MX2010011504A - Plantas tolerantes a la sequia y constructos relacionados y metodos que involucran genes que codifican las proteinas tirosina fosfatasa. - Google Patents

Plantas tolerantes a la sequia y constructos relacionados y metodos que involucran genes que codifican las proteinas tirosina fosfatasa.

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Stephen M Allen
Shoba Sivasankar
Scott V Tingey
Stanley Luck
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Robert Wayne Williams
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Abstract

Los polinucleótidos y polipéptidos aislados y constructos de ADN recombinante útiles para conferir tolerancia a la sequía, composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de .ADN recombinante, y métodos que usan estos constructos de ADN recombinante. El constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a un promotor que es funcional en una planta, en donde el polinucle6tido codifica una proteína tirosina fosfatasa.

Description

PLANTAS TOLERANTES A LA SEQUIA Y CONSTRUCTOS RELACIONADOS. Y METODOS QUE INVOLUCRAN GENES QUE CODIFICAN LAS PROTEINAS TIROSINA FOSFATASAS CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención se relaciona con el cultivo y la genética de las plantas y, particularmente, se relaciona con los constructos de ADN recombinante útiles en plantas para conferir tolerancia a la sequía.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El impacto abiótico es la causa primaria de la pérdida de los cultivos en todo el mundo. Provoca pérdidas en el rendimiento promedio de más que 50 % para los cultivos principales (Boyer, J.S. (1982) Science 218:443-448; Bray, E.A. et al. (2000) en Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Editado por Buchannan, B.B. et al., Amer. Soc . Plant Biol . , págs . 1158-1249). Entre los diferentes impactos abióticos, la sequía es el factor principal que limita la productividad de los cultivos en todo el mundo.
La exposición de las plantas a un ambiente limitado al agua durante varias etapas del desarrollo parece activar varios cambios fisiológicos y de desarrollo. El conocimiento del mecanismo molecular y bioquímico básico para la percepción del impacto, transducción y tolerancia a la sequía es un Ref . ¡213669 reto principal en la biología. Las revisiones en los mecanismos moleculares de respuesta al impacto abiótico y las redes reguladoras de la genética de la tolerancia al impacto por sequía se publicaron (Valliyodan, B., y Nguyen, H.T., (2006) Curr. Opin. Plant Biol . 9:189-195; Wang, W., 'et al. (2003) Planta 218:1-14); Vinocur, B., y Altman, A. (2005) Curr. Opin. Biotechnol . 16:123-132; Chaves, M.M., y Oliveira, M.M. (2004) J. Esp. Bot . 55:2365-2384; Shinozaki, K. , et al. (2003) Curr. Opin. Plant Biol. 6:410-417; Yamaguchi -Shinozaki , K. , y Shinozaki, K. (2005) Trends Plant Sci . 10 : 88-94) .
Un trabajo temprano en los aspectos moleculares de las respuestas al impacto abiótico se llevó a cabo por análisis sustractivo y/o' diferencial (Bray, E.A. (1993) Plant Physiol. 103:1035-1040; Shinozaki, K. , y Yamaguchi- Shinozaki, K. (1997) Plant Physiol. 115:327-334; Zhu, J.-K. ,et al. (1997) Crit. Rev. Plant Sci. 16:253-277; Thomashow, M.F. (1999) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50:571-599). Otros métodos incluyen la selección de genes candidatos y analizar la expresión de tal gen o su producto activo bajo impacto, o por complementacion funcional en un sistema de impacto bien definido (Xiong, L., y Zhu, J.-K. (2001) Physiologia Plantarum 112:152-166). Además, se usaron estudios genéticos directos e inversos que involucran la identificación y aislamiento de mutaciones en genes reguladores para proporcionar evidencia para cambios observados en expresión del gen bajo impacto o exposición (Xiong, L., y Zhu, J.-K. (2001) Physiologia Plantarum 112 : 152-166) .
Se puede usar la rotulación de la activación para identificar genes con la capacidad de afectar un rasgo. Este • planteamiento se ha usado en la planta modelo de especie Arabidopsis thaliana (Weigel, D., et al. (2000) Plant Physiol . 122:1003-1013). Las inserciones de elementos potenciadores de la transcripción pueden, en forma dominante, activar y/o aumentar la expresión de genes endógenos cercanos. Este método puede usarse para seleccionar los genes involucrados en los fenotipos agronómicamente importantes, que incluyen la tolerancia al impacto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye: En una modalidad, una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y en donde la planta muestra tolerancia a la sequía aumentada cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
En otra modalidad, una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y en donde la planta muestra una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. Opcionalmente , la planta muestra la alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones de limitación de agua, con la planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
En otra modalidad, la presente invención incluye cualquiera de las plantas de la presente invención, en donde la planta es una planta de maíz o una planta de soya.
En otra modalidad, un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de ¦ alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica de la etapa (b) , en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra tolerancia a la sequía aumentada cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
En otra modalidad, un método de evaluación de la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
En otra modalidad, un método de determinación de una alteración de por lo menos una característica agronómica en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) determinar si la planta progenie muestra alguna alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. Opcionalmente , la etapa determinante (d) comprende determinar si la planta transgénica muestra alguna alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
En otra modalidad, la presente invención incluye cualquiera de los métodos de la presente invención, en donde la planta es una planta de maíz o una planta de soya.
En otra modalidad, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de la proteína tirosina fosfatasa, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 90 % de identidad de secuencia, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: 25, 37, 40 ó 41, o al menos 93 % de identidad de secuencia, cuando se compara con la sec . con núm. de ident: 21 ó 39, o la secuencia de aminoácidos comprende la sec. con núm. de ident. : 17, 34, 43 ó 44, o (b) un complemento completo de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento completo y la secuencia de nucleótidos consiste del mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios. El polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. : 17, 21, 25, 34, 36, 37, 40, 41, 43 ó 44. La secuencia de nucleótidos puede comprender la secuencia de. nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 16, 20, 24, 39 ó 42.
En otra modalidad, la presente invención se relaciona con un constructo de ADN recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, y una célula, una planta, y una semilla que comprende el constructo de ADN recombinante.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La presente invención se comprenderá con mayor facilidad a partir de la siguiente descripción detallada y de las figuras acompañantes, así como del listado de secuencias que forman parte de la presente solicitud.
Las Figuras 1A-1C presentan un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína tirosina fosfatasa que se expone en la sec . con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 40, 43, 45 y 46. Los residuos que son idénticos al residuo de sec. con núm. de ident. : 15 en una posición dada se encierran en un cuadro. Se presenta una secuencia consenso donde un residuo se muestra idéntico en todas las secuencias, de otra manera, se muestra un período .
La Figura 2 presenta los valores porcentuales de identidad y divergencia de secuencias para cada par de secuencias que se presenta en las Figuras 1A-1C.
La Figura 3 presenta los valores porcentuales de identidad y divergencia de secuencias para cada par de secuencias de la proteína tirosina fosfatasa citosólica potencial que se expone en la sec. con núm. de ident. : 33, 34, 35, 36, 37, 38, 41, 44, 47, 48, 49 y 50.
Las Figuras 4A - 4B muestran una evaluación de las líneas individuales de maíz derivadas Gaspe Flint transformadas con PHP30853.
Las Figuras 5A - 5B muestran una evaluación resumen de las líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint transformadas con PHP30853.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La sec. con núm. de ident. :1 es la secuencia de nucleótidos del vector con rotulación de 'activación pHSbarENDs2 que se usa para formar las poblaciones de Arabidopsis .
La sec. con núm. de ident.:2 es la secuencia de nucleótidos del vector donante pD0NR™/Zeo GATEWAY®. El sitio attPl se encuentra en los nucleótidos 570-801; el sitio attP2 se encuentra en los nucleótidos 2754-2985 (cadena complementaria) .
La sec. con núm. de ident . :3 es la secuencia de nucleótidos del vector donante pDONR™221 GATEWAY®. El sitio attPl se encuentra en los nucleótidos 570-801; el sitio attP2 se encuentra en los nucleótidos 2754-2985 (cadena complementaria) .
La sec. con núm. de ident. :4 es la secuencia de nucleótidos de pBC-yellow, un vector de destino para usar con Arabidopsis . El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 11276-11399 (cadena complementaria) ; El sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 9695-9819 (cadena complementaria) .
La sec. con núm. de ident. :5 es la secuencia de nucleótidos de PHP27840, un vector de destino para usar con frijol de soya. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 7310-7434; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 8890-9014.
La sec. con núm. de ident. :6 es la secuencia de nucleótidos de PHP23236, un vector de destino para usar con líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 2006-2130; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 2899-3023.
La sec . con núm. de ident . :7 es la secuencia de nucleótidos de PHP10523 (Komari et al., Plant J. 10:165-174 (1996) ; Identificador General NCBI núm. 59797027) .
La sec. con núm. de ident. :8 es la secuencia de nucleótidos de PHP23235, un vector que se usa para construir el vector de destino PHP23236 para usar con líneas derivadas de Gaspe Flint.
La sec. con núm. de ident. :9 es la secuencia de nucleótidos de PHP28647, un vector de destino para usar con líneas endogámicas derivadas del maíz. El sitio attRl se encuentra . en los nucleótidos 2289-2413 ; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 3869-3993.
La sec. con núm. de ident. :10 es la secuencia de nucleótidos del sitio attBl .
La sec. con núm. de ident.: 11 es la secuencia de nucleótidos del sitio attB2.
La sec. con núm. de ident. :12 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo At3g44620-5 ' attB, que contiene la secuencia attBl, usada para amplificar una porción de la región codificante de la proteína At3g44620.
La sec. con núm. de ident. :13 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso At3g44620-3 ' attB, que contiene la secuencia attB2, usada para amplificar una porción de la región codificante de la proteína At3g44620.
La sec. con núm. de ident.:14 corresponde a la secuencia de nucleótidos (locus At3g44620) que codifica una proteína tirosina fosfatasa de la proteína de Arabidopsis .
La sec. con núm. de ident . :15 corresponde a NCBI GI núm. 79432726, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína tirosina fosfatasa de Arabidopsis codificada por la sec. con núm. de ident.: 14.
Tabla 1 ADNc que codifica las proteínas tirosina fosfatasas Planta Designación Sec . con núm . Sec. con núm. clones* de ident . : de iden . : (Nucleótido) (Aminoácido) Maíz cielc.pk001.nl3 16 17 (FIS) Frijol de Contigo de: 18 19 soya sll.pk0004.cl2 (FIS) & GI núm. 17401417 ijol de sdrlf .pk003. el 20 21 soya (FIS) ijol de Gen quimérico: 22 23 soya nt 6-26 de sec. con núm. de 22 23 ident . : 18 & nt 3-707 de sec . con núm. de ident . : 20 Remolacha ebslc .pk003.kl4 24 25 (FIS) Bledo easlc .pk002. d7 39 40 (FIS) Uva Contigo de: 42 43 vmblna .pkQOl . i3 (FIS) ; vdblc.pk011.h24 (EST) * La secuencia de todo el inserto de ADNc se denomina "secuencia de inserción completa" ("FIS", por sus siglas en inglés) .
La sec. con núm. de ident. :26 corresponde a NCBI GI núm. 29367340 que es la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADNc que codifica una proteína tirosina tipo fosfatasa del arroz.
La sec. con núm. de ident. :27 corresponde a NCBI GI núm. 29367341, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína como la proteína tirosina fosfatasa del arroz codificada por la sec. con núm. de ident. :26.
La sec. con núm. de ident.: 28 es la secuencia de aminoácidos que se presenta en la sec. con núm. de ident . : 366863 de la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US20040214272 , que corresponde a una proteína como la proteína tirosina fosfatasa del maíz.
La sec. con núm. de ident.: 29 es la secuencia de aminoácidos que se presenta en la sec. con núm. de ident.: 277487 de la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US20040031072-A1, que corresponde a una proteína como la proteína tirosina fosfatasa del frijol de soya.
La sec. con núm. de ident. :30 es la secuencia de nucleótidos del iniciador VC062, que contiene el promotor T3 y el sitio attBl, útil para amplificar los insertos de ADNc clonados en un vector BLUESCRIPT® II SK(+) (Stratagene) .
La sec. con núm. de ident. :31 es la secuencia de nucleótidos del iniciador VC063, que contiene el promotor T7 y el sitio attB2, útil para amplificar los insertos de ADNc clonados en un vector BLUESCRIPT® II SK(+) (Stratagene) .
La sec. con núm. de ident. :32 es la secuencia de nucleótidos del clon de entrada PHP33257, y contiene la región codificante para la proteína tirosina fosfatasa de maíz del clon de ADNc cielc.pk001.nl3.
La sec. con núm. de ident.: 33 corresponde a los aminoácidos 63-239 de sec. con núm. de ident. -.15.
La sec. con núm. de ident.: 34 corresponde a los aminoácidos 89-274 de sec. con núm. de ident.: 17.
La sec. con núm. de ident.:35 corresponde a los aminoácidos 59-240 de sec. con núm. de ident.:19.
La sec. con núm. de ident.:36 corresponde a los aminoácidos 54-235 de sec. con núm. de ident.:21.
La sec. con núm. de ident.:37 corresponde a los aminoácidos 77-255 de sec. con núm. de ident.:25.
La sec. con núm. de ident.:38 corresponde a los aminoácidos 84-268 de sec. con núm. de ident.:27.
La sec. con núm. de ident.:41 corresponde a los aminoácidos 41-219 de sec. con núm. de ident.:40.
La sec. con núm. de ident . : 4 corresponde a los aminoácidos 65-246 de sec. con núm. de ident. :43.
La sec. con núm. de ident. :45 corresponde a NCBI GI núm. 225436307, que es la secuencia' de aminoácidos de una proteína como la proteína tirosina fosfatasa de la uva.
La sec. con núm. de ident.: 46 corresponde a la sec. con núm. de ident .: 112865 de la patente de los Estados Unidos núm. 7214786, que es la secuencia de aminoácidos para una proteína como la proteína tirosina fosfatasa del trigo.
La sec. con núm. de ident. :47 corresponde a los aminoácidos 65-246 de sec. con núm. de ident. :45.
La sec. con núm. de ident. :48 corresponde a los aminoácidos 81-265 de sec. con núm. de ident. :46.
La sec. con núm. de ident. :49 corresponde a los aminoácidos 89-274 de sec. con núm. de ident. :28.
La sec. con núm. de ident.:50 corresponde a los aminoácidos 59-240 de sec. con núm. de ident.:29.
Las descripciones y el listado de secuencias adjuntos a la presente cumplen las reglas que determinan las descripciones de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos en solicitudes de patente como se exponen en 37 C.F.R. §1.821-1.825.
El listado de secuencias contiene el código de una sola letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de IUPAC- IUBMB descritos en Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) y en Biochemical J. 219 (núm. 2j:345-373 (1984) que se incorporan en la presente como referencia. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen las reglas que se exponen en 37 C.F.R. §1.822.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción de cada referencia indicada en la presente se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
Como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen la referencia del plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una pluralidad de tales plantas, la referencia a "una célula" incluye una o más células y los equivalentes de éstas que conoce un experimentado en la técnica, etc.
Como se usan en la presente: La proteína tirosina fosfatasa ("PTP" o "PTPase", por sus siglas en inglés) pertenece a un grupo de enzimas que eliminan los grupos fosfato de los residuos de tirosina fosforilados en las proteínas. Las proteínas fosfatasas de las plantas, que incluyen las proteína tirosina fosfatasas, se revisaron por Luán (2003 Annual Rev. Plant Biol . 54:63-92).
"Arabidopsis" y "Arabidopsis thalianá" se usan intercambiablemente en la presente, a menos que e indique de otra forma.
Una "etiqueta de secuencia expresada" ("EST", por sus siglas en inglés) es una secuencia de ADN derivada de una genoteca de ADNc y, por lo tanto, es una secuencia que ha sido transcrita. Una EST se obtiene, típicamente, mediante un paso de secuenciamiento único de un inserto de ADNc. La secuencia de todo el inserto de ADNc se denomina "secuencia de inserción completa" ("FIS", por sus siglas en inglés) . Una secuencia de "cóntigos" es una secuencia integrada de dos o más secuencias que se pueden seleccionar de, pero no se limitan a, el grupo que consiste de una EST, una FIS y una secuencia de PCR. Una secuencia que codifica una proteína entera o funcional se denomina "secuencia completa de genes" ("CGS", por sus siglas en inglés) y puede derivarse de una FIS o un contigo.
"Las características agronómicas" es un parámetro medible que incluye, pero no se limita a, verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido total de aminoácidos libres en la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de la plántula y emergencia de -la plántula al impacto por temperaturas bajas.
"Transgénico" se refiere a cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de la planta o planta cuyo genoma se ha alterado mediante la presencia de un ácido nucleico heterólogo, tal como un constructo de ADN recombinante , incluso los eventos transgénicos iniciales así como los creados mediante cruces sexuales o propagación asexual a partir del evento transgénico inicial. Como se usa en la presente, el término "transgénico" no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo de vegetales o por eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante , transformación bacterial no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.
El término "genoma", como se aplica a las células vegetales, abarca no sólo el ADN cromosómico que se encuentra dentro del núcleo, sino también el ADN del orgánulo que se encuentra en los componentes subcelulares (por ejemplo, mitocondrial , plástido) de la célula.
"Planta" incluye lo referente a plantas completas, órganos de plantas, tejidos de plantas, semillas, células vegetales y progenie de éstas. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas , tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas .
"Progenie" comprende cualquier generación subsiguiente de una planta.
"Planta transgénica" incluye lo referente a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólógo. Por ejemplo, el polinucleótido heterólógo está integrado de manera estable dentro del genoma de manera tal que el polinucleótido se transmita a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterologo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un constructo de ADN recombinante .
"Heteróloga" , con respecto a una secuencia, se refiere a una secuencia que se origina de una especie foránea o de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma natural en composición y/o locus genómico por intervención humana intencional.
Los términos "polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia nucleótida" o "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que, opcionalmente, contiene bases nucleótidas sintéticas, no naturales o alteradas. Se hace referencia a los nucleótidos (que, usualmente, se encuentran en su forma 5 ' -monofosfato) mediante su designación con una sola letra, de la siguiente manera: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para el ARN o ADN, respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A o G) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A, C o T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido.
Los términos "polipéptido", "péptido", "secuencia de aminoácidos" y "proteína" se usan indistintamente en la presente y se refieren a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos es o son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido", "péptido", "secuencia de aminoácidos" y "proteína" también son inclusivos de modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, unión lipídica, sulfación, gamacarboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación del ADP.
"ARN mensajero (AR m)" se refiere al ARN sin intrones y se puede traducir en proteína por medio de la célula.
"ADNc" se refiere a un ADN complementario a y sintetizado a partir de una plantilla de ARNm con el uso de la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o se puede convertir a la forma bicatenaria con el uso del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I.
Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado postransicionalmente ; es decir, de donde se eliminó cualquier pre o propéptido presente en el producto primario de traducción.
Proteína "precursora" se refiere al producto primario de traducción del ARNm; es decir, que aún tienen pre y propéptidos presentes. Los pre y propéptidos pueden ser, pero no se limitan a, señales intracelulares de localización.
"Aislados" se refiere a materiales tales como moléculas de ácidos nucleicos y/o proteínas sustancialmente libres o eliminados de algún modo de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con los materiales en un ambiente de origen natural. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar a partir de una célula huésped donde se originan naturalmente. Se puede usar métodos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos para los expertos para obtener polinucleótidos aislados. El término también abarca polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.
"Recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de una secuencia separados de alguna manera, por ejemplo, por síntesis química o manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. "Recombinante" también incluye lo referente a una célula o vector que ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una célula derivada de una célula ya modificada, pero no abarca la alteración de la célula o vector mediante eventos de origen natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural) tales como los ocurridos sin intervención humana intencional.
"Constructo de ADN recombinante" se refiere a una combinación de fragmentos de ácidos nucleicos que, normalmente, no se encuentran juntos en la naturaleza. Por lo tanto, un constructo de ADN recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a como se encuentran en la naturaleza.
Los términos "clon de entrada" y "vector de entrada" se usan indistintamente en la presente.
"Secuencias reguladoras" se refiere a las secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro o corriente abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación . Los términos "secuencia reguladora" y "elemento regulador" se usan indistintamente en la presente.
"Promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico con la capacidad de controlar la transcripción de otro fragmento de ácido nucleico.
"Promotor funcional en una planta" es un promotor capaz de controlar la transcripción en las células vegetales, se originen o no, de una célula vegetal.
Los términos "promotor específico para el tejido" y "promotor preferido del tejido" se usan indistintamente y se refieren a un promotor que se expresa predominantemente, pero no necesariamente exclusivamente, en un tejido u órgano, pero que también se puede expresar en una célula específica.
Promotor regulado por el desarrollo se refiere a un promotor cuya actividad está determinada por los eventos del desarrollo.
"Operacionalmente unido" se refiere a la asociación de fragmentos de ácidos nucleicos en un solo fragmento de modo que la función de uno es regulada por la función del otro. Por ejemplo, un promotor está operacionalmente unido con un fragmento de ácido nucleico cuando puede regular la transcripción dé ese fragmento de ácido nucleico.
La "expresión" se refiere a la producción de un producto funcional. Por ejemplo, la expresión de un fragmento de ácido nucleico se puede referir a la transcripción del fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, la transcripción resultante en ARNm o ARN funcional) y/o la traducción de ARNm en una proteína precursora o madura.
"Fenotipo" se refiere a las características perceptibles de una célula u organismo.
"Introducido", en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) en una célula, significa "transíección", "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica, en donde el fragmento de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plástido o mitocondrial) , convertido en un replicón autónomo o expresado transitoriamente (por ejemplo, ARNm transíectado) .
Una "célula transformada" es cualquier célula en la cual se ha introducido un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) .
"Transformación", como se usa en la presente, se refiere tanto a la transformación estable como a la transitoria.
"Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un genoma de un organismo hospedero que produce una herencia genéticamente estable. Una vez transformado de manera estable, el fragmento de ácido nucleico se integra establemente en el genoma del organismo hospedero y cualquier generación posterior.
"Transformación transitoria" se refiere a la introducción de un fragmento de ácido nucleico. en el núcleo, u orgánulo que contiene ADN, de un organismo hospedero que resulta en una expresión genética sin herencia genéticamente estable.
El "alelo" es una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus determinado en un cromosoma. Cuando los alelos presentes en un locus dado en un par de cromosomas homólogos en una planta diploide son iguales, esa planta es homocigota para ese locus. Si los alelos presentes en un locus dado en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide difieren, esa planta es heterocigota para ese locus. Si un transgen está presente en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide, esa planta es hemicigota para ese locus.
Un "péptido de tránsito al cloroplasto" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al cloroplasto u otros tipos de plástidos presentes en la célula en la cual se elabora la proteína. "Secuencia de tránsito al cloroplasto" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol . 42:21-53) . Si la proteína se dirigirá a una vacuola, también se puede añadir una señal de dirección vacuolar (más arriba) , y si se dirigirá al retículo endoplásmico, se puede añadir una señal de retención del retículo endoplásmico (más arriba) . Si la proteína se dirigirá al núcleo, cualquier péptido señal presente se debe eliminar e incluir en su lugar una señal de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys . 100 : 1627 -1632) . Un "péptido señal mitocondrial" es una secuencia de aminoácidos que dirige una proteína precursora en la mitocondria (Zhang y Glaser (2002) Trends Plant Sci 7:14-21).
Las alineaciones de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad se pueden determinar mediante varios métodos de comparación diseñados para detectar 1 secuencias homologas que incluyen, pero no se limitan a, el programa Megalign® del paquete integrado para bioinformática LASERGENE® (ADNSTAR® Inc., Madison, WI). A menos que se indique de otra manera, se realizaron múltiples alineamientos de las secuencias proporcionadas en la presente con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros predeterminados (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10 ) . Los parámetros predeterminados para las alineaciones en pares y para el cálculo ~ del porcentaje de identidad de secuencias de proteínas con el método .Clustal V son KTUPLE=1, GAP PENALTY=3 , IND0W=5 y DIAGONALS SAVED=5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WIND0 =4 y DIAGONALS SAVED= . Después del alineamiento de las secuencias con el programa Clustal V es posible obtener valores de "porcentaje de identidad" y "divergencia" al observar la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa; A menos que se indique de otra manera, los porcentajes de identidad y divergencias proporcionados y reivindicados en la presente se calcularon de esta manera.
Las técnicas estándar de ADN recombinante y clonación molecular usadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen más detalladamente en Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Clonación molecular: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook") .
Ahora, en cuanto a las modalidades: Las modalidades incluyen polinucleótidos aislados y polipéptidos , constructo de ADN recombinantes útiles para conferir tolerancia a la sequía, composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de ADN recombinante, y métodos que usan estos constructos de ADN recombinante .
Polinucleótidos y polipéptidos aislados: La presente invención incluye los siguientes polinucleótidos y polipéptidos aislados: Un polinucleótido aislado que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de al menos 50 o, o "o / 51 ° í 52 % 53 % , 54 %, 55 % , 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 % 63 % , 64 Q, %, 65 o , 66 %, 67 %, 68 o. 69 %, 70 %, 71 %, 72 % 73 Q, , 74 %, 75 % , 76 %, 77 %, 78 0, o / 79 %, 80 %, 81 %, 82 % 83 % , 84 %, 85 % , 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 Q, "5 93 o o 94 o 95 o g, "5 , 96 o / 97 o o / 98 %, 99 % ó 100 % d identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident:17, 21, 25, 34, 36, 37, 40, 41, 43 ó 44; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) , en donde el complemento completo y la secuencia de ácido nucleico de (i) consiste del mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios. Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante (incluso las constructos de ADN supresor) . de la presente invención. El polipéptido es, preferentemente, una proteína tirosina fosfatasa.
Un polipéptido aislado con una secuencia de aminoácidos de' por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:17, 21, 25, 34, 36, 37, 40, 41, 43 ó 44. El polipéptido es, preferentemente, una proteína tirosina fosfatasa.
Un polinucleótido aislado que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 % 54 %, 55 %, 56 %, 57 % , 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 64 %, 65 %, 66 %, 67 % , 68 %, 69 %, 70 %, 71 ° / 72 %, 73 74 %, 75 %, 76 %, 77 % , 78 %, 79 %, 80 %, 81 82 %, 83 84 %, 85 %, 86 %, 87 % , 88 89 %, 90 %, 91 92 %, 93 % 94 %, 95 %, 96 %, 97 , 98 %, 99 %, ó 100 de identidad d secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:16, 20, 24, 39 ó 42; o (ii) a un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) . Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante (incluso las constructos de ADN supresor) de la presente invención. El polinucleótidoaislado preferentemente codifica una proteína tirosina fosfatasa.
Constructos de ADN recombinante y Constructos de ADN Supresores : En un aspecto, la presente invención incluye constructos de ADN recombinante (incluso constructos de ADN supresor) .
En una modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 54 , 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 84 %, 85 %, 86 % , 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 % , 99 %, Ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident.:17, 21, 25, 34, 36, 37, 40, 41, 43 ó 44; o(ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) .
En otra modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta), en donde el polinucleótido comprende (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 51 , 52 53 54 %, 55 %, 56 , 57 %, 58 %, 59 60 56 , 62 63 64 %, 65 %, 66 , 67 68 %, 69 %, 70 71 , 72 73 74 %, 75 %, 76 , 77 %, 78 %, 79 80 81 , 82 83 84 %, 85 %, 86 , 87 88 %, 89 %, 90 9 . , 92 93 94 %, 95 %, 96 % 97 ¾ , 98 % , 99 %, ó 100 de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:16, 20, 24, 39 ó 42; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) .
En otra modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleotido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleotido codifica una proteína tirosina fosfatasa. La proteína tirosina fosfatasa puede ser de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja y Glycine tomentella .
En otro aspecto, la presente invención incluye constructos de ADN supresor.
Un constructo de ADN supresor puede comprender por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a (a) la totalidad o parte de: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 o o , 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 o ¾ , 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 87 %, 88 %, 89 o %, 90 %, 91 '%, 92 %, 93 %, 94 %, 95 "ó , 96 %, 97 %, 98 %, 99 %/ Ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident.:17, 21, 25, 34, 36, 37, 40, 41, 43 ó 44, o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; o (b) una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés; la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 % 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 % , 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 % , 63 %, 64 %, 65 %, 66 % 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 % , 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 Q, 0 , 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % , 97 %, 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica una proteína tirosina fosfatasa; o (c) la totalidad o parte de: (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 % , 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 % 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 O, ¾ / 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 g, ¾ / 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 ¾, 80 %, 81 o. %, 82 %, 83 %, 84 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 g. %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 g, o 97 o , 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:16, 20, 24, 39 ó 42, o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (c) (i) . El constructo de ADN supresor puede comprender un constructo cosupresor, constructo antisentido, constructo supresor viral, constructo supresor de horquilla, constructo supresor del tallo-lazo, constructo productor de ARN bicatenario, constructo de iARN, O constructo de ARN pequeño (por ejemplo, un constructo de ARNip o un constructo de miARN) .
Se entiende, tal como apreciarán aquellos con experiencia en la técnica, que la invención abarca otras secuencias además de las secuencias ilustrativas específicas. En la técnica, se conocen bien las alteraciones de un fragmento de ácido nucleico que resultan en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado pero que no afectan las propiedades funcionales del . polipéptido codificado. Por ejemplo, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como la glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como la valina, la leucina o la isoleucina. De modo similar, también se puede esperar cambios que resultan en la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico para ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina,' para producir un producto funcionalmente equivalente. Además, no se espera cambios de nucleótidos que resultan en la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de polipéptido para alterar la actividad del polipéptido. Cada una de las modificaciones propuestas permanece dentro de la rutina de la técnica, como lo hace la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados.
"Constructo de ADN supresor" es un constructo de ADN recombinante que, al transformarse o integrarse de manera estable en el genoma de la planta, resulta en el "silenciamiento" de un gen objetivo en la planta. El gen objetivo puede ser endógeno o transgénico a la planta. "Silenciamiento", como se usa en la presente con respecto al gen objetivo se refiere, generalmente, a la supresión de los niveles del ARNm o proteína/enzima expresada por el gen objetivo y/o el nivel de la actividad enzimática o de la funcionalidad proteica. Los términos "supresión", "suprimir" y "silenciar", usados intercambiablemente en la presente, incluyen bajar, reducir, declinar, disminuir, inhibir, eliminar o impedir. "El "silenciamiento" o "silenciamiento génico" no especifica el mecanismo y es inclusivo, y no se limita a, antisentido, cosupresión, supresión viral, supresión de horquillas, supresión de tallo- lazo, aproximaciones basadas en ARNi y aproximaciones basadas en ARN pequeños .
Un constructo de ADN supresor puede comprender una región derivada de un gen objetivo de interés y puede comprender total o parcialmente la secuencia de ácido nucleico de la cadena en sentido (o cadena antisentido) del gen objetivo de interés. Según la aproximación que se utilice, la región puede ser 100 % idéntica o menor que 100 % idéntica (por ejemplo por lo menos 50 %, 51 o "O / 52 "S / 53 %, 54 %, 55 % , 56 O , 57 % 58 % , 59 % , 60 % , 56 q. o / 62 %, 63 %, 64 %, 65 % , 66 % , 67 % 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 % , 76 % , 77 % 78 % , 79 %, 80 %, 81 %, 82 0, o / 83 %, 84 %, 85 % , 86 % , 87 % 88 % , 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % , 96 % , 97 % 98 %, ó 99 % idéntica) a la totalidad o parte del secuenciador (o cadena no codificante) del gen de interés.
Los constructos de ADN supresor se conocen bien en la técnica, se construyen fácilmente una vez se seleccione el gen objetivo de interés e incluyen, pero no se limitan a, constructos cosupresores , constructos antisentido, constructos de supresión viral, constructos supresores de horquilla, constructos supresores de tallo-lazo, constructos productores de ARN bicatenario y, más generalmente, constructos de ARNi (ARN de interferencia) y constructos de ARN pequeños tales como constructos de ARNip (ARN de interferencia corta) y constructos de miARN (microARN) .
"Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcritos de ARN antisentido con la capacidad de suprimir la expresión de la proteína objetivo o el producto génico. "ARN antisentido" se refiere a un transcrito de ARN complementario a todo o a una parte de un transcrito primario o ARNm objetivo y que bloquea la expresión de un fragmento aislado de ácido nucleico objetivo (patente de los Estados Unidos núm. 5,107,065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier porción del transcrito genético específico, es decir, en la secuencia 5' no codificante, secuencia 3' no codificante, intrones o secuencia codificante.
"Cosupresión" se refiere a la producción de transcritos de ARN sentido con la capacidad de suprimir la expresión de la proteína objetivo o el producto génico. El ARN "sentido" se refiere al transcripto de ARN que incluye el ARNm y puede ser traducido en la proteína dentro de una célula o in vitro. Anteriormente, se diseñaron constructos cosupresores en plantas que se enfocaban en la sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico con homología a un ARNm nativo, en la orientación de sentido, que resulta en la reducción de todo el ARN que tiene homología con la secuencia sobreexpresada (ver Vaucheret et al., Plant J. 16:651-659 (1998); y Gura, Nature 404:804-808 (2000)).
Otra variación describe el uso de secuencias , virales en plantas para dirigir la supresión del ARNm proximal que codifica secuencias (publicación PCT núm. WO 98/36083 publicada el 20 de agosto de 1998).
El ARN de interferencia se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en los animales, mediado por ARN cortos de interferencia (AR ip) (Fire et al., Nature 391:806 1998). El proceso correspondiente en plantas se denomina, comúnmente, silenciamiento génico postranscripcional (SGPT) o silenciamiento de ARN, así como represión en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado en términos evolutivos, que se usa para evitar la expresión de genes extraños; con frecuencia lo comparten diversas floras y filos (Fire et al., Trends Genet . 15:358 1999).
Los ARN pequeños juegan un papel importante en el control de la expresión genética. La regulación de varios procesos del desarrollo, que incluyen la floración, está controlada por ARN pequeños. Ahora es posible crear cambios en la expresión genética de los genes vegetales mediante el uso de constructos transgénicos que producen ARN pequeños en la planta.
Al parecer, los ARN pequeños funcionan por apareamiento de bases con ARN complementario o con secuencias objetivo de ADN. Al unirse con ARN, los ARN pequeños accionan ya sea el fraccionamiento del ARN o la inhibición de traducción de la secuencia objetivo. Al unirse con secuencias objetivo de ADN, se piensa que los ARN pequeños pueden mediar la metilación de ADN de la secuencia objetivo. La consecuencia de estos eventos, independientemente del mecanismo específico, es que la expresión genética se inhibe.
Los microARN (miARN) son ARN no codificantes que tienen de aproximadamente 19 a aproximadamente 24 nucleótidos (nt) de longitud, que se identificaron tanto en animales como en plantas (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol . 12:735-739 (2002); Lau et al., Science 294:858-862 (2001); Lee y Ambros, Science 294:862-864 (2001); Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 (2002); Mourelatos et al., Genes. Dev. 16:720-728 (2002); Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 (2002); Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 (2002)). Éstos se procesan a partir de transcritos precursores más largos que en tamaño se encuentran en el intervalo desde aproximadamente 70 hasta 200 nt y estos transcritos precursores tienen la capacidad de formar estructuras de horquilla estables.
Los MicroAR (miAR ) parecen regular genes objetivo por la unión a las secuencias complementarias ubicadas en los transcritos producidos por estos genes. Igualmente, parece que los miARN pueden entrar en al menos dos rutas de regulación del gen objetivo: (1) inhibición translacional ; y (2) fraccionamiento de ARN. Los microARN que entran en la vía de fraccionamiento del ARN son análogos a los ARN de interferencia corta (ARNip) de 21-25 nt generados durante la interferencia del ARN (ARNi) en animales y el silenciamiento génico postranscripcional (SGPT) en plantas, y probablemente se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés) que es similar o idéntico al observado para el ARNi .
Secuencias reguladoras: Un constructo de ADN recombinante (incluso un constructo de ADN supresor) de la presente invención puede comprender por lo menos una secuencia reguladora.
Una secuencia reguladora puede ser un promotor.
Se puede usar una gran variedad de promotores en los constructos de ADN recombinante de la presente invención. Los promotores se pueden seleccionar en base al resultado deseado y pueden incluir los constitutivos, específicos del tejido, inducibles, u otros promotores para la expresión en el organismo hospedero.
Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos de células, la mayoría de veces, se denominan comúnmente "promotores constitutivos".
La expresión constitutiva de alto nivel del gen candidato bajo control del promotor 35S o UBI puede tener efectos pleiotrópicos , aunque la eficacia del gen candidato se puede determinar cuando lo acciona un promotor constitutivo. El uso de promotores específicos de tejido y/o específicos de impacto pueden eliminar efectos indeseables pero mantener la capacidad de mejorar la tolerancia a la sequía. Este efecto se ha observado en Arabidopsis (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol . 17:287-91).
Los promotores constitutivos adecuados para su uso en una célula huésped vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor del núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. WO 99/43838 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,072,050; el promotor del núcleo CaMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)); actina del arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol . 12:619-632 (1989) y Christensen et al., Plant Mol .. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al., Theor. Appl . Genet . 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et ¦ al . , EMBÓ J. 3:2723-2730 (1984)); promotor ALS (patente de los Estados Unidos núm. 5,659,026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los mencionados en las patentes de los Estados Unidos núms . 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5 , 608 , 142 y 6 , 177 , 611.
Al seleccionar un promotor para su uso en los métodos de la invención, puede que se prefiera un promotor específico para el tejido o regulado por el desarrollo.
Un promotor preferido específico de tejido o regulado por el desarrollo es una secuencia de ADN que regula la expresión de una secuencia de ADN selectivamente en las células/tejidos de una planta, crítico para el desarrollo de la panoja, las semillas o ambos y limita la expresión de la secuencia de ADN al período de desarrollo de la panoja o a la maduración de las semillas en la planta. En los métodos de la presente invención se puede usar cualquier promotor identificable que cause la expresión temporal y espacial deseada.
Los promotores específicos de las semillas o embriones y que pueden ser útiles en la invención incluyen el inhibidor de trisina Kunitz del frijol de soya (Kti3, Jofuku y Goldberg, Plant Cell 1:1079-1093 (1989)), patatina (tubérculos de papa) (Rocha-Sosa, M . , et al. (1989) EMBO J. 8:23-29), convicilina, vicilina y legumina (cotiledones de chícharos) (Rerie, W.G., et al. (1991) Mol. Gen. Genet . 259:149-157; Newbigin, E.J., et al. (1990) Planta 180:461-470; Higgins, T.J.V., et al. (1988) Plant. Mol. Biol . 11:683-695), zeína (endosperma de maíz) (Schemthaner, J.P., et al. (1988) EMBO J. 7:1249-1255), . faseolina (cotiledones del frijol) (Segupta-Gopalan, C, et al . (1985) Proc . Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 82:3320-3324), fitohemaglutinina (cotiledones del frijol) (Voelker, T. et' al. (1987) EMBO J. 6:3571-3577), B-conglicinina y glicinina (cotiledón de frijol de soya) (Chen, Z-L, et al. (1988) EMBO J. 7:297- 302), glutelina (endosperma ' de arroz) , hordeína (endosperma de cebada) (Marris, C, et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10:359-366), glutenina y gliadina (endosperma de trigo) (Colot, V. , et al. (1987) EMBO J. 6:3559-3564) y esporamina (raíz tuberosa del camote) (Hattori, T., et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:595-604). Los promotores de genes específicos de semillas unidos operacionalmente a regiones codificantes heterólogas en constructos de genes quiméricos mantienen su estructura de expresión temporal y espacial en las plantas transgénicas . Tales ejemplos incluyen al promotor genético de proteína de almacenamiento de semilla 2S de Arabidopsis thaliana para expresar péptidos de encefalina en semillas de Arabidopsis y Brassica napus (Vanderkerckhove et al . , Bio/Technology 7:L929-932 (1989)), promotores de lecitina de frijol y beta-faseolina de frijol para expresar luciferasa (Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57 (1989)) y promotores de glutenina de trigo para expresar cloranfenicol acetiltransferasa (Colot et al., EMBO J 6:3559- 3564 (1987)).
Los promotores inducibles expresan selectivamente una secuencia de ADN operacionalmente unida en respuesta de un estímulo endógeno o exógeno, por ejemplo, por compuestos químicos (inductores químicos) o en respuesta de señales ambientales, hormonales, químicas y/o del desarrollo. Los promotores inducibles o regulados incluyen, por ejemplo, los promotores regulados por luz, calor, impacto, inundación o sequía, fitohormonas , lesiones, o sustancias químicas, tales como etanol, jasmonato, ácido salicílico o sustancias protectoras .
Los promotores para usar en la presente invención incluyen los siguientes: 1) el promotor inducible por impacto RD29A (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:287-91); 2) el promotor de cebada, B22E; la expresión del B22E es específica para el pedículo de granos de maíz en desarrollo ("Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers". Klemsdal, S.S. et al., Mol. Gen. Genet . 228 (1/2) : 9-16 (1991)); y 3) promotor de maíz, Zag2 ("Identification and molecular characterization of ZAG1, the, maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS", Schmidt, R.J. et al., Plant Cell 5(7):729-737 (1993) Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS- like ADS-box genes from maize", Theissen et al. Gene 156(2): 155-166 (1995); número de registro del GenBank del CNIB X80206) ) . Los transcritos Zag2 se pueden detectar 5 días antes de la polinización hasta 7 a 8 días después de la polinización (DDP) y dirigen la expresión en el carpelo de inflorescencias hembra en desarrollo y Ciml que es específico para el núcleo de granos de maíz en desarrollo. El transcrito Ciml se detecta 4 a 5 días antes de la polinización hasta 6 a 8 DDP. Otros promotores útiles incluyen cualquier promotor que pueda derivarse de un gen cuya expresión esté asociada maternalmente con cogollos hembra en desarrollo.
Los promotores adicionales para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en plantas son los promotores específicos de tallo. Tales promotores específicos de tallo incluyen el promotor S2A de alfalfa (número de registro del GenBank EF030816; Abrahams et al., Plant Mol. Biol . 27:513-528 (1995)) y el promotor S2B (número de registro del GenBank EF030817) y similares, incorporados en la presente descripción como referencia.
Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores distintos que se encuentran . en la naturaleza, o aun, pueden comprender segmentos de ADN sintético.
Los promotores para usar en la presente invención pueden incluir: RIP2, mLIP15, ZmCORl, Rabl7, CaMV 35S, RD29A, B22E, Zag2, SAM sintetasa, ubiquitina, CaMV 19S, nos, Adh, sacarosa sintasa, R-alelo, los promotores preferidos de tejido vascular S2A (número de registro del Genbank EF030816) y S2B (número de registro del Genbank EF030817) , y el promotor constitutivo G0S2 de Zea mays . Otros promotores incluyen promotores preferidos de la raíz, tales como el promotor NAS2 de maíz, el promotor Cyclo de maíz (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0156439, publicada el 13 de julio de 2006) , el promotor R00TMET2 de maíz (publicación de patente núm. WO05063998, publicada el 14 de julio de 2005) , el promotor CR1BIO (publicación de patente núm. WO06055487, publicada el 26 de mayo de 2006), el CR AQ81 (publicación de patente núm WO05035770, publicada el 21 de abril de, 2005) y el promotor ZRP2.47 de maíz (número de registro del CNIB: U38790; GI núm. 1063664), Los constructos de ADN recombinante de la presente invención también pueden incluir otras secuencias reguladoras que incluyen, pero no se limitan a, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. En otra modalidad de la presente invención, un constructo de ADN recombinante de la presente invención también comprende un potenciador o silenciador.
Se puede agregar una secuencia de intrones a la región 5' no traducida, la región de codificación de la proteína o la región 3' no traducida para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en los constructos de expresión, tanto de plantas como de animales, ha demostrado incrementar la expresión genética tanto en los niveles de ARNm como en los de proteína hasta 1000 veces. Buchman and Berg, Mol. Cell Biol . 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987).
Cualquier planta puede seleccionarse para la identificación de secuencias reguladoras y genes de la proteína tirosina fosfatasa para usarse en los constructos de ADN recombinante de la presente invención. Los ejemplos de plantas objetivo adecuadas para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, alfalfa, manzana, chabacano, Arajidppsis, alcachofa, rúgula, espárragos, aguacate, banana, cebada, frijoles, betabel, zarzamora, arándano vaccinio, brócoli, coles de bruselas, col, cañóla, cantalupo, zanahoria, mandioca, semilla de ricino, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, cítricos, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, arándano, pepino, abeto Douglas, berenjena, endibia, escarola, eucalipto, hinojo, higueras, ajo, calabaza, uva, toronja, melón de pulpa verde, jicama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, linaza, mango, melón, champiñones, nectarina, nuez, avena, palma aceitera, aceite de colza, quingombó, aceituna, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, chícharos, melocotón, cacahuate, pera, chile, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada roja, álamo, papa, calabaza, membrillo, pino de Monterrey, achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino palustre, frijol de soya, espinaca, calabacín, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, camote, árbol de ámbar, mandarina, té, tabaco, tomate, tritical, césped, nabo, una vid, sandía, trigo, ñames y calabacín.
Composiciones : Una composición de la presente invención es una planta que comprende en su genoma cualquiera de los constructos de ADN recombinante (que incluyen cualquiera de los constructos de ADN supresor) de la presente invención (tal como cualquiera de los constructos mencionados anteriormente) . Las composiciones también incluyen cualquier progenie de la planta y cualquier semilla obtenida a partir de la planta o su progenie, en donde la progenie o semilla comprende dentro de su genoma el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) . La progenie incluye generaciones posteriores obtenidas mediante la autopolinización o cruce de una planta. La progenie también incluye híbridas y endogámicas.
En cultivos propagados por semillas híbridas, las plantas transgénicas maduras pueden autopolinizarse para producir- una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semillas que contienen el recién introducido constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) . Estas semillas pueden crecer para producir plantas que pudieran mostrar una característica agronómica alterada (por ejemplo, una característica agronómica incrementada opcionalmente bajo condiciones de limitación de agua) , o usadas en un programa de reproducción para producir semillas híbridas, que pueden crecer para producir plantas que pudieran mostrar tal característica agronómica alterada. Las semillas pueden ser semillas de maíz.
La planta puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz o soya, tal como una planta híbrida de maíz o una planta endogámica de maíz. La planta también puede ser girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada o mijo.
El constructo de ADN recombinante puede estar integrado establemente en el genoma de la planta.
Las modalidades particularmente incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: 1. Un planta (por ejemplo, una planta de maíz o de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por Lo menos 50 %, 5? %, 52 %, 53 %, 54 %/ 55 %, 56 %, 57 %, 58 59 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 ¾ 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 , 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 80 81 %, 82 % , 83 %, 84 %, 85 %., ..86 %, 87 %, 88 %, 89 90 % , 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 97 % 98 % 99 % , ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y en donde la planta muestra tolerancia a la sequía aumentada cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. La planta puede mostrar, además, una alteración de por lo menos una característica cuando se compara con la planta de control .
Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que . comprende un polinucleótido unido operacionalmente a - por lo menos una secuencia reguladora, en . donde el polinucleótido codifica una proteína tirosina fosfatasa, y en donde la planta muestra tolerancia a la sequía aumentada cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. La planta puede mostrar, además, una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara con la planta de control .
Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica una proteína tirosina fosfatasa, y en donde la planta muestra una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, con la planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %-, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 58 %, 59 %, 60 56 %, 62 %, 63 %, " ':6.4 %, 65 66 %, 67 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 76 %». 77 %, 78 o / 79 80 · %, 81 %, 82 83 %, 84 85 %, 86 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 %, 97 98 99 %, Ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y en donde la planta muestra una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elemento regulador unido operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés , la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 % 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 % 72 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 o / 82 %, 83 , 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 o o, "o / 95 %, 96 % 97 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia , en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de donde se deriva la región y en la que el gen objetivo de interés codifica una proteína tirosina fosfatasa, y en donde la planta muestra una alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elemento regulador unido operacionalmente a la totalidad o parte de (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 57 % , 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 "o , 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 "o , 73 % , 74 %, 75 %, 76 "S 77 %, 78 %, 7? %, 80 %, 81 % , 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, o (b) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (a) , y en donde la planta muestra una alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Cualquier progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6, cualquier semilla de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6, cualquier semilla de la progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades preferidas 1-6, y las células a partir de cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6 y la progenie de éstos .
En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la proteína tirosina fosfatasa puede ser de Arabidopsis thaliana , Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja o Glycine tomentella.
En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) ·.. puede comprender por lo menos un promotor funcional en una planta como una secuencia reguladora.
En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la alteración de por lo menos una característica agronómica es un incremento o una disminución.
En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la por lo menos la única característica agronómica puede seleccionarse del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en el tejido vegetativo, contenido total de aminoácidos libres en la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido total de_ proteínas en la planta, -contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de 'proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de la plántula y emergencia de la plántula bajo impacto a temperaturas bajas. Por ejemplo, la alteración de por lo menos una característica agronómica puede ser un incremento en la producción, verdor o biomasa.
En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la planta puede mostrar la alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante (o el constructo de ADN supresor) .
"Sequía" se refiere a una disminución en la disponibilidad de agua para una planta que, especialmente cuando se prolonga, puede provocar daño a la planta o impide su crecimiento exitoso (por ejemplo, limita el crecimiento de la planta o la producción de las semillas) .
"Tolerancia a la sequía" es una característica de una planta para sobrevivir bajo condiciones de sequía por períodos prolongados de tiempo sin que muestre deterioro físico o fisiológico sustancial.
La "tolerancia a la sequía aumentada" de una planta se mide con relación a una planta de control o de referencia, y es una característica de una planta para sobrevivir en condiciones de sequía por períodos prolongados de tiempo, sin que muestre el mismo grado de deterioro físico o fisiológico con relación a una planta de' control o de referencia que crece en condiciones de sequía similares. Típicamente, cuando una planta transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante o constructo de ADN supresor en su genoma muestra tolerancia á la sequía aumentada con relación a una planta de control o de referencia, la planta de control o de referencia no comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante o constructo de AD supresor.
Una persona con conocimiento ordinario en la técnica estás familia izado con los protocolos para simular las condiciones de sequía y para evaluar la tolerancia a la sequía de plantas que se someten a condiciones de sequía simuladas o naturales. Por ejemplo, se pueden simular condiciones de sequía al proporcionar a las plantas menos agua que la que requieren normalmente o no proporcionarles agua durante un período de tiempo, y se puede evaluar la tolerancia a la sequía .al buscar las diferencias en la condición física y/o fisiológica, que incluyen (pero no se limitan a) vigor, crecimiento, tamaño, o longitud de la raíz o, particularmente, en el color de la hoja o el tamaño del área de la hoja. Otras técnicas para evaluar la tolerancia a la sequía incluyen medir la fluorescencia de la clorofila, las tasas fotosintéticas y las tasas de intercambio de gas.
Un experimento de impacto por sequía puede involucrar un impacto crónico (es decir, secado lento) y/o puede involucrar dos -impacto agudos (es decir, eliminación abrupta de agua) con separación de uno o dos días de la recuperación. El impacto crónico puede durar 8 - 10 días. El impacto agudo puede durar 3 - 5 días. Las siguientes variables se pueden medir durante el impacto por sequía y los tratamientos con bastante agua de plantas transgénicas y plantas de control relevantes: La variable "% área cambio_inicio crónico - agudo2" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinado por la imagen del espectro visible remoto entre el primer día de impacto crónico y el día del segundo impacto agudo La variable "% área cambio_inicio crónico - final crónico" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinado por la imagen del espectro visible remoto entre el primer día de impacto crónico y el último día de impacto crónico La variable "% área cambio_inicio crónico - cosecha" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinado por la imagen del espectro visible remoto entre el primer día de impacto crónico y el día de la cosecha La variable "% área cambio_inicio crónico recuperación24h" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinado por la imagen del espectro visible remoto entre el primer día de impacto crónico y 24 h en la recuperación (24h después del impacto agudo 2) La variable "psii_agudol" es una medida de la eficiencia del Fotosistema II (PSII) al final del primer período de impacto agudo. Esta proporciona un cálculo de la eficiencia a la que se absorbe la luz por las antenas de PSII y está directamente relacionada a la asimilación del dióxido de carbono dentro de la hoja.
La variable "psii_agudo2" es una medida de la eficiencia del Fotosistema II (PSII) al final del segundo período de impacto agudo. Proporciona un estimado de la eficiencia a la que se absorbe la luz por las antenas de PSII y está directamente relacionada a la asimilación del dióxido de carbono dentro de la hoja.
La variable "fv/fm_agudol" es una medida del rendimiento cuántico óptimo (Fv/Fm) al final del primer impacto agudo -(diferencia de fluorescencia de la variable entre la fluorescencia máxima y mínima / fluorescencia máxima) La variable "fv/fm_agudo2" es" una medida del rendimiento cuántico óptimo (Fv/Fm) al final del segundo impacto agudo - (diferencia de fluoréscencia de la variable entre la fluorescencia máxima y mínima / fluorescencia máxima) La variable "enrollado de las hojas_cosecha" es una medida de la relación de la imagen superior a la imagen lateral el día de la cosecha.
La variable "enrollado de las hoj as_recuperación24h" es una medida de la relación de la imagen superior a la imagen lateral 24 horas en la recuperación.
La variable "Tasa de crecimiento específico (SGR, por sus siglas en inglés)" representa el cambio en el área de superficie total de la planta (según se midió por Lemna Tec r*t r*t Iristrument) durante un único día (Y(t) = Y0*e ) . Y(t) = Y0*e es equivalente al % cambio en ?/? t, en donde los términos individuales son como siguen: Y(t) = Área de superficie total en t; YO = Área de superficie total inicial (calculada) ; r = Tasa de crecimiento específico día 1> y t = Días después de la plantación ("DAP", por sus siglas en inglés) La variable "peso seco del brote" es una medida del peso del brote 96 horas después de haberse colocado en un horno a 104 °C La variable "peso fresco del brote" es una medida del peso del brote inmediatamente después de haberse cortado de la planta.
Los ejemplos a continuación, describen algunos protocolos y técnicas representativas para simular condiciones de sequía y/o evaluar la tolerancia a la sequía.
También se puede evaluar la tolerancia a la sequía por la capacidad de la planta a mantener un rendimiento suficiente (por lo menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ó 100 % de rendimiento) en la prueba de campo bajo condiciones de sequía simuladas o naturales (por ejemplo, al medir el rendimiento sustancialmente equivalente bajo condiciones de sequía en comparación con condiciones sin sequía, o al medir menores pérdidas de rendimiento bajo condiciones de sequía en comparación con una planta de control o de referencia) .
Una persona con conocimientos ordinarios en la técnica reconocería fácilmente una planta de control o de referencia adecuada para su uso al evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica en cualquier modalidad de la presente invención en donde se usa una planta de control (por ejemplo, las composiciones o métodos como se describen en la presente) . Por ejemplo, a manera de ilustraciones no limitantes: 1. La progenie de una planta transformada que es hemicigota con respecto a un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) , de tal forma que la progenie se segrega en plantas ya sea que comprendan o no el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la progenie que comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) se determinará, típicamente, en relación a la progenie - que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) (es decir, la progenie que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN. supresor) es la planta de control o de referencia) . 2. La introgresión de un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) en una línea endogámica, tal como maíz, o en una variedad, tal como frijol de soya: la línea introgresa se mide, típicamente, en relación a la línea endogámica progenitora o de variedad (es decir, la línea endogámica progenitora o de variedad es la planta de control o de referencia) .
Dos líneas híbridas, en donde la primera línea híbrida se produce a partir de dos líneas endogámicas progenitoras y la segunda línea-híbrida se produce a partir de las mismas dos líneas endogámicas progenitoras, excepto que una de las líneas endogámicas progenitoras contiene un constructo de ADN recombinante (o constructo .de ADN supresor) : la segunda línea híbrida se determinará, típicamente, en relación con la primera línea híbrida (es decir, la primera línea híbrida es la planta de control o de referencia) . Una planta que comprende un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la planta se puede evaluar o determinar en relación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) aunque tenga, por otro lado, antecedentes genéticos comparables con la planta (por ejemplo, que comparta por lo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia del material genético nuclear en comparación con la planta que comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) ) .
Existen varias técnicas de laboratorio disponibles para el análisis, comparación y caracterización de los antecedentes genéticos de la planta; Entre éstas están la electroforesis de isoenzimas, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD, por sus siglas en inglés) , reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar (AP-PCR, por *- sus siglas en inglés) , amplificación de la huella de ADN (DAF, por sus siglas en inglés) , regiones amplificadas caracterizadas por las secuencias (SCAR, por sus siglas en inglés) , polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP®, por sus siglas en inglés) y repeticiones de secuencias simples (SSR, por sus siglas en inglés) también denominadas microsatélites .
Además, un experto en la técnica reconocería fácilmente que una planta de control o de referencia adecuada que se usa al evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica no incluiría una planta que haya sido seleccionada anteriormente, por mutagénesis o transformación, para la característica agronómica o fenotipo deseado .
Métodos : Los métodos" incluyen, pero no se limitan a, los métodos para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, los métodos para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, los métodos para alterar una característica agronómica en una planta, los métodos para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta y los métodos para producir semillas. La planta puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz o soya. La planta también puede ser girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada o mijo. La semilla es tal vez una semilla de maíz o soya, por ejemplo, una semilla de maíz híbrida o semilla de maíz endogámica.
Los métodos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: Un método para transformar una célula que comprende transformar una célula con cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención. La célula transformada por este método también se -incluye. En modalidades particulares la célula es una célula . eucariota, por ejemplo, una levadura, célula vegetal o de insecto, o procariota, por ejemplo, una bacteria.
Un método para producir una planta transgénica que comprende transformar una célula -vegetal con cualquiera de los polinucleótidos aislados o constructo de ADN recombinantes de la presente invención y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada. La invención se dirige también a la planta transgénica que se produce por este método, y la semilla transgénica que se obtiene a partir de esta planta transgénica.
Un método para aislar un polipéptido "de la invención a -partir de una célula o medio de cultivo de la "célula, en donde la célula comprende un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido de la . invención unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, y en donde la célula huésped transformada crece bajo condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante.
Un método para alterar el nivel de expresión de un polipéptido de la invención en una célula huésped, el método comprende: (a) transformar una célula huésped con un constructo de ADN recombinante de la presente invención; y (b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones que son adecuados para la expresión del constructo de ADN recombinante, en donde la expresión del constructo de ADN recombinante resulta en la producción de niveles alterados del polipéptido de* la invención en la célula hospedera transformada.
Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor1 funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 % 52 %, 53 %, 54 %, 55 56 %, 57 58 %, 59 %, 60 %, 56 % 62 %, 63 %, 64 65 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 71 % 72 %, 73 %, 74 %, 75 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 % 82 %, 83 %, 84 , 85 %, 86 %, 87 , 88 %, 89 %, 90 %, 91 % 92 %, 93 94 %, 95 96 %, 97 ¾ , 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra tolerancia a la sequía aumentada en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método puede comprender, adicionalmente , (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma .el cónstructo de ADN recombinante y muestra tolerancia a la sequía aumentada en comparación con una planta de control que no comprende el cónstructo de ADN recombinante.
Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un cónstructo de ADN supresor que . comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 54 %, 55 %, 56 % , 57 %, 58 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 64 %, 65 %, 66 , 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 , 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 '%, 86 % , 87 %, 88 %, 89 ° ' . 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 97 % , 98 % %, Ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, o (ii) un complemento, completo de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i); y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el cónstructo de ADN supresor y muestra tolerancia a la sequía aumentada en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, adicionalmente, (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y muestra tolerancia a la seguía aumentada en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés, la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 %, 60 56 62 63 64 65 66 67 68 69 %, 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 %, 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 %, 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica una proteína tirosina fosfatasa; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y muestra tolerancia a la sequía aumentada en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, adicionalmente , (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y muestra tolerancia a la sequía aumentada en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para evaluar la tolerancia-a la sequía en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 %, 51 % , 52 %, 53 54 %, 55 %, 56 %, 57 , 58 %, 59 %, 60 *o / 56 % , 62 63 65 Q, %, %, 64 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 % , 72 "o , 73 %, 74 %, 75 Q, 76 %, 77 o, 78 %, 79 %, 80 %, 81 % , 82 Q, 83 %, 84 85 %, 86 %, 87 88 %, 89 %, 90 %, 91 ¾, *o , 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 %, 97 o , 98 , 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia , en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante-; y (c) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método puede comprender, adicionalmente , (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (e) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 q, o / 54 "0 / 55 %, -56 %, 57 g, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 g, "O , 65 Q°. / 66 %, 67 % 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 75 ¦o / 76 %, 77 % 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 "° , 84 0 "S 85 o ¾ / 86 %, 87 % 88 "o , 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 g, ° ( 95 q, 96 %, 97 % 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) evaluar la planta transgénica para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo ' de' ADN supresor. El método puede comprender, adicionalm'ente, (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta •de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés, la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, .60 %, 56 %, 62 ° f 63 *S / 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 .78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 * 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 97 % 98 % , 99 % , ó 100 % "de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica una proteína tirosina fosfatasa; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) evaluar la planta transgénica para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, adicionalmente, (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la seguía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 % , 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 % , 67 g, ¾ / 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %> 76 % , 77 0, ¾ 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 g. 83 o. 84 %, 85 %, 86 % , - 87 %, 88 %, 89 o, 0 / 90 Q, "O / 91 %, 92 %, 93 o 94.%, 95 %, 96 % -97 % , 98 % , 99 %, Ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con lasec . con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de the célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia dé aminoácidos , 52 53 %, 54 ¾ / 55 %, 56 % 57 58 %, 59 ° / 60 %, 56 %, 62 63 64 %, 65 %, 66 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 ° / 73 %, 74 75 %, 76 % 77 %, 78 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 ¾ 87 88 89 90 %, 91 %, 92 93 94 %, 95 %, 96 % 97 %, 98 %, 99 %, ó 100 % ( al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con sec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada a partir de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, el método comprende (a) . introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN. supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por. ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de un gen objetivo de interés, la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, -51 %, 52 %, 53 %, 54 0. o / 55 %, 56 0, ¾ % ' 57. , .5-8 0, , 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 O, o / 65 %, 66 O. "6 , 67 % , 68 % , 69 %, 70 Q, %, 71 ° / 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 ¾ , 77 % , 78 o, *S , 79 %, 80 %;" '81 %, 82 %, 83 %, 84 o. 85 %, 86 g, ¾ , 87 % , 88 % , 89 %, 90 %/ 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 % 97 % 98 % 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica una proteína tirosina fosfatasa; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de "ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método de determinación de una alteración de una característica agronómica en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,., 93 %, 94 %, 95 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con lasec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43,..44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica' a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) determinar si la planta transgénica muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método puede comprender, adicionalmente, (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (e) determinar si la planta progenie muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 55 %, 56 %, 57 %, 58 59 60 56 % , 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 68 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %", 74 %, 75 76 77 %, 78 %, 79 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 85 86 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 97 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) determinar si la planta transgénica muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, adicionalmente , (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) determinar si la planta progenie muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o cadena no codificante de un gen objetivo de interés, la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 % 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 0, ¾ / 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 "o f 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 o o / 98 o * , 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica una proteína tirosina fosfatasa; (b) regenerar una planta transgénica a partir, de la célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) determinar si la planta transgénica muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el -'-constructo de ADN supresor. El método puede comprender, adicionalmente , (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) determinar si la planta progenie muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 o, *6 , 54 "o / 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 o, 01 60 %, 56 % , 62 % , 63 o. 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 % , 72 % , 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 o. 80 %, 81 % , 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 O. 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 o, 94 o ¦ó / 95 g, "O / 96" %7 97 %, 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con lasec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) determinar si la planta progenie muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta, el método comprende (a) introducir en 'una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 %, 51 ¾, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 70 %, 71 %, 72 %, 73 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 80 %, 81 %, 82 %, 83 84 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 90 %, 91 %, 92 %, 93 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ó 100 % de identidad secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23>-25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d) determinar si la planta progenie muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.
Un método de determinación de una alteración de una característica agronómica en una planta, el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unido operacionalmente a una región derivada de la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés, la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 o. %, 53 ? / 54 % 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 56 %, 62 %, 63 O, *0 / 64 O, *o 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 o. o o o / 71 %, 72 o / 73 74 g, ¾ 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 % 85 %, 86 % , 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 o. 95 %, 96 %, 97 % , 98 % , 99 %, ó 100 % de identidad d secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la totalidad o parte de un secuenciador o de una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica una proteína tirosina fosfatasa; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d) determinar si la planta progenie muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. un método para producir semillas (por ejemplo, semilla que se puede vender como una oferta de productos tolerantes a la sequía) que comprende cualquiera de los métodos anteriores, y que también comprende obtener semillas de la planta progenie, en donde las semillas comprenden en su genoma el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) .
En cualquiera de los métodos anteriores o cualquiera de las modalidades de los métodos de la presente invención, en la etapa de introducción la célula vegetal regenerable puede comprende una célula callosa, una célula callosa embriogénica , una célula gamética, una célula meristemática, o una célula de un embrión inmaduro. Las células vegetales regenerables se pueden derivar de una planta de maíz endogámica.
En cualquiera de los métodos anteriores o cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la etapa de regeneración puede comprender lo siguiente: (i) cultivar las células vegetales transformadas en un medio que comprende una hormona promotora embriogénica hasta observar estructura callosa; (ii) transferir las células vegetales transformadas de la etapa (i) a un primer medio que incluye una hormona promotora de estructura tisular; y (iii) subcultivar las células vegetales transformadas después de la etapa (ii) en un segundo medio, para permitir la elongación de los brotes, el desarrollo radicular o ambos.
En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la por lo menos una característica agronómica puede seleccionarse del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en el tejido vegetativo, contenido total de aminoácidos libres en la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de la plántula y emergencia de la plántula bajo impacto por temperaturas bajas. La alteración de por lo menos una característica agronómica puede ser un incremento en la producción, verdor o biomasa.
En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la planta puede mostrar la alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN . recombinante (o el constructo de AD supresor) .
En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención existen alternativas para introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de. ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido- operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora. Por ejemplo, se puede introducir en una célula vegetal regenerable una secuencia reguladora (tal como uno o más potenciadores , opcionalmente como parte de un elemento transponible) , y después tamizar . en busca de un evento en el que la secuencia reguladora se una operacionalmente a un gen endógeno que codifica un polipéptido' de la presente . invención .
La introducción de constructos de ADN recombinante de la presente invención en plantas se puede realizar mediante cualquiera de las técnicas adecuadas, que incluyen, pero no se limitan a, la captación directa de ADN, el tratamiento con sustancias químicas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, la infección, , la transferencia de ADN mediada por vectores, el bombardeo o la transformación mediada con Agrobacterium. Las técnicas para la transformación de la planta y regeneración se describieron en la publicación internacional de patente núm. wo 2009/006276, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia.
El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el fragmento foráneo, exógeno de ácido nucleico que codifica una proteína de interés se conoce bien en la técnica. Las plantas regeneradas pueden autopolinizarse para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas . De lo contrario, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con el de plantas cultivadas de semillas de líneas agronómicamente importantes. A la inversa, el polen de las plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva por medio de métodos muy conocidos por una persona con experiencia en la técnica.
EJEMPLOS La presente invención se ilustra con más detalle en los siguientes ejemplos, en los cuáles las partes y los porcentajes están en peso y los grados están en grados Celsius, a menos que se indique de otra manera. Debe entenderse que si bien estos ejemplos señalan modalidades de la invención, se aportan a manera de ilustración únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones. Por consiguiente, diversas modificaciones de la invención además de aquellas que se muestran y describen en la presente serán aparentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la descripción anterior. Las modificaciones también estarán comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas'.
Ejemplo 1 Creación de una población de Arabidopsis con genes con rotulación de activación Se creó un constructo binario basado en el ADN-T de 18.5-kb, pHSbarENDs2 (sec. con núm. de ident.:l), que contiene cuatro elementos potenciadores multimerizados que se derivan del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (correspondiente a las secuencias -341 a -64, como lo definió Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)). El constructo también contiene secuencias del vector (pUC9) y un poliligador para permitir el rescate del plásmido, secuencias transposón (Ds) para remobilizar el ADN-T, y el gen de barra para permitir al glufosinato la selección de las planta transgénicas . En principio, solamente el segmento de 10.8 kb del borde derecho (BD) al borde izquierdo (BI) inclusivo será transferido al genoma de la planta huésped. Ya que los elementos potenciadores se encuentran cerca del BD, pueden inducir la cis-activación de los loci genómicos seguida de la integración de ADN-T.
Se crearon poblaciones con rotulación de activación de Arabidopsis por la transformación con Agrobacterium de toda la planta. El constructo pHSbarENDs2 se transformó en la cepa C58 de Agrojbacterium tumefaciens, que se cultivó en el BI a 25 °C para OD600 -1.0. Después, las células se granularon mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de 5 % de sacarosa/0.05 % Silwet L-77 (OSI Specialties, Inc) . Durante la germinación precoz, el ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana cultivado en el suelo se empapó con la suspensión de Agrobacterium. Una semana después, las mismas plantas se empaparon nuevamente con la misma cepa de Agrobacterium en sacarosa/Silwet . Se permitió que las plantas dejaran semilla como lo hacen normalmente. Las semillas TI resultantes se sembraron en el suelo y se seleccionaron las plántulas transgénicas al atomizar con glufosinato (Finale®; AgrEvo; Bayer Environmental Science) . Se seleccionó un total de 100000 plántulas TI resistentes al glufosinato. La semilla T2 de cada línea se conservó por separado.
Ejemplo 2 Tamizados para identificar líneas con tolerancia mejorada a la sequía Tamizado cuantitativo para la sequía: De cada una de las 96000 líneas con rotulación de activación TI separadas, se sembraron nueve plantas T2 resistentes al glufosinato, cada una en un recipiente en suelo Scotts® Metro-Mix® 200. Las bandejas se configuraron con 8 recipientes cuadrados cada una. Cada uno de los recipientes cuadrados se rellenó hasta el tope con suelo. Cada recipiente (o célula) se sembró para producir 9 plántulas resistentes al glufosinato en un arreglo 3x3.
El suelo se inundó hasta la saturación y después las plantas crecieron bajo condiciones estándares (es decir, un ciclo de 16 horas luz, 8 horas oscuridad; 22 °C; -60 % humedad relativa). No se añadió agua adicional.
Se tomaron imágenes digitales de las plantas a la ~ aparición visible de los síntomas de impacto por sequía. Las imágenes se tomaron una vez al día (en el mismo momento del día), hasta que las plantas parecieron disecadas. Típicamente, se capturaron cuatro días consecutivos de datos.
El análisis de color se empleó para identificar las líneas potenciales tolerantes a la sequía. El análisis de color se usó para medir el aumento en el porcentaje del área de la hoja que cae en un bote de color amarillo. Con el uso de los datos de tono, saturación e intensidad ("HSI", por sus siglas en inglés) , el tanque de color amarillo consiste de los tonos 35 a 45.
El mantenimiento del área de la hoja también se usó como otro criterio para identificar las líneas potenciales tolerantes a la sequía, ya que las hojas de Arabidopsis se marchitan durante el impacto por sequía. El mantenimiento del área de la hoja puede medirse como la reducción del área de roseta de la hoja con el tiempo.
El área de la hoja se mide en términos del número de pixeles verdes que se obtienen al usar el sistema de imágenes LemnaTec . Las plantas de control y con rotulación de activación (por ejemplo, de tipo silvestre) crecieron juntas en bandejas que contienen 72 plantas (9 plantas/recipiente) . Cuando empiezan a marchitarse, se toman las imágenes por un número de días para monitorear el proceso de marchitado. A partir de estos datos, se determinan los perfiles de marchitez en base a los conteos de pixeles verdes obtenidos durante cuatro días consecutivos- para las plantas de control acompañantes y con rotulación de activación. El perfil se selecciona de una serie de mediciones durante el período de cuatro días que da el mayor grado de marchitez. La capacidad de resistir la sequía se mide por la tendencia de las plantas con rotulación de activación para resistir la marchitez en comparación con las plantas de control.
El programa LemnaTec HTSBonitUV se usó para analizar las imágenes CCD. Los estimados del área de la hoja de las plantas de Arabidopsis se obtuvieron en términos del número de pixeles verdes. El dato para cada imagen se promedia para obtener los cálculos de la desviación estándar y media para los conteos de los pixeles verdes para las plantas silvestres y con rotulación de activación. Los parámetros para una función de ruido se obtuvieron por regresión en línea recta de la desviación cuadrada contra el conteo promedio de pixeles por medio del uso de los datos para todas las imágenes en un grupo. Los cálculos de error para los datos de conteo promedio de pixeles se calcularon por medio del uso de parámetros establecidos para la función de ruido. Los conteos promedios de pixeles para las plantas silvestres y con rotulación de activación se suman para obtener una evaluación del área total de la hoja para cada imagen. El intervalo de cuatro días con marchitez máxima se obtiene al seleccionar el intervalo que corresponde a la diferencia máxima en el crecimiento de la planta. Las respuestas individuales a la marchitez de las plantas silvestres y con rotulación de activación se obtuvieron por normalización de los datos por medio del uso de valor del conteo de los pixeles verdes del primer día en el intervalo. La tolerancia a la sequía de la planta con rotulación de activación en comparación con la planta silvestre se anotó al sumar la diferencia en el peso entre la respuesta a la marchitez de las plantas con rotulación de activación y las plantas silvestres del día dos al día cuatro; los pesos se estimaron por propagación del error en los datos. Una anotación de tolerancia a la sequía positiva corresponde a una planta con rotulación de activación con una marchitez más lenta en comparación con la planta silvestre. El significado de la diferencia en la respuesta a la marchitez entre las plantas silvestres y con rotulación de activación se obtiene a partir de la suma ponderada del cuadrado de las desviaciones Las líneas con un significado retrasado en la acumulación del; color amarillo y/o con un mantenimiento significativo del área de la roseta de la hoja, cuando se compara con el promedio de la bandeja completa, se designaron como aciertos de la Fase 1. Los aciertos de la Fase 1 se tamizan nuevamente por duplicado bajo las mismas condiciones de la prueba. Cuando cualquiera o ambas repeticiones de la Fase 2 muestran un diferencia significativa (puntuación mayor que 0.9) a partir del promedio de la bandeja completa, la línea se considera" entonces una línea tolerante a la sequía validada.
Ejemplo 3 Identificación de genes con rotulación de activación Los genes contiguos al inserto de ADN-T en líneas tolerantes a la sequía se identifican por medio del uso de uno, o ambos, de los siguientes dos procedimientos estándares: (1) PCR térmica de entrelazado asimétrico (TAIL, por sus siglas en inglés) (Liu et al., (1995), Plant J. 8:457-63); y (2) SAIFF RCP (Siebert et al., (1995) Nucleic Acids Res. 23:1087-1088). En las líneas con insertos de ADN-T muítimerizados complejos, tanto el TAIL PCR como el SAIFF PCR pueden ser insuficientes para identificar genes candidatos. En estos casos, se puede usar otros procedimientos, que incluyen la PCR inversa, el rescate de plásmidos y/o la construcción de la genoteca de ADN.
Un resultado exitoso es cuando un fragmento único de TAIL o SAIFF PCR contiene una secuencia borde de ADN-T y una secuencia genómica de Arabidopsis.
Una vez que se obtiene una etiqueta de la secuencia genómica contigua al inserto de ADN-T, los genes candidatos se identifican mediante el alineamiento para la secuencia del genoma de Arabidopsis disponible al público.
Especialmente, el mencionado gen más cercano a los elementos potenciadores 35S/BD del ADN-T es candidato para genes activos.
Para verificar que un gen identificado está verdaderamente cerca de un ADN-T y excluir la posibilidad de que el fragmento TAIL/SAIFF sea un artefacto de clonación quimérica, se realiza una RCP diagnóstica en el ADN genómico con un oligo en el ADN-T y un oligo específico para el gen candidato. Las muestras de ADN genómico que proporcionan un producto de RCP se interpretan como representantes de la inserción de- ADN-T. Este análisis también verifica una situación donde ocurre más de un evento de inserción en la misma línea, por ejemplo, si se identifican múltiples fragmentos genómicos diferentes en los análisis TAIL y/o SAIFF PCR.
Ejemplo 4A Identificación del gen de la proteína tirosina fosfatasa con rotulación de activación Se analizó, además, una línea con rotulación de activación (núm. 116089) que muestra tolerancia a la sequía. Se extrajo el ADN de la línea, y se identificaron los genes contiguos al inserto de ADN-T en la línea mutante por medio del uso de SAIFF PCR (Siebert et al., Nucleic Acids Res. 23:1087-1088 (1995)). Se identificó un fragmento amplificado por PCR que contenía una secuencia borde de ADN-T y secuencia genómica de Arabidopsis . Se obtuvo la secuencia genómica contigua al inserto de ADN-T, y el gen candidato se identificó por alineamiento del genoma de Arabidopsis completo. Para un evento de integración de ADN-T dado, el gen anotado cercano a los elementos potenciadores 35S/ADN-T RB fue el candidato para el gen que se activó en la línea. En el caso de la línea 116089, el ADN-T se insertó en el gen At3g44610. Los potenciadores 35S en el sitio de integración se dirigieron hacia At3g44620 (sec. con núm. de ident.:14), que codifica una proteína tirosina fosfatasa (sec. con núm. de ident.:15; NCBI GI núm. 79432726).
Ejemplo 4B Ensayo para el nivel de expresión de los genes candidatos de tolerancia a la sequía Un alelo con rotulación de activación funcional debe resultar en cualquier regulación ascendente del gen candidato en tejidos, en donde se expresa normalmente, expresión ectópica en tejidos que no expresan normalmente ese gen, o ambos.
Se compararon los niveles de expresión de los genes candidatos en las líneas mutantes cognados en comparación con el tipo silvestre. Se usó un procedimiento RT-PCR estándar, tal como el kit de transcripción inversa QuantiTect® Kit de Qiagen®. La RT-PCR del gen de actina se usó como un control para mostrar que la amplificación y carga de las muestras de la línea mutante y de tipo silvestre son similares.
Las condiciones de ensayo se optimizan para cada gen. Los niveles de expresión se controlan en las hojas de roseta madura. Si el alelo con rotulación de activación resulta en expresión ectópica en otros tejidos (por ejemplo, raíces), no se detecta por este ensayo. Así, un resultado positivo es útil pero un resultado negativo no elimina un gen de análisis adicionales.
Ejemplo 5 Validación del gen candidato At3g44620 de Arabidopsis (proteína tirosina fosfatasa) por medio de la transformación en Arabidopsis Los genes candidatos se pueden transformar en Arabidopsis y sobreexpresar bajo el promotor 35S. Si se observa el mismo fenotipo o uno similar en la línea transgénica como en la línea . paterna con rotulación de activación, entonces se considera que el gen candidato es un "gen guía" validado en Arabidopsis .
El gen candidato de la proteína tirosina fosfatasa deArabidopsis (At3g44620 sec . con núm. de ident.:14) se evaluó para su capacidad para conferir tolerancia a la sequía de la siguiente manera.
Se construyó un vector binario basado en el ADN-T de 16.8-kb, llamado pBC-yellow (sec. con núm. de ident.:4), con .un promotor 35S de 1.3-kb inmediatamente corriente arriba del inserto de conversión GATEWAY® Cl de INVITROGEN™ . El vector también contiene el promotor RD29a que conduce la expresión del gen para ZS-Yellow (INVITROGEN™) , que confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada.
Un fragmento del nucleótido A 534 de la región codificante de la proteína ADNc At3g44620 se amplificó por RT-PCR con los siguientes iniciadores: (1) iniciador directo At3g44620-5 ' attB (sec. con núm. de ident . :12) : TTAAACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAACAATGGCGACTCCT CCTCCGACG (2) iniciador inverso At3g44620-3 ' attB (sec. con núm. de ident. :13) : TTAAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAACTTTGCGCAGTGA TACT El fragmento de nucleótido 534 amplificado por los iniciadores anteriores se designó AAt3g44620 y codifica una proteína tirosina fosfatasa truncada consistente de los aminoácidos 63-239 de la sec . con núm. de ident.:15. La secuencia de aminoácidos 177 de esta proteína truncada se presenta como la sec. con núm. de ident.:33, y le faltan los 62 aminoácidos del terminal amino de la proteína tirosina fosfatasa de Arabidopsis de longitud completa (sec. con núm. de ident . : 15 ) .
El iniciador directo contiene la secuencia attBl (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT; sec. con núm. de ident.: 10) y una secuencia de consenso Kozak (CAACA) adyacente a los 21 nucleótidos de la región codificante de la proteína, que comienza con el codón ATG en el nucleótido 216 de la sec. con núm. de ident. :14.
El iniciador inverso contiene la secuencia attB2 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT; sec . con núm. de ident.: 11) adyacente al complemento inverso de los últimos 21 nucleótidos de la región codificante de la proteína, que comienza con el complemento inverso del codón de parada de la sec. con núm. de ident.: 14.
Por medio del uso de la tecnología GATEWAY® CLONASE™ de INVITROGEN™, se llevó a cabo una reacción de recombinación BP con pDONR™/Zeo (sec. con núm. de ident. :2) . Este proceso eliminó el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen de resistencia al cloranlenicol (CAM) de pDONR™/Zeo y clonó direccionalmente el producto PCR con los sitios attBl y attB2 contiguos que crean un clon de entrada, PHP30192. Este clon de entrada se usó para una reacción de recombinación LR posterior con un vector de destino, como sigue.
Un vector binario basado en el ADN-T de 16.8-kb (vector de destino), llamado pBC-yellow (sec. con núm. de ident.:4), se construyó con el promotor 35S de 1.3-kb inmediatamente corriente arriba del inserto de conversión GATEWAY® Cl de INVITROGEN™ , que contiene el gen letal bacteriano ccdB así como el gen resistente al cloranlenicol (CAM) contiguo a las secuencias attRl y attR2. El vector también contiene el promotor RD29a que conduce la expresión del gen para ZS-Yellow (INVITROGEN™) , que confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada. Con el uso de la tecnología GATEWAY® de INVITROGEN™, se llevó a cabo una reacción de recombinación LR en el clon de entrada PHP30192, que contiene el producto clonado direccionalmente de la RCP y el pBC-yellow. Esto permitió la clonación rápida y direccional del gen candidato detrás del promotor 35S en pBC-yellow para crear el promotor 35S :: constructo de expresión AAt3g44620, pBC-Yellow- AAt3g44620.
Los solicitantes introdujeron después el promotor 35S:: constructo de expresión AAt3g44620 en la Arabidopsis de tipo silvestre ecotipo Col-0, y usaron el mismo procedimiento de transformación mediada por Agrobacterium descrito en el Ejemplo 1. Las semillas transgénicas TI se seleccionaron por fluorescencia amarilla, y las semillas TI se colocaron en placas próximas a las semillas de tipo silvestre y crecieron bajo condiciones de limitación de agua. Las condiciones de crecimiento y el análisis de imágenes fueron como sle describe en el Ejemplo 2. Se encontró que el fenotipo de tolerancia a la sequía original de la rotulación de activación se puede recapitular en las plantas de Arabidopsis de tipo silvestre que se transformaron con un constructo en donde AAt3g44620 se expresó directamente por el promotor 35S.- La puntuación de tolerancia a la sequía, según se determinó por el método del Ejemplo 2, fue 4.3.
Ejemplo 6 Preparación de genotecas de ADNc y Aislamiento y -secuenciamiento de clones de ADNc Las genotecas de ADNc se pueden preparar mediante cualquiera de los diversos métodos disponibles. Los ADN o ADN plasmídicos de insertos amplificados se someten a secuenciamiento en reacciones de secuenciamiento tinte- iniciador para generar secuencias parciales de ADNc (etiquetas de secuencia expresada o "EST" ver Adams et. al., (1991) Science 252:1651-1656) .
Los datos de la secuencia de inserción completa (FIS) se generan con el uso de un protocolo de transposición modificado.
Los patrones confirmados se transponen a través del kit de transposición Primer Island (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) que se basó en el elemento transponible Tyl deSaccharomyces cerevisíae (Devine y Boeke (1994) Nucleic Acids Res. 22:3765-3772. El ADN transpuesto se usó después para transformar las células electro-competentes DH10B (GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD) a través de la electroporación . El elemento transponible contiene un marcador seleccionable adicional (llamado . DHFR; Fling and Richards (1983) Nucleic Acids Res. 21:5147-5158) que permite la selección doble en placas con agar únicamente de los subclones que contienen el transposón integrado. Aleatoriamente, se seleccionan múltiples subclones de cada reacción de transposición, los ADN plasmídicos se preparan vía lisis alcalina y las plantillas se someten a secuenciamiento (tinte-terminador ABI PRISM mezcla ReadyReaction) hacia afuera del sitio del evento de transposición, con el uso de cebadores únicos específicos para los sitios de unión dentro del transposón.
La información de secuencias se recolecta (ABI PRISM® Collections) y se ensambla con el uso de Phred and Phrap (Ewing et al. (1998) Genome Res. 8:175-185; Ewing y Green (1998) Genome Res. 8:186-194) . Los ensambles se observan mediante el editor de secuencias Consed (Gordon et al. (1998) Genome Res. 8:195-202) .
En algunos clones, el fragmento de ADNc puede corresponder a la porción 3 '-terminal del gen y no cubre el marco de lectura abierto completo. Para obtener la información corriente arriba se usa uno de los dos protocolos diferentes. El primero de estos métodos resulta en la producción de un fragmento de ADN que contiene una porción de la secuencia de genes deseada mientras que el segundo método resulta en la producción de un fragmento que contiene el marco de lectura abierto completo. Ambos métodos usan dos tandas de amplificación de la RCP para obtener fragmentos de una o más genotecas. Las genotecas se escogen, algunas veces, en base al conocimiento previo que el gen específico debería encontrarse en un tejido específico y, algunas veces, se escogen aleatoriamente. Las reacciones para obtener el mismo gen se pueden realizar en varias genotecas en paralelo o en un grupo de genotecas. Los grupos de genotecas se preparan, normalmente, con el uso de 3 a 5 genotecas diferentes y se normalizan hasta una dilución uniforme. En la primera tanda de amplificación ambos métodos usan un cebador específico del vector (directo) correspondiente a una porción del vector localizada en la región 5 '-terminal del clon junto con un cebador específico del gen (inverso) . El primer método usa una secuencia complementaria a una porción de la secuencia de genes ya conocida, mientras que el segundo método usa un cebador específico del gen complementario a una porción de la región 3' no traducida (también llamada UTR, por sus siglas en inglés) . En la segunda tanda de amplificación se usa un set subdividido de cebadores para ambos métodos. El fragmento de ADN resultante se liga al vector pBLUESCRIPT® con el uso de un kit comercial y siguiendo el protocolo del fabricante. Este kit se selecciona de la variedad disponible de varios proveedores que incluyen Invitrogen™ (Carlsbad, CA) , Promega Biotech (Madison, WI) y Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) . El ADN plasmídico se aisla mediante el método de lisis alcalina y se somete a secuenciamiento y ensamble con el uso - de Phred/Phrap, como se mencionó anteriormente .
Ejemplo 7 Identificación de clones de ADNc ' Los clones de ADNc que codifican el polipéptido de interés pueden identificarse por la conducción de BLAST (Herramienta de Búsqueda del Alineamiento .Básico Local; Altschul et al., (1993) J". Mol. Biol. 215:403-410; ver también la explicación del algoritmo BLAST en el sitio en la web del National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine of the National Institutes of Health) con las secuencias de aminoácidos contenidas en la base de datos "nr" del BLAST (que comprende todas las traducciones no redundantes CDS del GenBank, las secuencias derivadas de la estructura tridimensional de Brookhaven Protein ? Data Í3ank, el último lanzamiento de la base de datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT y las bases de datos de EMBL y DDBJ) . Las secuencias de ADN de los clones pueden traducirse en todos los marcos de lectura y compararse la similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nat. Genet. 3:266-272) que proporciona el C IB. Los polipéptidos codificados por las secuencias de ADNc pueden analizarse para similitud con todas las secuencias de aminoácidos disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo BLASTP proporcionado por National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Por conveniencia, el valor P (probabilidad) o el valor E (expectativas) de observar una coincidencia de una secuencia de ADNc codificada con una secuencia contenida en las bases de datos de búsqueda simplemente por casualidad como lo calcula el BLAST se reporta en la presente como valor "pLog", que representa el negativo del logaritmo del valor P o el valor E reportado. Por lo tanto, mientras mayor sea el valor pLog, mayor es la probabilidad de que la secuencia de ADNc codificada y el "acierto" del BLAST representen proteínas homologas .
Las secuencias EST pueden compararse con la base de datos del Genbank como se describió anteriormente . Las EST que contienen secuencias con más de 5 ó 3 iniciadores se pueden encontrar por medio del uso del algoritmo BLASTN (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.) en comparación con la base de datos registrada de DUPOT™ que compara secuencias de nucleótidos que comparten regiones comunes o traslapadas de secuencias homologas . En donde hay secuencias comunes o traslapadas entre dos o más fragmentos de ácidos nucleicos, las secuencias se pueden ensamblar en una sola secuencia 'de nucleótidos contiguos, extendiendo así el fragmento"original, ya sea en la dirección del cebador 5 ó 3. Una vez que se identifica la mayor parte de los 5 primeros EST, su secuencia completa se puede determinar por secuenciación del inserto completo como se describió anteriormente. Los genes homólogos que pertenecen a diferentes especies se pueden encontrar al comparar la secuencia de aminoácidos de un gen conocido (ya sea de una fuente registrada o de una base de datos pública) con una base de datos de EST por medio del uso del algoritmo TBLASTN. El algoritmo TBLASTn compara una consulta formada por aminoácidos en comparación con una base de datos de nucleótidos traducida en los 6 marcos de lectura. Esta búsqueda permite diferencias en el uso de codones de nucleótidos entre diferentes especies y para la degeneración del codón.
Ejemplo 8 Caracterización de los clones de ADNc que codifican la proteína tirosina fosfatasa Las genotecas de ADNc que representan los ARNm de varios tejidos de maíz, soya, remolacha, bledo (.Amaranthus retroflexus) y uva se prepararon y se identificaron los clones de ADNc que codifican las proteínas tirosina fosfatasas. Las características de las genotecas se describen a continuación.
Tabla 2 Genotecas de ADNc del maíz, soya, remolacha, bledo y uva Genoteca Descripción Clon Espiga de maíz inmadura, de la cielc cielc .pkOOl .nl3 genoteca ciel sin resta Plántulas de soya en desarrollo sil sll.pk0004.cl2 de dos semanas Soya (Glycine max, Wye) raíz de sdrlf sdrlf .pk003. el 10 días Remolacha, genes de brote y ebslc ebslc .pk003.kl4 floema específicos Semillas jóvenes de Amaranthus easlc easlc .pk002. d7 retroflexus Uva (Vitis sp . ) bayas en etapa vmblna vmblna .pkO 01. i3 media normalizada* Uva (Vitis sp . ) yema en vdblc vdblc. pk011.h24 desarrollo * Estas genotecas se normalizaron esencialmente como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,482,845 La secuencia FIS del clon sil . k0004. cl2 se designó sil .pk0004. cl2 : fis y se encontró que carece de región codificante para los primeros treinta y siete aminoácidos de una proteína tirosina fosfatasa de soya. Por lo tanto, se formó un contigo entre la secuencia EST pública de GI núm. 17401417 en el extremo 5' y sil . k0004. cl2 : fis en el extremo 3' y se presenta como la sec . con núm. de ident.:18. La secuencia de aminoácidos codificada por la sec. con núm. de ident.:18 se presenta como la sec. con núm. de ident.:19.
Se encontró que el clon de ADNc sdrlf . pk003. el codifica una segunda proteína tirosina fosfatasa de soya. La secuencia FIS del clon sdrlf . pk003. el se designó sdrlf . pk003. el : fis (sec. con núm. de ident. :20) y se encontró que carece de región codificante para los primeros siete aminoácidos de la proteína tirosina fosfatasa. Por lo. tanto, se ensambló una secuencia de soya quimérica consistente de los nucleótidos 6-26 de la sec. con núm. de ident. :18 en el extremo 5' unido a los nucleótidos 3-707 de la sec. con núm. de ident. -.20 el extremo 3'y se presenta como la sec. con núm. de ident. :22. La secuencia de aminoácidos codificada por la sec. con núm. de ident.: 22 se presenta como la sec. con núm. de ident.: 23.
Se encontró que el clon de ADNc vmblna . pkOOl . i3 : fis carece de codón de iniciación para la proteína tirosina fosfatasa. Por lo tanto, se formó un contigo entre la secuencia FIS de vmblna . pkOOl . i3 : fis y los primeros 25 nucleótidos de la secuencia EST de vdblc.pk011.h24, y se presenta como la sec. con núm. de ident.:42. La secuencia de aminoácidos codificada por la sec. con núm. de ident.:42 se presenta como la sec. con núm. de ident.:43.
La búsqueda en BLAST por medio del uso de las secuencias de los clones enumerados en la Tabla 2 revelaron similitud de los polipéptidos codificados por los ADNc para las proteínas tirosina fosfatasas de varios organismos. Como se muestra en la Tabla 3 y las Figuras 1A-1C, los ADNc codificaron polipéptidos similares a los siguientes: una proteína tirosina fosfatasa de Arabidopsis (NCBI GI núm. 79432726; sec. con núm. de ident.:15); una proteína como la proteína tirosina fosfatasa del arroz (NCBI GI núm.. 29367341; sec. con núm. de ident.:27; Cooper et al., 2003, Proc . Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 100:4945-4950); una proteína como la proteína tirosina fosfatasa del maíz (sec. con núm. de ident.:28; US20040214272 ) ,· una proteína como la proteína tirosina fosfatasa de la soya (sec. con núm. de ident.:29; US20040031072-A1) , una proteína como la proteína tirosina fosfatasa de la uva (sec. con núm. de ident.:45; NCBI GI núm. 225436307) , y una proteína como la proteína tirosina fosfatasa del trigo (sec. con núm. de ident.:46; US7214786).
En la Tabla 3 (literatura no patente) y las Tablas 4 (literatura de patente) se muestran los resultados BLAST para las EST individuales ("EST") , las secuencias de los insertos de ADNc completos que comprenden los clones de ADNc indicados ("FIS") , las secuencias de cóntigos agrupados de dos o más secuencias EST, FIS o PCR ("Contigo") , o secuencias que codifican una proteína funcional o entera derivada de un FIS o un contigo ("CGS") . En las Tablas 3 y 4 también se muestran los valores del porcentaje de identidad de secuencias para cada par de secuencias de aminoácidos, por medio del uso del método .de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados:.
Tabla 3 Resultados de BLASTP para las proteína tirosina fosfatasas Secuencia Estado Núm. GI del CNIB BLASTP Porcentaje (Planta) (sec. con núm. pLog de Secuencia de ident . ) valor E Identidad sec. con núm. SCG 29367341 97.4 67.9 de ident . : 17 (sec. con núm.
Maíz de ident . : 27) sec. con núm. SCG 29367341 73.7 58.8 de ident . : 19 (sec. con núm.
Soya de ident. :27) sec. con núm. FIS 79432726 72.7 58.7 de ident . : 21 (sec. con núm.
Soya de ident . : 15 ) sec . con núm. SCG 79432726 72.7 57.7 de ident . : 23. (sec. con núm.
(Quimera Soya) de ident . : 15 ) sec. con núm. SCG 79432726 74.7 60.3 de ident . : 25 ( sec . con núm .
(Remolacha) de ident . : 15 ) sec. con núm. FIS 225436307 75 65.3 de ident . : 40 (sec. con núm.
Bledo de ident . : 45) sec. con núm. SCG 225436307 140 99.2 de ident . : 43 (sec. con núm.
Uva de ident . : 45) Tabla' 4 Resultados de BLASTP para las proteínas tirdsina fosfatasas Secuencia Estado Referencia BLASTP Porcentaje (Planta) (sec. con núm. pLog del Secuencia de ident.) valor E Identidad sec . con núm. SCG sec. con núm. de 152 98.9 de ident . : 17 ident . : 366863 ; Maíz US20040214272 (sec. con núm. de ident . : 28) sec . con num. SCG sec. con núm. de 136 100 de ident . : 19 ident. : 277487; Frijol de soya US20040031072-A1 (sec. con núm. de ident . : 29) sec. con num. FIS sec. con núm. de 120 89.4 de ident . : 21 ident . ¡277487 ; Soya US20040031072-A1 (sec. con núm. de ident . : 29) sec. con num. SCG sec. con núm. de 123 90.4 de ident . : 23 ident. : 277487; (Soya quimera) US20040031072-A1 (sec. con núm. de ident . : 29) sec. con num. SCG sec. con núm. de 74.3 58.3 de ident . : 25 ident. : 277487; (Remolacha) US20040031072-A1 ( sec . con núm . de ident . : 29) . con num. FIS sec. con núm. de 68.4 57.5 ident . : 40 ident . : 112865; Bledo US7214786 (sec. con núm. de ident . : 46 ) sec. con núm. SCG sec. con núm. de 72.2 54.5 de ident . : 43 ident . : 112865; Uva US7214786 (sec. con núm. de ident . : 46 ) Las Figuras 1A-1C presentan un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína tirosina fosfatasa que se expone en la sec. con núm. de ident.: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 40, 43, 45 y 46. La Figura 2 presenta el valor porcentual de identidad y divergencia de secuencia para cada par de secuencia que se presenta en las Figuras 1A-1C.
Los alineamientos de secuencias y los cálculos de porcentaje de identidad se realizaron por medio del uso del programa Megalign® del paquete integrado para bioinformát ica LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI) . El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó por medio del uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros predeterminados (GAP PENALTY= 10 , GAP LENGTH PENALTY=10) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares con el uso del método Clustal fueron KTUPLE 1, GAP PENALTY=3 , INDOW=5 y DIAGONALS SAVED=5.
Los alineamientos de secuencias y los valores y probabilidades del BLAST indican que los fragmentos de ácidos nucleicos que comprenden los clones de ADNc instantáneos codifican las proteínas tirosina fosfatasas .
La proteína - tirosina fosfatasa de Arabidopsis (sec. con núra . de ident . :15) parece ser un polipéptido dirigido al cloroplasto. Los 60 aminoácidos del terminal amino de sec. con núm . de "ident.: 15 tienen las características de un péptido de tránsito al cloroplasto. En las Figuras 1A-1C, un residuo de metionina se encuentra en la posición 63 de la sec. con núm. de ident. :15, y justo a continuación de la región del péptido de tránsito putativo. .La sec. con núm. de ident. :33 corresponde a los aminoácidos 63-239 de la sec. con núm. de ident. :15, y potenc ialmente codifica una versión citosólica de la proteína tirosina fosfatasa de Arabidopsis. Un residuo de metionina se encuentra en una posición correspondiente en cada una de las proteínas tirosina fosfatasas que se muestran en las Figuras 1A-1C. La Tabla 5 a continuación da la relación entre los polipéptidos precursores de la proteína tirosina fosfatasa de las Figuras 1A-1C, y las proteínas citosólicas potenciales correspondientes.
Tabla 5 Proteína tirosina fosfatasa citosólica potencial Precursor Versión citosólica Aminoácidos del precursor (sec. con núm. (sec. con núm. de que se encuentra en la de ident . ) ident . ) versión citosólica 15 33 63-239 17 34 .· . 89-274 19 35 59-240 21 36 54-235 25 37 77-255 27 38 84-268 28 49 89-274 29 50 59-240 40 41 41-219 43 44 65-246 45 47 65-246 46 48 81-274 Se formó un alineamiento múltiple de la secuencia de aminoácidos de la proteína tirosina fosfatasa citosólica potencial que se expone en la sec. con núm. de ident. :33, 34, 35, 36, 37, 38, 41, 44, 47, 48, 49 y 50. La Figura 3 presenta los valores porcentuales de identidad y divergencia para cada par de secuencia de la proteína tirosina fosfatasa citosólica potencial.
Ejemplo 9 Preparación de un vector de expresión para plantas que contienen un homólogo al gen guía de Arabidopsis Las secuencias homologas al polipéptido codificado por el gen guía de Arabidopsis se pueden identificar por medio del uso de algoritmos de comparación de secuencias tal como el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., j. Mol. Biol. 215:403-410 (1993); ver también la explicación del algoritmo BLAST en el sitio web de National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine of the National Institutes of Health) . Las secuencias que codifican polipéptidos con genes guía homólogos se pueden amplificar por PCR por cualquiera de los siguientes métodos.
Método 1 (basado en ARN) : Si la información de la secuencia 5' y 3' para la región codificante de la proteína de un gen que codifica un homólogo a un polipéptido con gen guía está disponible los iniciados específicos para el gen se pueden designar como se esbozó en el Ejemplo 5. La RT-PCR se puede usar con el ARN de la planta para obtener un fragmento de ácido nucleico que contiene la región codificante de la proteína contiguo a las secuencias attBl (sec. con núm. de ident.:10) y attB2 (sec. con núm. de ident.:ll) . El cebador puede contener una secuencia consenso de Kozak (CAACA) corriente arriba del codón de inicio.
Método 2 (basado en ADN) : Alternativamente, si un clon de ADNc está disponible para un gen que codifica un homólogo para el polipéptido con gen guía, el inserto completo de ADNc (que contiene las regiones 5' y 3' no codificantes) puede amplificarse por PCR. Se puede diseñar cebadores directos e inversos que contengan ya sea la secuencia attBl y la secuencia específica del vector que precede el inserto de ADNc o la secuencia attB2 y la secuencia específica del vector que sigue al inserto de ADNc, respectivamente. Para clonar un inserto de ADNc en el vector pBulescript SK+, se puede usar el iniciador directo VC062 (sec. con núm. de idént.:30) y el iniciador inverso VC063 (sec. con núm. de ident.:31) .
Los métodos 1 y 2 se pueden modificar de conformidad con los procedimientos conocidos por una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, los cebadores del método 1 pueden contener sitios de restricción en vez de sitios attBl y attB2, para la clonación posterior del producto de la RCP en un vector que contiene sitios attBl y attB2. Además, el método 2 puede requerir la amplificación de un clon de ADNc, un clon lambda, un clon BAC o ADN genómico.
Un producto de la PCR que se obtiene por cualquiera de los métodos anteriores se puede combinar con el vector donante GATEWAY®, tal como pDONR™/Zeo (INVITROGEN™ ; sec. con núm. de ident.:2) o pDONR™221 (INVITROGEN™ ; sec. con núm. de ident.:3), por medio del uso de una reacción dé recombinación BP. Este proceso elimina el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen resistente al cloranfenicol (CAM) de pDONR™221 y clona direccionalmente el producto de la PCR contiguo a los sitios attBl y attB2 para crear un clon de entrada. Con el uso de la tecnología de GATEWAY® CLONASE™ de INVITROGEN™, la secuencia del clon de entrada que codifica el polipéptido con gen guía homólogo puede después transferirse a un vector de destino adecuado, tal como pBC-Yellow (sec. con núm. de ident.:4), PHP27840 (sec. con núm. de ident.:5) o PHP23236 (sec. con núm. de ident.:6), para obtener un vector de expresión de la planta para usar con Arabidopsis, soya y maíz, respectivamente.
Los sitios attPl y. attP2 de los vectores donantes pDONR™/Zeo o pDONR™221 se muestran en la sec. con núm. de ident.:2 y 3, respectivamente. Los sitios attRl y attR2 de los vectores de destino pBC-Yellow, PHP27840 y PHP23236 se muestran en la sec. con núm. de ident.:4, 5 y 6, respectivamente.
Alternativamente, se puede realizar una reacción de recombinación LR MultiSite Gateway® entre múltiples clones de entrada y un vector objetivo adecuado para crear un vector de expresión.
Ejemplo 10 Preparación de vectores de expresión de soya y transformación de la soya con genes guías de Arabidopsis validados Las plantas de soya se pueden transformar para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de varias especies para examinar el fenotipo, resultante .
El mismo clon de entrada GATEWAY® descrito en el Ejemplo 5 se puede usar para clonar direccionalmente cada gen en el vector PHP27840 (sec. con núm. de ident.:5) de tal forma que la expresión del gen esté bajo control del promotor SCPl.
Los embriones de frijol de soya se pueden transformar con el vector de expresión -que comprende secuencias que codifican los polipéptidos instantáneos. Las técnicas para la transformación y regeneración de la soya se describieron en la Publicación internacional de patentes WO 2009/006276, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia.
Las plantas TI pueden someterse a un impacto por sequía en base al suelo. Con el uso del análisis de imágenes, el área de la planta, el volumen, el índice de crecimiento y el análisis del color pueden tomarse en múltiples momentos antes y durante el impacto por sequía. Los constructos de sobreexpresión que resultan en un retraso significativo de la marchitez o reducción del área de la hoja, acumulación del color amarillo y/o índice de crecimiento aumentado durante el impacto por sequía se considerarán evidencia de que el gen de Arabidopsis funciona en la soya para mejorar la tolerancia a la sequía.
Las plantas de soya transformadas con genes validados pueden ensayarse después en estudios de campo más vigorosos para estudiar el mejoramiento y/o la estabilidad bajo condiciones de limitación de agua y con bastante agua.
Ejemplo 11 Transformación del maíz con genes guías de Arabidopsis por medio del uso del bombardeo de partículas Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de varias especies para examinar el fenotipo resultante.
El mismo clon de entrada GATEWAY® descrito en el Ejemplo 5 se puede usar para clonar direccionalmente cada gen en un vector de transformación de maíz. La expresión del gen en el vector de transformación de maíz puede estar bajo control de un promotor constitutivo tal como el promotor de la ubiquitina del maíz (Christensen et al., (1989) Plant Mol. Biol . 12:619-632 y Christensen et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) El constructo de ADN recombinante descrito anteriormente puede introducirse después en las células de maíz por bombardeo de partículas. Las técnicas para la transformación del maíz por bombardeo de partículas y regeneración de plantas se describieron en la publicación internacional de patente núm. WO 2009/006276, el contenido de la misma se incorporan en la presente como referencia.
Las plantas TI pueden someterse a un impacto por sequía en base al suelo. Con el uso del análisis de imágenes, el área de la planta, el volumen, el índice de crecimiento y el análisis del color pueden tomarse en múltiples momentos antes y durante el impacto por sequía. Los constructos de sobreexpresión que resultan en un retraso significativo de la marchitez o reducción del área de la hoja, acumulación del color amarillo y/o índice de crecimiento aumentado durante el impacto por sequía se considerarán evidencia de que el gen de Arabidopsis funciona en el maíz para mejorar la tolerancia a la sequía.
Ejemplo 12 Electroporación de Agro.bacte.riuní tumefaciens LBA4404 Las células competentes por electroporación (40 mi), tal como Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que contiene PHP10523 (sec. con núm. de ident.:7), se descongelaron en hielo (20-30 min) . El PHP10523 contiene genes VIR para la transferencia de ADN-T, un origen de replicación de plásmido con un número de copia bajo de Agrobacteria, un gen de resistencia a la tetraciclina y un sitio Cos para la recombinación bimolecular de ADN in vivo. Mientras tanto, la cubeta de electroporación se enfría en hielo. La configuración del electroporador se ajustó a 2.1 kV. Una alícuota de ADN (0.5 µ? de ADN parental a una concentración de 0.2 ]ig -1.0 ug en un amortiguador bajo en sal o H20 destilada dos veces) se mezcla con las células de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 descongeladas mientras se mantienen en hielo. La mezcla se transfiere al fondo de la cubeta de electroporación y se mantiene en reposo sobre hielo durante 1-2 min. Las células se electroporan (electroporador 2510 de Eppendorf) al presionar el botón "pulse" dos veces (idealmente, hasta alcanzar un pulso de 4.0 milisegundos) . Posteriormente, se añadieron 0.5 mi del medio 2xYT a; temperatura ambiente (o medio SOC) a la cubeta y se transfirieron a un tubo con tapa a presión de 15 mi (por ejemplo, el tubo FALCON™) . Las células se incuban a 28-30 °C, 200-250 rpm durante 3 h.
Alícuotas de 250 µ? se rocían sobre las placas que contienen el medio YM y 50 ug/ml de espectinomicina y se. incubaron tres días a 28-30 °C. Para incrementar la cantidad de transformantes, se puede realizar uno de dos pasos opcionales: Opción 1: Placas revestidas con 30 µ? de 15 mg/ml rifampicina. El LBA4404 tiene un gen de resistencia cromosómica para la rifampicina. Esta selección adicional elimina algunas colonias contaminantes observadas cuando se usa preparaciones más deficientes de células competentes de LBA4404.
Opción 2: Realizar dos réplicas de la electroporación para compensar las células electrocompetentes más deficientes.
Identificación de transformantes: Cuatro colonias independientes se escogen y se dispersan en las placas que contienen un medio mínimo AB y 50 µg/ml de espectinomicina para aislar las colonias simples. Las placas se incubaron a 28 °C por. dos a tres días. Una colonia simple para cada co- integrado putativo se escogió y se inoculó con 4 mi de 10 g/1 de bactopeptona, 10 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de cloruro sódico y 50 mg/1 de espectinomicina. La mezcla se incuba durante 24 h a 28 °C con agitación. El ADN plásmido de 4 mi de cultivo es aisla por medio del uso de Qiagen® Miniprep y un lavado opcional con amortiguador PB. El ADN es eluidp en 30 µ? . Se usaron alícuotas de 2 µ? para electroporar 20 µ? de DHlOb + 20 µ? de H20 destilada dos veces como anteriormente. Opcionalmente , se puede usar una alícuota de 15 µ? para transformar 75-100 µ? Library Efficiency DH5 DE INVITROGEN™. Las células se rocían sobre las placas que contiene medio LB y 50 µg/ml de espectinomicina y se incuban a 37 °C toda la noche.
Se recogieron de tres a cuatro colonias independientes para cada co-integrado putativo y se inocularon 4 mi del medio 2xYT (10 g/1 bactopeptona, 10 g/1 de extractos de levadura, 5 g/1 de cloruro sódico) con 50 µg/ml de espectinomicina. Las células se incuban a 37 °C durante la noche con agitación. Después, se aisla el ADN plásmido de los 4 mi de cultivo por medio del uso de QIAprep® Miniprep con lavado opcional con amortiguador PB (eluido en 50 µ?) . Se usan 8 mi para la digestión con Salí (por medio del uso de ADN parental y PHP10523 como controles) . Se realizan otras tres digestiones más con el uso de las enzimas de restricción BamHI , EcoRI y HindIII para 4 plásmidos que representan 2 cointegrados putativos con patrón de digestión de Salí correcto (con el uso de ADN parental y PHP10523 como controles) . Se recomienda geles electrónicos para comparación.
Ejemplo 13 Transformación del maíz usando Agrobacterium Las plantas de · maíz se pueden transformar para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de varias especies para examinar el fenotipo resultante.
La transformación del maíz mediada por Agrobacterium se realizó esencialmente como lo describen Zhao et al. en Meth.
Mol. Biol . 318:315-323 (2006) (ver también Zhao et al., Mol.
Breed. 8:323-333 (2001) y la patente de los Estados Unidos núm. 5,981,840 emitida el 9 de noviembre de 1999, incorporada en la presente como referencia) . El proceso de transformación requiere inoculación bacteriana, cocultivo, reposo, selección y regeneración vegetal. 1. Preparación de embriones inmaduros: Los embriones inmaduros de maíz se separan de las cariopses y se colocan en un microtubo de 2 mi que contiene 2 mi de medio PHI-A. 2. Infección de Agrobacterium y cocultivo de embriones inmaduros : 2.1 Etapa de infección: Se retira el medio PHI-A de (1) con una micropipeta de 1 mi, y se añade 1 mi de suspensión de Agrobac erium. El tubo se invierte cuidadosamente para mezclar. La mezcla se incuba durante 5 rain a temperatura ambiente . 2.2 Etapa de cocultivo: La suspensión de Agrobacterium se retira de la etapa de infección con una micropipeta de 1 mi . Con el uso de una espátula estéril, los embriones se desprenden del tubo y se transfieren a una placa de medio PHI-B en. una caja petri de 100x15 mm. Los embriones se orientan con su eje hacia abajo sobre la superficie del medio. Las placas con los embriones se cultivan a 20 °C, en la oscuridad, durante tres días. Se puede usar L-cisteína en la fase de cocultivo. Con el vector binario estándar, el medio de cocultivo proporcionado con 100-400 mg/1 de L-cisteína es crítico para recuperar eventos transgénicos estables. 3. Selección de eventos transgénicos putativos: Para cada placa de medio PHI-D en una caja petri de 100x15 mm se transfiere 10 embriones, conservando la orientación y los platos se sellan con parafilm. Las placas se incuban en la oscuridad a 28 °C. Se espera que los eventos putativos de crecimiento activo, como tejido embrionario amarillo pálido, sean visibles en seis a ocho semanas. Los embriones que no producen eventos pueden ser cafés y necróticos y el poco crecimiento.de tejido friable es evidente. El tejido embrionario transgénico putativo se subcultiva en placas de PHI-D fres.co en intervalos de dos a tres semanas, dependiendo del índice de crecimiento. Los eventos se registran. 4. Regeneración de plantas TO : El tejido embrionario propagado en medio PHI-D se subcultiva en medio PHI-E (medio de maduración de embrión somático) , en cajas petri de 100x25 mm y se incuban a 28 °C, a oscuras, hasta que maduran los embriones somáticos, durante aproximadamente diez a dieciocho días. Los embriones somáticos maduros e individuales con escutelo y coleóptilo bien definidos se transfieren al medio de germinación de embriones PHI-F y se incuban a 28 °C en la luz (aproximadamente a 80 µ? de las -lámparas de luz blanca o lámparas fluorescentes equivalentes) . En siete a diez días, las plantas regeneradas de aproximadamente 10 cm de altura se colocan en. macetas en una mezcla hortícola y endurecida con el uso de métodos hortícolas estándar.
Medios para la transformación vegetal: 1. PHI-A: 4 g/1 de sales básales CHU, 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas Eriksson 1000X, 0.5 mg/1 de tiamina HCl , 1.5 mg/1 de 2.4-D, 0.69 g/1 de L- prolina, 68.5 g/1 de sacarosa, 36 g/1 de glucosa, H 5.2. Se agregan 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro) .
PHI-B: PHI-A sin glucosa, 2,4-D incrementado a 2 mg/1, sacarosa reducida a 30 g/1 y suplementado con 0.85 mg/1 de nitrato de plata (esterilizado con filtro), 3.0 g/1 Gelrite®, 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro), pH 5.8. PHI-C: PHI-B sin Gelrite® ni acetosiringona, 2.4-D reducido a 1.5 mg/1 y suplementado con 8.0 g/1 de agar, 0.5 g/1 de amortiguador de ácido 2- [N-morfolino] etano-sulfónico (MES) , 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro) .
PHI-D: PHI-C suplementado con 3 mg/1 de bialafos (esterilizados con filtro) .
PHI-E: 4.3 g/1 de sales de Murash-ige and Skoog (MS) , (Gibco, BRL 11117-074), 0.5 mg/1 de ácido nicotínico, 0.1 mg/1 de tiamina HC1, 0.5 mg/1 de piridoxina HCl, 2.0 mg/1 de glicina, 0.1 g/1 de mió- inositol , 0.5 mg/1 de zeatina (Sigma, cat . núm. Z-0164) , 1 mg/1 de ácido . indol acético (AIA) , 26.4 ug/l de ácido abscísico (ABA), 60 g/1 de sacarosa, 3 mg/1 de bialafos (esterilizados con filtro) , 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro), 8 g/1 de agar, pH 5.6. PHI-F: PHI-E sin zeatina, AIA ni ABA; sacarosa reducida a 40 g/1; reemplazar el agar con 1.5 g/1 de Gelrite®; pH 5.6.
Las plantas pueden regenerarse a partir del callo transgénico al transferir primeramente grupos de tejido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se puede transferir al medio regenerativo (Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990)).
Las plantas transgénicas T0 se pueden regenerar, y se puede determinar su fenotipo. Se pueden recolectar semillas TI.
Además, se puede introducir un constructo de ADN recombinante que contiene un gen de Arabidopsis validado en una línea de maíz endogámica élite, ya sea mediante transformación directa o introgresión de una línea transformada por separado.
Las planta transgénicas, endogámicas o híbridas se pueden someter a experimentos de campo más vigorosos para estudiar el aumento del rendimiento y/o la estabilidad bajo condiciones de limitación de agua y sin limitación de agua.
El análisis de rendimiento posterior se puede realizar para determinar si las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tienen una mejoría en el rendimiento de producción (bajo condiciones de limitación de agua y sin limitación de agua) , cuando se compara con las plantas de control (o referencia) que no contienen el gen guía de Arabidopsis validado. Específicamente, las condiciones de limitación de agua pueden imponerse durante el período de florecimiento y/o de llenado del grano para las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado y las plantas de control. Las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado podrían tener menos pérdida de rendimiento con relación a las plantas de control, por ejemplo, por lo menos 25 % menos de pérdida de rendimiento, bajo condiciones de limitación de agua, o podrían tener un rendimiento aumentado con relación a las plantas de control bajo condiciones sin limitación de agua.
Ejemplo 14A Preparación del Gen Guía de Arabidopsis (At3g44620) Vector de expresión para la transformación del maíz Con el uso de la tecnología GATEWAY® de INVITROGEN™, se llevó a cabo una reacción de recombinación LR con un clon de entrada (PHP30192) y un vector de destino (PHP28647) para crear el plásmido precursor PHP30197. El vector PHP30197 contiene los siguientes casetes de expresión: 1. Promotor de ubiquitina : : terminador moPAT : : Pinll ; cásete que expresa el gen resistente al herbicida PAT usado para la selección durante el proceso de transformación. 2. Promotor LTP2 :: terminador DS-RED2 : : Pinll ; cásete que expresa el gen marcador de color DS-RED usado para clasificar las semillas. 3. Promotor de ubiquitina : : terminador AAt3g44620 : : Pinll ; cásete que sobreexpresa el gen de interés, la proteína tirosina fosfatasa de Arabidopsis truncada de 177 aminoácidos (sec. con núm. de ident . :33) .
Ejemplo 14B Transformación del maíz con el gen guía (At3g44620) de Arabidopsis por medio del uso de Agrobacterium El cásete de expresión de la proteína tirosina fosfatasa truncada de 177 aminoácidos presente en el vector PHP30197 puede introducirse en una línea endogámica de maíz, o una línea de maíz transformable de una línea endogámica de maíz élite, por medio del uso de la transformación mediada por Agrobacterium como se describe en los Ejemplos 12 y 13.
El vector PHP30197 puede electroporarse en la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector PHP10523 (sec. con núm. de ident. :7) para crear el vector PHP30204 cointegrado. El vector co-integrado se forma por la recombinación de los 2 plásmidos, PHP30197 y PHP10523, a través de los sitios de recombinación COS contenidos en cada vector. El vector co-integrado PHP30204 contiene los mismos 3 casetes de expresión como anteriormente (Ejemplo 14A) además de otros genes (TET, TET, TRFA, ORI terminator, CTL, ORI V, VIR Cl, VIR C2, VIR G, VIR B) necesarios para la cepa de Agrobacterium y la transformación mediada por Agrobacterium.
Ejemplo 15 Preparación del vector de destino PHP23236 para la transformación en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint ¦El vector de destino PHP23236 (sec. con núm. de ident.:6) se obtuvo por la transformación de la cepa deAgrobacterium LBA4404 que contiene el plásmido PHP10523 (sec. con núm. de ident.:7) con el plásmido PHP23235 (sec. con núm. de ident.:8) y aislamiento del producto cointegrado resultante. El vector de destino PHP23236, puede usarse en una reacción de recombinación con un clon de entrada, como se describe en el Ejemplo 16, para crear un vector de expresión del maíz para la transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint.
Ejemplo 16 Preparación de plásmidos para la transformación en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint Con el uso del método descrito en el Ejemplo 9, el inserto del clon custom6.pk306. el de Arabidopsis generado por PCR se clonó direccionalmente en el vector de destino PHP23236 (sec. con núm. de ident.:6) para crear un vector de expresión, PHP30853. Este vector de expresión contiene el fragmento PCR de interés, que codifica la proteína tirosina fosfatasa de Arabidopsistruncada de 177 aminoácidos (sec. con núm. de ident.:33), bajo control del promotor UBI y es un vector binario de ADN-T para la transformación mediada por Agrobacterium en el maíz como se describió, pero no se limita a, los ejemplos descritos en la presente. 1 Ejemplo 17 .
Transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint con un gen guía de Arabidopsis validado Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar el gen guía de Arabidopsis o los homólogos correspondientes de otras especies para examinar el fenotipo resultante.
Plantas receptoras : Las células de plantas receptoras pueden ser de una línea de maíz uniforme con un ciclo de vida corto ("ciclo rápido") , de tamaño reducido y de potencial alto de transformación. Típico de estas células vegetales para maíz son las células vegetales de cualquiera de las variedades de líneas de Gaspe Flint (GBF) disponibles al público. Una posible variedad de líneas de plantas candidatas es el híbrido Fl de GBF x QTM (Quick Turnaroünd Maize, una forma disponible al público de Gaspe Flint, seleccionada para el crecimiento bajo condiciones de invernadero) que se describe en Tomes et al., publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0221212. Las plantas transgénicas obtenidas de esta línea son de tal tamaño reducido que se pueden cultivar en macetas de 10 cm (cuatro pulgadas) (1/4 del espacio necesario para una planta de maíz de tamaño normal) y madurar en menos de 2.5 meses. (Tradicionalmente , se requiere 3.5 meses para obtener semillas transgénicas T0 una vez las plantas transgénicas se aclimatan al invernadero.) Otra línea adecuada es una línea haploide doble de X Gaspe Flint de GS3 (una línea altamente transformable) . Otra línea adecuada adicional es una línea endogámica de élite transformable que lleva un transgén que causa floración, estatura reducida o ambas Protocolo de transformación: 4 Se puede usar cualquier método adecuado para introducir los transgenes en las células de maíz que incluye, pero no se limita a, los procedimientos de tipo inoculación por medio del uso de vectores basados en Agrobacterium. La transformación puede realizarse en embriones inmaduros de la planta (objetivo) recipiente.
Cultivo de precisión y seguimiento de las plantas: La población del evento de las plantas transgénicas (T0) resultante de los embriones de maíz transformado se cultiva en un ambiente controlado de invernadero con el uso de un diseño de bloqueo aleatorizado modificado para reducir o eliminar el error ambiental. Un diseño de bloques aleatorizado es una presentación vegetal en donde las plantas experimentales se dividen en grupos (por ejemplo, treinta plantas por grupo) denominados bloques y a cada planta se le asigna aleatoriamente una localidad con el bloque.
Para un grupo de treinta plantas, veinticuatro plantas experimentales transformadas y seis plantas de control (plantas con un fenotipo establecido) (colectivamente, un "grupo de réplicas") se colocan en macetas arregladas en filas (también conocido como un grupo de réplicas o de bloques) en una tabla ubicada dentro del invernadero. A cada planta, control o experimento se asigna aleatoriamente a una localidad con el bloque trazado hacia la localidad de un invernadero físico y único, así como al grupo de réplicas. Múltiples grupos de réplicas de treinta plantas cada una se pueden cultivar en el mismo invernadero en un solo experimento. La presentación (arreglo) de los grupos de réplicas debería determinarse para · minimizar los requerimientos de espacio, así como los efectos ambientales dentro del invernadero. Tal presentación puede denominarse presentación de invernadero comprimido.
Una alternativa a la adición de un grupo de control específico es identificar las plantas transgénicas que no expresan el gen de interés. Una gran variedad de técnicas, tales como TI-RCP, se puede aplicar para analizar cuantitativamente el nivel de expresión del gen introducido.
Las plantas TO que no expresan el transgén se pueden comparar con las que sí lo expresan.
Cada planta en la población del evento se identifica y se monitorea por todo el proceso de evaluación y la información recopilada de esa planta se asocia automáticamente con esa planta, de modo que la información recopilada se puede asociar con el transgén transportado por la planta. Por ejemplo, cada contenedor de plantas puede tener una etiqueta legible para el ordenador (tal como un código de barras del Código Universal de Productos (UPC, por sus siglas en inglés) ) que incluye la información de la identidad de la planta, que a su vez se correlaciona con una localidad del invernadero, de modo que la información obtenida de la planta se puede asociar automáticamente con esa planta.
Alternativamente, se puede usar cualquier sistema de identificación de plantas eficiente y legible para la máquina, tal como códigos de matriz bidimensional o incluso etiquetas de identificación por radiofrecuencia (RFID, por sus siglas en inglés) , en donde la información se recibe y se interpreta por un receptor/procesador de radiofrecuencias. Ver la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0122592, incorporada en la presente descripción como referencia.
Análisis fenotípico con el uso de imágenes tridimensionales : Cada planta del invernadero en la población del evento O, incluso cualquier planta de control, se analiza por las características agronómicas de interés y la información agronómica para cada planta se registra o se almacena de modo que. se asocie con información que la identifique (ver arriba) La confirmación de un fenotipo (efecto de los genes) se puede obtener en la generación TI con un diseño experimental similar al descrito anteriormente.
Las plantas TO se analizan a nivel fenotípico con el uso. de tecnología de imágenes cuantitativa y no destructiva por medio del ciclo de vida completo en invernadero de las plantas para analizar las cepas de interés. Se usa un analizador digital de imágenes para el análisis multidimensional y automático de las plantas completas. La obtención de imágenes se puede realizar adentro del invernadero. Para ver la planta de todos lados se usa dos sistemas de cámara colocados en la parte superior y al lado, así como un aparato para girar la planta. Las imágenes se obtienen desde la parte superior, frontal y a un lado de cada planta. Las tres imágenes juntas proporcionan suficiente información para examinar la biomasa, el tamaño y la morfología de cada planta.
Debido al cambio en el tamaño de las plantas desde el momento en que aparece la primera hoja del suelo hasta el momento en que las plantas se encuentran en el final de su desarrollo, las etapas tempranas del desarrollo de la planta se documentan de la mejor manera con una magnificación mayor desde la parte superior. Esto se puede lograr con el uso de un sistema de lentes de acercamiento motorizado controlado completamente por un programa de imágenes .
En una sola operación de análisis de imágenes, ocurren los siguientes eventos: (1) la planta se lleva dentro del área del analizador, se gira 360 grados de modo que su etiqueta legible para el ordenador se pueda leer y se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse; (2) la imagen lateral se toma y se ingresa en una base de datos; (3) la planta se gira 90 grados y nuevamente se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse y (4) la planta se retira del analizador.
Las plantas se dejan por lo menos seis horas en la oscuridad por un período de veinticuatro horas para que tengan un ciclo normal de día/noche.
Instrumentación de imágenes: Se puede usar cualquier tipo de instrumentación de imágenes, incluso, pero no se limita a, la instrumentación de imágenes digital de espectro de luz comercialmente disponible de LemnaTec GmbH of Wurselen, Alemania. Las imágenes se toman y se analizan con un LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 con un dispositivo de imágenes IT Progressive Sean IEE CCD de 1.3 cm (1/2"). Las cámaras de imágenes pueden estar equipadas con acercamiento motorizado, apertura motorizada y enfoque motorizado. Toda la configuración de la cámara se puede realizar con el uso de el programa LemnaTec. La variación instrumental del analizador de imágenes es menor que aproximadamente 5 % para componentes mayores, y menor que aproximadamente 10 % para componentes menores.
Software : El sistema de análisis de imágenes comprende un programa informático de LemnaTec HTS Bonit para análisis de color y arquitectura y una basa de datos del servidor para almacenar datos desde aproximadamente 500,000 análisis, que incluyen las fechas de análisis. Las imágenes originales y las imágenes analizadas se almacenan juntas para permitir que el usuario reanalice tanto como desee. La base de datos se puede conectar al hardware de imágenes para la . recolección y almacenamiento automático de datos. Una variedad de sistemas de programas comercialmente disponibles (por ejemplo Matlab, y otros) se puede usar para la interpretación cuantitativa de los datos de imágenes, y cualquiera de estos sistemas de programa puede aplicarse al conjunto de datos de imágenes.
Sistema transportador Se puede usar un sistema transportador con un dispositivo giratorio de plantas para transportar las plantas al área de imágenes y girarlas durante la obtención de las imágenes. Por ejemplo, hasta cuatro plantas, cada una con una altura máxima de 1.5 m, se colocan en carros para pasar sobre el sistema transportador circular y por el área de medición de imágenes. En este caso, la huella total de la unidad (analizador de imágenes y lazo del transportador) es de aproximadamente. 5 m x 5 m.
El sistema transportador se puede agrandar para acomodar más plantas a la vez. Las plantas se transportan a lo largo del lazo del transportador hacia el área de imágenes y se analizan hasta 50 segundos por planta. Se toman las vistas de la planta. El sistema transportador, así como el equipo de imágenes, debe poder usarse en condiciones ambientales de invernadero.
Iluminación : Cualquier modo adecuado de iluminación se puede usar para la captación de imágenes. Por ejemplo, se puede usar una luz en la parte superior sobre un fondo negro. Alternativamente, se puede usar una combinación de luz superior y posterior con un fondo blanco. El área iluminada se debe encerrar para asegurar condiciones constantes de iluminación. El alojamiento debe ser mayor que el área de medición de modo que prevalezcan las condiciones constantes de iluminación sin necesidad de abrir, cerrar o puertas. Alternativamente, la iluminación se puede variar para causar la activación, ya sea del transgén (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) , proteína fluorescente roja (RFP, por sus siglas en inglés)) o de fluoróforos endógenos (por ejemplo, clorofila).
Cálculo de la masa en base a imágenes tridimensionales Para el mejor cálculo de la biomasa, las imágenes de la planta deben tomarse por lo menos en vistas de tres ejes, por ejemplo, la . vista superior y dos vistas laterales (lados 1 y 2) . Después estas imágenes se analizan para separar la planta del fondo, de la maceta y de la bolsa de control de polen (si aplica) . El volumen de la planta se puede calcular mediante el cálculo: Volumen = I Área superior / Área del lado 1 ? / Área del lado 2 (vóxeles) (píxeles) (píxeles) * (píxeles) En la ecuación anterior las unidades de volumen y área son "unidades arbitrarias". Las unidades arbitrarias son completamente suficientes para detectar efectos genéticos en el tamaño y crecimiento de las plantas en este sistema ya que lo que se desea es detectar las diferencias (tanto las mayores-positivas como las menores-negativas) del medio experimental o del medio de control. Las unidades arbitrarias de tamaño (por ejemplo, el área) se pueden convertir trivialmente en mediciones físicas mediante la adición de una referencia física para el proceso de imágenes. Por ejemplo, una referencia física de área conocida se puede incluir tanto en el proceso de imágenes superiores como en el de imágenes laterales. En base al área de estas referencias físicas, se puede determinar un factor de conversión para permitir la conversión de pixeles a una unidad de área tal como centímetros cuadrados (cm2) . La referencia física puede o no ser una muestra independiente. Por ejemplo, la maceta, con un diámetro y altura conocidos, podría servir como una referencia física adecuada.
Clasificación de color: La tecnología de imágenes también se puede usar para determinar color de la planta y para asignar los colores de las plantas a varias clases de color. La asignación del color de las imágenes a las clases de color es una característica propia del programa LemnaTec . Con otros sistemas de programas de análisis de imágenes, la clasificación de color se puede determinar por una gran variedad de planteamientos computacionales .
Para la determinación de los parámetros del tamaño y crecimiento de las plantas, sé presenta un esquema de clasificación útil para definir un esquema simple de color que incluye dos o tres degradaciones de verde y, adicionalmente , una clase de- color para clorosis, necrosis y blanqueamiento, si ocurrieran estas condiciones. También se usa una clase de color de fondo que incluye colores en la imagen que no son de plantas (por ejemplo, colores de macetas y suelo) y estos pixeles se excluyen, específicamente, de la determinación del tamaño. Las plantas se analizan bajo iluminación constante controlada de modo que no se pueda cuantificar ningún cambio dentro de una planta con el tiempo o entre plantas o diferentes lotes de plantas (por ejemplo, diferencias temporales).
Además de su utilidad en determinar el crecimiento de la planta, la clasificación de color se puede usar para analizar otros rasgos del componente de producción. Para estos otros rasgos del componente de producción se puede usar esquemas adicionales de la clasificación del color. Por ejemplo, el rasgo conocido como "siempre verde", que se ha asociado con mejorías en la producción, se puede analizar mediante la clasificación de color que separa las degradaciones de verde de las sombras de amarillo y café (que son indicativos de tejidos senescentes). Si se aplica esta clasificación de color a las imágenes tomadas hacia el final del ciclo de vida de las plantas TO o TI, se puede identificar las plantas con cantidades aumentadas de colores de verde en relación con los colores amarillo o café (expresados, por ejemplo, como relación verde/amarillo). Las plantas con una diferencia importante en esta relación verde/amarillo se pueden identificar como transgenes portadores que impactan este rasgo agronómico importante.
El biólogo experto en plantas reconocerá que surgen otros colores de plantas que pueden indicar salud de la planta o respuesta al impacto (por ejemplo, antocianina) y que otros esquemas de clasificación de color pueden proporcionar medidas adicionales de la acción genética en rasgos relacionados con estas respuestas.
Análisis de la arquitectura de la planta: Los transgenes que modifican los parámetros de la arquitectura de la planta también se pueden identificar con el uso de la presente invención, incluso los parámetros tales como altura y anchura máxima, distancias internodales, ángulo entre las hojas y el tallo, cantidad de hojas que surgen de los nodulos y longitud de las hojas. El programa del sistema LemnaTec se puede usar para determinar la arquitectura de la planta de la siguiente manera. La planta se reduce a su arquitectura geométrica principal en una primera etapa de imágenes y, después, en base a esta imagen se puede realizar la identificación parametrizada de los diferentes parámetros de arquitectura. Los transgenes que modifican cualquiera de estos parámetros de arquitectura, ya sea solos o combinados, se pueden identificar mediante la aplicación de los enfoques estadísticos descritos anteriormente.
Fecha de esparcimiento del polen: La fecha de esparcimiento del polen es un parámetro importante de analizar en una planta transformada y se puede determinar mediante la primera aparición en la planta de una flor macho activa. Para encontrar el elemento de la flor macho, el extremo superior del tallo se clasifica por color para detectar anteras amarillas o violeta. Este análisis de la clasificación de color después se usa para definir una flor activa, que a su vez se puede usar para calcular la fecha de esparcimiento del-polen.
Alternativamente, la fecha de esparcimiento del polen y otros atributos de la planta que se detectan visualmente con facilidad (por ejemplo, la fecha de polinización, fecha de la primera seda) pueden ser registrados por el personal responsable del cuidado de la planta. Para maximizar la integridad de los datos y la eficacia del proceso, esta información se monitorea mediante el uso de los mismos códigos de barra usados por el dispositivo de análisis digital de espectro de luz de LemnaTec. Una computadora con lector de códigos de barras, un dispositivo digital personal o una computadora portátil se pueden usar para facilitar la captura de datos al registrar las horas de observación, el identificador vegetal y el operador que captó los datos.
Orientación de las plantas: Las plantas maduras de maíz cultivadas a densidades que se aproximan a la siembra comercial tienen, frecuentemente, una arquitectura plana. Es decir, la planta tiene un lado ancho claramente observable y un lado estrecho. La imagen de la planta está determinada por el lado ancho. Para cada planta se asigna una orientación básica bien definida para obtener la máxima diferencia entre el lado ancho y las imágenes de lado. La imagen superior se usa para determinar el eje principal de la planta y se usa un dispositivo giratorio adicional para posicionar la planta en la orientación adecuada antes de empezar la captación principal de imágenes.
Ejemplo 18A Evaluación de las líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint para la tolerancia a la sequía Las líneas de maíz transgénicas derivadas de Gaspe Flint que contienen el gen candidato pueden tamizarse para la tolerancia al impacto por sequía de la siguiente manera.
Las plantas transgénicas de maíz se someten a condiciones de bastante agua (control) y a condiciones de impacto por sequía. Las plantas transgénicas de maíz se tamizan en la etapa TI o más tarde.
Para el crecimiento de la planta, la mezcla de suelo consiste de ¾ TURFACE®, H SB300 y H arena. Todos los recipientes se llenaron con la misma cantidad de suelo ± 10 gramos. Los recipientes se llevan hasta el 100 % de capacidad de campo ("FC", por sus siglas en inglés) por riego manual . Todas las plantas se mantienen a 60 % FC por medio del uso de una solución nutriente de VN- 20-10-20 (N-P-K) 125 ppm. A través de todo el experimento el pH se monitorea por lo menos tres veces a la semana para cada tabla. Comenzando el día 13 después de la plantación (DAP, por sus siglas en inglés) , el experimento puede dividirse en dos grupos de tratamiento', con bastante agua y con agua reducida. Todas las plantas que comprenden tratamiento con agua reducida se mantienen a 40 % FC mientras que las plantas en el tratamiento con bastante agua se mantienen a 80 % FC . Las plantas con agua reducida crecieron por 10 días bajo condiciones de impacto crónico por sequía (40 % FC) . Todas las plantas se fotografían diariamente a través de todo el período de impacto crónico. Las plantas se muestrearon para el análisis de perfil metabólico al final de período de sequía crónico, 22 DAP. Al concluir el período de impacto crónico, todas las plantas se fotografiaron y se midió la fluorescencia de la clorofila. Las plantas con agua reducida se sometieron a un período de impacto por sequía severo seguido por un período de recuperación, 23 - 31 DAP y 32 - 34 DAP respectivamente.
Durante el impacto severo por sequía, el agua y los nutrientes se retuvieron hasta que las plantas alcanzaron 8 % FC . Al concluir los períodos de impacto severo y de recuperación, todas las plantas se fotografiaron otra vez y se midió la fluorescencia de la clorofila. La probabilidad de una prueba t de Student mayor se calcula para cada medio transgénico en comparación con la media nula apropiada (ya sea una media nula segregante o de constructo) . Un mínimo (P<t) de 0.1 se usó como corte para un resultado estadísticamente significativo.
Ejemplo 18B Transformación y evaluación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint transformadas con PHP30853 Una línea de maíz derivada de Gaspe Flint se transformó a través de Agrojbacterium por medio del uso del ADN plásmido PHP30853, que codifica la. proteína tirosina fosfatasa de Arabidopsis (At-PTPase) . Se evaluaron cinco eventos de transformación para el constructo del plásmido para la tolerancia a la sequía esencialmente como es descrito en el Ejemplo 18A.
Las Tablas 6-7 muestran las variables para cada evento transgénico que fueron significativamente alteradas, en comparación con los nulos segregantes. Se definió un "efecto positivo" como una mejora estadísticamente significativa en la variable para el evento transgénico en relación con el control nulo. Se definió un "efecto negativo" como una mejora estadísticamente significativa en la variable para el control nulo en relación con el evento transgénico. La Tabla 6 presenta el número de variables con un cambio significativo para "eventos individuales transformados con el constructo del ADN del plásmido. La Tabla 7 presenta "el número de eventos para el constructo que mostró un cambio significativo para cada variable individual.
Tabla 6 Número de variables con un cambio significativo* para eventos individuales Transformados con PHP30853 que codifica At-PTPase (At3g4462Q) Agua reducida Bastante agua Evento Efecto Efecto Efecto Efecto positivo negativo positivo negativo EA2391.453. .1. .2 2 1 0 4 EA2391.453. .1. .3 3 2 1 4 EA2391.453. .1. .6 0 1 2 0 EA2391.453. .1. .7 6 0 0 0 EA2486.033.1 .2 0 0 0 0 * Valor P menor o iqual crue 0.1 Tabla 7 Número de eventos transformados con PHP30853 que codifican At-PTPase (At3g44620) con un cambio significativo* para variables individuales Agua reducida Bastante agua Variable Efecto Efecto Efecto Efecto positivo negativo positivo negativo % cambio área inicio crónico - final crónico 0 0 0 1 % cambio área_inicio crónico - final severo 0 0 0 0 % cambio área inicio crónico - recuperación48h 1 0 0 0 fv/fm_final severo 1 0 2 0 fv/fm_recuperación48h 2 0 0 1 fv/fm inicio severo 1 1 0 2 enrollado de las hojas recuperación48h 1 0 0 1 psii_final severo 1 1 1 0 psii_recuperación48h 3 0 0 0 psii inicio severo 0 0 0 2 sgr - r2 > 0.9 1 1 0 0 Peso seco del brote 0 1 0 1 Peso fresco del brote 0 0 0 0 * Valor P menor que o igual a 0.1 Para el constructo evaluado, PHP30853, el valor estadístico asociado con cada variable mejorada se presenta en las Figuras 4A, 4B, 5A y 5B . Un resultado positivo significativo tuvo un valor P menor que o igual a 0.1. Los resultados para las líneas individuales de maíz transformadas se presentan en las Figuras 4A-4B. La evaluación sumaria para el constructo PHP30853 se presenta en las Figuras 5A-5B.
Ejemplo 19A Análisis del rendimiento de las líneas de maíz con el gen guía de Arabidopsis Un constructo de ADN recombinante que contiene un gen de Arabidopsis validado se puede introducir en una línea endogámica de maíz élite por transformación directa o introgresión de una línea transformada por separado.
Las planta transgénicas , endogámicas o híbridas, se pueden someter a experimentos de campo más vigorosos para estudiar el aumento del rendimiento y/o la estabilidad bajo condiciones de bastante agua y de limitación de agua.
Se puede realizar un análisis de rendimiento posterior para determinar si las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tienen una mejoría en el rendimiento de producción bajo condiciones de limitación de agua, cuando se compara con las plantas de control que no contienen el gen guía de Arabidopsis validado. Específicamente, las condiciones de sequía pueden imponerse durante el período de florecimiento y/o de llenado del grano para las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado y las plantas de control. La reducción en la producción se puede medir para ambas. Las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tienen menos pérdida de producción en relación con las plantas de control, por ejemplo, por lo menos 25 % menos pérdida de producción.
El método anterior se puede usar para seleccionar las plantas transgénicas con un rendimiento aumentado, bajo condiciones de limitación de agua y/o condiciones de bastante agua, cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
Ejemplo 19B Análisis del rendimiento de las líneas de maíz transformadas con PHP3Q204 que codifican el gen guía de Arabidopsis AT3G44620 El cásete de expresión del gen de la proteína tirosina fosfatasa presente en el vector PHP30204 se introdujo en una línea de maíz transformable derivada de una línea endogámica de maíz élite como es descrito en el Ejemplo 14A - 14B.
Ocho eventos transgénicos se probaron en campo en el 2008 en Johnston, IA ("JH") , York, NE ("YK") , y Woodland, CA ("WO") . En la localización de Woodland, CA, se impusieron condiciones de sequía durante el florecimiento ("FS"; impacto en el florecimiento) y durante el período de llenado del grano ("GFS"; impacto en el llenado del grano) .. La localización JH se regó bien, y la localización YK experimentó una sequía ligera durante el período de llenado del grano. La diferencia en el rendimiento entre el evento transgénico y el segregante nulo se muestra en bushel/acre ("ganancia de producción") . El significado estadístico se reporta en P<0.1 para una prueba de dos colas... Tres eventos tuvieron efectos positivos en el ambiente FS WO y tres eventos tuvieron efectos positivos en la localización YK; dos de estos fueron comunes en las dos localizaciones. Un evento tuvo un efecto negativo significativo en tres de las cuatro localizaciones. El evento E7587.105.2.1 mostró una ganancia promedio en todas las localizaciones de 15.7 bu/ac y la ganancia promedio para el evento E7587.105.1.35 fue de 12.8 bu/ac.
Tabla 8 Prueba de campo- 2008 del maíz transformado con PHP30204 Ganancia de rendimiento (bu/ac) Evento W0-FS WO-GFS JH YK E7587.105.1. .10 4. 1 -10.7 -9.2 12.0* E7587.105.1. .12 16. 1* -1.8 -4.8 11.0* E7587.105.1. .19 -7 .7 0.6 -5.3 5.3 E7587.105.1.35 16.6* 10.8 14.2 9., 6 E7587 .105 .1 .7 4. 8 0. 9 7.5 2. .2 E7587 .105 .1 .8 -9 .1 -18. 6** -11.6 3 , .0 E7587 .105 .2 .1 15. 5* 4. 9 21.6 20 , .9* E7587 .105 .4 .2 1. 8 -42. * * -31.3** -20 .4 * * * Ganancia significativa en el rendimiento ** Pérdidas siqriificativas en el rendimiento Ejemplo 20A Preparación del vector de expresión del gen guía de la proteína tirosina fosfatasa de maíz para la transformación del maíz El clon cielc.pk001.nl3 codifica una proteína tirosina fosfatasa de maíz (sec. con núm. de ident.:17) designada ZM-TYR-PPASE1. La región codificante de la proteína del clon cielc.pk001.nl3 se introdujo en el vector pENTR/D-TOPO® de INVITROGEN™ para crear el clon de entrada PHP33257 (sec. con núm. de ident . :32) .
Con el uso de la tecnología GATEWAY® de INVITROGEN™ se llevó a cabo una reacción de recombinación LR con un clon de entrada (PHP33257) y un vector de destino (PHP28647) para crear el plásmido precursor. El vector PHP33271 contiene los siguientes casetes de expresión: 1. Promotor de ubiquitina : : terminador moPAT : : Pinll ; cásete que expresa el gen resistente al herbicida PAT usado para la selección durante el proceso de transformación.
Promotor LTP2 : : terminador DS-RED2 : : Pinll ; cásete que expresa el gen marcador de color DS-RED usado para clasificar las semillas.
Promotor de ubiquitina :: ZM-TYR-PPASE1 :: terminador Pinll; cásete que sobreexpresa el gen de interés, proteína tirosina fosfatasa de maíz.
Ejemplo 20B Transformación del maíz con el gen guía de la proteína tirosina fosfatasa del maíz por medio del uso de AgroJbacteriun? El cásete de expresión de ZM-TYR-PPASE1 presente en el vector PHP33271 puede introducirse en una línea endogámica de maíz, o una línea de maíz transformable derivada de una línea endogámica de maíz élite, por medio del uso de la transformación mediada por Agrobacterium, como se describe en los Ejemplos 12 y 13.
El vector PHP33271 puede electroporarse en la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector PHP10523 (sec. con núm. de ident.:7) para crear el vector co-integrado PHP33272. El vector co-integrado se forma por la recombinación de los 2 plásmidos, PHP33271 y PHP10523, a través de los sitios de recombinación COS contenidos en cada vector. El vector co-integrado PHP33272 contiene los mismos 3 casetes de expresión como anteriormente (Ejemplo 14A) además de otros genes (TET, TET, TRFA, ORI terminador, CTL, ORI V, VIR Cl, VIR C2, VIR G, VIR B) necesarios para la cepa de Agrobacterium y la transformación mediada por Agrobacterium.
Ejemplo 21 Preparación de plásmidos de expresión del maíz para la transformación en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint El clon cielc.pk001.nl3 codifica una proteína tirosina fosfatasa de maíz (sec. con núm. de ident.:17) designada ZM-TYR-PPASE1. Con el uso de la tecnología de recombinación GATEWAY® de INVITROGE ™ descrita en el Ejemplo 9, el clon cielc.pk.001.nl3 que codifica la proteína tirosina fosfatasa de maíz homologa se clona direccionalmente en el vector de destino PHP23236 (sec. con núm. de ident.:6) para crear un vector de expresión. Este vector de expresión contiene el ADNc de interés bajo el control del promotor UBI y es un vector binario de ADN-T para la transformación mediada por Agrobacterium en el maíz como se describe, pero no se limita a, los ejemplos descritos en la presente descripción.
Ejemplo 22 Transformación y evaluación de la soya con homólogos de la soya de genes guía validados En base a las búsquedas de homología, uno o varios homólogos candidatos de la soya de genes guías de Arabidopsis validados pueden identificarse y evaluarse para su capacidad de mejorar la tolerancia a la sequía en la soya. La construcción del vector, la transformación de la planta y el análisis fenotípico sería similar al de los ejemplos descritos previamente.
Ejemplo 23 Transformación y evaluación del maíz con homólogos del maíz de genes guía validados En base a las búsquedas de homología, uno o varios homólogos candidatos de la soya de genes guías de Arabidopsis validados pueden identificarse y evaluarse para su capacidad de mejorar la tolerancia a la sequía en el maíz. La construcción del vector, la transformación de la planta y el análisis fenotípico sería similar al de los ejemplos descritos previamente.
Ejemplo 24 Transformación de Arabidopsis con Homólogos de maíz y soya de genes guía validados Homólogos de maíz y soya de genes guía de Arabidopsis validados pueden transformarse en Arabidopsis bajo el control del promotor 35S y evaluados para su capacidad de mejorar la tolerancia a la sequía en Arabidopsis. La construcción del vector, la transformación de la planta y el análisis fenotípico sería similar al de los ejemplos descritos previamente.
Ejemplo 25A Tamizado para la emergencia de las plántulas bajo impacto por temperaturas frías Las semillas de una línea mutante con rotulación de activación de Arabidopsis pueden probarse para la emergencia después del impacto por frío a 4 °C. Cada ensayo puede consistir de una placa de 96 pocilios de medio MS/GELRITE® con una semilla individual en cada pocilio. El medio MS/GELRITE® se preparó como sigue: 0.215 g de la mezcla de sal basal Murashige y Skoog (MS) de PHYTOTECHNOLOGY LABORATORIES™ por 100 mi de medio, pH ajustado a 5.6 con KOH, GELRITE® a 0.6 %; el medio se pone en autoclave por 30 min. La fila "A" de cada placa se llena con semilla silvestre de Arabidopsis thaliana Colombia como control. Las semillas se esterilizan con lejía 20 % (20 % lejía; 0.05 % T EEN® 20) y se colocan en 1 % de agarosa. La semilla esterilizada se cubre con aluminio y se coloca en un refrigerador de pared a 4 °C por tres días. Después del tratamiento frío de estratificación en la oscuridad las semillas se colocan en placas de 96 pocilios y se colocan en una cámara de crecimiento oscura a 4 °C. Cada placa se marca con un número de placa único. Al tercer día después de la colocación en las placas se toman los conteos de germinación por medio del uso de un microscopio de disección. Después, las placas se quitan de 4 °C y se colocan en un banco de laboratorio a 22-25 °C. Las plántulas se dejan crecer con las placas hasta la etapa de dos hojas (3-4 días), y se rocían con herbicida glufosinato (por ejemplo, 0.002 % de herbicida FINALE®) . Después que las plántulas no transgénicas mueren con la atomización del herbicida aproximadamente tres días) , se evalúa el número de semillas transgénicas germinadas con rotulación de activación.
Ejemplo 25B Línea 116089 (At3g44620) con rotulación de activación deArabidopsis Emergencia de las plántulas bajo impacto por temperaturas frías La línea 116089 con rotulación de activación de Arabidopsis se tamizó para la emergencia de las plántulas bajo impacto por temperaturas frías como se describe en el Ejemplo 25A. Los resultados se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9 Emergencia de las plántulas bajo impacto por temperaturas frías Línea ID % Desviación % de semillas Desviación Germinación estándar con rotulación estándar promedio de activación promedio 116089 44 6 44 6 Silvestre 21 4 ___ Los resultados en la Tabla 7 demuestran que la línea 116089 con rotulación de activación de Arabidopsis, que fue previamente seleccionada por tener un fenotipo de tolerancia a la sequía, también demuestra emergencia de las plántulas aumentada bajo impacto por temperaturas frías.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:.
1. Una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, caracterizada porque el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.. :15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y en donde la planta muestra tolerancia a la sequía aumentada cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
2. Una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, caracterizada porque el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con sec. la con núm. de ident.: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y en donde la planta muestra una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
3. La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque además por lo menos una característica agronómica es por lo menos una que se selecciona del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de aminoácidos libres en la toda la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semilla, contenido de proteína en los frutos, contenido de proteína en la semilla, contenido de proteína en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de la plántula y emergencia de la plántula bajo impacto por temperaturas bajas.
4. La planta de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizada porque además la planta muestra la alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones de limitación de agua, con la planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
5. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque además la planta es una planta de maíz o una planta de soya.
6. Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica de la etapa (b) , en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra tolerancia a la sequía aumentada cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
7. Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (d) evaluar la planta progenie para la tolerancia a la sequía en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .
8. Un método para determinar una alteración de por lo menos una característica agronómica en una planta, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un a polipéptido con una secuencia de aminoácido de por lo menos 50 % de identidad de secuencia, en base al método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) determinar si la planta progenie muestra alguna alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además la etapa (d) de determinación comprende determinar si la planta transgénica muestra alguna alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.
10. El método de conformidad con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, caracterizado porque además por lo menos una característica agronómica es por lo menos una que se selecciona del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de aminoácidos libres en la toda la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semilla, contenido de proteína en los frutos, contenido de proteína en la semilla, contenido de proteína en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de la plántula y emergencia de la plántula bajo impacto por temperaturas bajas.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque además la planta es una planta de maíz o una planta de soya.
12. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipétido con actividad de la proteína tirosina fosfatasa, en dodne se basa en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados de alineamiento por pares de KTUPLE=1, GAP PENALTY=3 , INDOW=5 y DIAGONALS SAVED=5, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 90 % de identidad de secuencia cuando se compara con la sec . con núm. de ident.:25, 37, 40 ó 41, o por lo menos 93. % de identidad de secuencia cuando se compara con la sec. con núm. de ident.:2l ó 39, o la secuencia de aminoácidos comprende la sec. con núm. de ident.:17, 34, 43 ó 44; o (b) el complemento completo de la secuencia de nucleótidos de (a) .
13. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la sec . con núm. de ident.:17, 21, 25, 34, 36, 37, 40, 41, 43 ó 44.
14. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además la secuencia de nucleótidos comprende la sec. con núm. de ident.:16, 20, 24, 39 ó 42.
15. Una planta o semilla que comprende un constructo de ADN recombinante , caracterizada porque el constructo de ADN recombinante comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora.
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