991) Mol. Gen. Genet . 259:149-157; Newbigin, E.J., et al. (1990) Planta 180:461-470; Higgins, T.J.V., et al. (1988) Plant. Mol. Biol. 11:683-695), zeína (endosperma del maíz) (Schemthaner, J.P., et al. (1988) EMBO J. 7:1249-1255), faseolina (cotiledón del frijol) (Segupta-Gopalan, C. , et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 82:3320-3324), fitohemaglutinina (cotiledón del frijol) (Voelker, T. et al. (1987) EMBO J. 6:3571-3577), B-conglicinina y glicinina (cotiledón del frijol de soya) (Chen, Z-L, et al. (1988) EMBO J. 7:297- 302), glutelina (endosperma de ajrroz) , hordeína (endosperma de cebada) (Marris, C. , et al. (ip88) Plant Mol. Biol. 10:359-366), glutenina y gliadina (endosperma de trigo) (Colot, V., et al. (1987) EMBO J. 6:3559-3564) y esporamina (raíz tuberosa del camote) (Hattori, T., et al . (1990) Plant Mol. Biol. 14:595-604). Los promotores de genes específicos de semillas unidos operacionalmente a regionejs codificantes heterólogas en constructos de genes quiméricos mantienen su estructura de expresión temporal y espacial en las plantas transgénicas . Tales ejemplos incluyen al promotor genético de proteína de almacenamiento de semilla 2S de Arabidopsis thaliana para expresar péptidos de encefaliña I en semillas de Arabidopsis y Brassica napus (Vanderkerckhove et al . , Bio/Technology 7: L929-932 (1989)), promotores1 de lectina de frijol y beta-faseolina de frijol para expresar luciferasa (Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57 (1989)) y promotores de I glutenina de trigo para expresar | cloranfenicol acetiltransferasa (Colot et al., EMBO J 6:3559- 3564 (1987)) .
Los promotores inducibles expresan selectivamente una secuencia de ADN operacionalmente unida en respuesta de un estímulo endógeno o exógeno, por ejemplo, por compuestos químicos (inductores químicos) o en respuesta de señales ambientales, hormonales, químicas y/o del desarrollo. Los promotores inducibles o regulados incluyen, pLr ejemplo, los promotores regulados por luz, calor, estrés inundación o sequía, f itohormonas , lesiones, o sustancias químicas, tales como etanol, jasmonato, ácido salicílico o sustancias i protectoras. I Los promotores a ser usados en la presente invención incluyen los siguientes: 1) el promotor RD29A inducible por estrés (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnll . 17:287-91) ; I 2) el promotor de cebada, B22E; la expresión de B22E es específica para el pedicelo en granos de maíz en desarrollo ("Primary Structure of a Novel Barley Gene Dif ferentially Expressed in Immature Aleurone Layers" . Klemsdal, S.S. et al., Mol. Gen. Gene . 228 (1/2) : 9-16 (1991)) ; y 3) el promotor del maíz, Zag2 ("Identification ¡ and molecular characterization of ZAG1, the maize hc olog of the i Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS" , S¿hmidt, R.J. et al.( Plant Cell 5(7):729-737 (1993) | "Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS- like MADS box genes from maize", Theissen et al . Gene 156 (2 ): 155-166 (1995); núm. de registro del GenBank del NCBI X80206) ) . Los transcritos Zag2 se pueden detectar 5 días antes de la polinización hasta 7 a 8 días después de la polinización ( "DDP" ) | y dirigen la expresión en el carpelo de inflorescencias hembra en desarrollo y Ciml que es específico para el núcleo de granos de maíz en desarrollo. El transcrito Ciml sej detecta 4 a 5 días antes de la polinización hasta 6 a j 8 DDP. Otros promotores útiles incluyen cualquier promotor que pueda derivarse de un gen cuya expresión jesté asociada i maternalmente con cogollos hembra en desarrollo.
Los promotores adicionales para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en plantas son los promotores específicos del tallo. Tales promotores específicos del tallo incluyen el promotor S2A de alfalfa (núm. de registro del GenBank EF030816; Abrahams et al., Plant Mol. Biol . 27:513-528 (1995)) y el promotor S2B I (núm. de registro del GenBank EF030817) y similares, incorporados en la presente invención como refe;rencia.
Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores distintos que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos sintéticos de ADN. Los experimentados en la técnica entienden qije los distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos de células diferentes, o en distintas etapas del desarrollo, o en respuesta a condiciones ambientales diferentes. Se reconoce, además, que dado que en la mayoría de los casos los límites precisos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de alguna variación pueden tener una activjidad promotora idéntica. Los promotores que hacen que un gen se exprese en casi todos los tipos de células la mayoría ¿le las veces se mencionan comúnmente como "promotores i constitutivos" . Constantemente, se descubren promotores nuevos de variados tipos útiles en células vegetales; varios ejemplos pueden encontrarse en la compilación realizada por Okamuro, J. K. , y Goldberg, R. B., Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989). i Los promotores que se van a usar en la presente invención podrían incluir: RIP2, mLIP15, ZmCORl, Rabl7, CaMV 35S, RD29A, B22E, Zag2 , SAM sintetasa, ubiquitina, CaMV 19S, nos, Adh, sacarosa sintasa, R-alelo, los promotores preferidos para el tejido vascular S2A (número de registro i del GenBank EF030816) y S2B (número de registro del GenBank EF030817) y el promotor constitutivo G0S2 de Lea mays. Otros comprende, además, un potenciador o silenciadorj.
Se puede agregar una secuencia de intrones a la región 5' no. traducida, la región codificante de proteínas o la I región 3' no traducida para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol . La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en los constructos de expresión, tanto de plantas como de animales, ha demostrado incrementar la expresión genétiia tanto en los niveles de ARNm como en los de proteína hasjta 1000 veces.
Buchman and Berg, Mol. Cell Biol . 8:4395-4405¡ (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987).
Se puede seleccionar cualquier pl†nta para la identificación de secuencias reguladores y genes del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) que se usarán en los constructos de ADN , recombinante de la presente invención. Los ejemplos de plantas objetivo adecuadas para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, alfalfa, manzana, chabacano, Arabidopsis, alcachofa, rúgulcL, espárragos, aguacate, banana, cebada, frijoles, betabel, zarzamora, arándano vaccinio, brócoli, coles de brusela^, col, cañóla, cantalupo, zanahoria, mandioca, semilla de ri|cino, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, cítrico-i, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, arándano,! pepino, abeto Douglas, berenjena, endibia, escarola, eucajlipto, hinojo, higueras, ajo, calabaza, uva, toronja, melón de pulpa verde, jicama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, linaza, mango, melón, champiñones, nectarina i nuez, avena, i palma aceitera, aceite de colza, quingombó, aceituna, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, chícharos, melocotón, cacahuate, pera, chile, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada roja, álamo, papa, i calabaza, membrillo, pino de Monterrey, achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino palustre, frijol de soya, espinaca, calabacín, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, camote, árbol de ámbar, mandarina, té, tabaco, tomate, triticai, césped, nabo, una vid, sandía, trigo, ñames y calabacín.
Composiciones : Una composición de la presente invención es una planta que comprende en su genoma cualquiera de los constructos de ADN recombinante (que incluyen cualquiera de los constructos de ADN supresor) de la presente invención (tal como cualquiera de los constructos mencionados anteriormente) . Las composiciones incluyen, además, cualquier progenie de la planta y cualquier semilla obtenida de la planta o su progenie, en donde la progenie o semilla comprende dentro de su genoma el constructo de ADN recombinante (jo constructo de ADN supresor) . La progenie incluye generaciones posteriores obtenidas mediante la autopolinización o cruce^ de una planta.
La progenie también incluye híbridas y .
En cultivos propagados por se ridas, las plantas transgénicas maduras pueden zarse para producir una planta endogámica homocigotja. La planta endogámica produce semillas que contienen j el constructo recientemente introducido de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) . Estas semillas se puedeni cultivar para producir plantas que exhibirían una característica agronómica alterada (por ejemplo, una característijca agronómica incrementada, opcionalmente, en condiciones de¡ agua limitada) o usarse en un programa de cultivos para producir una semilla híbrida que se puede cultivar para producir plantas que exhibirían la característica agronómica alterada. Las semillas podrían ser semillas de maíz. j La planta podría ser una planta morjocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya, tal como una planta híbrida de maízj o una planta endogámica de maíz. La planta podría ser, aclemás, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz , j cebada o mijo.
El constructo de ADN recombinante | podría estar integrado establemente en el genoma de la plaijta.
Las modalidades particulares incluyen; pero no se limitan a: 1. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia ! reguladora , en donde ese polinucleót ido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 1 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 ¦s , 58 59 60 56 62 63 %, 64 %, 65 %, 66 67 68 69 70 %, 71 72 73 %, 74 75 %, 76 %, 77 78 79 %, 80 81 %, 82 83 %, 84 85 %, 86 %, 87 88 %, 89 %, 90 !%, 91 %, 92 93 %, 94 95 % 96 %, 97 %, 98 % 99 1 o 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33, y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que noj comprende ese constructo de ADN recombinante . La planta podría exhibir, además, una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara con la planta de control . 2. Una planta (por ejemplo, una pljanta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) , y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante. La j planta podría exhibir, además, una alteración de por j lo menos una característica agronómica .cuando se compara con la planta de control . 3. Una planta (por ejemplo, una pLanta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4), y en donde esa planta exhibe una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . 4. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinu'cleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido codifica un polip'éptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 53 %, 54 55 %, 56 57 58 59 60 56 %, 62 %, 63 %, 64 65 %, 66 67 68 69 70 o / 71 72 %, 73 %, 74 75 %, 76 77 78 79 80 81 82 83 %, 84 85 %, 86 %, 87 88 89 90 91 92 93 %, 94 o 95 % 96 *, 97 98 % 99 O 100 de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con húm. de ident . : i 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o! 33, y en donde esa planta exhibe una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara ¡con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . 5. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elemento regulador unido operacionalmente a una región derivada de todo o parte de un secuenciador o cadena no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo. menos 50 % 51 %, 52 %, 53 54 %, 55 %, 56 % 57 %, 58 %, 59 %, 60 56 % , 62 %, 63 64 %, 65 %, 66 % 67 68 69 70 71 , 72 % , 73 74 75 %, 76 % 77 78 79 80 81 , 82 83 84 s. 85 %, 86 % 87 , 88 % 89 , 90 , 91 % , 92 % , 93 94 %, 95 96 % 97 %, 98 99 % o 100 % de identidad de seciíencia , en bas al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de donde se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido de la famil|a de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) , y en donde esk planta exhibe una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN supresor. ! 6. Una planta (por ejemplo, una pl nta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma uri constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elejnento regulador unido operacionalmente a la totalidad o par(te de (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un olipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, complemento total de la secuencia de ácido nucjleico de (a) , y j en donde esa planta exhibe una alteración de p|or lo menos una característica agronómica cuando se compara ccjn una planta de control que no comprende ese constructo de ADN| supresor. 7. Cualquier progenie de las plantas mencionadas í anteriormente en las modalidades 1-6, cualqu'ier semilla de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1· 6, cualquier semilla de la progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6 y las células de cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6 así como, la progenie de éstas.
En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, el polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) podría ser de Arabidopsis thaliana , e^ mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja o Glycine ella .
En cualquiera de las modalidades ante 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, constructo de ADN recombinante (o conslJructo de ADN supresor) podría comprender por lo menos un promotor funcional en una planta como una secuencia reguladora.
En cualquiera .de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente j invención, la alteración de por lo menos una característica agronómica es un incremento o una disminución. ¡ En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente intención, por lo menos la única característica agronómica podría seleccionarse del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la madurajción, peso seco en la maduración, producción de frutos, j producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno .en un tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres j en la planta, contenido de aminoácidos libres en los fruto^, contenido de I aminoácidos libres en las semillas, contenido de aminoácidos i libres en un tejido vegetativo, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido I de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía,J captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, tolerancia a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés de temperaturas bajas. Por ejemplo, la alteración de por lo menos una característica agronómica podría ser un aumento en la producción, verdorj o biomasa.
En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la planta podría exhibir la alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de agua limitada, con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante (o ese constructo de ADN supreáor) .
"Sequía" se refiere a una disminución en la disponibilidad de agua para una planta que, especialmente cuando es prolongada, puede dañar la planta o evitar su crecimiento adecuado (por ejemplo, limita el ! crecimiento de la planta o la producción de semillas) . I "Tolerancia a la sequía" es un rasgo de una planta para sobrevivir en condiciones de sequía durante periodos de tiempo prolongados sin exhibir un deterioro fisiológico o físico considerable.
La "actividad de tolerancia a la sequía" de un polipéptido indica que la sobreexpresión del jpolipéptido en una planta transgénica confiere a la planta transgénica una mayor tolerancia a la sequía en comparación ¡con una planta de referencia o de control.
La "mayor tolerancia a la sequía" de una planta se mide con respecto a una planta de referencia o de control, y es un rasgo de la planta para sobrevivir en condicjiones de sequía durante periodos de tiempo prolongados sin ejxhibir el mismo grado de deterioro fisiológico o físico conj respecto a la planta de referencia o de control cultivada eii condiciones de sequía similares. Típicamente, cuando una planta transgénica que comprende un constructo de ADN recombinantej o un constructo de ADN supresor en su genoma exhibe una mayor j tolerancia a la sequía con respecto a una planta de referencia <~> de control, la planta de referencia o de control no comprende j en su genoma el constructo de ADN recombinante o el constructo <jle ADN supresor.
Una persona de habilidad ordinaria en la técnica conoce los protocolos para simular condiciones de sequía y para evaluar la tolerancia a la sequía de plantas que se expusieron a condiciones de sequía naturales oj simuladas. Por ejemplo, se pueden simular condiciones de sequía si se suministra a las plantas una cantidad de aguja menor que la técnicas para evaluar la tolerancia a la seq¡uía incluyen la medición de la fluorescencia de la clorofilia, los índices fotosintéticos y los índices de intercambio dej gas.
Un experimento para probar el estrés de la sequía podría implicar un estrés crónico (es decir lenta de agua) y/o dos estreses agudcjs eliminación abrupta del agua) separados uno o dos días de recuperación. El estrés crónico podría dürar de 8 a 10 días. El estrés agudo podría durar de 3 a 5 días . Las siguientes variables podrían medirse durante el estrés de la sequía y los tratamientos de riego adecuado de plantas transgénicas y plantas de control relevantes : j La variable "¾ área chg_start chronic - acute2" es una medida del porcentaje de cambio en el área tojtal determinada por medio de captación remota de imágenejs de espectro visible entre el primer día de estrés crónico y el día del segundo estrés agudo.
La variable "% área chg_start chronic - end chronic" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinada por medio de captación remota de imágenes de espectro visible entre el primer día de estrés crónico y el último día de estrés crónico.
La variable "% área chg_start chronic - Íiarvest" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinada por medio de captación remota de imágenes de eLpectro visible entre el primer día de estrés crónico y el dial de cosecha.
La variable "% área chg_start chronic - -ecovery24hr" es ? una medida del porcentaje de cambio en |el área total determinada por medio de captación remota ¡de imágenes de espectro visible entre el primer día de. estrés crónico y las 24 horas de recuperación (24 horas después del estrés agudo 2) .
La variable "psii_acutel" es una medida de la eficacia del Photosystem II (PSII) al final del primer periodo de estrés agudo. Proporciona una estimación de la eficacia de las antenas del PSII para absorber la luz y se relaciona directamente con la asimilación de dióxido de carbono dentro de ja hoja.
La variable "psii_acute2" es una medida de la eficacia del Photosystem II (PSII) al final del segundo periodo de estrés agudo. Proporciona un cálculo de la eficacia de las antenas del PSII para absorber la luz y se relaciona directamente con la asimilación de dióxido de carbono dentro de la hoja.
La variable "fv/fm_acutel" es una medida del rendimiento cuántico óptimo (Fv'/Fm') al final del primer estrés agudo - (diferencia de fluorescencia variable entre la fluorescencia máxima y mínima / fluorescencia máxima) . : La variable "fv/fm_acute2" es una' medida del rendimiento cuántico óptimo (Fv'/Fm' ) al final del segundo estrés agudo - (diferencia de fluorescencia variable entre la fluorescencia máxima y mínima / fluorescencia máxima) .
La variable "leaf rolling_harvest" es una medida de la relación de la imagen superior a la imagen lateral en el día de la cosecha.
La variable "leaf rolling_recovery24hr' es una medida de la relación de la imagen superior a la imagen lateral 24 horas después de iniciada la recuperación. j La variable "índice de crecimiento específico (SGR, por sus siglas en inglés)" representa el cambio en el área de superficie total de la planta (medida con un instrumento Lemna Tec Instrument) en un solo día (Y(t) = Y0*er*t) . Y(t) = Y0*er*t es equivalente al % de cambio en ?/? t, en donde los términos individuales son los siguientes: Y(t) = Área de superficie total en t; YO = Área de superficie total inicijal (calculada) ; r = índice de crecimiento específico día"1, y tj = Días después de la plantación ( "DAP" , por sus siglas en inglés) .
La variable "peso seco del brote" es una medida del peso del brote 96 horas después de colocarlo en un horno a 104 °C.
La variable "peso fresco del brote" es ¡una medida del peso del brote inmediatamente después de cortarlo de la i planta.
Los ejemplos incluidos a continuación describen algunos protocolos y técnicas representativas para simular condiciones de sequía y/o para evaluar la tolerancia a la sequía.
Además, se puede evaluar la tolerancia a la sequía en base a la capacidad de una planta para mantenejr la producción suficiente (una producción de por lo menos 75¡ %, 76 %, 77 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 o "5 / %, 86 %, 87 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 o "o í %, 96 %, 97 98 %, 99 % o 100 %) determinada en condiciones de sequía natural o (pqr ejemplo, mediante la medición de una producción considerablemente equivalente en condiciones de sequía cuando se compara con condiciones que no implican sequía o mediante la medición de una pérdida menor de producción en condiciones de sequía cuando se compara con una planta de control o de referencia) .
Un experto en la técnica reconocería fácilmente una planta de control o de referencia adecuada para ser usada al evaluar o determinar una característica ¡ agronómica o fenotipo de una planta transgénica en cualquier modalidad de la presente invención donde se usa una planta de control (por ejemplo, las composiciones y métodos, tal como se describen en la presente descripción) . Por ejemplo, a manera de ilustraciones no limitantes: I 1. La progenie de una planta transjformada que es hemicigota con respecto a un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) , de tal jnanera que la progenie se segregue en plantas que comprenden o no comprenden el constructo de ADN recombinantej (o constructo de ADN supresor) : la progenie que comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) se mediría, típicamente, con respecto a la progenie que :io comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) (es decir, la progenie que no comprende el constructo de ADN recombinante (o el con†tructo de ADN supresor) es la planta de control o de referencia) . 2. Introgresión de un constrijcto de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) en una línea endogámica, tal como en el maíz o en una variedad, tal como en el frijol de soya: la línea introgresada se mediría, típicamente, con respecto a la línea de variedad o endogámica parental (es decir, la línea de variedad o endogámica parental es la planta de control o de referencia) . ! 3. Dos líneas híbridas, en donde la primera línea híbrida se produce a partir de dos línejas endogámicas parentales y la segunda línea híbrida se produce a partir de las mismas dos líneas endogámicas parentales cqn la diferencia de que una de las líneas endogámicas parentales contiene un constructo de ADN recombinante (o constructo de! ADN supresor) : la segunda línea híbrida se mediría, típicamentje , con respecto a la primera línea híbrida (es decir, la primerja línea híbrida es la planta de control o de referencia) . 4. Una planta que comprende un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la planta se podría evaluar o determinar en relación con | una planta de control que no comprende el constructo de AD ! recombinante (o constructo de ADN supresor) , pero que por ¿tro lado tiene antecedentes genéticos comparables con la planta (por ejemplo, comparte por lo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 94 95 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia del material genético nuclear en comparación con la planta que comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) . Existen varias técnicas de laboratorio disponibles para el análisis, la comparación y la caracterización de antecedentes genéticos de las plantas; entre ellas se incluyen: electroforesis isoenzimas , polimorfismo de la longitud de fragmentos restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD, por sus siglas en inglés) , reacción en cadena de la polimerasa con cebadores arbitrarios (??-PCR, por sus siglas en inglés) , análisis de amplificación de la huella del ADN (DAF, por sus siglas en inglés) , regiones amplificadas caracterizadas de secuencia (SCAR, por sus sigjlas en inglés) , polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP®) i y repeticiones de secuencia simple (SSR, porj sus siglas en inglés) conocidas, además, como microsatélites .j Además, un experto en la técnica reconocería fácilmente que una planta de control o de referencia ádecuada que se usa al evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica no incluiría una planta que haya sido seleccionada anteriormente, por mutagénesis o transformación, para la característica agronómica o fenotipo deseado .
Métodos : Los métodos incluyen, pero no se limitan a, los métodos para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, los métodos para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, los métodos para alterar una característica agronómica en una planta, los métodos para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta y los métodos para producir semillas. La planta podría ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya. La planta podría ser, además, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alflalfa, algodón, arroz, cebada o mijo. La semilla podría ser una semilla de maíz o de frijol de soya, por ejemplo, una Semilla híbrida de maíz o una semilla endogámica de maíz.
Los métodos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes : Un método para transformar una célula j que comprende transformar una célula con cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención. Además, se incluye la célula transformada por este método. Hn modalidades específicas, la célula es una célula eucariot , por ejemplo, una levadura, un insecto o una célula de luna planta, o procariota, por ejemplo, una célula de una bacteria.
Un método para producir una planta transgénica que comprende transformar una célula de una planta con i cualquiera de los polinucleótidos aislados o| constructos de ADN recombinante de la presente invención y regenerar una planta transgénica de la célula vegetal transformada. La invención está dirigida, además, a la planta transgénica producida por este método y a la semill!a transgénica obtenida de esta planta transgénica.
Un método para aislar un polipéptido de la invención a partir de una célula o medio de cultivo de la célula, en donde la célula comprende un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido de la invención unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, y en donde la célula huésped transformada se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante.
Un método para alterar el nivel de expresión de un polipéptido de la invención en una célul huésped que com rende: (a) transformar una célula húésped con un constructo de ADN recombinante de la presente invención; y (b) cultivar la célula huésped transformada en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante, en donde la expresión del conjstructo de ADN recombinante resulta en la producción de nivelejs alterados del polipéptido de la invención en la célula huésped transformada.
Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejempló, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 52 53 54 55 56| %, 57 %, 58 % 59 %, 60 %, 56 , 62 Q, 63 o, 64 o, 65 66 *5 , 67 68 % 69 %, 70 %, 71 %, 72 73 %, 74 %, 75 %, 76 "o , 77 78 % 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. i de ident.: 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, | 29, 31 o 33; y transgénica, en donde esa planta progenie comprende en su I genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN| supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuenciaj de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 52 %, 53 %, 54 55 %, 56 % 57 %, 58 %, 59 % , 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 ¾ , 65 %, 66 % 67 %, 68 %, 69 % , 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 ¾, 75 %, 76 % 77 78 79 % , 80 %, 81 82 %, 83 %, 84 ¾/ 85 % 86 % 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de id método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33; 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 O 33, o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a.) (i) ; y (b) regenerar una planta transgénicaj a partir de la célula vegetal regenerable después de la etap† (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia a l'a sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el I constructo de ADN supresor. El método podría comprender, además, (c) obtener una planta progenie derivaka de la planta transgénica, en donde esa planta progenie cjomprende en su genoma el constructo de ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara coij una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para aumentar la tolerancia a lja sequía en una planta; el método comprende: (a) introducir j en una célula regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia a la sjequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método podría comprender, además, (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde esa planta progenie cjomprende en su genoma el constructo de ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para evaluar la tolerancia a 1^ sequía en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 51 52 53 54 55 56 57 58 *o 59 %, 60 *o 56 62 63 64 65 *5 f 66 67 68 69 %, 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 %, 80 ,81 82 83 84 85 86 87 88 89 %, 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 % o 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident.: 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33; 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) evaluar la planta transgénica para determinar la tolerancia a la sequía cuando se compara coj una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante . El método podría comprender, además, (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (e) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN rjecombinante .
Un método para evaluar la tolerancia a l sequía en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladorja (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida opejracionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia! de aminoácidos a sec. con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33; 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33, o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) evaluar la planta t ansgénica para determinar la tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método podría comprender, además, (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia a la sequía cuando se compara cor] una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor I funcional en una planta) unida operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenci†dor o cadena no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50i 51 %, 52 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 56 %, 62 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70|%, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80| %, 81 ¾, 82 %, 83 84 , 91 ¾, 92 %, 93 94 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de u:i secuenciador o cadena no codificante de donde se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) (b) regenerar una planta transgénica a partir de 1† célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) evaluar la planta transgénica para determinar la tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de AN supresor. El método podría comprender, además, (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) evaluar la planta progenie para determin r la tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. ¡ Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende (a) introducir ; en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinuci.eótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 o, "O , 54 0, %, 55 ¾ / 56 %, 57 Q, *o , 58 % 59 %, 60 , 56 %, 62 o o , 63 O, , 64 %, 65 o r 66 o , 67 O, ¾ , 68 % 69 %, .70 %, 71 % , 72 o. 73 %, 74 %, 75 g, O / 76 % , 77 %, 78 % 79 %, 80 o, *o , 81 %, 82 %, 83 o, "o , 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % 89 %, 90 91 o, %, 92 "o , 93 O. o o , 94 o "0 , 95 0 , 96 %, 97 %, 98 % 99 o 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con ü rja sec . con núm. de ident. : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 2†, 29, 31 o 33; (b) regenerar una planta transgénica a parti: de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; (c) obtener una planta progenie derivada de esa planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y! (d) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancdja a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
Un método para evaluar la tolerancia a lá sequía en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia regulador^ (por ejemplo, I un promotor funcional en una planta) unida opejrracionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ! ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 o. ¾ / 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % , 60 %, 56 o. 62 %, 63 %, 64 Q, ° / 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % , 70 %, 71 %, 72 %, 73 o. ¾ / 74 %, 75 %, 76 Q, *S / 77 %, 78 g, "S / 79 % , 80 %, 81 %, 82 o ¾ i 83 Q, 84 %, 85 %, 86 %, 87 O. %, 88 o "o / 89 % , 90 %, 91 %, 92 0 / 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 o. o, "O ; 98 o / 99 O. *0 o 100 % de identidad de secuer Lcia , en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se j compara con la sec. con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33, o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de esa planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo eje ADN supresor; y (d) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende (a) introducir ¡ en una célula vegetal regenerable un constructo de AD : supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico «Jie por lo menos 50 %, 51 % 52 %, 53 ¾ f 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 % 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 % 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 78 %, 79 %, 80 %, 81 % , 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 92 93 94 95 %, 96 %, 97 ! ) , 98 % f 99 % o 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con| la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de donde se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4); (b) regenerar una plantk transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la ¡planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN iupresor; y (d) evaluar la planta progenie para determinar, la ^tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de jcontrol que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinúcleótido unido 95 %, 96 97 % 98 %, 99 % o 100 de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento cjustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma ese constructo de ADN recombinante ; y (c) determinar I si la planta transgénica exhibe una alteración !en por lo menos una característica agronómica cuando se compara., opcionalmente en condiciones de agua limitada, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante . El método podría comprender, además, (d) obtener una planta progenie I derivada de la planta transgénica, en donde la jplanta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN írecombinante ; y (e) determinar si la planta progenie exhibe unL alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente en condiciones de agua limitada, ] con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
Un método para determinar una altejración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos ¿Je por lo menos 50 51 %, 52 % 53 %, 54 So- , 3C Dc 2o- r 56 %, 57 58 o / 59 60 56 %, 62 % 63 %, 64 % , 65 % , 66 %, 67 68 o / 69 70 71 %, 72 % 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 78 Q, ¾ / 79 80 81 %, 82 % 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 88 %, 89 90 91 %, 92 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 ½ 99 100 % de identidad de secuencia, en base j al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara c<jm la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33, o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; (b) regenerar una planta ¡ transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa j (a) , en donde la planta transgénica comprende 0n su genoma el i constructo de ADN supresor; y (c) determinar si la planta transgénica exhibe una alteración de por , lo menos una i característica agronómica cuando se compara, opcionalmente en condiciones de agua limitada, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. Ejl método podría comprender, además, (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) determinar si la planta progenie exhibe una a teración de por lo menos una característica agronómica cuarjdo se compara, opcionalmente en condiciones de agua limitada ,j con una planta de control que no comprende el constructo de A supresor.
Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerabje un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos' una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional] en una planta) unida operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 52 %, 53! % , 54 %, 55 % 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 "o , 63 % , 64 %, 65 % 66 %, 67 o. *5 / 68 69 %, 70 %, 71 %, 72 73 ! % , 74 %, 75 *S 76 %, 77 78 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 % , 84 %, 85 % í 86 %, 87 88 89 90 %, 91 ° , 92 %, 93 ' % , 9 %, 95 "o 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad di secuencia, ei base al método de alineamiento Clustal V, cuandó se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de donde se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) determinar si la planta transgénica exhibe una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, cjipcionalmente en condiciones de agua limitada, con una planta d^ control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método podría comprender, además, (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) determinar si la planta progenie exhibe una alteración de po:: lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , en condiciones de agua limitada, con una planta dé control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta):, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 ¾, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, ADN recombinante ; (c) obtener una planta progenie derivada de esa planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) determinar si la planta progenie exhibe una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente en condiciones de agua limitada, con una planta de control que no comprende el constructo de ADIst recombinante.
Un método para determinar una alteración de una í característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerabl un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional j en una planta) unida operacionalmente a la totalidad o parte de (i) una I secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con i una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5?| %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 ¡%, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 o %, 66 o / 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 73 %, 74 %, 75 o, ° f 76 %, 77 %, 78 %, 79 o, %, 80 81 83 %, 84 o. 85 %, 86 %, 87 %, 88 % 89 0. 90 %, 91 93 a "S / 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % de de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33, o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i); (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de esa planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d^ determinar si la planta progenie exhibe una alteración de pór lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente en j condiciones de agua limitada, con una planta dej control que no comprende el constructo de ADN supresor. j Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo I de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional ; en una planta) unida operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de un gen donde esas semillas comprenden en su genoma ese constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) En cualquiera de los métodos anteriores en cualquie otra modalidad de los métodos de la presente invención, en esa etapa de introducción, esa célula vegetal recenerable podría comprender una célula callosa, una célula callosa embriogénica, una célula gamética, una célula meristemática o una célula de un embrión inmaduro. Las células vegetales jregenerables se podrían derivar de una planta endogámica de maíij: .
En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, esa etapa de regeneración podría comprender lo j siguiente: (i) cultivar esas células vegetales transformadas en un medio vegetales transformadas después de la etapa j (ii) sobre un segundo medio para permitir el alargamiento} del brote, el desarrollo de la raíz o ambos. j I En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente ; invención, por lo menos la única característica agronómica podría seleccionarse del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres¦ en la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutoís, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía,] captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosjecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura d^ las espigas, longitud de las espigas, tolerancia a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés de temperaturas bajas. La alteración de por lo menos una característica agronómica I podría ser un aumento en la producción, verdor o biomasa. I En cualquiera de los métodos anteriores jo en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la planta podría exhibir la alteración de por¡ lo menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de agua limitada, con una planta de control qjie no comprende ese constructo de ADN recombinante (o ese corlstructo de ADN supresor) .
En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención existen alternativas para introducir en una ¡ célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinant que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora. Por ejemplo, se podría introducir en una célula vegetal regenerable una secuencia jreguladora (tal como uno o más potenciadores , opcionalmente ,j como parte de un elemento transponible) y, después, ensayar en busca de un evento en el que la secuencia reguladora se una operacionalmente a un gen endógeno que codifica un polipéptido de la presente invención.
La introducción de constructos de ADN rec'ombinante de la presente invención en plantas se podría rellizar mediante cualquiera de las técnicas adecuadas que incluyen, pero no se i limitan a, la captación directa de ADN, el tratamiento con sustancias químicas, la electroporación, la |microinyección, la fusión celular, la infección, la transferencia de ADN mediada por vectores, el bombardeo o la j transformación mediada con Agrobacterium. Las técnicas paraj transformar y regenerar plantas se han descrito en la jpublicación de patente internacional núm. WO 2009/006276, cuyo contenido se i incorpora en la presente descripción como referencia.
El desarrollo o regeneración de plantas qüe contienen el fragmento foráneo, exógeno de ácido nucleico que codifica una proteína de interés se conoce bien en la técndjca. Las plantas regeneradas se podrían autopolinizar para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas . De lo contrario, el polen obtenido de las plantas regeneradas se crjuza con el de plantas cultivadas de semillas de líneas agronómicamente importantes. A la inversa, el polen de las plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantías regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva por medi métodos muy conocidos por una persona con experiencia en la técnica.
EJEMPLOS La presente invención se ilustra con más ¡detalle en los I siguientes ejemplos, en los cuales las jpartes y los porcentajes están en peso y los grados están en grados Celsius, a menos que se indique de otra manera. Se debe entender que estos ejemplos, que indican modalidades de la invención, sólo se incluyen a título ilustratij/o . A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá determinar las ^características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla !a los diversos usos y condiciones. Por consiguiente, diversas modificaciones de la invención además de aquellas que se muestran y describen en la presente serán aparentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la descripción anterior. Las modificaciones también estarán comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. | Ejemplo 1 Creación de una población de Arabidopsis con genes con rotulación de activación Se preparó un construct T-ADN de 18.5 kb, pHSbarENDs2 (Fig. 1; nt.:l) que contenía cuatro elementos potenciadores j multimerizados derivados del promotor del virus mosaico de la coliflor 35S (que corresponde a las secuencias -341 a j-64, tal como definen Odell et al., Nature 313:810-81^ (1985)). El constructo contenía, además, secuencias del -j-ector (pUC9) y un policonector para permitir el rescate del plásmido, secuencias de transposones (Ds) para removilizar el T-ADN y el gen bar para permitir la selección del gluiiosinato de las plantas transgénicas . Inicialmente se transferirá al genoma de la planta huésped solamente el segmento ele 10.8 kb del borde derecho (BD) al borde izquierdo (BI) inclusive. Ya que los elementos potenciadores se encuentran jeerca del BD, pueden inducir la cis-activación de los jLoci genómicos seguida de la integración de T-ADN.
Se crearon poblaciones con rotulación de¡ activación de Arabidopsis por medio de la transformación (completa de la planta mediada por Agrobacterium. El constructo de pHSbarENDs2 se transformó en la cepa de Agrobacterium tumefaciens C58 cultivada en LB a 25 °C ha^ta OD600 -1.0.
Después, las células se conformaron en bolillas mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de 5 % de sacarosa/0.05 % de Silwet L-77 (OSI Specialties, Inc) . Durante la germinación precoz, el ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana cultivado en el suelo s¿ empapó con la suspensión de Agrobacterium. Una semana despyés, las mismas plantas se empaparon nuevamente con la jnisma cepa de Agrobacterium en sacarosa/Silwet . Se permitió jque las plantas dejaran semilla como lo hacen normalmente.! Las semillas I resultantes TI se sembraron en suelo y sé seleccionaron plántulas transgénicas al atomizar con glufosjinato (Finale®; AgrEvo; Bayer Environmental Science) . Se seleccionó un total de 100,000 plántulas TI resistentes al glufosinato. La semilla T2 de cada línea se conservó por separado.
Ejemplo 2 Ensayos para identificar líneas con mayor tolerancia a la sequía Ensayo cuantitativo de sequía: A partir ¡de cada una de las 96,000 líneas TI con rotulación de activac ón separadas se sembraron nueve plantas T2 resistentes al glufosinato; cada una de ellas en una sola maceta con suelo Scotts® Metro-Mix® 200. Se prepararon bandejas de cultivo con 8 macetas cuadradas cada una. Cada maceta cuadrada se llenó con suelo hasta la parte superior. Cada maceta (o célula) se sembró para producir 9 plántulas resistentes al glufosinato en una njatriz de 3x3.
El suelo se regó hasta la saturación , después, las plantas se cultivaron en condiciones estándar (es decir, un ciclo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad; 22 °C; -60 % de humedad relativa) . No se suministró agua adicional.
Se tomaron imágenes digitales de las plantas cuando comenzaron los síntomas visibles de estrés de la sequía. Las imágenes se tomaron una vez al día (a la misma hora del día) hasta que las plantas se desecaron. Típicamente, los datos se recolectan durante cuatro días consecutivos .
Para identificar potenciales líneas tolerantes a la sequía se usa análisis del color. El análisi del color se puede usar para medir el incremento en el porcentaje de área de la hoja que cae dentro del ancho del inte†valo del color amarillo. En base a los datos del tono, saturación e intensidad ("HSI", por sus siglas en inglés), el ancho del intervalo del color amarillo consiste en los tónos 35 a 45. i Además, otro criterio usado para identificar líneas potencialmente tolerantes a la sequía es el mantenimiento i del área de la hoja, ya que las hojas de Arabidopsis se marchitan durante el estrés de la sequía. El mantenimiento del área de la hoja se puede medir como la. reducción del área de la hoja de roseta en el tiempo.
El área de la hoja se mide en términosj del número de pixeles verdes obtenidos con el sistema de captación de imágenes LemnaTec. Se cultivan plantas con rotulación de activación y de control (por ejemplo, de tipo silvestre) una al lado de la otra en bandejas de cultivo que contienen 72 plantas (9 plantas/maceta) . Una vez que empiezan a marchitarse, se miden las imágenes por una cantidad de días necesaria para controlar el proceso de marchitc.do. A partir de estos datos se determinan perfiles de marchitado en base a los recuentos de pixeles verdes obtenidos durante cuatro días consecutivos para las plantas con rotulac :i:ón lilee activación y las plantas de control acompañantes. El perfil se selecciona a partir de una serie de mediciones durante el periodo de cuatro días que produce el mayor grado de marchitadó. La capacidad para soportar la sequía se mide por medio de la tendencia de i las plantas con rotulación de activación para resistir el marchitado cuando se comparan con plantas de control .
Para analizar las imágenes en CCD se usá la aplicación informática LemnaTec HTSBonitUV. Se obtiene† cálculos del área de la hoja de las plantas de Arabidopsisj en términos de la cantidad de pixeles verdes. Se promedian los datos de cada imagen para calcular la desviación media y estándar para los conteos de pixeles verdes de las plantas con! rotulación de activación y de tipo silvestre. Se obtienen parámetros para una función de ruido mediante regresión lineal de la desviación cuadrática contra el recuento medio de pixeles con datos de todas las imágenes en un grupo. Se estiman los errores para los datos del recuento promedio de pixeles con los parámetros de ajuste para la función de ruido. Los recuentos promedio de pixeles para las plantas^ con rotulación de activación y de tipo silvestre se suman j ara obtener la evaluación del área total de la hoja para cáela imagen. Para obtener el intervalo de cuatro días con marchjitado máximo se selecciona el intervalo que corresponde a j la diferencia máxima en el crecimiento de la planta. Las respuestas de marchitado individuales de las plantas conj rotulación de activación y de tipo silvestre se obtienen mediante normalización de los datos con el valor del recuento de pixeles verdes del primer día en el intervaloj. La tolerancia a la sequía de la planta con rotulación de activación cuando se compara con la planta de tipo silvestre se califica por medio de la suma de la diferencia ponderada entre la respuesta de marchitado de las plantas con rotulación de activación y las plantas de tipo silvestre en el día dos al día cuatro; los pesos se calculan mediante la propagación del error en los datos. Un puntaje positivo para la tolerancia a la sequía corresponde a una planta con , otulación de activación con marchitado más lento cuando se > compara con la planta de tipo silvestre. El significado de 1¡a diferencia en la respuesta al marchitado entre las plantas con rotulación de activación y de tipo silvestre se obtiene a partir de la suma ponderada de las desviaciones cuadráticas Las líneas con un retardo signifi ¡ccativo en la acumulación de color amarillo y/o con un mantenimiento significativo del área de la hoja de la roseta, cuando se compara con el promedio de la bandeja de cultivo completa, se designan como aciertos de la Fase 1. Los aciertos de la Fase 1 se tamizan nuevamente por duplicado bajo las mismas condiciones de la prueba. Cuando una o ambas réplicas de la Fase 2 muestran una diferencia significativa (puntaje mayor i que 0.9) con la media de la bandeja completja, la línea se considera como una línea tolerante a la sequíal validada .
Además, las líneas con mayor tolerancia ja la sequía se pueden ensayar con el siguiente método (véJse, además, el programa de tratamiento de la Fig. 12) : Las plántulas de maíz transgénicas se ensayan para i determinar la tolerancia a la sequía por medio de la medición del rendimiento de la fluorescencia de j la clorofila, acumulación de biomasa y supervivencia a jja sequía. Las plantas transgénicas se comparan contra las plantas no transgénicas (que no contienen el transgeL) . El diseño experimental es un bloque completo al azar y la replicación consiste en 13 plantas positivas de cadaj evento y un constructo negativo (2 negativos para cada evento) .
La planta se cultiva en condiciones de irrigación adecuada ( , por sus siglas en inglés) = 60 % de capacidad de campo (%FC) para una etapa de tres hojas. En la etapa de tr.es hojas y en condiciones de irrigación adecuada se toma la primera medición de fluorescencia en la hoja superior totalmente extendida en el punto de inflexióiji, en el margen de la hoja y evitando la nervadura media.
Después, se impone un estrés de sequía moderado (Fig. 12, día 13, MOD DRT) para lo cual se mantiene el 20 % de la FC durante 9 a 10 días.
Durante este tratamiento de estrés, las ho^jas pueden tener una apariencia gris y se puede producir el enrollado. Al final de la MOD DRT, las plantas se recuperan (MOD rec) mediante el incremento hasta 25 % de la FC. Durante este tiempo, las hojas comenzarán a desenrollarse. Esta es una etapa sensible al tiempo que podría demorar hasta 1 hora en producirse y que puede depender del constructo y los eventos que se prueban.
Cuando las plantas aparentan una recuperación total (hojas desenrolladas) se toma la segunda medición de la fluorescencia.
Después, se impone un estrés de sequía severo (SEV DRT) por medio de la retención de toda el agua I hasta que las plantas se pliegan. La duración del estrés de la sequía severa es de 8 a 10 días y/o el tiempo sano para que las plantas se plieguen.
A partir de allí, se impone una recuperación (REC) mediante la irrigación de todas las plantas hasta una FC del 100 %.
Se mantiene la FC del 100 % durante 72 horas.
Se registra el puntaje de supervivencia (si/no) después de 24, 48 y 72 horas de recuperación. j El brote completo (fresco) se muestrea y se registran los pesos. (Pesos del brote fresco) . Después, el jmaterial de los brotes frescos se seca durante 120 horas a 70 grjados, momento en el cual se registra el peso del brote seco.
Las variables medidas se definen de la siguiente manera: La variable "Fv' /Fm' no stress" es una medidá del rendimiento cuántico óptimo (Fv'/Fm') en condiciones óptimai de agua en la hoja superior totalmente extendida (más frecuentemente, la tercera hoja) en el punto de inflexión, en el margen de la hoja y evitando la nervadura media. Fv' /Fm' proporciona un cálculo de la eficiencia máxima de la fotoquímica del PSII a un PPFD determinado, que es la eficiencia operativa del pjsil si todos los centros del PSII estuvieran abiertos (QA oxidado) . J La variable "Fv' /Fm' stress" es una medida' del rendimiento cuántico óptimo (Fv'/Fm') en condiciones de estrés del agua (25 % de capacidad de campo) . La medición está precedida por un periodo de sequía moderado, en donde la capacidad de campo cae de 60 % a 20 %, momento en el cual la capacidad de campo se lleva al 25 % y se realiza la medición. j La variable "phiPSII_no stress" es una j medida de la eficiencia del Photosystem II (PSII) en condiciones óptima de agua en la hoja superior totalmente extendida (más frecuentemente, la tercera hoja) en el punto de inflexión, en el margen de la hoja y evitando la nervadura media. phiPSII proporciona una estimación de la eficiencia operativa del PSII que estima la eficiencia en la cual la luz absorbida por el PSII se usa para la réducción de Q¾.
La variable "phiPSII_stress" es una medida de la eficiencia del Photosystem II (PSII) en condiciones de estrés del agua (25 % de capacidad de campo) . La medición está precedida por un periodo de sequía moderado, en donde la capacidad de campo cae de 60 % a 20 %, momento en el cual la capacidad de campo se¡ lleva al 25 % y se realiza la medición.
Ejemplo 3 Identificación de genes con rotulación de activación Los genes contiguos al inserto de T-ADN en líneas tolerantes a la seguía se identifican con el uso de uno o ambos procedimientos estándar siguientes: (1) PCR termal de entrelazado simétrico (TAIL PCR, por sus siglas en inglésl) (Liu et al . , (1995), Plant J. 8:457-63); y (2) SAIFF PCR (jsiebert et al., (1995) Nucleic Acids Res. 23:1087-1088) . En jlas líneas con insertos de T-ADN multimerizados complejos, tanto jel TAIL PCR como el SAIFF PCR pueden ser insuficientes para identificar genes candidatos . En estos casos se puede usar otros] procedimientos, incluso la RCP inversa, el rescate de plásmidos y/o la construcción de la genoteca de ADN. j Un resultado exitoso es cuando un fragmento único de TAIL o SAIFF PCR contiene una secuencia de borde de T-ADN y una secuencia genómica de Arabidopsis.
Una vez se .obtiene una etiqueta de la secuencia genómica contigua al inserto de T-ADN, los genes candidatos se identifican mediante el alineamiento para la secuencia del genoma de Arabidopsis disponible al público.
Especialmente, el mencionado gen más cercanoj a los elementos potenciadores 35S/BD del T-ADN es candidato para genes activos.
Para verificar que un gen identificado está verdaderamente cerca de un T-ADN y excluir la posibilidad de que el fragmento TAIL/SAIFF sea un artefacto de clonación quimérica, se realiza una RCP diagnóstica en el ADN genómico con un oligo en el T-ADN y un oligo específico para el gen candidato. Las muestras de ADN genómico I que proporcionan un producto de RCP se interpretan como representantes de la inserción de T-ADN. Este análisis también verifica una situación en donde ocurre más de un evento de inserción en la misma línea, por ejemplo, si se identifican múltiples fragmentos genómicos diferentes en los análisis TAILj y/o SAIFF PCR. Ejemplo 4A j Identi icación del gen del polipéptido de la familia; de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) con rotulación de activación Se analizó aun más una línea con rotulación de activación (núm. 102143) que mostraba tolerancia a la sequía. Se extrajo el ADN de la línea y los genes contiguos al inserto de T-ADN en la línea mutante se identificaron con SAIFF PCR (Siebert et al., Nucleic Acids Res. 23:1087-1088 (1995)). Se identificó un fragmento amplificado por PCR que contenía una secuencia del borde de T-ADN y una secuencia genómica de Arabidopsis..Se obtuvieron secuencias genómicas contiguas al inserto de T-ADN y el gen candidato se identificó mediante alineamiento con el genoma completo de Arabidopsis. un evento de integración de T-ADN determinado, el mencionado gen cercano a los elementos potenciadores 35S/BD del T-ADN era el cancjidato para el gen que se activa en la línea. En el caso de la línea núm. 102143, el gen más cercano a los potenciadores 35S en el sitio de integración era At2g01150 (sec. con núm. de ident.:16; identificadorj general del NCBI núm. 98960889, registro BT025510) que codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) (sec . con núm. de ident.:17; identificador general del NCBI núm. 98960J889) .
Ejemplo 4B Ensayo para el nivel de expresión de los genes candi|dato con tolerancia a la sequía j Un alelo con rotulación de activación funcional debería producir la regulación en alta del gen candidato en ej idos, en donde se expresa normalmente, la expresión ectópica i en tejidos que normalmente no expresan ese gen o ambos. Se comparan los niveles de expresión de los genes candidato en la línea mutante afín contra el tipo silvestre. Se usa un procedimiento de RT-PCR estándar, tal como el estuche de transcripción inversa QuantiTect® del Qiagen®. Se usa RT-PCR del gen actina como un control para j mostrar que la amplificación y la carga de muestras de la línea mutante y del tipo silvestre son similares.
Las condiciones de ensayo se optimizan para cada gen. Los niveles de expresión se controlan en las hojas de Roseta maduras. Si el alelo con rotulación de activación produce la expresión ectópica en otros tejidos (por ejemplo, raíces) la expresión no se detecta por medio de este ensayo. Como tal, un resultado positivo es útil, pero un resultado negativo no excluye el análisis posterior del gen.
Ejemplo 5 Validación del gen candidato de Arabidopsis At2g01150 (polipéptido de la familia de dedos de zinc) a través de la transformación en Arabidopsis Los genes candidatos se pueden transformar en Arabidopsis í y sobreexpresar bajo el promotor 35S. Si se observa el mismo fenotipo o uno similar en la línea transgénica como en la línea paterna con rotulación de activación, entonces considera que el gen candidato es un "gen guía" validado en Arabidopsis.
El gen candidato del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) de Arabidopsis (At2g01150; sec . con núm. de ident.:16) se probó para determinar su capacidad para conferir tolerancia a la sequía de la siguiente manera.
Se preparó un vector binario basado en Tj-ADN de 16.8 kb denominado pBC-amarillo (sec. con núm. de ident.:4; Fig. 4), con un promotor 35S de 1.3 kb ubicado inmediatamente 5' del inserto de conversión Cl INVITROGEN™ GATEWIY® . El vector contiene, además, el promotor RD29a que conduce la expresión del gen para ZS-amarillo ( INVITROGEN™) j que confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada .
La región codificante de proteínas del ADNc At2g01150 se amplificó mediante RT-PCR con los siguientes cebadores: (1) Cebador directo At2g01150-5 ' attB (s$c. con núm. de ident . : 12) : TTAAACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAACAATGGGACTACAAGGTCAGCTC (2) Cebador inverso At2g01150-3 ' attB (s†c. con núm. de ident . : 13) : TTAAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAATGAGATGATGCAGTAGA El cebador directo contiene la secuencia de attBl (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT; sec. con núm. de ijdent.:10) y una secuencia de consenso de Kozak (CAACA) adyacente a los primeros 21 nucleótidos de la región codificante de proteínas, comenzando con el codón de iniciación ATG, de ese ADNc.
El cebador inverso contiene la secuencia attB2 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT; sec. con núm. j de ident.: 11) adyacente al complemento inverso de los últimoS| 21 nucleótidos i de la región codificante de proteínas que cpmienza con el complemento inverso del codón de terminación, de ese ADNc.
Con la tecnología INVITROGEN™ GATEWAY^ CLONASE™ se realizó una reacción de recombinación BP conl el pD0NR™/Zeo (sec. con núm. de ident.:2; Fig. 2). Este proceso eliminó el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen resistente al cloranfenicol (CAM) de pD0NR™/Zeo Y clonó direccionalmente el producto de la PCR con sitios attBl y attBp contiguos que crearon un clon de entrada (PHP31324) . Este clon de entrada se usó para una reacción de recombinación LR posterior con un vector de destino, de la siguiente manera.
Se preparó un vector binario con base de T-ADN de 16.8 kb (vector de destino) denominado pBC-amarillo (sec. con núm. de ident.:4; Fig. 4) con un promotor 35S de 1.3 kb ubicado inmediatamente 5' del inserto de conversión Cl INVITROGEN™ GATEWAY® que contiene el gen ccdB letal bacteriano además del gen de resistencia al cloranfenicol (CAM, por sus siglas en inglés) contiguo a las secuencias de attRl y attR2. El vector contiene, además, el promotor RD29a que conduce la expresión del gen para ZS-amarillo (INVITROGEN™) que confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada. Con el uso de la tecnología de INVITROGEN™ GATEWAY®, ¡jse realizó una reacción de recombinación LR en el clon de entrada que contiene el producto clonado direccionalmente de la PCR y el pBC-amarillo . Esto permitió realizar la clonación rápida y direccional del gen candidato pbr detrás del promotor 35S en el pBC-amarillo para creai} la expresión del constructo promotor 35S : : At2g01150 , pBC-Yellow-At2g01150.
Después, los solicitantes introdujeron! el constructo de expresión del promotor 35S : : At2g01150 en el ecotipo Col-0 de Arabidopsis de tipo silvestre mediante el mismo procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium descrito en el Ejemplo 1. Se seleccionaron semillas TI transgénicas seleccionadas mediante fluorescencia amarilla y las semillas TI se colocaron en placas cerca de las i semillas de tipo silvestre y se cultivaron jen condiciones de agua limitada. Las condiciones de crecimiento y el análisis por captación de imágenes fueron tal como se i describe en el Ejemplo 2. Se encontró que el fenotipo original de tolerancia a la sequía de la rotulación con i activación se podría recapitular en plantas |de Arabidopsis de tipo silvestre que se transformaron con jun constructo, en donde el At2g01150 se expresó directam nte por medio del promotor 35S. El puntaje de la tolerancia a la sequía, determinado por medio del método del Ejemplo 2, fue de ? 2.258. I Ejemplo 6 I Preparación de genotecas de ADNc y Aislamiento y secuenciamiento de clones de ADNc I Las genotecas de ADNc se pueden preparar mediante cualquiera de los diversos métodos disponible!. Por ejemplo, los ADNc se podrían introducir en vectores pl^smídicos, para lo cual primero se preparan las genotecas de A Nc en vectores XR UNI-ZAP™ de conformidad con el protocolo j del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . Las genotecas XR UNI-ZAP™ se convirtieron en genotecas ¿lasmídicas de conformidad con el protocolo proporcionado po Stratagene. Al realizar la conversión, los insertos de . ADNc estarán contenidos en el vector plasmídico pBluescripk® . Además, los ADNc se podrían introducir directamente eri los vectores precortados Bluescript® II SK(+) (Stratagene) con ADN-ligasa T4 (New England Biolabs) , seguido de la cransfección en lulas DH10B de conformidad con el protoco del fabricante (GIBCO BRL Products) . Una vez que los insertos de ADNc están en vectores plasmídicos, los ADN plasmídicos se preparan a partir de colonias bacterianas seleccionadas aleatoriamente que contienen plásmidos recombinantes pBluescript® o las secuencias de ADNc insertadas se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa con el uso de cebadores específicos para secuencias de vectores contiguos a las I secuencias de ADNc insertadas. Los ADN o ADN j plasmídicos de insertos amplificados se someten a en reacciones de secuenciamiento tinte-c rar secuencias parciales de ADNc (etiq cia expresada o "EST" ; ver Adams et al., (19 51-1656) . Las EST resultantes se analizan con el uso de un secuenciador fluorescente Modelo 377 de Perkin ¡ Elmer .
Los datos de la secuencia de inserto completo (FIS) se generan con el uso de un protocolo de transposición modificado. Los clones identificados por las FIS se recuperan de reservas de glicerina conservadas como colonias únicas y los ADN plasmídicos se aislan vía lisis alcalina. Las plantillas de ADN aisladas se hacen reaccionar con nucleótidos directos e inversos M13 cebados por el vector en una reacción de secuenciamiento en base a RCP y se cargan eiji secuenciadores automatizados. La confirmación de la identificjación de clones se realiza por alineamiento de secuencias con la secuencia de EST original de donde se realiza la solicitud de FIS.
Los moldes confirmados son transpuestos mediante el kit de transposición Primer Island (PE Applied Bicjsystems, Foster City, CA) que se basa en el elemento transponible Tyl de Sa.ccha.rom.yces cerevisiae (Devine and Boeke (1994) Nucleic Acids Res. 22:3765-3772) . El sistema de transposición in vitro coloca aleatoriamente sitios de unión únicos en toda la población de moléculas grandes de ADN. Después, el ADN transpuesto se usa para transformar | las células electrocompetentes de DH10B (Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD) vía electroporación . El elemento transponible contiene un marcador seleccionable adicionjal (denominado DHFR; Fling and Richards (1983) Nucleic Acidé Res. 21:5147-5158) que permite la selección doble en placas con agar únicamente de los subclones que contienen transposón ntegrado. Aleatoriamente, se selecciona múltiples subclones ensamblados . Los ensambles se observan mediante el editor de secuencias Consed (Gordon et al. (1998) Genome Res. 8:195-202) .
En algunos clones, el fragmento dej ADNc podría corresponder a una porción 3 '-terminal del geft sin cubrir el marco de lectura abierto completo. Para obtener la información 5' se usa uno de los dos protocolos diferente^ . El primero de estos métodos resulta en la producción de un fjragmento de ADN que contiene una porción de la secuencia dej genes deseada mientras que el segundo método resulta en la pjroducción de un fragmento que contiene el marco de lectura abierto completo.
Ambos métodos usan dos tandas de amplificación de la RCP para obtener fragmentos de una o más genotecas . Las genotecas se escogen, algunas veces, en base al conocimiento previo que el gen específico debería encontrarse en un tejido específico y, algunas veces, se escogen aleatoriamente. Las reacciones para, obtener el mismo gen se pueden realizar en varias genotecas en paralelo o en un grupo de genotecas. Los grupos de genotecas se preparan, normalmente, con el uso de 3 a 5 genotecas diferentes y se normalizan hasta una dilución uniforme. En la primera tanda de amplificación ambos métodos usan un cebador específico del vector (directo) correspondiente a una porción del vector localizada en la región 5'-terminal| del clon junto con un cebador específico del gen (inverso) . EÍ primer método usa una secuencia complementaria a una porción de la secuencia de genes ya conocida, mientras que el segundo método usa un cebador específico del gen complementario a una porción de la región 3' no traducida (también llamada UTR, por sus siglas en inglés) . En la segunda tanda de amplificación se usa un grupo i subdividido de cebadores para ambos métodos . 1 fragmento de ADN resultante se liga en un vector pBluescript ®0 con el uso de somete a secuenciamiento y ensamble con el uso de Phred/Phrap , como se mencionó anteriormente.
Ejemplo 7 Identificación de clones de ADNc Para identificar clones de ADNc jque codifican polipéptidos de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) se pueden realizar búsquedas con BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al (1993) J. Mol. Biol . 215:403-410; véase, además, la explicación del algoritmo BLAST en el sitio en la web del National Center for i Biotechnology Information at the National Librjary of Medicine of the National Institutes of Health) para identificar la similitud con las secuencias de aminoácidos contenidas en la base de datos "nr" del BLAST (que comprejnde todas las traducciones no redundantes CDS del GenBank, las secuencias derivadas de la estructura tridimensional de Brookhaven Protein Data Bank, el último lanzamiento de la base de datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT y las bases de datos de EMBL y DDBJ) . Las secuencias de ADN de los clones se pdeden traducir en todos los marcos de lectura y se puede comparar la similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nat . Genet. 3:266-272) que proporci†na el NCBI . Los polipéptidos codificados por las secuencias de ADNc se pueden analizar para determinar la similitud con todas las secuencias de aminoácidos disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo de BLASTP proporcionado por el Center for Biotechnology Information (NCBI) . Por conveniencia, el valor P (probabilidad) o el valor E (expectativa) de la observación de una logaritmo del valor P o valor E informado. consecuencia, mientras mayor sea el valor pLog, mayor es la probabilidad de que la secuencia codificada de ADNc y el "acierto" del BLAST representen proteínas homologas.
Las secuencias de EST se pueden comparar con la base de datos del Genbank tal como se describió anteriormentje . Las EST que contienen más cebadores en el extremo 5 o 3 de | la secuencia se pueden encontrar mediante el uso del algoritmo BLPSTn (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.) contra la base de datos i de propiedad de Du Pont comparando secuencias de| nucleótidos que comparten regiones de secuencias homologas comunes o traslapadas. En donde hay secuencias comunes o traslapadas entre dos o más fragmentos de ácidos nucleicos, las secuencias se pueden ensamblar en una sola secuencia de nucleótidos contiguos, lo que extiende así el fragmento original ya sea en la dirección del cejbador 5 o 3. Una vez que se identifica el cebador más-5 EST, su secuencia completa se puede determinar mediante secuenciamiento del inserto completo tal como se describió anteriormente. Para encontrar los genes homólogos que pertenecen a diferentes especies se puede comparar la secuencia de aminoácidos de un gen conocido (ya sea de una fuente registrada o de una base de datos pública) con una base de datos de EST mediante el algoritmo tBLASTn. El algoritmo tBLASTn busca aminoácidos en una base de datos de nucleótidos traducida en los 6 marcos de lectura. Esta búsqueda permite diferencias en el uso de codones de nucleótidos entre diferentes especies y para la degeneración del codón.
Ejemplo 8 Caracterización de los clones de ADNc polipéptidos de la familia de dedos de zinc (dedo RING del Se pueden preparar genotecas de ADNc que representan ARNm a partir de diversos tejidos de betabel,j cañóla, maíz, arroz, frijol de soya, trigo y hierba gatera y se pueden identificar clones de ADNc que codifican los polipéptidos de i la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipcj) C3HC4) .
Se pueden identificar secuencias I homologas al polipéptido EXPAIO de Arabidopsis con | algoritmos de comparación de secuencias tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403-410 (1993); ver, además, la explicación del algoritmo BLAST en el sitio web del National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine of the National Institutes of Health) . Las secuencias que codifican polipéptidos de EXPAIO homólogos pueden amplificarse mediante PCR con cualquiera de los métodos siguientes Método 1 (basado en ARN) : Si la información de las secuencias de 5' y 3' para la región codificante de proteínas de un gen que codifica un homólogo del polipéptido de EXPAIO está disponible se pueden diseñar cebadores específicos del gen tal como se describió en el Ejemplo 5. Se puede usar RT-PCR con el ARN de la planta para obtener un fragmento de ácido nucleico que contieke la región codificante de proteínas contigua a las sejcuencias attBl (sec. con núm. de ident . : 10) y attB2 (sed. con núm. de ident.:ll). El cebador puede contener una secuencia consenso de Kozak (CAACA) 5' del codón de inicio. J Método 2 (basado en ADN) : Alternativamentej, si un clon de ADNc está disponible para un gen que codifica ün homólogo del polipéptido de EXPAIO, el inserto completo de ADNc (que contiene las regiones 5' y 3' no codificaijites) se puede amplificar por PCR. Se puede diseñar cebadores directos e inversos que contengan ya sea la secuencia attBl y la secuencia específica del vector que precede inserto de ADNc o la secuencia attB2 y la secuencia específica del vector que sigue al inserto de ADNc, respectivamente. |Para clonar un inserto de ADNc en el vector pBulescript SK+ sje puede usar el cebador directo VC062 (sec. con núm. de idént.: 14) y el cebador inverso VC063 (sec. con núm. de ident . : 15) .
Método 3 (ADN genómico) : Se pueden obtener secuencias genómicas por medio de captura de PCR genómico de largo alcance. Los cebadores se pueden diseñar en base a la secuencia del locus genómico, y el producto de PCR resultante se puede secuenciar. La secuencia se puede analizar con el programa FGENESH (Salamov, A. j y Solovyev, V. (2000) Genome Res., 10: 516-522) y, opcionalrjiente , se puede alinear con secuencias homologas de otras especies para facilitar la identificación de intrones putativos.
Los métodos 1, 2 y 3 se pueden modificar de conformidad con los procedimientos conocidos por una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, los¡ cebadores del método 1 pueden contener sitios de restricción en vez de sitios attBl y attB2 , para la clonación j posterior del producto de la RCP en un vector que contiene ¡sitios attBl y attB2. Además, el método 2 puede requerir la amplificación de un clon de ADNc, un clon lambda, un clon BAC o ADN genómico.
Un producto de la PCR obtenido por cualquiera de los métodos anteriores se puede combinar con el vector donante de GATEWAY®, tal como pDONR™/Zeo (INVITROGEN™; F^g . 2; sec. con núm. de ident.:2) o pDONR™221 (INVITROGEN™; F^g. 3; sec. con núm. de ident.:3) mediante una reacción de recombinación BP. Este proceso elimina el gen letal bacteriano c<j:dB, así como el gen resistente al cloranfenicol (CAM) de pDONR™221 y clona direccionalmente el producto de la PCR con sitios attBl y attB2 contiguos para crear un clon de entrada. Con la tecnología de INVITROGEN™ GATEWAY® CLONASE™, la secuencia que codifica el polipéptido de EXPA10 homólogo del clon de entrada se puede transferir después a un vector de destino adejcuado, tal como pBC-amarillo (Fig. 4 ; sec. con núm. de iden|t. : 4 ) , PHP27840 (Fig. 5 ; sec. con núm. de ident. : 5 ) o PHP2323 js (Fig. 6 ; sec. con núm. de ident.:6) para obtener un vector de expresión vegetal para usar con Arabidopsis, frijol dé soya y maíz, respectivamente. i Los sitios attPl y attP2 de vectores donantes pDONR™/Zeo o pDONR™221 se ilustran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. Los sitios attRl y attR2 de los vectores objetivo pBC-amarillo , PHP27840 y PHP23236 se ilustran en i las Figuras 4 , 5 y 6 , respectivamente.
Alternativamente, se puede realizar una reacción de recombinación LR de MultiSite GATEWAY® entre múltiples clones de entrada y un vector de destino adecuado para crear un vector de expresión. ! i Ejemplo 10 Preparación de vectores de expresión del friji l de soya y transformación del frijol de soya con genes g|iía de Arabidopsis validados por el promotor SCP1.
Los embriones de frijol de soya se pueden transformar con el vector de expresión que comprende secuencias que codifican los polipéptidos instantáneos. j Para producir embriones somáticos, cotiledones, de 3-5 mm i de longitud separados de la superficie esterilizada, las semillas inmaduras .del cultivar A2872 del frijol de soya se pueden cultivar en la luz o en la oscuridad; a 26 °C en un medio de agar apropiado durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos, que producen embriones secundarios, después se separan y se colocan en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida para los grupos de embriones somáticos que se multiplican como embriones prematuros en fase globular, las suspensiones se conservan como se describe a continuación.
Los cultivos embriogénicos en suspensión de frijol de soya se pueden mantener en 35 mi de medio líquido en un agitador giratorio de 150 rpm, a 26 °C, con luces fluorescentes en un horario de 16:8 horas día/noche. Los cultivos¡ se subcultivan cada dos semanas mediante la inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido.
I Los cultivos embriogénicos en suspensióh de frijol de soya se pueden transformar mediante el método de bombardeo de partículas (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73, patente de los Estados Unidos núm. 4,945,050) . Para estas transformaciones se puede usar un instrumento PDS1000/HE de DUPONT™ BIOLISTIC™ (retroajuste de helio) .
I Un gen marcador seleccionable que se pjuede usar para facilitar la transformación del frijol de sjoya es un gen quimérico compuesto del promotor 35S del virjus mosaico del coliflor (Odell et al. fosfonotransferasa de la coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188) y a región de 3' del gen nopalina sintasa del T-ADN del pjlásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Otro gen marcador seleccionable que se puede usar para facilitar la transformación de frijol de soya es un gen de la acetolactato sintasa (ALS) resistente a herbicidas de frijol de soya o Arabidopsis . I La ALS es la primera enzima común en la biosíntesis de los I aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. Se ha identificado que las mutaciones en la ALS imparten resistencia a algunas o a las tres clases de inhibidores de la ALS (patente de los Estados Unidos núm. 5,013,659; cuyo contenido completo se .incorpora en la presente como referencia) . La expresión del gen de la ALS resistente a herbicidas puede estíar bajo control del promotor de la SAM sintetasa (solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US-2003-0226166-A1; cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia) .
A 50 µ? de una suspensión de 60 mg/ml de partículas de oro de 1 ym se agrega (en orden) : 5 µ? de ADN (l g/ l) , 20 pL de espermidina (0.1 ) y 50 µ? de CaCl2 (2.5 M) . Después, la preparación de partículas se mezcla durante tres minutos, se centrifuga en un microcentrifugador durante l(j) segundos y el sobrenadante se retira. Después, las partículas cubiertas de ADN se lavan una sola vez en 400 µ? de etanojl al 70 % y se resuspenden en 40 µ? de etanol anhidro. Lai suspensión de ADN/partículas se puede sonicarse tres veces duijrante un segundo cada una. Después, se carga, 5 µ? de las partículas de oro cubiertas de ADN en cada disco del macroportador.
Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas se coloca en una placa petri de 60x15 mm vacía y el líquido restante del tejido se retira con una pipeta. Para cada experimento de transformación se bombardea, normalmente, aproximadamente 5-10 placas de tejido. La fuerza ke ruptura de la membrana se ajusta a 7.584 MPa (1100 psi) y la cámara se evacúa al vacío con 94.8 kPa (28 pulgadas de mercurio). El tejido se coloca a aproximadamente 8.89 era (3.5 pulgadas) del ensayo de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir a la mitad y se puede colocar nuevamentje en el líquido para cultivarlo como se describió anteriormente.
Cinco a seis días después del bombardeo, los medios líquidos se pueden intercambiar con medios frescos y once a doce días i después del bombardeo con medios frescos que contijenen 50 mg/ml de higromicina. Estos medios selectivos se pueden refrescar semanalmente . Siete a ocho semanas después del bortbardeo, se puede observar tejido verde transformado que crece de grupos embriogénicos necróticos no transformados. El tejido verde aislado se extrae e inocula en matraces individuales para generar cultivos en suspensión embriogénicos nuevos, transformados jy propagados por clonación. Cada línea nueva se puede tratar como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcultivar y mantener como grupos de embriones; inmaduros o se pueden regenerar en plantas completas mediante ¡la maduración y I germinación de embriones somáticos individuales. | Las plantas TI se pueden exponer a estrés dej la sequía en el I suelo de cultivo. Para determinar el área de: la planta, el volumen, el índice de crecimiento y analizar el 'color en varios momentos antes y durante del estrés de la sequía se puede usar análisis de imágenes. Los constructos de sobreexpresión que producen una demora significativa en el marchitado o la reducción del área de la hoja, acumulación del color amarillo y/o mayor índice de crecimiento durante el estrés de la sequía se considerarán como evidencia de que el gen de Arabidopsis actúa en el frijol de aoya para aumentar la tolerancia a la sequía.
Después, las plantas de frijol de soya transformadas con genes validados se pueden probar mediante estudjos de campo más intensos para analizar la mejora en la producciórl y/o estabilidad en condiciones de irrigación adecuada y de limitación de agua.
Ejemplo 11 j Transformación del maíz con genes guía de Ara idopsis validados mediante bombardeo de partículas Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de varia† especies para examinar el fenotipo resultante. ¡ I El mismo clon de entrada de GATEWAY® descrito en el Ejemplo 5 se puede usar para clonar , direccionalmente cada gen en un vector de transformación de maíz. La expresión del gen en el vector de transformación de maíz puede realizarse bajo el control de un promotor constitutivo tal como el promotor de la ubiquitina del maíz (Christensen et al., (1989) Plant Mol. Biol . 12:619-632 y Christensen et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) .
Después, el constructo de ADN recombinante descrito anteriormente se puede introducir en células de maíz mediante el procedimiento siguiente. Se pueden diseccionar embriones de maíz inmaduros a partir de cariópsides en desarrollo derivados de cruces entre las líneas de maíz endogámicas H99 y LH132. Los embriones se aislan 10 a 11 días después de la polinización cuando tienen una longitud de 1.0 a 1.5 mm. Después, los embriones se colocan con el¡ lado del eje orientado hacia abajo y en contacto con medio N6 solidificado con agarosa (Chu et al. (1975) Sci. Sin. Pekí^ng 18:659-668) . Los embriones se conservan en la oscuridad a \21 °C. El callo embriogénico friable consistente de masas inc-iferenciadas de células con proembrioides somáticos y embijrioides de las estructuras suspensoras prolifera del escutelo de estos embriones inmaduros. El callo embriogénico aislado del explanto primario se puede cultivar en medliioo NNi6 y subcultivar en este medio cada 2 a 3 semanas .
El plásmido p35S/Ac (obtenido de Dr. Pete_| Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) . se puede usar en experimentos de transformación para determinar un marcador seléccionable . Este í plásmido contiene el gen pat (ver la publicación de patente de Europa núm. 0 242 236) que codifica la fosfinotricina acetil transferasa (PAT) . La enzima PAT confiere ; resistencia a inhibidores herbicidas de la glutamina sintetasá, tales como la fosfinotricina . El gen pat en p35S/Ac está bajo! el control del promotor 35S del virus mosaico del coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812) y la región de 3' del gen nopalina sintasa del T-ADN del plásmido Ti de Agrojbac erjiura tumefaciens .
El método de bombardeo de partículas (Klein et al. (1987) Nature 327:70-73) se podría usar para transferir genes a las células de cultivos callosos. De conformidad con este método, las partículas de oro (1 m de diámetro) se recubren con ADN mediante la siguiente técnica. Se agregan diez pg de ADN i plasmídico a 50 pL de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mi) . Se añade cloruro cálcico (50 ih\ de una solución de 2.5 M) y base libre de espermidina (20 iL dej una solución de 1.0 M) a las partículas. La suspensión se agita en vórtice durante la adición de estas soluciones. Después de 10 minutos, los tubos se centrifugan brevemente (5 s a 15,000 rpm) y se retira el sobrenadante. Las partículas se resusjpenden en 200 pL de etanol absoluto, se centrifugan nuevamente j y se retira el sobrenadante. El enjuague de etanol se vuelve a. realizar y las partículas vuelven a suspenderse en un volumenj final de 30 L i de etanol. Se puede colocar, una alícuota ¡ (5 pL) de las partículas de oro recubiertas de ADN en el cendro de un disco volante de KAPTON™ (Bio-Rad Labs) . Después, las partículas se aceleran en el tejido de maíz con un instrumento PDS-1000/He de í DUPONT™ BIOLISTIC™ (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) con una presión de helio de 6.895 MPa (1000 psi) , una distancia de separación de 0.5 cm y una distancia de vuelo de 1.0 cm.
Para el bombardeo, el tejido embriogénico se coloca en papel de filtro sobre el medio N6 solidificado con agarosa . El tejido se dispone como una batista delgada y cubre un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La placa petri que. contiene el tejido se puede colocar en la cámara del PDS-1000/He a aproximadamente 8 cm del ensayo de terminación. El aire en la cámara se evacúa entonces a un vacío de 28 pulgadas de Hg. El macroportadorj se acelera con una onda expansiva de helio con el uso de una membrana de ruptura que se rompe cuando la presión del en el tubo de choque alcanza 6.895 MPa (1000 psi) . ¡ Siete días después del bombardeo, el Jej ido se puede transferir al medio N6 que contiene bialafos (5 mg por litro) y carece de caseína o prolina. El tejido continúa creciendo lentamente en este medio. Después de 2 semanasj más, el tejido se puede transferir al medio N6 fresco que cohtiene bialafos. Después de 6 semanas se pueden identificar áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callos que crecen activamente en algunas de las placas que coniienen el medio complementado con bialafos. Estos callos pueden continuar creciendo cuando se subcultivan en el medio selectivo.
¡ Las plantas pueden regenerarse a partir del callo transgénico al transferir, primeramente, grupós de tejido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro dej2,4-D. Después de dos semanas el tejido se puede transferir al medio regenerativo (Fromm et al . (1990) Bio/'Technology 8:833-839). Las plantas transgénicas TO se pueden regenerar y su fenotipo se puede determinar mediante procedimientos de alto rendimiento ( "HTP" , por sus siglas en inglés). Se puede recolectar semillas TI.
Las plantas TI se pueden exponer a estrés de sequía en el suelo de cultivo. Para determinar el área de la planta, el volumen, el índice de crecimiento y analizár el color en I varios momentos antes y durante del estrés ce la sequía se puede usar análisis de imágenes. Los constructos de sobreexpresión que producen una demora significativa en el marchitado o la reducción del área de la hoja, acumulación del color amarillo y/o mayor índice de crecimiento durante el estrés de la sequía se considerarán como evidencia de que el gen de Arabidopsis actúa en el maíz par¡a aumentar la tolerancia a la sequía.
Ejemplo 12 ¡ Electroporacion de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Las células competentes por electroporjación (40 pL) , tales como Agrobacterium tumefaciens LBA4404! que contienen PHP10523 (Fig. 7; sec . con núm. de ident.:7) se descongelan en hielo (20-30 min) . El PHP10523 contiene genes VIR para la transferencia de T-ADN, un origen de replicad.ón de plásmido con un número bajo de copias de Agrobacterium, un gen de resistencia a la tetraciclina y un sitio Cos para recombinación bimolecular del ADN in vivo. Mientras tanto, la cubeta de electroporación se enfría en hielo. La ! configuración del electroporador se determina para ser 2.1 kV. Una alícuota de DNA (0.5 ih de DNA parental a una concentración de 0.2 \ig -1.0 µg en tampón de |sal baja o H20) destilado dos veces mezclado con las céluljas LBA4404 del Agrobacterium turnefaciens descongelado LBA4404 mientras aún está sobre hielo. La mezcla se transfiere jil fondo de la cubeta de electroporación y se mantiene en j descanso sobre hielo durante 1 a 2 minutos. Las células ^e electroporan (electroporador Eppendorf 2510) al empujar el botón "pulsar" dos veces (logrando idealmente un pulso de 4. oj milisegundos) . Posteriormente, se agrega 0.5 mi del medio 2xY|T (o medio SOC) a temperatura ambiente en la cubeta y se transjfiere a un tubo con tapa a presión de 15 mi (por ejemplo, tubjo FALCON™) . Las células se incuban a 28-30 °C, 200-250 rpm durante 3 h.
Se esparcen alícuotas de 250 µL sobre placas que contienen medio YM y 50 µ9/??1 de espectinomicina y se incuba durante tres días a 28-30 °C. Para incrementar la cantidad de transformantes, se puede realizar uno de dos pajsos opcionales: Opción 1: Cubrir las placas con 30 L de rifampicina de 15 mg/ml. El LBA4404 tiene un gen de resistencia cromosómica para la rifampicina. Esta selección adicional jelimina algunas colonias contaminantes observadas cuando se usa preparaciones más deficientes de células competentes de LBA4404.
Opción 2: Realizar dos réplicas de la electroporación para compensar las células electrocompetentes de menlr calidad.
Identificación de transformantes: Se eligen y vetean cuatro colonias independientes en láminas que contienen .un medio mínimo y 50 µg/ml de espectinomicina para aislamiento de colonias únicas. Las láminas se incuban a 28 °C durante dos a tres días. Se elige una única colonia por cada cointegrado supuesto! y se la inocula con 4 mi de bactopeptona de 10 g/L, extracto de levadura de 10 g/L, cloruro sódico de 5 g/L y espectinomicjina de 50 mg/L. La mezcla se incuba durante 24 horas se la sacude. Se aisla el ADN plasmídico de 4 mi de ? ?^?? por medio de la minipreparación Qiagen® Miniprep y un tampón de lavado PB opcional. El ADN se eluye en 30 pL. Se usan alícuotas de 2 pL para electroporar 20 pL de DHlOb + 20 pL de H20 destilada dos veces, según se describió anteriormente. Opcionalmente , se puede usar una alícuota de 15 µL para trans ornear 75-100 pL de INVITROGEN™ Library Efficiency DH5a . Las célula! se esparcen en láminas que contienen un medio LB y esp<-}ctinomicina de i 50 pg/ml, y se incuban a 37 °C durante la noche J i Se eligen de tres a cuatro colonias independientes por cada cointegrado supuesto y se inoculan 4 mlj de medio 2xYT (bactopeptona de 10 g/L, extracto de levadúra de 10 g/L, cloruro sódico de 5 g/L) con 50 pg/ml de espec'tinomicina . Las células se incuban a 37 °C durante la noche ijdentras se las Ejemplo 13 Transformación del maíz con el uso de Agrobactérium Las plantas de maíz se pueden tránsformar para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de variad especies para examinar el fenotipo resultante.
La transformación de maíz mediada porj Agrobactérium se realiza prácticamente como lo describen Lhao et al. en Meth. Mol. Biol . 318:315-323 (2006) (ver támbién Zhao et al., Mol. Breed. 8:323-333 (2001) y la patente de los Estados Unidos núm. 5,981,840 emitida el 9 de noviembre de 1999, incorporada en la presente descripción como referencia) . El proceso de transíorma ión requiere inoculación bacteriana, cocultivo, reposo,1 selección y regeneración vegetal. 1. Preparación de embriones inmaduros: Los embriones inmaduros de maíz se deparan de las cariopses y se colocan en un microtubo de 2 mi que contiene 2 mi de medio PHI-A. 2. Infección por Agrobacterium y cocultivo e embriones inmaduros : 2.1 Etapa de infección: Se retira el medio PHI-A de (1) con una micropipeta de 1 mi , y se añade 1 mi de suspensión de Agrobacterium. El tubo se invierte cuidadosamente para mezclar. La mezcla se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. 2.2 Etapa de cocultivo: La suspensión de Agrobacterium se retira de la etapa de infección con una micropipeta de 1 mi . Con el uso de una espátula estéril, los embriones se desprenden del tubo y se transfieren a una placa de medio PHI-B en una caja petri de 100x15 mm. Los embriones se orientan con su e:je hacia abajo sobre la superficie del medio. Las placas con los embriones se cultivan a 20 °C, en la oscuridad, durante tres días. Se puede usar L-cisteína en la fase de cocultivo. Con el vector binario estándar, el medio de cocultivo proporcionado con i 100-400 mg/L de L-cisteína es crítico para recuperar eventos transgénicos estables . í 3. Selección de eventos transgénicos putativós: Para cada placa de medio PHI-D en una ¡ caja petri de 100x15 mm se transfiere 10 embriones, se conserva la orientación y los platos se sellan con parafilni. Las placas se incuban en la oscuridad a 28 °C. Se espera observar eventos supuestos de crecimiento activo, como tejido embrionario amarillo pálido, en seis a ocho semanas.. Los embriones que no producen eventos pueden ser cafés y necróticos y el poco crecimiento de tejido friable es evidente. El tejido embrionario transgénico putativo se subcultiva en placas de PHI-D fresco en intervalos de dos a tres semanas, dependiendo del índice de crecimiento. Se registran los eventos 4. Regeneración de vegetales TO : El tejido embrionario propagado en m^dio PHI-D se subcultiva en medio PHI-E (medio de maduración de embrión somático) , en cajas petri de 100x25 mm y se incuban a 28 °C, a oscuras, hasta que maduran los embriones somáticos, durante aproximadamente diez a dieciocho días. Los embriones somáticos maduros e individuales :on escutelo y coleóptilo bien definidos se transfieren al medio de germinación de embriones PHI-F y se incuban! a 28 °C en la luz (aproximadamente a 80 µ? de las lámparas de luz blanca o lámparas fluorescentes equivalentes ) . En siete a diez días las plantas regeneradas de aproximadamente 10 cm de altura se colocan en macetas n una mezcla hortícola y endurecida con el uso de métodos hortícolas estándar.
Medios para la transformación vegetal: 1. PHI-A: 4 g/L de sales básales de¡ CHU, 1.0 ml/L de mezcla de vitaminas de Eriksson 1000X, 0.5 Tig/L de tiamina HC1, 1.5 mg/L de 2,4-D, 0.69 g/L de L-prolina, 68.5 g/L de sacarosa, 36 g/L de glucosa, pH 5.2. Se adicionan 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro) . 2. PHI-B: PHI-A sin glucosa, el 2,4-D aumenta a 2 mg/L, la sacarosa se reduce a 30 g/L y se complementa con 0.85 mg/L de nitrato de plata (esterilizadó con filtro), 3.0 g/L de Gelrite®, 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro), pH 5.8. 3. PHI-C: PHI-B sin Gelrite® y acetosiringona, el 2,4-D se reduce a 1.5 mg/L y se complementa con 8.0 g/L de agar, 0.5 g/L de tampón de ácido 2 - [N-niorfolino] etano-sulfónico (MES) , 100 mg/L de carbenicilina (esterilizada con filtro) . 4. PHI-D: PHI-C complementado con 3 mg/L de bialafos (filtro-esterilizado) . 5. PHI-E: 4.3 g/L de sales de Murashiáe y Skoog (MS) , (Gibco, BRL 11117-074), 0.5 mg/L de ácido nicotínico, 0.1 mg/L de tiamina HCl, 0.5 mg/L de piridoxina HCl, 2.0 mg/L de glicina, 0.1 g/L de mio-inositol, 0.5 mg/L de zeatina (Sicma, cat . núm. Z-0164), 1 mg/L de ácido indol acético (AIA) , 26.4 yg/L de ácido abscísico (ABA) , 60 g/L de sacarosa, 3 mg/L de bialafos (esterilizados con filtro) , 100 mg/L de carbenicilina (esterilizada con filtro), 8 g/L de agar, pH 5.6. 6. PHI-F: PHI-E sin zeatina, IAA, ABA; reduce sacarosa a 40 g/L; reemplaza agar por GélriLte 1.5 g/L de Gelrita®; pH 5,6.
Las plantas pueden regenerarse a partir, del callo transgénico al transferir primeramente grupos; de tejido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se puede transferir al medio regenerativo (Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990)).
Las plantas transgénicas TO se pueden regenerar y se puede determinar su fenotipo. Se puede recolectar semillas TI.
Además, puede introducirse un constructo de ADN recombinante que contiene un gen de Arabidopais validado en producción (en condiciones de limitación de agua o sin limitación de agua) , cuando se comparan con plantas de control (o de referencia) que no contienen el gen guía de Arabidopsis validado. Específicamente, las ¡condiciones de limitación de agua se pueden imponer durantej el periodo de i floración y/o llenado del grano para las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado y para las plantas de control. Las plantas que contienen gen guía de Arabidopsis validado tendrían una pérdida! menor de la producción que las plantas de control, por ejemplo, una pérdida de la producción al menos 25 % menor, en condiciones de agua limitada, o tendrían una producción mayor que las plantas de control en condiciones de agua no limitada.
Ejemplo 14A Preparación del vector de expresión del gen gula de Arabidopsis (At2g01150) para la transformación del maíz Con el uso de la tecnología de INVITROG J™ GATEWAY® se i realizó una reacción de recombinación LR con un clon de entrada (PHP31324) y un vector de destino |PHP28647) para crear el plásmido del precursor PHP31363. El ^vector PHP31363 contiene los siguientes casetes de expresión: 1. Promotor de ubiquitina: :moPAT: :terminador Pinll; cásete que expresa el gen PAT de resistencia a herbicidas usado para la selección durante el proceso de transformación. 2. Promotor LTP2 : :DS-RED2 : :terminador Pinll; cásete que expresa el gen marcador de color DS-RED usado para la selección de las semillas. 3. Promotor de ubiquitina: :At2gO1150 : :terminador Pinll; cásete que sobreexpresa el gen de interés, polipépt do de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) de Arabidppsis.
Ejemplo 14B Transformación del maíz con el gen guía de Arabidopsis (At2g01150) con Agrobacterium El cásete de expresión del polipéptido dé la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) presente en el vector PHP31363 se puede introducir en una línea endogámica de maíz o una línea transformable de maíz derivada de una línea endogámica de élite del maíz ¿or medio de transformación mediada por Agrobac erium tal como se describe en los Ejemplos 12 y 13.
El vector PHP31363 se puede electroporar en la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector PHP10523 (Fig. 7; sec . con núm. de ident.:7) para crear el vector cointegrado PHP31373. El vector cointegtíado se forma mediante la recombinación de los 2 plásmidos, PHP31363 y PHP10523, a través de los sitios de recombinación de COS contenidos en cada vector. El vector cointegrado PHP31373 contiene los mismos 3 casetes de expresión anteriores (Ejemplo 14A) adicionalmente a otros genfes (TET, TET, TRFA, terminador ORI, CTL, ORI V, VIR Cl , VlR C2 , VIR G, VIR B) necesarios para la transformación de la cepa de Agrobacterium mediada por Agrobacterium .
Ejemplo 15 Preparación del vector de destino PHP23236 para la transformación en líneas de maíz derivadas ¿le Gaspe Flint Se obtuvo el vector de destino PHP23236 (Fig. 6, sec . con núm . de ident.:6) mediante la transformación de la cepa de Agrobacterium LBA4404 que contiene el plásmido PHP10523 (Fig. 7, sec. con núm. de ident.:7) con el plásmido PHP23235 (Fig. 8, sec. con núm. de ident.:8) y el aislamiento del producto obtenid<o por la cointegración. El vector de destino PHP23236 se puede usar en una reacción de recombinación con un clon de entrada, como se describe en el Ejemplo 16, para crear un vector de expresión del maíz para la transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint.
Ejemplo 16 Preparación de plásmidos para la transformación, en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint Se usó la tecnología de recombinación LR de INVITROGENTI GATEWAY® para clonar direccionalmente el rtiiismo clon de I j entrada descrito en el Ejemplo 5A en el vec¡tor de destino I PHP23236 (sec. con núm. de ident.:6; Fig. 6)i para crear un vector de expresión, PHP30775. Este vector de expresión contiene el ADNc de interés que codifica el polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del i:ipo C3HC4) de Arabidopsis controlado por el promotor UBI ? es un vector binario de T-ADN para la transformaciór. mediada por Agrobacterium en maíz tal como se describe, pero sin limitarse a los ejemplos descritos en la preseite invención.
Ejemplo 17 Transformación de líneas de maíz derivadas de paspe Flint con un gen guía de Arabidopsis validado Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar el gen guía de Arabidopsis o los homólogos correspondientes de otras especies para examinar el fenotipo resultante.
Plantas receptoras : Las células de plantas receptoras pueden ser de una línea de maíz uniforme con un ciclo de vida corto ciclo rápido"), de tamaño reducido y de potencial de transformación alto. Las células vegetales para maíz típicas son las células vegetales de las variedades de líneas de Gaspe Flint (GBF) disponibles al público. Una variedad posible de la línea de plantas candidato es el híbrido Fl de GBF x QTM (Q ick Turnaround Maize, una forma disponible al público de Gaspe Flint seleccionada para el crecimiento en condiciones de invernadero) descrito en Tomes et al., publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0221212. Las plantas transgénicas obtenidas de esta línea tienen un tamaño reducido tal que se pueden cultivar en macetas de 10 cm (cuatro pulgadas) (1/4 del espacio necesario para una planta de maíz de tamaño normal) y que maduran en menos de 2.5 meses. (Tradicionalmente , para obtener la semilla tra: sgénica T0 una vez que las plantas transgénicas se aclimatan al invernadero se requieren 3.5 meses) . Otra línea adecuada es una línea haploide doble de X Gaspe Flint de GS3 (una ¡Línea altamente transformable) . Otra línea adecuada adicional es una línea endogámica de élite transformable que lleva un transgén que causa floración, estatura reducida o ambas.
Protocolo de transformación: Para introducir los transgenes en las células del maíz I se podría usar cualquier método adecuado que incluye, pero no se limita a, los procedimientos de inoculación que emplean vectores basados en Agrobacterium. La transformación se podría realizar en embriones inmaduros j de la planta receptora (objetivo) .
Cultivo de precisión y seguimiento de las plantas La población del evento de las plantas transgénicas (TO) resultante de los embriones de maíz transformado se cultiva en un ambiente controlado de invernadero con] el uso de un diseño de bloqueo aleatorizado modificado para reducir o eliminar el error ambiental. Un diseño de bloques aleatorizado es una presentación vegetal en donde las plantas experimentales se dividen en grupos (por ejemplo, treinta plantas por grupo) denominados bloques y a cada planta se le asigna aleatoriamente una localidad con el bloque.
Para un grupo de treinta plantas se colocan veinticuatro plantas de experimento transformadas y seis plantas de control (plantas con un fenotipo determinado) (colectivamente, un "grupo de réplicas") en macetas dispuestas en un arreglo (mencionado también como un bloque o grupo de réplicas) sobre una mesa ubicada dentro de un invernadero. Cada planta, control o experimento se asigna aleatoriamente a una lbcalidad con el bloque mapeado hacia la localidad de un invernadero físico y único, así como al grupo de réplicas. Múltiples grupos de réplicas de treinta plantas cada una se pueden cultivar en el mismo invernadero en un solo experimento. La presentación (arreglo) de los grupos de réplicas debería determinarse para minimizar los requerimientos de espacio, así cbmo los efectos ambientales dentro del invernadero. Tal presentación puede denominarse presentación de invernadero comprimido.
Una alternativa a la adición de un grupo de control específico es identificar las plantas transgénicas que no expresan el gen de interés. Una gran variedad de técnicas, I tales como TI- CP, se puede aplicar [para analizar cuantitativamente el nivel de expresión del gén introducido.
Las plantas TO que no expresan el transjgén se pueden comparar con las que sí lo expresan.
Cada planta en la población del evento se identifica y se monitorea por todo el proceso de evaluación y la información recopilada de esa planta se asocia automáticamente con esa planta, de modo que la información recopilada se puede asociar con el transgén transportado por la planta. Pojr ejemplo, cada contenedor de plantas puede tener una etiqueta legible para computadora (tal como un código de barras del uódigo Universal de Productos (UPC, por sus siglas en inglés) ) que incluye información de la identidad de la planta, qüe a su vez se correlaciona con una localidad del invernadero, de modo que la información obtenida de la planta se puede asociar automáticamente con esa planta.
Alternativamente, se puede usar cualquier sistema de identificación de plantas eficiente y legible para computadora, tal como códigos de matriz bidimensional o incluso etiquetas de identificación por radiofrecuencia (RFID, por j sus siglas en inglés), , en donde la información se recibe y se! interpreta por un receptor/procesador de radiofrecuencias. Ver la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm¿ 2004/0122592, incorporada en la presente descripción como refjrencia.
Análisis fenotípico con el uso de imágenes trijdimensionales : Cada planta del invernadero en la pobladión del evento T0, incluso cualquier planta de control, se Analiza por las características agronómicas de interés y íla información agronómica para cada planta se registra o se almacena de modo que se asocie con información que la identifique (ver arriba) La confirmación de un fenotipo (efecto de los genes) se puede obtener en la generación TI con un diseño experimental similar al descrito anteriorment .
Las plantas T0 se analizan a nivel fenotípico con el uso de tecnología de imágenes cuantitativa y no destructiva por medio del ciclo de vida completo en invernaderc de las plantas para analizar las cepas de interés. Para el análisis multidimensional y automático de las plantas completas se podría usar un analizador digital de imágenes, La obtención de imágenes se puede realizar adentro del invernadero. Para ver la planta de todos lados se usa dos sistemas de cámara colocados en la parte superior y al lado, así jcomo un aparato para girar la planta. Las imágenes se obtienen desde la parte superior, frontal y a un lado de cada planta. Las tres imágenes juntas proporcionan suficiente injformación para examinar la biomasa, el tamaño y la morfología de cada planta.
Debido al cambio en el tamaño de las plantas desde el momento en que aparece la primera hoja del Jsuelo hasta el momento en que las plantas se encuentran en el final de su desarrollo, las etapas tempranas del desarrol o de la planta se documentan de la mejor manera con una magnificación mayor desde la parte superior. Esto se puede lograr con el uso de un sistema de lentes de acercamiento motorizado controlado completamente por un programa de imágenes.
En una sola operación de análisis de imágenes ocurren los siguientes eventos: (1) la planta se lleva dentro del área del analizador, se gira 360 grados de modo que su etiqueta legible para la computadora se pueda leer y se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse; (2) la imagen llateral se toma y se ingresa en una base de datos; (3) la plánta se gira 90 grados y nuevamente se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse y (4) la planta se retira del 'analizador .
Las plantas se dejan por lo menos sei s horas en la oscuridad por un período de veinticuatro horas para que tengan un ciclo normal de día/noche.
Instrumentación de imágenes: aproximadamente 5 % para componentes mayores y menor que aproximadamente 10 % para componentes menores.
Software : El sistema de análisis de imágenes comprende un programa informático de LemnaTec HTS Bonit para análisis de color y arquitectura y una basa de datos del servidor para almacenar datos desde aproximadamente 500,000 análisis, que incluyen las fechas de análisis. Las imágenes originales y las imágenes analizadas se almacenan juntas para permitir que el usuario reanalice tanto como desee. La base de datos se puede conectar al hardware de imágenes para la recolección y almacenamiento automático de datos. Puede usarse una gran variedad de sistemas de programas disponibles comercialmentje (por ejemplo, atlab y otros) para la interpretación cuantitativa de los datos de imágenes, y cualquiera de estos sistemas de programas puede aplicarse al conjunto de datos de imágenes.
Sistema transportador: Se puede usar un sistema transportador con un dispositivo giratorio de plantas para transportar las plantas al área de imágenes y girarlas durante la obtención de las imágenes. Por ejemplo, hasta cuatro plantas, cada una ¡ con una altura máxima de 1.5 m, se colocan jen carros para pasar sobre el sistema transportador circular y por el área I de medición de imágenes. En este caso, la huella total de la unidad (analizador de imágenes y lazo del transportador) es de aproximadamente 5 m x 5 m.
El sistema transportador se puede agrandar para acomodar más plantas a la vez. Las plantas se transportal a lo largo del lazo del transportador hacia el área de imágenes y se analizan hasta 50 segundos por planta. Se toman las vistas de la planta. El sistema transportador, así como el equipo de imágenes, debe poder usarse en condiciones ambientales de invernadero.
Iluminación : ( Cualquier modo adecuado de iluminación se jpuede usar para la captación de imágenes. Por ejemplo, se puecle usar una luz en la parte superior sobre un fondo negro. Alternativamente, se puede usar una combinación de luz superior y posterior con un fondo blanco. El área iluminada se debe encerrar para asegurar condiciones constantes de iluminación. El alojamiento debe ser mayor que el área de medición de modo que prevalezcan las condiciones constantes de iluminación sin necesidad de abrir, cerrar o puertas. Alternativamente, la| iluminación se puede variar para causar la activación ya sea del transgén (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP,| por sus siglas en inglés) , proteína fluorescente roja (RFP, pqr sus siglas en inglés) ) o de fluoróforos endógenos (por ejemplo, clorofila) .
Cálculo de la biomasa en base a imágenes tridimensionales : Para el cálculo óptimo de la biomasa, lias imágenes de la planta deben tomarse por lo menos en vistas de tres ejes, por ejemplo, la vista superior y dos vistas laterales (lados 1 y 2) . Después, estas imágenes se analizan para separar la planta del fondo, de la maceta y de la bolse. de control de polen (si aplica) . El área total de la planta se puede calcular de la siguiente manera: j Área total calculada para la planta (pixeles) = Área superior (pixeles ) + Área del lado 1 (pixeles) + Área del lado 2 (pixeles) En la ecuación anterior las unidades de área son "unidades arbitrarias" . Las unidades arbitrarias son completamente suficientes para detectar efectos genéticos en el tamaño y crecimiento de las plantas en este sistema ya que lo que se desea es detectar las diferencias (tanto las mayores-positivas como las menores-negativajs) del medio experimental o del medio de control . Las unidades arbitrarias de tamaño (por ejemplo, área) podrían convertirse comúnmente en mediciones físicas mediante la adición de una referencia física al proceso de imágenes. Por ejemplo, una referencia física de área conocida se puede incluir tanto en el proceso de imágenes superiores como en, el de imágenes laterales. En base al área de estas referencias físicas se p*uede determinar un factor de conversión para permitir la converjsión de pixeles a una unidad de área tal como centímetros cuadrados (cm2) . La referencia física puede o no ser una muestra! independiente. Por ejemplo, la maceta, con un diámetro y altura conocidos, podría servir como una referencia física adecuada .
Clasificación del color: La tecnología de imágenes también se puede usar para determinar color de la planta y para asignar los colores de las plantas a varias clases de color. La asignación del color de . las imágenes a las clases de color es una característica propia del programa LemnaTéc . Con otros sistemas de programas de análisis de imágenes, la clasificación de color se puede determinar por una gran variedad de planteamientos computacionales .
Para la determinación de los parámetrosj del tamaño y crecimiento de las plantas se presenta un esquema de clasificación útil para definir un esquema simple de color que incluye dos o tres degradaciones de verde y, adicionalmente , una clase de color para clorosis, necrosis y blanqueamiento, si ocurrieran estas condiciones. También se usa una clase de color de fondo que incluye colores en la imagen que no son de plantas de modo que se pueda cuantificar cualquier j cambio que se produce en una planta con el tiempo o entre plantas o lotes diferentes de plantas (por ejemplo, diferencias iestacionales) .
Además de su utilidad en determinar el ¡crecimiento de i la planta, la clasificación de color se piiede usar para analizar otros rasgos del componente de pr ducción. Para estos otros rasgos del componente de produjcción se puede usar esquemas adicionales de la clasificación del color. Por ejemplo, él rasgo conocido como "siempre verde", que se ha asociado con mejorías en el rendimiento, se puede analizar mediante la .clasificación de color que separa las degradaciones de verde de las sombras de amarillo y café (que son indicativos de tejidos senescentes) . Si se aplica i esta clasificación de color a las imágenes temadas hacia el final del ciclo de vida de las plantas T0 jo TI, se puede identificar las plantas con cantidades aumentadas de colores de verde en relación con los colores amarillo o café (expresados, por ejemplo, como relación verde /amarillo) . Las plantas con una diferencia importante en esta relación verde/amarillo se pueden identificar como transgenes portadores que impactan este rasgo agronómico importante .
El biólogo experto en plantas reconocerá que surgen otros colores de plantas que pueden indicajr salud de la planta o respuesta al estrés (por ejemplo, j antocianina) y que otros esquemas de clasificación, de j color pueden proporcionar medidas adicionales de la acción genética en rasgos relacionados con estas respuestas. j Análisis de la arquitectura de la planta: Los transgenes que modifican los parámetros de la í arquitectura de la planta se pueden identificar, además, con el uso de la presente invención, incluso los pLrámetros tales como altura y anchura máxima, distancias internodales, ángulo entre las hojas y el tallo, cantidad de hoja¿ que surgen de los nodulos y longitud de las hojas. El progrjama del sistema LemnaTec se puede usar para determinar la arquitectura de la j planta de la siguiente manera. La planta _je reduce a su arquitectura geométrica principal en una prjimera etapa de imágenes y, después, en base a esta imagen sej puede realizar la identificación parametrizada de los diferentes parámetros de arquitectura. Los transgenes que modifican cualquiera de estos parámetros de arquitectura, ya sean solos o combinados, se pueden identificar mediante la aplicación de los enfoques estadísticos descritos anteriormente.
Fecha de esparcimiento del polen: La fecha de esparcimiento del polen ek un parámetro importante de analizar en una planta transformada y se puede determinar mediante la primera aparición en la plknta de una flor macho activa. Para encontrar el elemento de la! flor macho, el extremo superior del tallo se clasifica por color para detectar anteras amarillas o violeta. Este análisis de la ¡clasificación de color después se usa para definir una flor activa, que a su vez se puede usar para calcular la fecha de esparcimiento jdel polen.
Alternativamente, el personal responsable dejl cuidado de la planta puede registrar la fecha de esparcimiento d^l polen y otros atributos de la planta fácilmente detectables por medio de la vista (por ejemplo, fecha de polinización, primera fecha de maduración) . Para maximizar la integridad de ¡los datos y la eficacia del proceso, esta información se monitorea mediante el uso de los mismos códigos de barra usados por ejl dispositivo de análisis digital de espectro de luz de LemnaTec. Una computadora con lector de códigos de barras, un dispositivo personal digital o una computadora portátil se pueden usar para facilitar la captura de datos por medio de registrar las horas de ! observación, el identificador vegetal y el operador que captó los Latos.
Orientación de las plantas: Las plantas maduras de maíz cultivadas a densidades que se aproximan a la siembra comercial usualmente tienen una arquitectura plana. Es decir, la planta tiene un lado ancho claramente observable y un lado estrecho. La imagen de la planta está determinada por el lado ancho. Para cada planta se asigna una orientación básica bien definida para obtener la rjiáxima diferencia entre el lado ancho y las imágenes de lado. La imagen superior se usa para determinar el eje principal de la planta y se usa un dispositivo giratorio adicional para posicionar |la planta en la i orientación adecuada antes de empezar la captación principal de imágenes . j Ejemplo 18 A ! j Análisis de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint para determinar la tolerancia a la sequía Las líneas de maíz transgénicas derivadas de Gaspe Flint que contienen el gen candidato se pueden analizar para determinar la tolerancia al estrés de la sequía de la siguienjte manera.
Las plantas de maíz transgénicas se exponen a condiciones de riego adecuadas (control) y a condiciones de estrés de la sequía. Las plantas de maíz transgénicas se analizan en la etapa TI o posterior.
El estrés se impone a los 10 a 14 días después de la siembra (DAS, por sus siglas en inglés) o a los 7 días después del trasplante, y continúa hasta la maduraciónj Las macetas se riegan por medio de un sistema automático equipado con tempo izadores para proporcionar riego a 25 o 50 de la capacidad de campo durante todo el periodo dej tratamiento de estrés de la sequía. La intensidad y duración de este estrés permitirá identificar el impacto en el crecimiento vegetativo y en el intervalo de antesis-maduración .
Mezcla para el cultivo en macetas: Se puede usar una i mezcla de 1/3 TURFACE® (Profile Products LL!C, IL, Estados Unidos) , 1/3 de arena y 1/3 de SB300 (Sun Gro H<prticulture , WA, Estados Unidos) . El SB300 se puede reemplazar por Fafard Fine-Germ (Conrad Fafard, Inc., MA, Estados Unidos) jy la proporción de arena en la mezcla se puede reducir. De ¡este modo, una mezcla final para el cultivo en macetas puede ser de 3/8 (37.5 %) de TURFACE®, 3/8 (37.5 %) de Fafard^y ¼ (25 ¾) de arena . ¡ Determinación de la capacidad de campo: Se ^mide el peso de la mezcla de suelo (wl) que se usará en una Jnaceta S200 (se resta el peso de la maceta) . Si todos los componentes de la mezcla de suelo no están secos, el suelo se seca a 100 °C hasta obtener un peso constante antes de determinar el wl . El suelo de la maceta se riega hasta que se satura completamente y se espera hasta que toda el agua gravitacional drene. Una vez que se escurrió toda el agua gravitacional, se determina el peso del suelo (w2) (menos el peso de la maceta) . La capacidad de campo es el peso del agua que queda en el suelo í obtenido como w2- l. Se puede expresar como un| porcentaje del peso del suelo secado en horno.
Tratamiento del estrés: Durante la etapa temprana del crecimiento de la planta (10 DAS a 21 DAS) , la planta de control regada adecuadamente recibe un riego diario de 7 de la capacidad de campo y la planta con tratamiento estrés de la sequía recibe un riego diario de 25 % de ? capacidad de campo, ambas como una única! dosis diaria provista exactamente o aproximadamente a las 10 AM. A medida que las plantas crecen, a los 21 DAS, será necesario aumentar el riego diario de la planta de control regada adecuadamente. hasta la capacidad total de campo y en la planta con i tratamiento de estrés de la sequía hasta él 50 % de la capacidad de campo.
Solución nutriente: Para el riesgo se usa una solución de Hoagland modificada en una dilución de jl/16 con agua corriente (Tabla 1, Tabla 2) . ! Tabla 1 Preparación de 20 L de solución de Hoagland m< Ddificada con la siguiente receta: Tabla 2 | Preparación de 1 L de solución 10X de micronutjrientes con la siguiente receta: Se usa un fertilizante de grado K 03.
Es conveniente añadir en la maceta medial cucharadita de OSMOCOTE® (NPK 15:9:12) en el momento de realizar el trasplante o después del afloramiento (The Scotts Miracle-Gro Company, OH, Estados Unidos) .
Plantas de borde: Se coloca una hilera de plantas de borde en los bordes de la mesa de trabajo adyacentes a las paredes de vidrio del invernadero o adyacentes a otras causas potenciales de variabilidad microambi ntal , tal como un ventilador de enfriamiento. j Automatización: Para el riego se pueden usar tubos de PVC con orificios perforados que suministran el agüa a las macetas ubicadas en forma sistemática por medio de un dispositivo con sifón. El riego se puede programar por medio de temporizadores .
Análisis estadístico: Los valores promedio del tamaño, color y fluorescencia de la clorofila de la planta registrados en los eventos transgénicos con los distintos tratamientos del estrés se exportarán a Spotfire (Spotfire, Inc., MA, Estados Unidos) . Para evaluar las diferencias en los valores promedio del tratamiento se usará análisis de varianza. I Replicación: Se usan de ocho a diez plantjas individuales por tratamiento y por evento. j Observaciones realizadas: Se realizan mediciones con el . i dispositivo Lemnatec tres veces a la semána durante el crecimiento para obtener el índice de crecimiento de la planta. Asimismo, el dispositivo Lemnatec | se usa para determinar el color de la hoja tres veces a IÓL semana durante el periodo de estrés. La fluorescencia de la clorofila se registra como PhiPSII (que indica la eficiencia cuántica operativa de la fotoquímica del photosystem II; mencionado, además, como AF/Fm' o F'q/Fm') y Fv' /Fm' (que es la eficiencia máxima del photosystem II) dos a cuatro vjces durante el periodo experimental, y se empieza a las 11 AM en los días de medición con el instrumento Hansatech FMS2 (LemnaTec GmbH, Wurselen, Alemania) . Las mediciones comienzan durante el periodo de estrés al inicio de los síntomajs visibles del estrés de la sequía, es decir, cuando las h¿jas se vuelven grises y cuando comienzan a enrollarse hasta el final del experimento y las mediciones se registran en la hoja más joven y más expandida. Se registran las fechas de formación de la panoja y maduración en las plantas individuales y se calcula e intervalo de antesis-maduración (ASI) .
Los métodos anteriores se podrían usar para seleccionar plantas transgénicas con una mayor tolerancia a la sequía cuando se comparan con una planta de control qjue no comprende I ese constructo de ADN recombinante . i Ejemplo 18B Transformación y evaluación de las líneas de m íz transformadas con PHP31373 El cásete de expresión del polipéptido dé la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) presente en el vector cointegrado PHP31373 se introdujo en uAa. línea de maíz transformable derivada de una línea endogámica de élite del maíz tal como se describe en los Ejemplos 14A y 14B. i Para los nueve eventos de transformacióiji se obtuvieron semillas TI y se evaluaron para determinar ja actividad de tolerancia a la sequía prácticamente como se describe en el Ejemplo 18 A. La Figura 10 muestra las variables para cada I evento transgénico que se alteraron considerablemente , en comparación con las no segregantes. Un "efecto positivo" se definió como una mejora estadísticamente significativa en esa variable para el evento transgénico con respecto al control negativo. Un "efecto negativo" se definió cjomo una mejora estadísticamente significativa en esa variable para el control negativo con respecto al evento transgénico.
La Figura 10 muestra el valor estadístico asociado con cada variable mejorada para el constructo evaluado, PHP31373. Un resultado positivo significativo tenía una valor P menor que o igual a 0.1. Los resultados para las líneas de maíz individuales transformadas se muestran jen la Figura 10. í I La Figura 10 indica que siete de nue^ve eventos en el experimento 1 y cinco de nueve eventos en el experimento de replicación 2 most un efecto positivo en al menos una variable (tal como el peso del brote) cuando las plantas se cultivaron en condiciones de agua reducida (estrés de la sequía) .
Ejemplo 19 A Análisis de la producción de líneas de majíz con el gen guía de Arabidopsis Un constructo de ADN recombinante que contiene un gen de Arabidopsis validado se puede Introducir en una línea endogámica de élite del maíz mediante transformación directa o introgresión de una línea transformada separadamente.
Las plantas t ransgénicas , ya sea endogámicas o híbridas, se pueden probar mediante estudios de campo más intensos para analizar la mejora en la producción y/o estabilidad en condiciones de riego adecuadas y en condiciones de limitación de agua.
El análisis de producción posterijor se puede realizar para determinar si las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tienpn una mejora en el rendimiento de producción en condiciones de limitación de agua, cuando se comparan con las plantas de cont de Arabidopsis las condiciones de periodo de floración y/o llenado del grano para las plantas que contienen el gen guía de Arabidops i s validado y para las plantas de control. La reducción en la producción se puede medir para ambas. Las plantas que contienen el gen guía di Arabidopsis validado tienen menos pérdida de producción en relación con las plantas de control, por ejemplo, una pérdida de producción al menos 25 % meno .
El método anterior se podría usar para seleccionar plantas transgénicas con un mayor rendimiento, en condiciones de limitación de agua y/o j de riego adecuado, cuando se comparan con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante .
Ejemplo 19 B Análisis de la producción de líneas de m i z transformadas con PHP31373 que codifican el gen guía de Arabidopsis At2g01150 El cásete de expresión del polipeptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING de", tipo C3HC4) presente en el vector cointegrado ¡ PHP31373 se I introdujo en una línea de maíz transformable derivada de una línea endogámica de élite del maíz tal como se describe en los Ejemplos 14A y 14B.
Se probaron en campo nueve eventos] transgénicos en 2009 en Johnston, IA ("JH") , York,¡ NE ( "YK" ) y oodland, CA ( "WO" ) . En Woodland, CA , las condiciones de sequía se impusieron durante la floración (estrés de la floración; "FS" por sus siglas en inglés) y durante el periodo de llenado del grano (estrés del llenado del grano; "GFS" por sus siglas en inglés) . El área tratada en JH estaba bien regada y el área de YK experimentó una sequía ligera durante el periodo de llenado del grano. Los datos de la producción (bushel/ acre; bu/ac) de los 9 eventos transgénicos se ilustran en la Tabla 3 junto con el control de tipo silvestre (WT, por sus siglas en inglés) y el control no transgénico (BN, por sus siglas en inglés) . La significancia estadística se informa a P<0.1 para una prueba de dos colas. En el ambiente de YK tres eventos tuvieron efectos positivos y en el j área de W0_GFS un evento mostró efectos positivos cuando se compararon con el control WT o BN . En el área de WO_GFS un evento mostró efectos Jpositivos. En i dos de las cuatro áreas tres eventos j mostraron un efecto negativo significativo. El evento E7899. 44.1.4 mostró una producción mayor en tres de las cuatro áreas cuando se compara con el control WT, con un aumento significativo de 3707 a 61781 bu/km2 (15 a 25 bu/ac) en el área de WO-GFS cuando s-e compara con el control BN o WT, respectivamente.
Tabla 3 Prueba de campo de 2009 del maíz transformado con PHP31373 Ganancia significativa en la producción Pérdida significativa en la producción La Figura 16 muestra la producción promedio de 8 eventos transgénicos del maíz (que contiene el cásete de expresión del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) ) contra la producción de los no transgénicos. La línea gris (relación 1:1) marca el lugar en el cual la relación de la producción entre los eventos transgénicos y los no transgénicos es 1:1, lo que representa una producción igual. Puede observarse que cuando los niveles generales de producción son bajos, las plantas transgénicas muestran una ventaja en la producción sobre los eventos no transgénicos (ver las áreas marcadas con un círculo en donde la producción transgénica es mayor que la relación 1:1) .
Además, cuando las plantas de maíz se exponen a un estrés gradual (Figura 16, panel izquierdo) puede observarse un punto de cruce (aproximadamente a 19768 bu/km2 (80 bu/acre)) en un nivel de producción mayor cuando se compara con la plantas expuestas a un estrés rápido (aproximadamente a 12355 bu/km2 (50 bu/acre) ) panel derecho) .
Ejemplo 20A j Preparación del vector de expresión del gen guía del polipéptido de la familia de dedos de zinc (deqio RING del tipo C3HC4) del maíz para la transformación dej. maíz pueden identificar clones que codifican un polipéptido de la familia de dedos de zinc ¡(dedo RING del tipo C3HC4) del maíz. La región codificante de proteínas de estos clones se puede introducir en el vector INVITROGEN™ pENTR/D-TOPO® para crear clones de entrada.
Ejemplo 20B Transformación del maíz con un gen guía del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) del maíz con Agrojbacterium Un cásete de expresión del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) del maíz se puede introducir en una línea endogámica de maíz o en una línea transformable de maíz derivada de una línea endogámica de élite del maíz por medio de transformación mediada por Agrobacterium tal como se describe en los Ejemplos 12 y 13 Ejemplo 21 Preparación de plásmidos de expresión del maíz para la transformación en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint Se, pueden identificar clones que codifican un homólogo completo del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) del maíz.
Con la tecnología de recombinación INVITROGEN™ GATEWAY® descrita en el Ejemplo 9, los clones que ¡ codifican los homólogos del polipéptido de la familia RING del tipo C3HC4) del maíz direccionalmente en un vector de destino para' crear vectores de expresión. Cada vector de expresión puede contener el ADNc de interés controlado por el promotor UBI y es un vector binario de T-ADN para la transformación' mediada por Agrojbacterium en maíz tal como se describe, pero sin limitarse a, los ejemplos descritos en la presente invencion.
Ejemplo 22 Transformación y evaluación del frijol de soya con homólogos del frijol de soya de genes guía validados En función de búsquedas de homología se puede identificar uno o varios homólogos del frijol de soya candidato de genes guía de Arabidopsis y, además, se puede evaluar su capacidad para mejorar la tolerandia a la sequía en el frijol de soya. La construcción del vector, la transformación de la planta y el análisis f notípico serán similares a los descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 23 , Transformación y evaluación del maíz con homólógos del maíz genes guía validados En función de búsquedas de homología se puede identificar uno o varios homólogos del maíz candidato de genes guía de Arabidopsis y, además, se puede evaluar su capacidad para mejorar la tolerancia a la sequía en el maíz.
La construcción del vector, la transformació ! de la planta y el análisis fenotípico serán similares a lop descritos en los Ejemplos anteriores.
Ejemplo 24 Transformación de Arabidopsis con homólogos dej. maíz y frijol de soya de genes guía validados Los homólogos del frijol de soya y maíz de genes guía de Arabidopsis validados se pueden transformar en Arabidopsis bajo el control del promotor 35S y se puede evaluar su capacidad para mejorar la tolerancia a ¡la sequía en Arabidopsis . La construcción del vector, la transformación de la planta y el análisis fenotípico serán similares a los descritos en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 25 Mayor caracterización del gen candidato de Arabidopsis At2g01150 (polipéptido de la familia de dedos ¿e zinc; RHA2B) El gen candidato del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) c.e Arabidopsis (At2g01150; sec . con núm. de ident.:16) se probó para determinar su capacidad para conferir tolerancia a la sequía tal como se describe en el Ejemplo 5.
Para caracterizar aún más el gen í candidato de Arabidopsis At2g01150 se realizaron experimentos para probar si el gen candidato de Arabidopsis At2g0_|l50 tiene una función en las respuestas al ABA. Se informó que una ligasa E3 con dedo ring (RHA2a) de Arabidopsis AtRHA2a regula el control mediado por ABA de la germinación de La semilla (Bu, Q. et al. Plant Physiology, vol . 150, págs . 463-481).
La sensibilidad del ABA se analizó durante la germinación de las semillas transgénicas de tipo silvestre (Wt) y T2 de Arabidopsis que contienen el 'polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING dél tipo C3HC4) (mencionadas como semillas 35S- At2g01150) (Figura 11, panel izquierdo) . Las semillas transgénicas Wt y T2 agrupadas (-100 semillas) se colocaron ei placas y se mantuvieron durante 4 días a 4 °C para j.nterrumpir el estado latente. Después, se incubaron placas Petri a 22 °C en ciclos de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. La germinación se calificó cada día. Para cada tratamiento se calificaron dos placas de réplicas. Los porcentajes de germinación para wt y para 35-At2g01150 en placas ¼ MS-agarosa fueron similares. En presencia del ABA, las semillas de 35S-At2g01150 mostraron una sensibilidad al ABA mayor que las plantas wt . De manera similar, el índice de la inhibición producida por el ABA en el crecimiento posterior a la germinación aumentó significativamente en las líneas transgénicas que sobreexpresan At2g01150 (ver núm. 27, Figura 11, panel derecho) .
En concordancia con la hipersensibilidad al ABA, las plantas transgénicas 35S-At2gll50 muestran una mayor tolerancia a la sequía en la prueba de sequía/reirrigación. La prueba de sequía1/, reirrigación mj.de la diferencia en la recuperación después de la deshidratación con plantas cultivadas en el suelo. Las plantas se cultivaron durante 16 horas de luz a 22 °C y 40 % de humedad relativa. El estrés de la sequía se impuso en plantas de 3 semanas de vida mediante la retención de agua durante dos semanas; después, las plantas se reirrigaron. El índice de recuperación de las plantas 35-At2g01150 fue marcadamente mayor en comparación con las plantas wt .
Los experimentos de sequía/reirr igación indicaron que el rendimiento de las plantas Arab idop transgénicas que sobreexpresan At2g0115Q (RHA2B) fue mejor y que mostraron actividad de tolerancia a la sequía en comparación con las plantas de tipo silvestre que no contienen el transgén (Figura 15) .
Ejemplo 26 Análisis del rasgo "siempre verde" de línjeas de maíz transformadas con PHP31373 que codifica ejl gen guía de Arabidopsis At2g01150 El cásete de expresión del polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4 presente en el vector cointegrado PHP31373 se introdujo en una línea de maíz transformable derivada de una línea endogámica de élite del maíz tal como se describe en los Ejemplos 14A y 14B.
El rasgo "siempre verde" es un cálculo visual de la proporción de la copa de la planta que está verde en la fecha en que se realiza la observación. Cuando se usó para experimentos de la j sequía, la calificación se realizó en los casosj en que se observaron diferencias en la senectud inducida por la sequía. Las puntuaciones del rasgo "siempre verde" reflejan la proporción de la copa de 1.a planta que aún era verde en la fecha en que se asignó la puntuación (9=90 % verde, 1=10 % verde) .
En Woodland, CA, en 2009, se probaron en campo nueve eventos transgénicos . Las condiciones de sequía se impusieron durante la floración (estrés de la i floración; "FS") y durante el periodo dé llenado del grano (estrés del llenado del grano; "GFS" ) . El fenotipo "siempre verde" de los ! 9 eventos transgénicos se ilustra en la Tabla 4 junto con el control de tipo silvestre (WT) y el: control no transgénico (BN) . La significancia esitadística se informa a P<0.1 para una prueba de dos colas.
Ganancia significativa en el fenotipo "siempre | verde" Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención comol antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Una planta que comprende en ! su genoma un i constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalraente a por lo menos un elemento regulador, i caracterizada porque el polinucleótido codifica1 un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33, y en donde la planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. i 2. La planta de conformidad con la j reivindicación 1, caracterizada porque además la planta es una planta de maíz o de frijol de soya. 3. Un método para aumentar la tojlerancia a la sequía en una planta, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que ¡ comprende polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clüstal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante . 4. Método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende, además: (c) obtener una planta progenie derivada de la planta i transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara conj una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante . 5. Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, caracterizado porque comprende : j (a) introducir en una célula vegetal ¡regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleóti.do codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos (e) evaluar la planta progenie para ¡ determinar la i tolerancia a la sequía cuando se compara conj una planta de control que no comprende el constructo de ADN jrecombinante . 7. Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que ¡ comprende polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tienen una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, Cuando se compara co:i las sec. con núms. de ident.:17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, o 33; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genomaj el constructo i de ADN recombinante ; | (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie cómprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y (d) evaluar la planta progenie para determinar tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la planta es una planta de maíz o una planta de frijol de soya. 9. El método de conformidad con la i reivindicación 4, caracterizado porque la planta es una planta de maíz o una planta de frijol de soya. 10. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la planta es una planté de maíz o una planta de frijol de soya. 11. El método de conformidad con la I reivindicación 6, caracterizado porque la planta es una plantja de maíz o una planta de frijol de soya. 12. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la planta es una plantja de maíz o una planta de frijol de soya. 13. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende : (a) una secuencia de nucleótidos qué codifica un polipéptido de la familia de dedos de zinc (dedo RING del tipo C3HC4) , en donde el polipéptido tiene uña secuencia de aminoácidos de por lo menos 90 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V \ con parámetros predeterminados de alineamiento en pares de KTUPLE=1( PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 , cuando se compara con la sec con núm. de ident. : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 291 31 o 33, o (b) el complemento total de la secuencia de nucleótidos de (a) . I 14. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el po[lipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 95 % de I identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados de alineamiento en pares, cuando se compara con la sec. con ijiúm. de ident. : 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 O 3Í . 15. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núm. de ident.:17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31 o 33. 16. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la sec. con núm. de idert.: 16. 17. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13. 18. Un constructo de ADN recombinante caracterizado porque comprende el polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 13 unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora. 19. Una célula que comprende el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque además la célula se selecciona del grupo que comprende una célula bacteriana, una céluia de levadura y una célula de insecto y una célula vegetal . 20. Una planta o semilla caracterizada porque comprende el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 18.
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