MX2011004443A - Plantas con caracteristicas agronomicas alteradas bajo condiciones limitantes de nitrogeno y constructos y metodos relacionados que involucran genes que codifican polipeptidos tolerantes al bajo contenido de nitrogeno (lnt6) y homologos de estos. - Google Patents

Abstract

Los polinucleótidos y polipéptidos aislados y los constructos de ADN recombinante particularmente útiles para alterar las características agronómicas de las plantas bajo condiciones limitantes de nitrógeno, las composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de ADN recombinante y los métodos que usan estos constructos de ADN recombina.nte. El constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operativamente a un promotor funcional en una planta, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido LNT6 o un homólogo de éste.

Description

PLANTAS CON CARACTERISTICAS AGRONOMICAS ALTERADAS BAJO CONDICIONES LIMITANTES DE NITROGENO Y CONSTRUCTOS Y METODOS RELACIONADOS QUE INVOLUCRAN GENES QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS TOLERANTES AL BAJO CONTENIDO DE NITROGENO (LNT6) Y HOMOLOGOS DE ESTOS CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención se relaciona con el cultivo y la genética de plantas y, particularmente, con constructos de ADN recombinante útiles en las plantas para conferir eficacia en el uso de nitrógeno y/o tolerancia a condiciones limitantes de nitrógeno.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los agentes estresantes abióticos limitan significativamente la producción de cultivos a nivel mundial. Acumulativamente, se cree que estos factores son los responsables de una reducción promedio de 70 % de la producción agrícola. Las plantas son sésiles y deben adaptarse a las condiciones ambientales predominantes de su entorno. Esto ha causado en su desarrollo una gran plasticidad en la regulación, morfogénesis y metabolismo de los genes. Las estrategias de adaptación y defensa requieren la activación de genes que codifiquen proteínas importantes en la aclimatación o defensa ante los distintos agentes estresantes.

La absorción de nitrógeno por las plantas desempeña una Ref . :218385 función importante en su crecimiento (Galláis et al., <J. Esp. Bot. 55 (396) : 295-306 (2004)). Las plantas sintetizan los aminoácidos del nitrógeno inorgánico en su entorno. Por consiguiente, la fertilización con nitrógeno ha sido una potente herramienta para incrementar la producción de plantas cultivadas, tales como el maíz y el frijol de soya. Los agricultores de hoy en día desean reducir el uso del fertilizante con nitrógeno para evitar la contaminación por nitratos y mantener el suficiente margen de ganancias . Si es posible incrementar la capacidad de asimilación de nitrógeno de una planta, entonces también se puede esperar un incremento en el crecimiento vegetal y la producción. En resumen, se prefiere las variedades de plantas que tienen una mejor eficacia del uso de nitrógeno (NUE) .

Se puede usar la rotulación de la activación para identificar genes con la capacidad de afectar un rasgo. Este método se ha usado en especies modelo de plantas Arabidopsis thaliana (Weigel et al., Plant Physiol. 122:1003-1013 (2000) ) . Las inserciones de elementos potenciadores de la transcripción pueden, en forma dominante, activar y/o aumentar la expresión de genes endógenos cercanos . Este método se puede usar para identificar genes de interés para un rasgo en particular (por ejemplo, la eficacia del uso de nitrógeno en una planta) , genes que al colocarlos en un organismo como un transgen pueden alterar ese rasgo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye : En una modalidad, una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec . con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47 y en donde la planta muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

En otra modalidad, una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47, y en donde la planta muestra una alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante. Opcionalmente, la planta muestra la alteración de por lo menos la única característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con la planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

En otra modalidad la por lo menos única característica agronómica se selecciona del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de aminoácidos libres en la planta completa, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semillas, contenido proteico en los frutos, contenido proteico en las semillas, contenido proteico en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de las plántulas y emergencia de las plántulas bajo estrés por temperatura baja.

En otra modalidad el por lo menos único rasgo agronómico es la producción o biomasa y la alteración es un incremento.

En otra modalidad la presente invención incluye cualquiera de las plantas de la presente invención, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de: maíz, frijol de soya, cañóla, arroz, trigo, cebada y sorgo.

En otra modalidad, la presente invención incluye la semilla de cualquiera de las plantas de la presente invención, en donde la semilla comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47, y en donde una planta producida a partir de esa semilla muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno, cierta alteración de por lo menos una característica agronómica o ambas, en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

En otra modalidad, un método para incrementar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operati amente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; (b) regenerar una planta transgénica de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) obtener una planta progenie a partir de la planta transgénica de la etapa (b) , en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno, en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

En otra modalidad, un método para evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; (c) obtener una planta progenie a partir de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) evaluar la planta progenie para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

En otra modalidad, un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; (b) regenerar una planta transgenica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; (c) obtener una planta progenie a partir de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) determinar si la planta progenie muestra alguna alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante. Opcionalmente, esta última etapa (d) comprende determinar si la planta transgénica muestra una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

En otra modalidad, la por lo menos única característica agronómica se selecciona del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de aminoácidos libres en la planta completa, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semillas, contenido proteico en los frutos, contenido proteico en las semillas, contenido proteico en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de las plántulas y emergencia de las plántulas bajo estrés por temperatura baja.

En otra modalidad el por lo menos único rasgo agronómico es la producción o biomasa y la alteración es un incremento .

En otra modalidad la presente invención incluye cualquiera de los métodos de la presente invención, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de: maíz, frijol de soya, cañóla, arroz, trigo, cebada y sorgo .

En otra modalidad la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident 20, 24, 26, 28, 37 o 40 tiene por lo menos 71 % , 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % , 81 q. o / 82 -o / 83 'o 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % o. , 90 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % O 100 % de identidad de secuencias en base al método de alineamiento Clustal V o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento y la secuencia de nucleótidos contienen la misma cantidad de nucleótidos y son 100 % complementarios. El polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 20, 24, 26, 28, 37 o 40 y la secuencia de nucleótidos puede comprender la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 19, 23, 25, 27, 36 o 39.

En otra modalidad la presente invención trata sobre un constructo de ADN recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención unidos operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, y una célula, una planta y una semilla que comprende el constructo de ADN recombinante . La célula podría ser eucariota, por ejemplo, una célula de una planta, un insecto o una levadura, o procariota, por ejemplo, una bacteria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se comprenderá con mayor facilidad a partir de la siguiente descripción detallada y de las figuras acompañantes, así como del listado de secuencias que forman parte de la presente solicitud.

La Fig. 1 muestra un esquema del constructo de rotulación de la activación de pHSbarENDs2 que se usa para elaborar las poblaciones de Arabidopsis (sec. con núm. de ident . :1) .

La Fig. 2 muestra un esquema del vector pD0NR™Zeo (sec. con núm. de ident. :2), vector donante GATEWAY®. El sitio attPl se encuentra en los nucleótidos 570-801; el sitio attP2 se encuentra en los nucleótidos 2754-2985 (cadena complementaria) .

La Fig. 3 muestra un esquema del vector pD0NR™221 (sec. con núm. de ident. :3), vector donante GATEWAY®. El sitio attPl se encuentra en los nucleótidos 570-801; el sitio attP2 se encuentra en los nucleótidos 2754-2985 (cadena complementaria) .

La Fig. 4 muestra un esquema del vector pBC-amarillo (sec. con nútn. de ident.:4), un vector objetivo para usar en la creación de los vectores de expresión para Arabidopsis. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 11276-11399 (cadena complementaria) ; El sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 9695-9819 (cadena complementaria) .

La Fig. 5 muestra un esquema del vector PHP27840 (sec. con núm. de ident. :5) , un vector objetivo para usar en la creación de los vectores de expresión para frijol de soya. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 7310-7434; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 8890-9014.

La Fig. 6 muestra un esquema del vector PHP23236 (sec. con núm. de ident. :6), un vector objetivo para usar en la creación de los vectores de expresión para líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 2006-2130; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 2899-3023.

La Fig. 7 muestra un esquema del vector PHP10523 (sec. con núm. de ident. :7) , un ADN de plásmidos presente en la cepa LBA4404 de Agrobacterium (Komari et al., Plant J. 10:165-174 (1996); núm. de ident. general del NCBI 59797027) .

La Fig. 8 muestra un esquema del vector PHP23235 (sec. con núm. de ident. :8) , un vector que se usa para construir el vector objetivo PHP23236.

La Fig. 9 muestra un esquema del vector PHP20234 (sec. con núm. de ident. :9) .

La Fig. 10 muestra un esquema del vector objetivo PHP22655 (sec. con núm. de ident. :10).

La Fig. 11 muestra un patrón cuadriculado típico para cinco líneas (marcadas de 1 a 5 - once individuos para cada línea) , más el control silvestre Cl (nueve individuos) , que se usa en. los ensayos.

La Fig. 12 muestra un gráfico que representa el efecto de las diversas concentraciones de nitrato potásico sobre el color de la planta, tal como se determinó mediante análisis de imágenes. La respuesta de la cubeta de color verde (tono 50 a 66) a la dosificación de nitrato demuestra que esta cubeta se puede usar como indicador de la asimilación del nitrógeno .

La Fig. 13 muestra el medio de crecimiento que se usó para los cultivos semi -hidropónicos de maíz en el Ej emplo 18.

La Fig. 14 muestra una tabla que muestra los datos relacionados con el efecto de las distintas concentraciones de nitrato sobre el crecimiento y desarrollo de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint en el Ejemplo 18.

Las Figs . 15A-15G muestran el alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos de longitud total del polipéptido LNT6 de Arabidopsis thaliana (sec. con núm. de ident. : 30) y las secs . con núms . de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 31, 33, 37 y 38 de los homólogos de LNT6.

La Fig. 16 muestra un cuadro del porcentaje de identidad de secuencias y los valores de divergencia para cada par de secuencias de aminoácidos que se exponen en las Figs . 15A-15G.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS Las descripciones y la lista de secuencias adjunta a la presente descripción cumplen con las reglas que rigen las descripciones de las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos en las solicitudes de patente, tal como se exponen en 37 C.F.R. §1.821-1.825. El listado de secuencias contiene el código de una letra para los caracteres de las secuencias nucleótidas y los códigos de tres letras para las secuencias de aminoácidos, tal como se define de conformidad con los estándares de la IUPAC-IUBMB descritos en Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) y en Biochemical J. 219 (2):345-373 (1984) que se incorporan en la presente descripción como referencia. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen con las reglas que se describen en el Título 37 del C.F.R., §1.822.

La Tabla 1 enumera ciertos polipéptidos que se describen en la presente invención, la designación de los clones de ADNc que comprenden los fragmentos de ácido nucleico que codifican polipéptidos que representan todos o una porción sustancial de estos polipéptidos, así como el identificador correspondiente (sec. con núm. de ident . ) tal como se usa en el listado de secuencias adjunto.

Tabla 1 Proteínas tolerantes al bajo contenido de nitrógeno (LNT) La sec. con núm. de ident.: 1 es la secuencia de nucleótidos del vector de rotulación de la activación pHSbarENDs2.

La sec. con núm. de ident.: 2 es la secuencia de nucleótidos del constructo pDONR™Zeo (Fig. 2) .

La sec. con núm. de ident.: 3 es la secuencia de nucleótidos del constructo pDONR™221 (Fig. 3) .

La sec. con núm. de ident.: 4 es la secuencia de nucleótidos del vector pBC-amarillo (Fig. 4) .

La sec. con núm. de ident.: 5 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP27840 (Fig. 5) .

La sec. con núm. de ident.: 6 es la secuencia de nucleótidos del vector objetivo PHP23236 (Fig. 6) .

La sec. con núm. de ident.: 7 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP10523 (Fig. 7) .

La sec. con núm. de ident.: 8 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP23235 (Fig. 8) .

La sec. con núm. de ident.: 9 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP20234 (Fig. 9) .

La sec. con núm. de ident.: 10 es la secuencia de nucleótidos del vector objetivo PHP22655 (Fig. 10) .

La sec. con núm. de ident.: 11 es la secuencia de nucleótidos del policonector que se usa para sustituir el sitio de restricción Pací en la posición 5775 de pHSbarENDs2.

La sec. con núm. de ident.: 12 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia attBl .

La sec . con núm. de ident.:13 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia attB2.

La sec. con núm. de ident.:14 es la secuencia de nucleótidos del clon de entrada PHP23112.

La sec. con núm. de ident . : 15 es el cebador codificante VC062 en el Ejemplo 5.

La sec. con núm. de ident.: 16 es el cebador no codificante VC063 en el Ejemplo 5.

Secs . con núms . de ident.: 17-28 (véase la Tabla 1) . La sec. con núm. de ident. : 29 es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la "proteína desconocida" de Arabidopsis thaliana (LNT6) (At2g06005; núm. de ident. general del NCBI 42568965) .

La sec. con núm. de ident.: 30 es la secuencia de aminoácidos de la "proteína desconocida" de Arabidopsis thaliana (LNT6) (At2g06005; núm. de ident. general del NCBI 18396221) .

La sec. con núm. de ident. : 31 es la secuencia de aminoácidos de la "proteína hipotética" de Oryza sativa con el núm. de ident. general del NCBI 115449029.

La sec. con núm. de ident. : 32 es la secuencia de aminoácidos de la "proteína hipotética" de Oryza sativa con el núm. de ident. general del NCBI 125541346.

La sec. con núm. de ident.: 33 es la secuencia de aminoácidos de la "proteína desconocida" de Populus trichocarpa con el núm. de ident . general del NCBI 118482875.

La sec. con núm. de ident. : 34 es la secuencia de nucleótidos del cebador codificante attB At2g06005-5 ' .

La sec. con núm. de ident. : 35 es la secuencia de nucleótidos del cebador no codificante attB At2g06005-3 ' .

Secs . con núms . de ident.: 36-37 (véase la Tabla 1) .

La sec. con núm. de ident. : 38 es la secuencia de aminoácidos de la "proteína hipotética" de Sorghum bicolor con el núm. de ident. general del NCBI 242063244.

Secs. con núms. de ident. : 39-40 (véase la Tabla 1) .

La sec. con núm. de ident.: 1 corresponde al núm. GI de NCBI 42567994, que es la secuencia de aminoácidos de la "proteína desconocida" de Arabidopsis thaliana codificada por At5g20580.1.

La sec. con núm. de ident.: 42 corresponde al núm. GI de NCBI 223544760, que es la secuencia de aminoácidos de la "proteína hipotética" de Ricinus communis.

La sec. con núm. de ident.: 43 corresponde al núm. GI de NCBI 157342535, que es la secuencia de aminoácidos del "producto proteico no identificado" de Vitis vinifera.

La sec. con núm. de ident.: 44 corresponde al núm. GI de NCBI 148907370, que es la secuencia de aminoácidos de la "proteína no identificada" de Picea sitchensis .

La sec. con núm. de ident.: 45 corresponde al núm. GI de NCBI 168067690, que es la secuencia de aminoácidos de la "proteína pronosticada" de Physcomitrella patens subsp. patents .

La sec. con núm. de ident . : 46 corresponde al núm. GI de NCBI 242063244, que es la secuencia de aminoácidos de la "proteína hipotética" Sb04g034890 de Sorghum bicolor.

La sec. con núm. de ident.: 47 corresponde a la secuencia de aminoácidos de una proteína pronosticada de Selaginella moellendorffi (jgi | Selmol | 114771 | e_gwl .49.312.1 ; JGI = Joint Genome Institute) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción de cada referencia indicada en la presente descripción se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen la referencia del plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una pluralidad de tales plantas, la referencia a "una célula" incluye una o más células y los equivalentes de éstas que conoce un experimentado en la técnica, etc.

Como se usa en la presente descripción: La frase "condiciones limitantes de nitrógeno" se refiere a las condiciones en donde la cantidad de nitrógeno total disponible (por ejemplo, de nitratos, amoníaco u otras fuentes conocidas de nitrógeno) no es suficiente para mantener el óptimo crecimiento y desarrollo de la planta. Una persona con experiencia en la técnica sabe en qué condiciones el nitrógeno total disponible es suficiente para mantener el óptimo crecimiento y desarrollo de la planta. Una persona con experiencia en la técnica sabe qué constituye una cantidad suficiente de nitrógeno total disponible y qué constituye suelos, medios y entradas de fertilizantes para proporcionar nitrógeno a las plantas. Las condiciones limitantes de nitrógeno varían según varios factores, que incluyen, pero no se limitan a, la planta en particular y las condiciones ambientales.

"Int6" se refiere al locus genético At2g06005 de Arabidopsis tha.lxa.na. (sec. con núm. de ident . : 29). "LNT6" se refiere a la proteína (sec. con núm. de ident. :30) codificada por la sec. con núm. de ident.: 29.

La frase "similar a lnt6" se refiere a homólogos de nucleótidos de distintas especies, tales como maíz y frijol de soya, del locus "lnt6" de Arabidopsis thaliana, At2g06005 (sec. con núm. de ident.: 29), e incluye, pero no se limita a, cualquiera de las secuencias de nucleótidos de las secs . con núms. de ident.: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 36 y 39.

La frase "similar a lnt6" se refiere a homólogos de proteínas de distintas especies, tales como maíz y frijol de soya, de "LNT6" de Arabidopsis thaliana (sec. con núm. de ident.: 30) e incluye, pero no se limita a, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las secs . con núms . de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 y 47.

Los términos "monocotiledónea" y "planta monocotiledónea" se usan indistintamente en la presente descripción. Una monocotiledónea de la presente invención incluye la Gramineae.

Los términos "dicotiledónea" y "planta dicotiledónea" se usan indistintamente en la presente descripción. Una dicotiledónea de la presente invención incluye las siguientes familias: Brassicaceae , Leguminosae y Solanaceae.

Los términos "complemento total" y "complemento de longitud total" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un complemento de una secuencia de nucleótidos específica, en donde el complemento y la secuencia de nucleótidos consisten de la misma cantidad de nucleótidos y son 100 % complementarios.

Una "etiqueta de secuencia expresada" ("EST") es una secuencia de ADN derivada de una genoteca de ADNc y, por lo tanto, es una secuencia que ha sido transcrita. Una EST se obtiene, típicamente, mediante un paso de secuenciamiento único de un inserto de ADNc. La secuencia de todo el inserto de ADNc se denomina "secuencia de inserto completo" ("FIS", por sus siglas en inglés) . Una secuencia de "cóntigos" es una secuencia integrada de dos o más secuencias que se pueden seleccionar de, pero no se limitan a, el grupo que consiste de una EST, una FIS y una secuencia de PCR. Una secuencia que codifica una proteína entera o funcional se denomina "secuencia completa de genes" ("CGS", por sus siglas en inglés) y puede derivarse de una FIS o un contigo.

Las "características agronómicas" son parámetros medibles que incluyen, pero no se limitan a, verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos en la planta completa, contenido de aminoácidos libres en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semillas, contenido proteico total en la planta, contenido proteico en los frutos, contenido proteico en las semillas, contenido proteico en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, resistencia a la ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas y longitud de las espigas, vigor temprano de las plántulas y emergencia de las plántulas bajo estrés por temperatura baja.

El "índice de cosecha" se refiere al peso de los granos dividido por el peso total de la planta.

La "tolerancia al estrés por nitrógeno" es un rasgo de una planta y se refiere a la capacidad que tiene la planta para sobrevivir bajo condiciones limitantes de nitrógeno.

La "tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno" de una planta se determina con relación a una referencia o planta control y significa que la tolerancia al estrés por nitrógeno de la planta se incrementa en cualquier cantidad o medida en comparación con la tolerancia al estrés por nitrógeno de la referencia o planta control .

Una "planta tolerante al estrés por nitrógeno" es una planta que muestra tolerancia al estrés por nitrógeno. Una planta tolerante al estrés por nitrógeno puede ser una planta que muestra un incremento en por lo menos una característica agronómica con relación a una planta control bajo condiciones limitantes de nitrógeno.

Las "condiciones ambientales" se refieren a las condiciones bajo las cuales se cultiva la planta, tales como la disponibilidad de agua, disponibilidad de nutrientes (por ejemplo, nitrógeno) o la presencia de insectos o enfermedades.

"Transgénico" se refiere a cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de la planta o planta, cuyo genoma se ha alterado mediante la presencia de un ácido nucleico heterólogo, tal como un constructo de ADN recombinante, que incluye los eventos transgénicos iniciales así como los creados mediante cruces sexuales o propagación asexual a partir del evento transgénico inicial. Como se usa en la presente, el término "transgénico" no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo de vegetales o por eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante , transformación bacterial no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

El término "genoma" , como se aplica a las células vegetales, abarca no únicamente el ADN cromosómico que se encuentra dentro del núcleo, sino también el ADN de los organelos que se encuentra en los componentes subcelulares (por ejemplo, mitocondrial , plástido) de la célula.

"Planta" incluye lo referente a plantas completas, órganos de plantas, tejidos de plantas, semillas, células vegetales y progenie de éstas. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas.

"Progenie" comprende cualquier generación subsiguiente de una planta.

"Planta transgénica" incluye lo referente a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado de manera estable dentro del genoma de tal manera que el polinucleótido se transmita a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterologo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un constructo de ADN recombinante .

"Heteróloga" , con respecto a una secuencia, se refiere a una secuencia que se origina de una especie foránea o de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma natural en composición y/o locus genómico por intervención humana intencional .

Los términos "polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico" , "secuencia de nucleótidos" o "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que, opcionalmente, contiene bases nucleótidas sintéticas, no naturales o alteradas. Se hace referencia a los nucleótidos (que, usualmente, se encuentran en su forma 51 -monofosfato) mediante su designación con una sola letra, de la siguiente manera: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para el ARN o ADN, respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A o 6) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A, C o T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido.

Los términos "polipéptido" , "péptido" , "secuencia de aminoácidos" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos, en donde uno o más residuos de aminoácidos es o son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido" , "péptido" , "secuencia de aminoácidos" y "proteína" también son inclusivos de modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, unión lipídica, sulfación, gamacarboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación del ADP .

"ARN mensajero (ARNm) " se refiere al AR sin intrones y que se puede traducir en proteína por medio de la célula.

"ADNc" se refiere a un ADN complementario a y sintetizado a partir de una plantilla de ARNm con el uso de la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o se puede convertir a la forma bicatenaria con el uso del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I .

Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado postransicionalmente ; es decir, de donde se eliminó cualquier pre o propéptido presente en el producto primario de traducción.

Proteína "precursora" se refiere al producto principal de la traducción de ARNm; es decir, que aún tienen pre y propéptidos presentes. Los pre y propéptidos pueden ser, pero no se limitan a, señales intracelulares de localización.

"Aislados" se refiere a materiales tales como moléculas de ácidos nucleicos y/o proteínas sustancialmente libres o eliminados de algún modo de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con los materiales en un ambiente de origen natural. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar a partir de una célula huésped donde se originan naturalmente. Se puede usar métodos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos para los expertos para obtener polinucleótidos aislados. El término también abarca polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.

"Recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de una secuencia separados de alguna manera, por ejemplo, por síntesis química o manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. "Recombinante" también incluye lo referente a una célula o vector que ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una célula derivada de una célula ya modificada, pero no abarca la alteración de la célula o vector mediante eventos de origen natural (por ejemplo, mutación espontánea, transíormación/transducción/transposición natural) tales como los ocurridos sin intervención humana intencional .

"Constructo de ADÑ recombinante" se refiere a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que, normalmente, no se encuentran juntos en la naturaleza. Por lo tanto, un constructo de ??? recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a como se encuentran en la naturaleza.

Los términos "clon de entrada" y "vector de entrada" se usan indistintamente en la presente descripción.

Los términos "secuencias reguladoras" y "elementos reguladores" se usan indistintamente y se refieren a las secuencias de nucleótidos localizadas corriente arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro o corriente abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante y que afectan la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del AEN o la traducción de la secuencia codificante relacionada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

"Promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico con la capacidad de controlar la transcripción de otro fragmento de ácido nucleico.

"Promotor funcional en una planta" es un promotor con la capacidad de controlar la transcripción en las células vegetales, se origine o no de una célula vegetal.

Los términos "promotor específico para el tejido" y "promotor preferido del tej ido" se usan indistintamente y se refieren a un promotor que se expresa predominantemente, pero no necesariamente, exclusivamente en un tejido u órgano, pero que también se puede expresar en una célula específica.

"Promotor regulado por el desarrollo" se refiere a un promotor cuya actividad está determinada por los eventos del desarrollo .

"Operativamente unido" se refiere a la relación de los fragmentos de ácido nucleico en un solo fragmento, de tal manera que la función de uno esté regulada por la función del otro. Por ejemplo, un promotor está operativamen e unido con un fragmento de ácido nucleico cuando puede regular la transcripción de ese fragmento de ácido nucleico.

La "expresión" se refiere a la producción de un producto funcional. Por ejemplo, la expresión de un fragmento de ácido nucleico se puede referir a la transcripción del fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, la transcripción resultante en ARNm o ARN funcional) y/o la traducción de ARNm en una proteína precursora o madura.

"Fenotipo" se refiere a las características perceptibles de una célula u organismo.

"Introducido", en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) en una célula, significa "transfección" , "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica, en donde el fragmento de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plástido o mitocondrial) , convertido en un replicón autónomo o expresado transitoriamente (por ejemplo, AR m transfectado) .

Una "célula transformada" es cualquier célula en la cual se ha introducido un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) .

"Transformación" , como se usa en la presente descripción, se refiere tanto a la transformación estable como a la transitoria.

"Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un genoma de un organismo huésped que produce una herencia genéticamente estable. Una vez transformado de manera estable, el fragmento de ácido nucleico se integra establemente en el genoma del organismo huésped y cualquier generación posterior.

"Transformación transitoria" se refiere a la introducción de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u orgánulo que contiene ADN, " de un organismo huésped que resulta en una expresión genética sin herencia genéticamente estable.

El "alelo" es una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus determinado en un cromosoma.

Cuando los alelos presentes en un locus dado en un par de cromosomas homólogos en una planta diploide son iguales, esa planta es homocigota para ese locus. Si los alelos presentes en un locus específico en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide difieren, esa planta es heterocigota para ese locus. Si un transgen está presente en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide, esa planta es hemicigota para ese locus.

Un "péptido de tránsito al cloroplasto" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al cloroplasto u otros tipos de plástidos presentes en la célula en la cual se elabora la proteína. "Secuencia de tránsito al cloroplasto" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y que dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53) . Si la proteína se va a dirigir a una vacuola, también se puede agregar una señal de dirección vacuolar (supra) o si se va a dirigir al retículo endoplasmático, se puede agregar una señal de retención del retículo endoplasmático (supra) . Si la proteína se va a dirigir al núcleo, cualquier péptido señal presente se debe eliminar e incluir en su lugar una señal de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632) . Un "péptido de señal mitocondrial" es una secuencia de aminoácidos que dirige una proteína precursora hacia la mitocondria (Zhang and Glaser (2002) Trends Plant Sci 7:14-21) .

Las alineaciones de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad se pueden determinar mediante varios métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas que incluyen, pero no se limitan a, el programa Megalign® del paquete integrado para bioinformática LASERGENE® (ADNSTAR® Inc., Madison, WI) . A menos que se indique de otra manera, el alineamiento múltiple de las secuencias proporcionadas en la presente descripción se realizó con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)) con los parámetros predeterminados (PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10) . Los parámetros predeterminados para las alineaciones en pares y para el cálculo del porcentaje de identidad de secuencias de proteínas con el método Clustal V son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. Para ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS= . Después del alineamiento de las secuencias con el programa Clustal V es posible obtener valores de "porcentaje de identidad" y "divergencia" al observar la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa; A menos que se indique de otra manera los porcentajes de identidad y divergencias proporcionadas y reivindicadas en la presente se calcularon de esta manera.

Las técnicas estándar de ADN recombinante y clonación molecular usadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen más detalladamente en Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Clonación molecular: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook") .

Ahora, en cuanto a las modalidades: Las modalidades incluyen polinucleótidos y polipéptidos aislados, constructos de ADN recombinante, composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de ADN recombinante y métodos que usan estos constructos de ADN recombinante .

Polinucleótidos y polipéptidos aislados La presente invención incluye los siguientes polinucleótidos y polipéptidos aislados: Un polinucleótido aislado que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 O, %, 52 %, 53 Q, ¾ f 54 %, 55 9- %/ 56 %, 57 "o / 58 59 %, 60 % 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 69 o. 70 % 71 o. o. %, 72 O. 73 74 %, 75 ¦s / 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % 81 %, 82 %, 83 O. "o / 84 %, 85 o 86 %, 87 %, 88 %, 89 o, o / 90 % 91 . 93 Q ° 92 o . o / 94 o. , 95 96 %, 97 98 99 % o 100 de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec . con núm. de ident. : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) , en donde el complemento total y la secuencia de ácido nucleico de (i) consiste de la misma cantidad de nucleótidos y son 100 % complementarios. Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante (incluso constructos de ADN supresor) de la presente invención. El polipéptido es, preferentemente, un LNT6 o una proteína similar a LN 6. polipéptido aislado que tiene una secuencia aminoácidos de por lo menos 50 % , 51 % , 52 %, 53 %, 54 %, 55 % o. 56 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 % , 63 %, 64 %, 65 % 66 o "O 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 ¾ , 74 %, 75 % 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 o 82 %, 83 84 %, 85 % 86 %, 87 %, 88 % , 89 o O ¾ í 90 %, 91 92 %, 93 Q. ° / 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, ei base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident. : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47. El polipéptido es, preferentemente, un LNT6 o una proteína similar a LNT6.

Un polinucleótido aislado que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 53 %, 54 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 64 65 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 71 72 73 74 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 ¾, 80 %, 81 %, 82 83 %, 84 85 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 91 %, 92 93 %, 94 %, 95 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec . con núm. de ident.: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36 o 39; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) . Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante (incluso las constructos de ADN supresor) de la presente invención. El polinucleótido aislado codifica, preferentemente, un LNT6 o una proteína similar a LNT6.

Constructos de ADN recombinante y constructos de ADN supresor En un aspecto, la presente invención incluye constructos de ADN recombinante (incluso constructos de ADN supresor) .

En una modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 % , 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 66 % , 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 ¾, 72 %, 73 %, 74 75 %, 76 Q, %, 77 o. "¾ / 78 ° 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 86 9 O- / 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 %, 97 o ¦o / 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias , base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) .

En otra modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido comprende (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 O, O ~o / 51 . "6 / 52 o 0 / 53 %, 54 %, 55 h, 56 %, 57 %, 58 %, 59 O. 60 Q o, %, 61 , o. "o / 62 0 / 63 o ° / 64 %, 65 ° / 66 %, 67 ° / 68 %, 69 o, o r 70 g, o "o / 71 %, 72 ° / 73 ?_ ¾, ¾ / 74 ¾ / 75 o. 'o / 76 ¾. / 77 Q, "o / 78 %, 79 %, 80 %, 81 O. ¾ / 82 O. %, 83 ° 1 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %/ 90 %, 91 %, 92 %, 93 o "8 , 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36 o 39; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) .

Las Figs . 15A-15G muestran el alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos de las secs . con núms . de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 y 47. El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó con el uso del programa MEGALIGN® del paquete integrado para bioinformática LASERGENE® (ADNSTAR® Inc., Madison, WI) ; particularmente, con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989) ) con los parámetros predeterminados de alineamiento múltiple de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10 y los parámetros predeterminados de alineamiento en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5.

La Fig. 16 es una tabla del porcentaje de identidad de secuencias y los valores de divergencia para cada par de secuencias de aminoácidos que se exponen en las Figs . 15A-15G.

En otra modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un LNT6 o una proteína similar a LN 6.

En otro aspecto la presente invención incluye constructos de ADN supresor.

Un constructo de ADN supresor puede comprender por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a (a) toda o una parte de: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 60 %, 61 62 %, 63 %, 64 %, 65 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 72 %, 73 %, 74 %, 75 76 %, 77 %, 78 %, 79 %/ 80 %, 81 82 %, 83 %, 84 %, 85 86 %, 87 %, 88 %, 89 90 %, 91 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 %, 97 %, 98 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident. : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; o (b) una región derivada de la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés; la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 51 %, 52 %, 53 %, 54 %/ 55 %/ 56 57 %, 58 %, 59 %, 60 61 62 %, 63 %, 64 %, 65 66 67 %, 68 %, 69 2- / 70 %, 71 72 73 74 q, 75 76 %, 77 %, 78 79 %, 80 81 %, 82 83 %, 84 %, 85 %, 86 87 %, 88 89 90 %, 91 %, 92 93 94 %, 95 96 "Ó , 97 %, 98 % 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la totalidad o parte de un cadena codificante o de una cadena no codificante de donde se deriva la región y en donde el gen objetivo de interés codifica un LWT6 o una proteína similar a LNT6; o (c) la totalidad o parte de: (i) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 ° f 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %/ 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 87 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident . : 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36 o 39; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (c) (i) . El constructo de ADN supresor puede comprender un constructo cosupresor, constructo no codificante, constructo supresor de virus, constructo supresor de horquillas, constructo supresor de tallo-lazo, constructo productor de ARN bicatenario, constructo de ARNi o constructo de ARN pequeño (por ejemplo, un constructo de ARNip o un constructo de miARN) .

Se entiende, tal como apreciarán aquellos con experiencia en la técnica, que la invención abarca otras secuencias además de las secuencias ilustrativas específicas. En la técnica se conocen bien las alteraciones de un fragmento de ácido nucleico que resultan en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado pero que no afectan la propiedades funcionales del polipéptido codificado. Por ejemplo, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como la glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como la valina, la leucina o la isoleucina. De modo similar, también se puede esperar cambios que resultan en la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico para ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, para producir un producto funcionalmente equivalente. Además, no se espera cambios de nucleótidos que resultan en la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de polipéptido para alterar la actividad del polipéptido. Cada una de las modificaciones propuestas permanece dentro de la rutina de la técnica, como lo hace la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados .

Un "constructo de ADN supresor" es un constructo de ADN recombinante que al transformarse o integrarse de manera estable en el genoma de la planta resulta en el "silenciamiento" de un gen objetivo en la planta. El gen objetivo puede ser endógeno o transgénico a la planta. "Silenciamiento" , como se usa en la presente descripción con respecto al gen objetivo se refiere, generalmente, a los niveles de supresión del AR m o proteína/enzima expresada por el gen objetivo y/o el nivel de la actividad enzimática o de la funcionalidad proteica. Los términos "de supresión", "supresor" y "de silenciamiento" , que se usan indistintamente en la presente descripción, incluyen aminorar, reducir, bajar, disminuir, inhibir, eliminar o evitar. El "silenciamiento" o "silenciamiento génico" no especifica el mecanismo y es inclusivo y no se limita a métodos basados en no codificante, cosupresión, supresión de virus, supresión de horquillas, supresión de tallo-lazo, ARNi y métodos basados en ARN pequeños .

Un constructo de ADN supresor puede comprender una región derivada de un gen objetivo de interés y puede comprender la totalidad o parte de la secuencia de ácido nucleico del secuenciador (o cadena no codificante) del gen objetivo de interés. Según el método que se use, la región puede ser 100 % idéntica o menos idéntica (por ejemplo, por lo menos 50 %, 51 %, 52 % 53 % 54 %, 55 o. / 56 %, 57 %, 58 o "o 1 59 %, 60 % , 61 %, 62 "o / 63 % , 64 %, 65 g. 66 %, 67 %, 68 o.

"O 69 %/ 70 %, 71 %, 72 %, 73 O, o , 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 q. ° / 83 % , 84 %, 85 %, 86 O, ° / 87 %, 88 o o. "o , 89 %, 90 %, 91 %, 92 ¾o. , 93 o , 94 %, 95 o. "o f 96 %/ 97 %, 98 % o 99 % idéntica) a la totalidad o parte del secuenciador (o cadena no codificante) de gen de interés.

Los constructos de ADN supresor se conocen bien en la técnica, se construyen fácilmente una vez se seleccione el gen objetivo de interés e incluyen, pero no se limitan a, constructos cosupresores , constructos no codificantes, constructos de supresión viral, constructos supresores de horquilla, constructos supresores de tallo-lazo, constructos productores de ARN bicatenario y, más generalmente, constructos de ARNi (ARN de interferencia) y constructos de ARN pequeños tales como constructos de ARNip (ARN cortos de interferencia) y constructos de miAR (microAR ) .

"Inhibición no codificante" se refiere a la producción de transcritos de ARN no codificante con la capacidad de suprimir la expresión del gen objetivo o producto genético. "ARN no codificante" se refiere a un transcrito de ARN complementario a todo o a una parte de un transcrito primario o ARNm objetivo y que bloquea la expresión de un fragmento aislado de ácido nucleico objetivo (patente de los Estados Unidos núm. 5,107,065). La complementariedad de un ARN no codificante puede ser con cualquier porción del transcrito genético específico, es decir, en la secuencia 5' no codificante, secuencia 3' no codificante, intrones o secuencia codificante.

"Cosupresión" se refiere a la producción de transcritos de ARN codificante con la capacidad de suprimir la expresión del gen objetivo o producto genético. ARN "codificante" se refiere al transcrito de ARN que incluye el ARNm y que se puede traducir en proteina dentro de una célula o in v tro. Anteriormente, se había diseñado constructos cosupresores en plantas con un enfoque en la sobreexpresion de una secuencia de ácido nucleico con homología a un ARNm nativo, en la orientación codificante, que produce la reducción de todo el ARN con homología a la secuencia sobreexpresada (véase Vaucheret et al., Plant J. 16:651-659 (1998) y Gura, Nature 404 : 804-808 (2000) ) .

Otra variación describe el uso de secuencias virales en plantas para dirigir la supresión del ARNm proximal que codifica secuencias (publicación del PCT núm. O 98/36083 publicada el 20 de agosto de 1998) .

El interferencia por AR se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en los animales mediado por ARN cortos de interferencia (ARNip) (Fire et al., Nature 391:806 (1998)). El proceso correspondiente en plantas se denomina, comúnmente, silenciamiento génico postranscripcional (SGPT) o silenciamiento de ARN, así como represión en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado en términos evolutivos que se usa para evitar la expresión de genes extraños; este proceso lo comparten, comúnmente, diversidad de flora y phyla (Fire et al., Trends Genet . 15:358 (1999)).

Los ARN pequeños juegan un papel importante en el control de la expresión genética. La regulación de varios procesos del desarrollo, que incluyen la floración, está controlada por ARN pequeños. Ahora es posible crear cambios en la expresión genética de los genes vegetales mediante el uso de constructos transgénicos que producen ARN pequeños en la planta.

Al parecer, los ARN pequeños funcionan por apareamiento de bases con ARN complementario o con secuencias objetivo de ADN. Al unirse con ARN, los ARN pequeños accionan ya sea el clivaje del ARN o la inhibición de traducción de la secuencia objetivo. Al unirse con secuencias objetivo de ADN, se piensa que los AR pequeños pueden mediar la metilación de ADN de la secuencia objetivo. La consecuencia de estos eventos, independientemente del mecanismo específico, es que la expresión genética se inhibe.

Los microARN (miARN) son ARN no codificantes de aproximadamente 19 a aproximadamente 24 nucleótidos (nt) de longitud que se han identificado tanto en animales como en plantas (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 (2001), Lagos-Quintana et al., Curr.Biol. 12:735-739 (2002); Lau et al., Science 294:858-862 (2001); Lee and Ambros, Science 294:862-864 (2001); Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 (2002); Mourelatos et al., Genes. Dev. 16:720-728 (2002); Park et al., Curr. Biol . 12:1484-1495 (2002); Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 (2002)). Estos se procesan a partir de transcritos precursores más largos que en tamaño se encuentran en el intervalo de aproximadamente 70 a 200 nt y estos transcritos precursores tienen la capacidad de formar estructuras de horquilla estables.

Se cree que los microARN (miARN) regulan los genes objetivo al unirse a las secuencias complementarias localizadas en los transcritos producidos por estos genes. Parece probable que los miARN puedan ingresar por lo menos en dos vías de regulación de genes objetivo: (1) inhibición de la traducción; y (2) clivaje de ARN. Los microARN que entran en la vía de clivaje de ARN son análogos a los ARN cortos de interferencia de 21-25 nt (ARNip) generados durante la interferencia por ARN (ARNi) en animales y silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) en plantas y, probablemente, se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que sea similar o idéntico al observado en la ARNi . Secuencias reguladoras : Un constructo de ADN recombinante (incluso un constructo de ADN supresor) de la presente invención puede comprender por lo menos una secuencia reguladora.

Una secuencia reguladora puede ser un promotor.

Se puede usar una gran variedad de promotores en los constructos de ADN recombinante (y los constructos de ADN supresor) de la presente invención. Los promotores se pueden seleccionar en base al resultado deseado y pueden incluir los constitutivos, específicos del tejido, inducibles u otros promotores para la expresión en el organismo huésped.

Comúnmente, los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos celulares la mayoría de veces se denominan "promotores constitutivos" .

La expresión constitutiva de alto nivel del gen candidato bajo control del promotor 35S o UBI puede (o no) tener efectos pleiotrópicos, aunque la eficacia del gen candidato se puede determinar cuando lo acciona un promotor constitutivo. El uso de promotores específicos del tejido y/o del estrés puede eliminar los efectos no deseados pero retener la capacidad de mejorar la tolerancia al nitrógeno. Este tipo de efecto se ha observado en Arabidopsis para la tolerancia a la sequía y el frío (Kasuga et al., Nature Biotechnol . 17:287-91 (1999)).

Los promotores constitutivos adecuados para usarse en una célula huésped vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor del núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. WO 99/43838 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,072,050; el promotor del núcleo CaMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)); actina del arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) y Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al., Theor. Appl . Genet. 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); promotor ALS (patente núm. 5,659,026) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los mencionados en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611.

Al seleccionar un promotor para su uso en los métodos de la invención, puede que se prefiera un promotor específico para el tejido o regulado por el desarrollo.

Un promotor específico para el tej ido o regulado por el desarrollo es una secuencia de ADN que regula la expresión de una secuencia de ADN selectivamente en las células/tejidos de una planta crítico para el desarrollo de la panoja, las semillas o ambos y que limita la expresión de la secuencia de ADN al período de desarrollo de la panoja o de maduración de las semillas en la planta. En los métodos de la presente invención se puede usar cualquier promotor identificable que cause la expresión temporal y espacial deseada.

Los promotores específicos de las semillas o embriones y que pueden ser útiles en la invención incluyen el inhibidor de tripsina unitz del frijol de soya (Kti3, Jofuku and Goldberg, Plant Cell 1:1079-1093 (1989)), patatina (tubérculos de papa) (Rocha-Sosa, M. , et al . , EMBO J. 8:23-29 (1989)), convicilina, vicilina y legumina (cotiledones de chícharos) (Rerie, W.G., et al., Mol. Gen. Genet . 259:149-157 (1991); Newbigin, E.J., et al., Planta 180:461-470 (1990); Higgins, T.J.V., et al., Plant. Mol. Biol . 11:683-695 (1988)), zeína (endosperma de maíz) (Schemthaner, J.P., et al., EMBO J. 7:1249-1255 (1988)), faseolina (cotiledones del frijol) (Segupta-Gopalan, C, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos 82:3320-3324 (1995) ) , fitohemaglutinina (cotiledones del frijol) (Voelker, T.et al., EMBO J. 6:3571-3577 (1987)), B-conglicinina y glicinina (cotiledón de frijol de soya) (Chen, Z-L, et al., EMBO J. 7:297-302 (1988)), glutelina (endosperma de arroz), hordeína (endosperma de cebada) (Marris, C, et al., Plant Mol. Biol. 10:359-366 (1988)), glutenina y gliadina (endosperma de trigo) (Colot, V., et al., EMBO J. 6:3559-3564 (1987)) y esporamina (raíz tuberosa del camote) (Hattori, . , et al., Plant Mol. Biol . 14:595-604 (1990)). Los promotores de genes específicos de semillas unidos operativamente a regiones codificantes heterólogas en constructos de genes quiméricos mantienen su estructura de expresión temporal y espacial en las plantas transgénicas . Tales ejemplos incluyen el promotor genético de proteínas de almacenamiento de semillas 2S de Arabidopsis thaliana para expresar péptidos de enquefalina en semillas de Arabidopsis y Brassica napus (Vanderkerckhove et al., Bio/Technology 7:L929-932 (1989)), promotores de lectina de frijol y de beta-faseolina de frijol para expresar luciferasa (Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57 (1989)) y promotores de glutenina de trigo para expresar cloranfenicol acetiltransferasa (Colot et al., EMBO J. 6:3559- 3564 (1987)).

Los promotores inducibles expresan selectivamente una secuencia de ADN operativamente unida en respuesta de un estímulo endógeno o exógeno, por ejemplo, por compuestos químicos (inductores químicos) o en respuesta de señales ambientales, hormonales, químicas y/o del desarrollo. Los promotores inducibles o regulados incluyen, por ejemplo, los promotores regulados por luz, calor, estrés, inundación o sequía, fitohormonas , lesiones, o sustancias químicas, tales como etanol, jasmonato, ácido salicílico o sustancias protectoras .

Los promotores para usar en la presente invención incluyen los siguientes: 1) el promotor RD29A inducible por el estrés (Kasuga et al., Nature Biotechnol . 17:287-91 (1999)); 2) el promotor de la cebada, B22E; la expresión de B22E es específica para el pedículo de granos de maíz en desarrollo ("Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers" , Klemsdal et al., Mol. Gen. Genet. 228 (1/2) : 9-16 (1991)); y 3) el promotor de maíz, Zag2 ("Identification and molecular characterization of ZAG1, the homólogos de maíz of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS", Schmidt et al., Plant Cell 5 (7) -.129-131 (1993); "Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize", Theissen et al.. Gene 156 (2) : 155-166 (1995); número de registro del GenBank del C IB X80206) ) . Los transcritos Zag2 se pueden detectar cinco días antes de la polinización hasta siete a ocho días después de la polinización ("DAP") y dirigen la expresión en el carpelo de inflorescencias hembra en desarrollo y Ciml que es específico para el núcleo de granos de maíz en desarrollo. El transcrito Ciml se detecta cuatro a cinco días antes de la polinización hasta seis a ocho DAP. Otros promotores útiles incluyen cualquier promotor que pueda derivarse de un gen cuya expresión esté asociada maternalmente con cogollos hembra en desarrollo.

Los promotores adicionales para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en plantas son los promotores específicos de tallo. Tales promotores específicos de tallo incluyen el promotor S2A de alfalfa (número de registro del GenBank EF030816; Abrahams et al., Plant Mol. Biol . 27:513-528 (1995)) y el promotor S2B (número de registro del GenBank EF030817) y similares, incorporados en la presente descripción como referencia.

Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores distintos que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos sintéticos de ADN.

Los promotores para usar en la presente invención pueden incluir: RIP2, mLIP15, ZmCORl, Rabl7, CaMV 35S, RD29A, B22E, Zag2, SAM sintetasa, ubiquitina, CaMV 19S, nos, Adh, sacarosa sintasa, R-alelo, los promotores preferidos del tejido vascular S2A (número de registro del GenBank EF030816) y S2B (número de registro del GenBank EF030817) y el promotor constitutivo G0S2 de Zea mays. Otros promotores incluyen promotores preferidos de la raíz, tales como el promotor NAS2 de maíz, el promotor Cyclo de maíz (publicación de los Estados Unidos núm. 2006/0156439, publicada el 13 de julio de 2006) , el promotor ROOTMET2 de maíz (patente núm. O 2005/063998, publicada el 14 de julio de 2005), el promotor CR1BIO (patente núm. WO 2006/055487, publicada el 26 de mayo de 2006), el CRWAQ81 (patente núm. WO 2005/035770, publicada el 21 de abril de 2005) y el promotor ZRP2.47 de maíz (núm. de registro del NCBI U38790; núm. de IG del NCBI 1063664) .

Los constructos de ADN recombinante (y constructos de ADN supresor) de la presente invención también pueden incluir otras secuencias reguladoras que incluyen, pero no se limitan a, secuencias líderes de traducción, secuencias de intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. En otra modalidad de la presente invención, un constructo de ADN recombinante de la presente invención también comprende un potenciador o silenciador.

Se puede agregar una secuencia de intrones a la región 5' no traducida, la región codificante de proteínas o la región 3' no traducida para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol . La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en los constructos de expresión, tanto de plantas como de animales, ha demostrado incrementar la expresión genética tanto en los niveles de ARNm como en los de proteína hasta 1000 veces (Buchman and Berg, Mol. Cell Biol . 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987)).

Se puede seleccionar cualquier planta para la identificación de secuencias reguladoras y genes para usar en los constructos de ADN recombinante de la presente invención. Los ejemplos de plantas objetivo adecuadas para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, alfalfa, manzana, chabacano, Arabidopsis, alcachofa, rúgula, espárragos, aguacate, banana, cebada, frijoles, betabel, zarzamora, arándano vaccinio, brócoli, coles de bruselas, col, cañóla, cantalupo, zanahoria, mandioca, semilla de ricino, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, cítricos, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, arándano, pepino, abeto Douglas, beren ena, endibia, escarola, eucalipto, hinojo, higo, ajo, calabaza, uva, toronja, melón de pulpa verde, jicama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, linaza, maíz, mango, melón, champiñones, nectarina, nuez, avena, palma aceitera, aceite de colza, guingombó, aceituna, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, chícharos, melocotón, cacahuate, pera, chile, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada roja, álamo, papa, calabaza, membrillo, pino de Monterrey, achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino palustre, frijol de soya, espinaca, calabacín, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, camote, árbol de ámbar, mandarina, té, tabaco, tomate, tritical, césped, nabo, una vid, sandía, trigo, ñames y calabacín.

Composiciones Una composición de la presente invención es una planta que comprende en su genoma cualquiera de los constructos de ADN recombinante (que incluyen cualquiera de los constructos de ADN supresor) de la presente invención (tales como cualquiera de los constructos mencionados anteriormente) . Las composiciones también incluyen cualquier progenie de la planta y cualquier semilla obtenida de la planta o su progenie, en donde la progenie o semilla comprende dentro de su genoma el constructo de ADN recombinante o constructo de ADN supresor) . La progenie incluye generaciones posteriores obtenidas mediante la autopolinización o cruce de una planta. La progenie también incluye híbridas y endogámicas.

En cultivos propagados por semillas híbridas, las plantas transgénicas maduras pueden autopolinizarse para producir una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semillas que contienen el constructo recientemente introducido de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) . Estas semillas se pueden cultivar para producir plantas que muestren cierta característica agronómica (por ejemplo, una característica agronómica aumentada, opcionalmente, bajo condiciones limitantes de nitrógeno) o se pueden usar en un programa de cultivo para producir semillas híbridas que se puedan cultivar para producir plantas que muestren tal característica agronómica aumentada. Las semillas pueden ser semillas de maíz.

La planta puede ser monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya, como una planta de maíz, una planta híbrida de maíz o una planta endogámica de maíz. La planta también puede ser girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada o mijo.

El constructo de ADN recombinante está integrado de manera estable en el genoma de la planta.

Las modalidades incluyen, pero no se limitan a, las siguientes : 1. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 51 %, 52 Q, %, 53 "o / 54 %, 55 %, 56 o. "o / 57 %, 58 o, ° 59 %, 60 %, 61 O, "o / 62 %, 63 %, 64 o.

O / 65 %, 66 67 o, o O i 68 o, o / 69 o. 70 o, o / 71 %, 72 O 73 %, 74 %/ 75 O j 76 77 %, 78 o, o / 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 o, "O y 84 %, 85 %, 86 o. 87 % , 88 %, 89 %, 90 o_ %, 91 0 i 92 %, 93 %/ 94 %, 95 %, 96 , 97 %, 98 o. o 99 % O 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47 y en donde la planta muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante . La planta también puede mostrar cierta alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con la planta control .

Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende : (a) un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (b) un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elemento regulador que se une operativamente : (i) la totalidad o parte de: (A) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de- identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 5 44, 45, 46 o 47, o (B) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (b) (i) (A) ; o (ii) una región derivada de la totalidad o parte de una cadena codificante o de lo una cadena no codificante de un gen objetivo de interés; la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de 15 alineamiento Clustal V, en comparación con la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de donde se deriva la región y en donde el gen objetivo de 20 interés codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LN 6 , y caracterizada porque la planta muestra alguna alteración de por lo menos una característica agronómica en 25 comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LNT6 y en donde la planta muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante . La planta también puede mostrar cierta alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con la planta control . El polipéptido LNT6 puede ser de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja o Glycine tomentella.

Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LNT6, y en donde la planta muestra cierta alteración de por lo menos una característica agronómica bajo condiciones limitantes de nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante . El polipéptido LNT6 puede ser de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja o Glycine tomentella. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 55 , 56 %, 57 %, 58 , 59 , 60 , 61 %, 62 ° / 63 % , 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 69 %, 70 o / 71 % , 72 %, 73 %, 74 %/ 75 76 77 78 %, 79 , 80 , 81 %, 82 83 84 %, 85 86 %, 87 "o , 88 89 %, 90 %, 91 *o j 92 %, 93 %, 94 %, 95 % , 96 97 %, 98 % 99 "5 o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47 y en donde la planta muestra cierta alteración de por lo menos una característica agronómica bajo condiciones limitantes de nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante . Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elemento regulador unido operativamente a una región derivada de la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés; la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 51 %, 52 53 , 54 55 56 %, 57 58 %, 59 %, 60 61 % 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 69 % 70 %, 71 72 %, 73 %, 74 75 76 %, 77 78 %, 79 80 %, 81 %, 82 83 %, 84 85 % r 86 %, 87 88 %, 89 90 91 %, 92 93 ¾ 94 95 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de donde se deriva la región y en donde el gen objetivo de interés codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LNT6, y en donde la planta muestra cierta alteración de por lo menos una característica agronómica bajo condiciones limitantes de nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elemento regulador unido operativamente a la totalidad o parte de: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 54 %, 55 %, 56 57 58 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 , 64 65 %, 66 67 %, 68 , 69 70 71 72 %, 73 %/ 74 %, 75 %, 76 %, 77 78 %, 79 %/ 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 *S / 85 86 87 %, 88 , 89 90 %, 91 %, 92 93 94 95 % 96 %, 97 98 99 % o 100 de identidad de secuencias , en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (b) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a) y en donde la planta muestra cierta alteración de por lo menos una característica agronómica bajo condiciones limitantes de nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor. 8. Cualquier progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-7, cualquier semilla de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-7, cualquier semilla de la progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1- 7 y las células de cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1- 7, así como la progenie de éstas.

En cualquiera de las modalidades 1-8 mencionadas anteriormente o cualquier otra modalidad de la presente invención, el constructo de ADN recombinante o constructo de ADN supresor) puede comprender por lo menos un promotor funcional en una planta como una secuencia reguladora.

En cualquiera de las modalidades 1-8 mencionadas anteriormente o cualquier otra modalidad de la presente invención, la alteración de por lo menos una característica agronómica es un incremento o una disminución.

En cualquiera de las modalidades 1-8 mencionadas anteriormente o cualquier otra modalidad de la presente invención, la por lo menos una característica agronómica se puede seleccionar del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido total de aminoácidos libres en la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semillas, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido proteico total en la planta, contenido proteico en los frutos, contenido proteico en las semillas, contenido proteico en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, longitud de las espigas, vigor temprano de las plántulas y emergencia de las plántulas bajo estrés por temperatura baja. Por ejemplo, la alteración de por lo menos una característica agronómica puede ser un incremento en la producción, verdor o biomasa.

En cualquiera de las modalidades 1-8 mencionadas anteriormente o cualquier otra modalidad de la presente invención, la planta puede mostrar cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones de estrés por nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombxnante o constructo de ADN supresor) .

Una persona con experiencia en la técnica está familiarizada con los protocolos para simular las condiciones de nitrógeno, ya sean limitantes o no limitantes, y para evaluar las plantas que se han sometido a condiciones de nitrógeno simuladas o de origen natural, ya sean limitantes o no limitantes. Por ejemplo, se puede simular las condiciones de nitrógeno al proporcionar a las plantas menos nitrógeno de lo que requieren normalmente o nada de nitrógeno durante cierto período de tiempo y es posible evaluar tales plantas con la búsqueda de diferencias en las características agronómicas, por ejemplo, cambios en la condición fisiológica y/o física, que incluyen (pero no se limitan a) vigor, crecimiento, tamaño o longitud de la raíz o, particularmente, color de las hojas o tamaño de área de las hojas. Otras técnicas para evaluar tales plantas incluyen la medición de la fluorescencia clorofílica, velocidades fotosintéticas , crecimiento radicular o índices de intercambio gaseoso.

Los ejemplos a continuación describen algunos protocolos representativos y técnicas para simular las condiciones limitantes de nitrógeno y/o evaluar las plantas bajo tales condiciones.

También se puede evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno mediante la capacidad de una planta para mantener la producción suficiente (por lo menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %/ 83 *o r 84 %, 85 %, 86 o. -° , 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 o. ~° 1 95 %, 96 %/ 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de producción) en las pruebas de campo bajo condiciones con alto o bajo contenido de nitrógeno simuladas o de origen natural (por ejemplo, la medición de la producción sustancialmente equivalente bajo condiciones con alto o bajo contenido de nitrógeno en comparación con las condiciones normales de nitrógeno o mediante la medición de menos pérdida de producción bajo condiciones con alto o bajo contenido de nitrógeno en comparación con una planta control o de referencia) .

Una persona con experiencia en la técnica reconocería fácilmente una planta control o de referencia adecuada para evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica en cualquier modalidad de la presente invención en la cual se usa una planta control (por ejemplo, las composiciones o métodos tal como se describe en la presente invención) . Por ejemplo, a manera de ilustraciones no limitantes: 1. La progenie de una planta transformada que es hemicigota con respecto a un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) , de tal forma que la progenie se segrega en plantas ya sea que comprendan o no el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la progenie que comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) se determinará, típicamente, con relación a la progenie que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) (es decir, la progenie que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) es la planta control o de referencia) . La introgresión de un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) en una línea endogámica, tal como maíz, o en una variedad, tal como frijol de soya: la línea introgresa se mide, típicamente, en relación a la línea endogámica progenitora o de variedad (es decir, la línea endogámica progenitora o de variedad es la planta control o de referencia) . Dos líneas híbridas, en donde la primera línea híbrida se produce a partir de dos líneas endogámicas progenitoras y la segunda línea híbrida se produce a partir de las mismas dos líneas endogámicas progenitoras, excepto que una de las líneas endogámicas progenitoras contiene un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la segunda linea híbrida se determinaría, típicamente, con relación a la primera línea híbrida (es decir, la primera línea híbrida es la planta control o de referencia) . Una planta que comprende un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la planta se puede evaluar o determinar con relación a una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) aunque por otro lado, con antecedentes genéticos comparables con la planta (por ejemplo, compartir por lo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias del material genético nuclear en comparación con la planta que comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) ) . Existen varias técnicas de laboratorio disponibles para el análisis, comparación y caracterización de los antecedentes genéticos de la planta; Entre estas están la electroforésis de isoenzimas, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD, por sus siglas en inglés) , reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar (AP-PCR, por sus siglas en inglés) , amplificación de la huella de ADN (DAF, por sus siglas en inglés) , regiones amplificadas caracterizadas por las secuencias (SCAR, por sus siglas en inglés) , polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP®, por sus siglas en inglés) y repeticiones de secuencias simples (SSR, por sus siglas en inglés) también denominadas microsatélites .

Además, un experto en la técnica reconocería fácilmente que una planta control o de referencia adecuada que se usa al evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica no incluiría una planta que haya sido seleccionada anteriormente, por mutagénesis o transformación, para la característica agronómica o fenotipo deseado.

Métodos Los métodos incluyen, pero no se limitan a, los métodos para aumentar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta, los métodos para evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta, los métodos para alterar cierta característica agronómica en una planta, los métodos para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta y los métodos para producir semillas. La planta puede ser monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya. La planta también puede ser girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada o mijo. La semilla puede ser una semilla de maíz o de frijol de soya, por ejemplo, una semilla híbrida de maíz o semilla endogámica de maíz.

Los métodos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes : Un método para transformar una célula; el método comprende transformar una célula con cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención. También se incluye la célula transformada mediante este método. En modalidades particulares la célula es eucariota, por ejemplo, una célula de levadura, insecto o planta, o procariota, por ejemplo, una bacteria.

Un método para producir una planta transgénica; el método comprende transformar una célula vegetal con cualquiera de los polinucleótidos aislados o constructos de ADN recombinante de la presente invención y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada. La presente invención también está dirigida a la planta transgénica producida mediante este método y la semilla transgénica obtenida de esta planta transgénica.

Un método para aislar un polipéptido de la invención de una célula o medio de cultivo de la célula, en donde la célula comprende un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido de la invención unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, y en donde la célula huésped transformada se cultiva bajo las condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante.

Un método para alterar el nivel de expresión de un polipéptido de la invención en una célula huésped; el método comprende: (a) transformar una célula huésped con un constructo de ADN recombinante de la presente invención; y (b) cultivar la célula huésped transformada bajo las condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante, en donde la expresión del constructo de ADN recombinante resulta en la producción de niveles alterados del polipéptido de la invención en la célula huésped transformada.

Un método para incrementar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 51 52 , 53 54 55 56 %, 57 %, 58 59 %, 60 61 %, 62 , 63 64 % 65 %, 66 67 %, 68 69 %, 70 %, 71 %, 72 % , 73 %, 74 % 75 %, 76 %, 77 %, 78 79 %, 80 %, 81 %, 82 % , 83 %, 84 % 85 %, 86 %, 87 %, 88 89 90 %, 91 %, 92 % , 93 %, 94 % 95 *o / 96 o / 97 % 98 % 99 o 100 de iden idad d< secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec . con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47/ y (b) regenerar una planta transgénica de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método puede comprender, además: (c) obtener una planta progenie a partir de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y muestra tolerancia aumentada al nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para incrementar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %° 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 % , 58 ° / 59 %, 60 %/ 61 o, ° / 62 %, 63 %, 64 %, 65 % , 66 %, 67 % , 68 %, 69 %, 70 %, 71 q. o / 72 g, *« / 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 % , 78 o. "o / 79 %, 80 %, 81 o. "o / 82 g, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87.%, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 O 47 o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, además: (c) obtener una planta progenie a partir de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y muestra tolerancia aumentada al nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para incrementar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a una región derivada de la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés, la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 ° / 64 %, 65 66 %, 67 g, ¾ / 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 76 %, 77 ¾ / 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 % z 85 86 %, 87 ° / 88 % , 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LNT6; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, además: (c) obtener una planta progenie a partir de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y muestra tolerancia aumentada al nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleó ido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta), en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 54 %, 55 %, 56 %, 57 9- ° / 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 % 63 o / 64 %, 65 % , 66 %, 67 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 % 73 ° / 74 %, 75 %, 76 / 77 *° / 78 %, 79 %/ 80 81 %, 82 83 %, 84 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 "o 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % 99 9- o 100 % df identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; (b) regenerar una planta transgénica de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) evaluar la planta transgénica para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método puede comprender, además: (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (e) evaluar la planta progenie para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 O, %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 O. ° / 59 0 , 60 %, 61 %, 62 %, 63 O %, 64 %, 65 o / 66 o, "o / 67 %, 68 o, ¾ / 69 %, 70 ° f 71 o, ° / 72 %, 73 %, 74 %, 75 q. o / 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 % , 83 %, 84 %, 85 Q. o / 86 o "o / 87 %, 88 Q, / 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 Q, ° / 96 Q.

"S / 97 %, 98 % / 99 % o 100 o o de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec . con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; (b) regenerar una planta transgénica de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) evaluar la planta transgénica para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, además: (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) evaluar la planta progenie para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a una región derivada de la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés; la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 52 %, 53 %, 54 %, 55 % 56 %, 57 o, ¾ / 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 *o 66 %, 67 o % 9- ¾ / 68 , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 ° f 74 %, 75 ¾ 76 %, 77 o, *¾ / 78 %, 79 %, 80 %, 81 g, ¾ / 82 % 7 83 Q. ¾ í 84 %, 85 % 86 %, 87 %, 88 "o 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 94 %, 95 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias , base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LNT6; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) evaluar la planta transgénica para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, además: (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) evaluar la planta progenie para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) evaluar la planta progenie para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un método para evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 ¾, 53 p„ *S / 54 %, 55 o» "¾ / 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 o, 64 S- q. 0 / 65 %, 66 *¾ / 67 %, 68 %, 69 %, 70 Q, 0 / 71 *« / 72 %, 73 o. "6 / 74 o. 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 o, "o f 84 o. ° / 85 %, 86 "o / 87 ¾, 88 %, 89 o "o / 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 97 %, 98 %, 99 % O 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d) evaluar la planta progenie para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para evaluar la tolerancia al estrés por nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a una región derivada de la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés; la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 ¦o / 54 % 55 %, 56 %, 57 %, 58 % , 59 o / 60 %, 61 o, 62 %, 63 %, 64 %/ 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 o, 72 %, 73 74 %/ 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 81 %, 82 %, 83 %, 84 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 92 %, 93 94 o. 95 %, 96 %, 97 % , 98 %, 99 % o 100 de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LNT6; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie a partir de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d) evaluar la planta progenie para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 g, 58 %, 59 %, 60 ° / 61 %, 62 %, 63 %, 64 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 71 g, %, 72 73 %, 74 75 %, 76 %, 77 78 ¾ / 79 %, 80 81 %, 82 ° / 83 %, 84 %, 85 %, 86 g. ° / 87 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) determinar si la planta transgénica muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método puede comprender, además: (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie" comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (e) determinar si la planta progenie muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un método para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 % , 52 %, 53 %, 54 55 %, 56 57 %, 58 %, 59 %, 60 %/ 61 % , 62 %, 63 %, 64 %, 65 66 67 %, 68 %, 69 %, 70 71 % , 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %/ 77 %, 78 %, 79 %, 80 %/ 81 , 82 %, 83 84 %, 85 %, 86 %/ 87 %, 88 %, 89 %, 90 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 ¾ de identidad de secuencias , en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) determinar si la planta transgénica muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, además: (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) determinar si la planta progenie muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a una región derivada de la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés; la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 % , 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 61 , 62 %, 63 64 65 66 67 68 69 %, '70 71 % , 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 81 % , 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 91 % , 92 93 , 94 %, 95 96 97 %, 98 99 % O 100 de identidad de secuencias , en base al método alineamiento Clustal V, en comparación con la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de donde se deriva la región, y en donde el gen objetivo de interés codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LNT6 ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) determinar si la planta transgénica muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método puede comprender, además: (d) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (e) determinar si la planta progenie muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones limitantes de nitrógenol con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 52 %, 53 54 %, 55 56 %, 57 58 %, 59 %, 60 %, 61 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 67 68 %, 69 %, 70 71 %, 72 %, 73 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 ¾, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) determinar si la planta progenie muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un método para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a la totalidad o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 Q, ¾ / 63 %, 64 %, 65 %, 66 Q, *o / 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 72 O, "o / 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 o. o / 81 o ¾ / 82 %, 83 %, 84 85 ° / 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 g, o / 91 o "o / 92 Q, %, 93 "ó / 94 95 0. o / 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 *o de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; o (ii) un complemento total de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d) determinar si la planta progenie muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compra, opcionalmente, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operativamente a una región derivada de la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de un gen objetivo de interés; la región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 o. 55 o 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 o, ° r 65 66 %, 67 %/ 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 o 73 *, 74 a, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 ¾, 80 %, 81 %, 82 83 84 o. ° í 85 o o / 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 93 o. 94 %, 95 o "S , 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias, . en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la totalidad o parte de una cadena codificante o de una cadena no codificante de donde se deriva la región y en donde el gen objetivo de interés codifica un LNT6 o un polipéptido similar a LN 6 ; (b) regenerar una planta transgenica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgenica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (d) determinar si la planta progenie muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para producir semillas (por ejemplo, semillas que se puedan comercializar como productos tolerantes al estrés por nitrógeno) ; el método comprende cualquiera de los métodos mencionados anteriormente y comprende, además, obtener semillas de la planta progenie, en donde las semillas comprenden en su genoma el constructo de ADN recombinante o constructo de ADN supresor) .

En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente o cualquiera de las modalidades de los métodos de la presente invención, la etapa para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta transgénica, si aplica, puede comprender determinar si la planta transgénica muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo diversas condiciones ambientales, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente o cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la etapa para determinar cierta alteración de una característica agronómica en una planta progenie, si aplica, puede comprender determinar si la planta progenie muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo diversas condiciones ambientales, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente o cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la etapa para introducir la célula vegetal regenerable puede comprender una célula callosa, una célula callosa embriogénica, una célula gamética, una célula meristemática o una célula de un embrión inmaduro. Las células vegetales regenerables se pueden derivar de una planta endogámica de maíz.

En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente o cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la etapa regeneradora comprende: (i) cultivar las células vegetales transformadas en un medio que comprende una hormona promotora embriogénica hasta observar estructura callosa; (ii) transferir las células vegetales transformadas de la etapa (i) a un primer medio que incluye una hormona promotora de estructura tisular; y (iii) subcultivar las células vegetales transformadas después de la etapa (ii) en un segundo medio para permitir la elongación de los brotes, el desarrollo radicular o ambos.

En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente o cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la por lo menos única característica agronómica se puede seleccionar del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido de aminoácidos en la planta completa, contenido de aminoácidos libres en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semillas, contenido proteico total en la planta, contenido proteico en los frutos, contenido proteico en las semillas, contenido proteico en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, resistencia a la ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de las plántulas y emergencia de las plántulas bajo estrés por temperatura baja. La alteración de por lo menos una característica agronómica puede ser un incremento en la producción, verdor o biomasa.

En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente o cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la planta puede mostrar cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones de estrés por nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) .

En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente o cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, existe alternativas para introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polínucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora. Por ejemplo, se puede introducir en una célula vegetal regenerable una secuencia reguladora (tal como uno o más potenciadores , opcionalmente, como parte de un elemento transponible) y, después, analizar para detectar un evento en el cual la secuencia reguladora se una operativamente a un gen endógeno que codifica un polipéptido de la invención instantánea.

La introducción de constructos de ADN recombinante de la presente invención en plantas se puede realizar mediante cualquiera de las técnicas adecuadas, que incluyen, pero no se limitan a, la captación directa de ADN, el tratamiento con sustancias químicas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, la infección, la transferencia de ADN mediada por vectores, el bombardeo o la transformación mediada con Agrobacterium. Las técnicas para la transformación y regeneración de plantas se han descrito en la publicación de la patente internacional núm. O 2009/006276, cuyo contenido se incorpora en la presente descripción como referencia.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el fragmento foráneo, exógeno de ácido nucleico que codifica una proteína de interés se conoce bien en la técnica. Las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. De lo contrario, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con el de plantas cultivadas de semillas de líneas agronómicamente importantes. A la inversa, el polen de las plantas de estas lineas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva por medio de métodos muy conocidos por una persona con experiencia en la técnica.

EJEMPLOS La presente invención se ilustra con más detalle en los siguientes ejemplos, en los cuales las partes y los porcentajes están en peso y los grados están en grados Celsius, a menos que se indique de otra manera. Se debe entender que si bien estos ejemplos indican las modalidades de la invención, éstos se aportan únicamente a manera de ejemplo. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones. Por lo tanto, diversas modificaciones de la invención además de aquellas que se muestran y se describen en la presente invención serán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la descripción anterior. Las modificaciones también estarán comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Creación de una población de Arabidopsis con genes con rotulación de activación Se realizó un constructo binario a base de T-ADN de 18.49-kb, pHSbarENDs2 (sec. con núm. de ident.:l; Fig. 1) , que contiene cuatro elementos potenciadores muítimerizados derivados del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (correspondiente a las secuencias -341 a -64, tal como lo definen Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)). El constructo también contiene secuencias de vectores (pUC9) y un policonector (sec. con núm. de ident.:ll) para permitir el rescate de plásmidos, secuencias de transposones (Ds) para removilizar el T-ADN y el gen bar para permitir la selección con glufosinato de las plantas transgénicas . En teoría, únicamente el segmento de 10.8-kb del borde derecho (BD) al borde izquierdo (BI) inclusivo se transferirá al genoma de la planta huésped. Ya que los elementos potenciadores se encuentran cerca del BD, pueden inducir la cis-activación de los loci genómicos seguida de la integración de T-ADN.

Las poblaciones con rotulación de activación de Arabidopsis se crearon mediante transformación de la planta completa de Agrobacterium. El constructo pHSbarENDs2 se transformó en la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, que se cultivó en medio de caldo de lisogenia a 25 °C para OD600 -1.0. Después las células se granularon mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de 5 % de sacarosa/O .05 % de Silwet L-77 (OSI Specialties, Inc) . Durante la germinación precoz, el ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana cultivado en el suelo se empapó con la suspensión de Agrobacterium. Una semana después, las mismas plantas se empaparon nuevamente con la misma cepa de Agrobacterium en sacarosa/Silwet . Se permitió que las plantas dejaran semilla como lo hacen normalmente. Las semillas resultantes TI se sembraron en suelo y se seleccionó plántulas transgénicas al atomizar con glufosinato (FINALE®; AgrEvo; Bayer Environmental Science) . Se seleccionó un total de 100,000 plántulas TI resistentes al glufosinato. La semilla T2 de cada línea se conservó por separado.

Ejemplo 2 Ensayos para identificar líneas con tolerancia al bajo contenido de nitrógeno De cada una de las 100,000 líneas con rotulación dé activación TI separadas, once plantas T2 se sembraron en placas cuadradas (15 mm X 15 mm ) con 0.5x de Hoagland libre de N, 0.4 mM de nitrato de potasio, 0.1 % de sacarosa, 1 mM de MES y 0.25 % de Phytagel™ (medio con bajo contenido de N) . En cada placa se coloca cinco líneas y la inclusión de 9 individuos silvestres en cada placa da un total de 64 individuos en un patrón cuadriculado de 8x8 (véase la Fig. 11) . Las placas se conservan tres días en la oscuridad a 4 °C para estratificar las semillas y después se colocan hor zontalmente durante nueve días a 22 °C de luz y 20 °C de oscuridad. El período de exposición a la luz es de dieciséis horas; ocho horas de oscuridad, con una intensidad de luz promedio de -200 mm ol/m2/s. Las placas se rotan y se cambian de sitio diariamente dentro de cada anaquel . En el día doce (nueve días de crecimiento) , se evalúa el estado de las plántulas mediante la obtención de imágenes de la placa completa.

Después de cubrir la imagen de la placa para eliminar el color de fondo, se recopila dos mediciones diferentes para cada individuo: el área total de la roseta y el porcentaje de color que cae en una cubeta de color verde. Con el uso de datos de tono, saturación e intensidad (HSI) , la cubeta de color verde consiste de los tonos 50 al 66. El área total de la roseta se usa como una medida de la biomasa vegetal, mientras que la cubeta de color verde demostró mediante estudios de dosis-respuesta ser un indicador de la asimilación de nitrógeno (véase la Fig. 12) .

Las líneas con un incremento significativo en el área total de la roseta y/o cubeta de color verde, en comparación con las líneas control silvestres, se designaron como aciertos de la Fase 1. Los aciertos de la Fase 1 se analizaron otra vez por duplicado bajo las mismas condiciones de ensayo (ensayo de la Fase 2) . También se usó un ensayo de la Fase 3 para validar adicionalmente los imitantes que pasaron por las Fases 1 y 2. En la Fase 3, cada línea se colocó en placas por separado en un medio con bajo contenido de N, de tal manera que los individuos 32 T2 se cultivaron junto a los individuos 32 silvestres en una placa, lo cual le proporcionó al análisis mayor exactitud estadística. Si una línea muestra una diferencia significativa en comparación con las líneas control en la Fase 3, entonces la línea se considera una línea tolerante a la deficiencia de N validada.

Ejemplo 3 Identificación de genes con rotulación de activación Los genes que flanquean el inserto de T-ADN en líneas tolerantes al nitrógeno se identifican con el uso de uno o ambos de los siguientes procedimientos estándar: (1) PCR termal de entrelazado asimétrico (TAIL) (Liu et al., Plant J. 8:457-63 (1995)); y (2) PCR SAIFF (Siebert et al., Nucleic Acids Res. 23:1087-1088 (1995)). En las líneas con insertos de T-ADN muítimerizados complejos, tanto el procedimiento PCR TAIL como el PCR SAIFF pueden ser insuficientes para identificar genes candidatos. En estos casos se puede usar otros procedimientos, incluso la PCR inversa, el rescate de plásmidos y/o la construcción de la genoteca de ADN.

Un resultado exitoso es cuando un fragmento único de TAIL o PCR SAIFF contiene una secuencia de borde de T-ADN y una secuencia genómica de Arabidopsis . Una vez que se obtiene una etiqueta de la secuencia genómica contigua al inserto de T-ADN, los genes candidatos se identifican mediante el alineamiento para la secuencia del genoma de Arabidopsis disponible al público. Especialmente, el mencionado gen más cercano a los elementos potenciadores 35S/BD del T-ADN es candidato para genes activos.

Para verificar que un gen identificado está verdaderamente cerca de un T-ADN y excluir la posibilidad de que el fragmento TAIL/SAIFF sea un artefacto de clonación quimérica, se realiza una PCR diagnóstica en el ADN genómico con un oligo en el T-ADN y un oligo especifico para el gen candidato. Las muestras de ADN genómico que proporcionan un producto de PCR se interpretan como representantes de la inserción de T-ADN. Este análisis también verifica una situación en donde ocurre más de un evento de inserción en la misma línea, por ejemplo, si se identifican múltiples fragmentos genómicos diferentes en los análisis TAIL y/o PCR SAIFF.

Ejemplo 4 Identificación del gen del LNT6 con rotulación de activación Adicionalmente , se analizó una linea con rotulación de activación (línea 136595) que muestra tolerancia a la deficiencia de nitrógeno. El ADN de la línea se extrajo y los genes que flanquean el inserto de T-ADN en la línea mutante se identificaron con el Uso de la PCR mediada por ligación (Siebert et al., Nucleic Acids Res. 23:1087-1088 (1995) ) . Se identificó un solo fragmento amplificado que contenía una secuencia de borde de T-ADN y una secuencia genómica de Arabidopsis. Una vez que se obtuvo una etiqueta de secuencia genómica que flanqueara el inserto de T-ADN, se identificó un gen candidato mediante alineamiento hacia el genoma de Arabidopsis. Específicamente, el mencionado gen más cercano a los elementos potenciadores 35S/BD del T-ADN fue el candidato para el gen activo en la línea. En el caso de la línea 136595, el gen más cercano a los potenciadores 35S fue el At2g06005 (sec. con núm. de ident.:29) que codifica la "proteína desconocida" de Arabidopsis thaliana denominada en la presente descripción LNT6 (sec. con núm. de ident.:30; NCBI GI 18396221).

E emplo 5 Validación del gen candidato de Arabidopsis (At2g06005) vía transformación en Arabidopsis Los genes candidatos se pueden transformar en Arabidopsis y sobreexpresar bajo el promotor 35S. Si se observa el mismo fenotipo o uno similar en la línea transgénica como en la línea paterna con rotulación de activación, entonces se considera que el gen candidato es un "gen guía" validado en Arabidopsis.

Se analizó la capacidad del gen At2g06005 de Arabidopsis (sec. con núm. de ident.:29) para conferir tolerancia a la deficiencia de nitrógeno de la siguiente manera: El ADNc de At2g06005 se amplificó mediante RT-PCR con los siguientes cebadores : 1_. Cebador codificante attB de At2g06005-5' (sec. con núm. de ident.:34) El cebador codificante contiene la secuencia attBl (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT; sec. con núm. de ident.:12) y una secuencia consenso Kozak (CAACA) corriente arriba de los primeros 21 nucleotidos de la región codificante de proteínas, empezando con el codón de inicio ATG, del ADNc. 2. Cebador no codificante attB deAt2g06005-3 ' (sec. con núm. de ident.:35) El cebador no codificante contiene la secuencia attB2 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGG ; sec. con núm. de ident.:13) adyacente al complemento no codificante de los últimos 21 nucleotidos de la región codificante de proteínas, al comenzar con el complemento no codificante del codón de terminación, del ADNc.

Con el uso de la tecnología CLONASE™ de INVI ROGEN™ GATEWAY® se realizó una reacción de recombinación de BP con pDONR™Zeo (sec. con núm. de ident . : 2 ; Fig. 2). Este proceso elimina el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen de resistencia al cloranfenicol (CAM) de pDONR™Zeo y clona direccionalmente el producto de la PCR con los sitios de flanqueo attBl y attB2, para crear un clon de entrada. Este clon de entrada se usó para una reacción posterior de recombinación LR con un vector objetivo de la siguiente manera.

Un vector binario basado en T-ADN de 16.8-kb (vector objetivo), denominado pBC-amarillo (sec. con núm. de ident.:4; Fig. 4), se creó con un promotor 35S de 1.3-kb inmediatamente corriente arriba del inserto de conversión Cl de INVITROGEN™ GATEWAY, que contiene el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen de resistencia al cloranfenicol (CAM) flanqueado por las secuencias attRl y attR2. El vector también contiene el promotor RD29a que dirige la expresión del gen para ZS-amarillo (INVITROGEN™) , que le confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada. Con el uso de la tecnología de INVITROGEN™ GATEWAY® se realizó una reacción de recombinación LR en el clon de entrada que contiene el producto clonado direccionalmente de la PCR y el vector pBC-amarillo . Esta amplificación permitió la clonación rápida y direccional del gen At2g06005 con el promotor 35S en pBC-amarillo .

Después, los solicitantes introdujeron el promotor 35S : constructo de expresión At2g06005 en el ecotipo silvestre Col-0 de Ara±)idopsiscon el uso del mismo procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium descrito en el Ejemplo 1. Las semillas transgénicas TI se seleccionaron por fluorescencia amarilla y 32 de estas semillas TI se colocaron en placas junto a 32 semillas de ecotipos Col-0 silvestres de Arabidopsis en un medio con bajo contenido de nitrógeno. Todas las condiciones de crecimiento y los análisis de obtención de imágenes posteriores se realizaron tal como se describió en él Ejemplo 1. Se descubrió que el fenotipo original de la rotulación de la activación, la tolerancia a las condiciones limitantes de nitrógeno, se puede recapitular en plantas silvestres de Arabidopsis que se transformaron con un constructo en donde At2g06005 se expresó directamente mediante el promotor 35S.

Ej emplo 6 Composición de genotecas de ADNc, aislamiento y secuenciamiento de clones de ADNc Las genotecas de ADNc se pueden preparar mediante cualquiera de los diversos métodos disponibles. Por ejemplo, los ADNc se pueden introducir en vectores plasmídicos por medio de preparar primero las genotecas de ADNc en vectores Uni-ZAP™ XR de conformidad con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . Las genotecas de Uni-ZAP™ XR se convierten en genotecas plasmídicas de conformidad con el protocolo que proporciona Stratagene . Con la conversión, los insertos de ADNc estarán contenidos en el vector plasmídico pBLUESCRIPT® . Adicionalmente , los ADNc se pueden introducir directamente en los vectores precortados II S (+) de BLUESCRIPT® (Stratagene) con el uso de la ADN ligasa T . (New England Biolabs) , seguido por la transfección en células DH10B de conformidad con el protocolo del fabricante (GIBCO BRL Products) . Una vez que los insertos de ADNc están en vectores plasmídicos, los ADN plasmídicos se preparan a partir de colonias bacterianas seleccionadas aleatoriamente que contienen plásmidos recombinantes pBLUESCRIPT® o las secuencias de ADNc insertadas se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa con el uso de cebadores específicos para secuencias de vectores que flanquean las secuencias de ADNc insertadas . Los ADN de insertos o ADN plasmídicos amplificados se someten a secuenciamiento en reacciones de secuenciamiento tinte-cebador para generar secuencias parciales de ADNc (etiquetas de secuencia expresada o "EST" ; véase Adams et al., Science 252:1651-1656 (1991) ) . Las EST resultantes se analizan con el uso de una cadena codificante fluorescente modelo 377 de Perkin Elmer.

Los datos de la secuencia de inserto completo (FIS) se generan con el uso de un protocolo de transposición modificado. Los clones identificados por las FIS se recuperan de reservas de glicerina conservadas como colonias únicas y los ADN plasmídicos se aislan vía lisis alcalina. Las plantillas de ADN aisladas se hacen reaccionar con nucleótidos codificantes o no codificantes M13 cebados por el vector en una reacción de secuenciamiento en base a PCR y se cargan en secuenciadores automatizados. La confirmación de la identificación de clones se realiza por alineamiento de secuencias con la secuencia de EST original de donde se realiza la solicitud de FIS.

Las plantillas confirmadas se transponen mediante el kit de transposición Primer Island (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) que se basa en el elemento transponible Tyl de Saccharomyces cerevisiae (Devine and Boeke, Nucleic Acids Res. 22:3765-3772 (1994)). El sistema de transposición in vitro coloca aleatoriamente sitios de unión únicos en toda la población de moléculas grandes de ADN. Después, el ADN transpuesto se usa para transformar las células electrocompetentes de DH10B (Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, D) vía electroporación . El elemento transponible contiene un marcador seleccionable adicional (llamado DHFR; Fling and Richards, Nucleic Acids Res. 11:5147-5158 (1983)), que permite la selección doble en placas de agar únicamente de los subclones que contienen el transposón integrado. Aleatoriamente, se selecciona múltiples subclones de cada reacción de transposición, los ADN plasmídicos se preparan vía lisis alcalina y las plantillas se someten a secuenciamiento (tinte-terminador ABI Prism mezcla ReadyReaction) hacia afuera del sitio del evento de transposición, con el uso de cebadores únicos específicos para los sitios de unión dentro del transposón.

Se recolecta datos de las secuencias (ABI Prism® Collections) y se ensamblan con el uso de Phred and Phrap (Ewing et al., Genome Res. 8:175-185 (1998); Ewing et al . , Genome Res. 8:186-194 (1998)). Phred es un programa de dominio público que relee los datos de secuencias ABI , vuelve a llamar a las bases, asigna valores de calidad y escribe llamadas de bases y valores de calidad en archivos de salida editables . El programa de ensamble de secuencias Phrap usa estos valores de calidad para aumentar la precisión de los cóntigos de secuencias ensamblados. Los ensambles se observan mediante el editor de secuencias Consed (Gordon et al., Genome Res. 8:195-202 (1998)) .

En algunos clones el fragmento de ADNc corresponde a la porción 3 '-terminal del gen y no cubre el marco de lectura abierto completo. Para obtener la información corriente arriba se usa uno o dos protocolos diferentes. El primero de estos métodos resulta en la producción de un fragmento de ADN que contiene una porción de la secuencia de genes deseada mientras que el segundo método resulta en la producción de un fragmento que contiene el marco de lectura abierto completo. Ambos métodos realizan la amplificación de la PCR dos veces para obtener fragmentos de una o más genotecas . Algunas veces las genotecas se seleccionan en base al conocimiento previo que el gen especifico deberla encontrarse en un tejido específico y, algunas veces, se escogen aleatoriamente. Las reacciones para obtener el mismo gen se pueden realizar en varias genotecas en paralelo o en un grupo de genotecas. Los grupos de genotecas se preparan, normalmente, con el uso de 3 a 5 genotecas diferentes y se normalizan hasta una dilución uniforme. En la primera tanda de amplificación ambos métodos usan un cebador específico del vector (codificante) correspondiente a una porción del vector localizada en la región 5'-terminal del clon junto con un cebador específico del gen (no codificante) . El primer método usa una secuencia complementaria a una porción de la secuencia de genes ya conocida, mientras que el segundo método usa un cebador específico del gen complementario a una porción de la región 3' no traducida (también llamada UT , por sus siglas en inglés) . En la segunda vez que se realiza la amplificación se usa un grupo subdividido de cebadores para ambos métodos . El fragmento de ADN resultante se liga al vector pBLUESC IPT® con el uso de un kit comercial y se sigue el protocolo del fabricante. Este kit se selecciona de la variedad disponible de varios proveedores que incluye Invitrogen™ (Carlsbad, CA) , Promega Biotech (Madison, I) y Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) . El ADN plasmidico se aisla mediante el método de lisis alcalina y se somete a secuenciamiento y ensamble con el uso de Phred/Phrap, como se mencionó anteriormente.

Ej emplo 7 Identificación de clones de ADNc Los clones de ADNc que codifican polipéptidos similares a LNT6 se identificaron mediante búsquedas BLAST (herramienta para búsqueda de alineamiento local básico; Altschul et al., J, Mol. Biol. 215:403-410 (1993); véase, además, la explicación de las búsquedas del algoritmo BLAST en el sitio en la web del National Center for Biotechnology Information en la National Library of Medicine of the National Institutes of Health) de similitud con las secuencias de aminoácidos contenidas en la base de datos "nr" del BLAST (que comprende todas las traducciones no redundantes CDS del GenBank, las secuencias derivadas de la estructura tridimensional de Brookhaven Protein Data Bank, la última versión de la base de datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT y las bases de datos de EMBL y DDBJ) . Las secuencias de ADN de clones se pueden traducir en todos los marcos de lectura y su similitud se puede comparar con todas las secuencias de proteínas disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo BLASTX (Gish and States, Nat . Genet . 3:266-272 (1993)) que proporciona el NCBI. Los polipéptidos codificados por las secuencias de ADNc se pueden analizar para detectar la similitud con cualquiera de las secuencias de aminoácidos disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo de BLASTP que proporciona el National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Por conveniencia, el valor P (probabilidad) o el valor E (expectación) de observar una coincidencia de una secuencia codificada por ADNc con una secuencia contenida en la base de datos de búsqueda simplemente por casualidad como lo calcula el BLAST se reporta en la presente descripción como valor "pLog" , que representa el negativo del logaritmo del valor P o el valor E reportado. Por lo tanto, mientras mayor sea el valor pLog, mayor es la probabilidad de que la secuencia codificada por ADNc y el "acierto" del BLAST representen proteínas homologas .

Las secuencias de EST se pueden comparar con la base de datos del GenBank tal como se describió anteriormente. Las EST que contienen secuencias de más de 5- o 3 -prima se pueden encontrar con el uso del algoritmo de BLASTN (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)) en comparación con la base de datos patentada de DUPONT que compara las secuencias de nucleótidos que comparten regiones comunes o superpuestas de homología de secuencias . Donde hay secuencias comunes o traslapadas entre dos o más fragmentos de ácidos nucleicos, las secuencias se pueden ensamblar en una sola secuencia de nucleótidos contiguos, lo que extiende así el fragmento original ya sea en la dirección del cebador 5 o 3. Una vez se identifica la EST con el máximo 5-prima, su secuencia completa se puede determinar mediante el secuenciamiento completo de insertos .

Los genes homólogos que pertenecen a especies diferentes se pueden encontrar al comparar la secuencia de aminoácidos de un gen conocido (ya sea de una fuente registrada o de una base de datos pública) con una base de datos de EST con el uso del algoritmo de tBLASTn. El algoritmo tBLASTn busca aminoácidos en una base de datos de nucleótidos traducida en los 6 marcos de lectura. Esta búsqueda permite diferencias en el uso de codones de nucleótidos entre diferentes especies y para la degeneración del codón.

Ejemplo 8A Caracterización de clones de ADNc que codifican polipéptidos similares a LNT6 Se preparó genotecas de ADNc que representan los ARNm de varios tejidos de Zea mays (maíz), Nepeta racemosa (nébeda) , Oryza sativa (arroz), Glycine max (frijol de soya) , Helianthus annuus (girasol) y Triticum aestivum (trigo) . Las características de las genotecas se describen más abaj o .

Tabla 2 Genotecas de ADNc del maíz, nébeda, arroz, frijol de soya, trigo y girasol Genoteca Descripción (tejido) Clon cfp4n Espigas polinizadas de maíz, cfp4n.pk073 .a8 reunidas 48_72 h después de la :fis polinización, de longitud completa, enriquecidas, normalizadas ecllc Nébeda, Nepeta racemosa, genoteca de ecllc .pkOOl .bl ADNc del tejido de las hojas jóvenes 5 :fis rslln Arroz {Oryza sativa, YM) plántula rslln.pk003 .h2 normalizada de 15 días de edad :fis slslc Frijol de soya {Glycine max L., slslc .pkOll . c2 S1990) infectado con Sclerotinia :fis sclerotiorum mycelium. hsolc Plantas de girasol transgénicas hsolc .pkOlO .h7 oxalato oxidasa :fis wlmkl Plántulas de trigo 1 hora después de wlmkl .pk033 .el la inoculación con Erysiphe graminis 2 :fis f. sp tritici y tratamiento con KQ926** sfpln Genoteca normalizada enriquecida con sfpln.pk027 .k2 insertos completos de ADNc de soya, 1 tejido mezclado (flor y vaina) Tal como se muestra en la Tabla 3, Figs. 15A-15G y Fig. 16, los ADNc identificados en la Tabla 2 codifican polipéptidos similares al polipéptido LNT6 de Arabidopsis thaliana (At2g06005; núm. de ident. general del NCBI 18396221 ; sec. con núm. de ident. :30) y polipéptidos similares a LNT6 de Oryza sativa (núm. de ident. general del NCBI 115449029 (sec. con núm. de ident. :31)) y de Populus trichocarpa (núm. de ident. general del NCBI 118482875 (sec. con núm. de ident. :33)) .

En la Tabla 3 (literatura que no es de patentes) y la Tabla 4 (literatura de patentes) se muestran los resultados del BLASTP para las EST individuales ("EST") , las secuencias de los insertos completos de ADNc que comprenden los clones de ADNc ("FIS") indicados, las secuencias de los cóntigos ensamblados de dos o más secuencias de EST, FIS o PC ("contigo") o las secuencias que codifican una proteína completa o funcional derivada de una FIS o un contigo ("CGS") . Las Tablas 3 y 4 también muestran los valores porcentuales de la identidad de secuencias para cada par de secuencias de aminoácidos con el uso del método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados (que se describen a continuación en el Ejemplo 8C) .

Tabla 3 Resultados del BLASTP para polipéptidos homólogos de LNT6 Secuencia Estado Núm. GI del CNIB % de Puntaj e (sec. con núm. de identidad pLog del ident. : #) BLASTP cfp4n.pk073.a8 :fi SCG 125541346 82.3 148 S (sec. con (sec. con núm. de núm. de ident . : 18) ident. :32*) ecllc.pk001.bl5:f SCG 118482875 71.9 124 is (sec. con núm. (sec. con de ident . :20) núm . de ident. :33) rslln.pk003.b.2 :fi SCG 115449029 100.0 >250 s (sec. con núm. (sec. con de ident. :22) núm . de ident . : 31) slslc.pk011.c2 : fi SCG 118482875 75.3 133 s (sec. con núm. (sec. con de ident . : 24) núm. de ident . : 33 ) hsolc . pkOlO . h7 : fi SCG 118482875 71.3 108 s (sec. con núm. (sec. con de ident . -.26) núm. de ident. :33) wlmkl.pk033. cl2 :f SCG 125541346 83.6 141 is (sec. con núm. (sec. con de ident. :28) núm . de ident. :32*) sfpln.pk027.k21 SCG 118482875 75.0 133 (sec. con núm. de (sec. con ident. :37) núm. de ident. :33) sfpln.pkOOS .p24 SCG 118482875 75.0 133 (sec. con núm. de (sec. con ident. :40) núm. de ident . : 33 ) * Esta secuencia se descontinuó en la base de datos GenBank antes de la fecha de prioridad de esta solicitud por lo tanto, se retiró del alineamiento en Figura 15.

Tabla 4 Resultados del BLASTP para polipéptidos homólogos de LNT6 Secuencia Estado Referencia % Puntaj e (sec. con núm. de Identidad pLog ident. : #) del BLASTP cfp4n.pk073. a8.- SCG Sec. con núm. 99.7 174 fis de (sec. con núm. de ident. =257833 ident . : 18) en la patente de los Estados Unidos núm. 2004214272 ecllc.pk001.bl5 SCG Sec. con 69.3 118 : fis (sec. con núm. de núm. de ident. : 10125 ident. :20) 4 en la patente de los Estados Unidos núm. 2007214517 rslln.pk003.h2 : SCG Sec . con 100.0 >250 fis (sec. con núm . de núm. de ident . : 28789 ident . :22) en la patente núm.

JP2005185101 slslc .pkOll . c2 : SCG Sec. con 80.1 143 fis (sec. con núm . de núm . de ident. :28034 ident . :24) 2 en la patente de los Estados Unidos núm. 2004031072 hsolc.pk010.h7 : SCG Sec . con 68.4 100 fis (sec. con núm. de núm. de ident. : 10125 ident . : 26) 4 en la patente de los Estados Unidos núm. 2007214517 wlmkl.pk033.cl2 SCG Sec . con 83.3 142 :fis (sec. con núm. de núm. de ident. : 25783 iden . :28) 3 en la patente de los Estados Unidos núm. 2004214272 sfpln.pk027.k21 SCG Sec. con 78.7 151 (sec. con núm. núm. de de ident. :37) ident . : 280342 en la patente núm.

US2004003107 2 sfpln.pk005.p24 SCG Sec. con núm. 78.7 151 (sec. con núm. de de ident . : ident. :40) 280342 en la patente núm.

US20040031072 Ejemplo 8B Identificación de otras secuencias homologas de LNT6 El polipéptido codificado por el locus At2g06005 (sec. con núm. de ident. :29) se analizó para detectar la similitud con todas las secuencias de aminoácidos disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo de BLASTP que proporciona el National Center for Biotechnology Information (NCBI) . En el análisis BLAST, se identificó varias secuencias homologas de LNT6. La "proteína desconocida" de Arabidopsis thaliana codificada por At5g20580.1 (núm. de IG del NCBI 42567994; sec. con núm. de ident. -.41) es 69 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 30 con un pLog de 112. La "proteína hipotética" de Ricinus communis (núm. de IG del NCBI 223544760; sec. con núm. de ident. :42) es 70.5 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 30 con un pLog de 118. El "producto proteico no identificado" de Vitís vinifera (núm. de IG del NCBI 157342535; sec. con núm. de ident.: 43) es 74.9 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 30 con un pLog de 115. La wproteína desconocida" de Picea sitchensis (núm. de IG del NCBI 148907370; sec. con núm. de ident. :44) es 52.5 % idéntica a la sec . con núm. de ident.:30 con un pLog de 83. La "proteína pronosticada" de Physcomitrella patens subsp. patenta (núm. de IG del NCBI 168067690; sec. con núm. de ident. :45) es 47.2 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 30 con un pLog de 57. La "proteína hipotética" de Sorghum bicolor Sb04g034890 (núm. de IG del NCBI 242063244; sec. con núm. de ident. :46) es 58.2 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 30 con un pLog de 96. La proteína pronosticada de Selaginella moellendorffi (sec. con núm. de ident. : 47) es 49.5 % idéntica a la sec. con núm. de ident. :30 con un pLog de 52. Los valores porcentuales de la identidad de secuencias se determinaron con el uso del método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados (que se describen a continuación en el Ejemplo 8C) .

Ejemplo 8C Alineamiento de secuencias y cálculos de identidad porcentual para LNT6 y sus homólogos Las Figs . 15A-15G presentan un alineamiento de las secuencias de aminoácidos que se definen en las secs . con núms. de ident. :18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 y 47. La Fig. 16 es un cuadro del porcentaje de identidad de secuencias y los valores de divergencia para cada par de secuencias de aminoácidos que se presentan en las Figs. 15A-15G.

Los alineamientos de secuencias y los cálculos de porcentaje de identidad se realizaron con el uso del programa MEGALIGN® del paquete integrado para bioinformática LASERGENE® (ADNSTAR® Inc., Madison, I) . El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó con el uso del método de alineamiento Clustal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros predeterminados (PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares con el uso del método Clustal fueron KTUPLE 1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5.

Ejemplo 9 Preparación de un vector de expresión de plantas que contiene un homólogo del gen guía de Arabidopsis Las secuencias homologas del gen guía de LNT6 se pueden identificar con el uso de algoritmos de comparación de secuencias, tales como el BLAST (herramienta para búsqueda de alineamiento local básico; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993); ver también la explicación del algoritmo BLAST en el sitio web del National Center for Biotechnology Information at the National Library · of Medicine of the National Institutes of Health) . Las secuencias similares a LNT6 homologas, tales como las descritas en el Ejemplo 8, se pueden amplificar por PCR mediante cualquiera de los métodos siguientes .

Método 1 (basado en ARN) : Si se encuentra disponible información de las secuencias 5' y 3' para la región codificante de proteínas de un homólogo de LNT6, los cebadores específicos del gen se pueden diseñar tal como se describió en el Ejemplo 5. Se puede usar RT-PCR con ARN vegetal para obtener un fragmento de ácido nucleico que contiene la región codificante de proteínas flanqueada por las secuencias attBl (sec. con núm. de ident.:12) y attB2 (sec. con núm. de ident.:13). El cebador puede contener una secuencia consenso de Kozak (CAACA) corriente arriba del codón de inicio.

Método 2 (basado en ADN) : Alternativamente, si un clon de ADNc está disponible para el homólogo de LNT6, el inserto completo de ADNc (que contiene las regiones 5' y 3' no codificantes) se puede amplificar por la PCR. Se puede diseñar cebadores codificantes o no codificantes que contengan ya sea la secuencia attBl y la secuencia específica del vector que precede el inserto de ADNc o la secuencia attB2 y la secuencia específica del vector que sigue al inserto de ADNc, respectivamente. Para clonar un inserto de ADNc en el vector pBLUESCRIPT SK+, se puede usar el cebador codificante VC062 (sec. con núm. de ident. :15) y el cebador no codificante VC063 (sec. con núm. de ident. :16) .

Los métodos 1 y 2 se pueden modificar de conformidad con los procedimientos conocidos por una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, los cebadores del método 1 pueden contener sitios de restricción en vez de sitios attBl y attB2, para la clonación posterior del producto de la PCR en un vector que contiene sitios attBl y attB2. Además, el método 2 puede requerir la amplificación de un clon de ADNc, un clon lambda, un clon BAC o ADN genómico.

Un producto de la PCR obtenido por cualquiera de los métodos mencionados anteriormente se puede combinar con el vector donante GATEWAY®, tal como pDONR™ Zeo (sec. con núm. de ident.:2; Fig. 2) o pDONR™ 221 (sec. con núm. de ident.:3; Fig. 3), con el uso de una reacción de recombinación BP. Este proceso elimina el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen de resistencia al cloranfenicol (CAM) de pDONR™ Zeo o pDONR™ 221 y clona direccionalmente el producto de la PCR con los sitios de flanqueo attBl y attB2 para crear un clon de entrada. Con el uso de la tecnología CLONASE™ de INVITROGEN™ GATEWAY®, la secuencia que codifica el polipéptido LNT6 homólogo del clon de entrada se puede transferir a un vector objetivo adecuado, como pBC-amarillo (sec. con núm. de ident. :4; Fig. 4), PHP27840 (sec. con núm. de ident.:5; Fig. 5) o PHP23236 (sec. con núm. de ident. :6; Fig. 6), para obtener un vector de expresión de plantas para usar con Arabidopsis, frijol de soya y maíz, respectivamente.

Los sitios attPl y attP2 de los vectores donantes pDONR™/Zeo o pD0NR™221 se muestran en las Figs. 2 y 3, respectivamente. Los sitios attRl y attR2 de los vectores objetivo pBC-amarillo, PHP27840 y PHP23236 se muestran en las Figs. 4, 5 y 6, respectivamente.

Alternativamente, se puede realizar una reacción de recombinación LR de MultiSite Gateway® entre múltiples clones de entrada y un vector objetivo adecuado para crear un vector de expresión.

Después, los solicitantes pueden introducir el vector de expresión en el ecotipo silvestre de Arabidopsis Col-O, con el uso del mismo procedimiento de transformación mediada por Agrobacterium descrito en el Ejemplo 1. Las semillas transgénicas TI se pueden seleccionar por fluorescencia amarilla y 32 de estas semillas TI se pueden colocar en la casa junto a 32 semillas de ecotipos silvestres de Arabidopsis Col-0 en un medio con bajo contenido de nitrógeno. Todas las condiciones de crecimiento y análisis de obtención de imágenes posteriores se pueden realizar tal como se describió en el Ejemplo 1. También se puede realizar ensayos duplicados similares con el uso de semillas T2.

Alternativamente, se puede introducir el vector de expresión en maíz o frijol de soya de conformidad con los protocolos descritos en la presente invención.

Ejemplo 10 Preparación de vectores de expresión de frijol de soya y transformación de frijol de soya con genes guía de Arabidopsis validados Las plantas de frijol de soya se pueden transformar para sobreexpresar cada gen de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes de las diversas especies para examinar el fenotipo resultante.

El mismo clon de entrada GATEWAY® descrito en el Ejemplo 5 se puede usar para clonar direccionalmente cada gen en el vector PHP27840 (sec. con núm. de ident.:5; Fig. 5) de tal manera que la expresión del gen esté bajo control del promotor SCP1.

Los embriones de frijol de soya se pueden transformar con el vector de expresión que comprende secuencias que codifican los polipéptidos instantáneos.

Para producir embriones somáticos, cotiledones de 3-5 mm de longitud separados de la superficie esterilizada, las semillas inmaduras del cultivar A2872 del frijol de soya se pueden cultivar en la luz o en la oscuridad a 26 °C en un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos, que producen embriones secundarios, después se separan y se colocan en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida para los grupos de embriones somáticos que se multiplican como embriones prematuros en fase globular, las suspensiones se conservan como se describe a continuación.

Los cultivos embriogénicos en suspensión de frijol de soya se pueden mantener en 35 mi de medio líquido en un agitador giratorio de 150 rpm, a 26 °C con luces fluorescentes con un horario de 16:8 horas día/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas mediante la inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido.

Después, los cultivos embriogénicos en suspensión de frijol de soya se pueden transformar mediante el método de bombardeo de partículas (Klein et al., Nature (London) 327:70-73 (1987), patente de los Estados Unidos núm. 4,945,050). Se puede usar un instrumento PDS1000/HE de DuPont Biolistic™ (retroajuste de helio) para estas transformaciones.

Un gen marcador seleccionable que se puede usar para facilitar la transformación del frijol de soya es un gen quimérico compuesto del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al., (1985) Nature 323:810-812), el gen de la higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. colij Gritz et al., Gene 25:179-188 (1983)) y la región 3 ' del gen de la nopalina sintasa del T-ADN del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . Otro gen marcador seleccionable que se puede usar para facilitar la transformación de frijol de soya es un gen de la acetolactato sintasa (ALS) resistente a herbicidas de frijol de soya o Arabidopsis . La ALS es la primera enzima común en la biosíntesis de los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. Se ha identificado que las mutaciones en la ALS imparten resistencia a algunas o a las tres clases de inhibidores de la ALS (patente de los Estados Unidos núm. 5,013,659; cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia) . La expresión del gen de la ALS resistente a herbicidas puede estar bajo control del promotor de la SA sintetasa (solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US-2003-0226166-A1 ; cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia) .

A 50 µ? de una suspensión de 60 mg/ml de partículas de oro de 1 µt? se agrega (en orden) : 5 µ? de ADN (1 pg/ l) , 20 µ? de espermidina (0.1 M) y 50 µ? de CaCl2 (2.5 M) . Después, la preparación de partículas se mezcla durante tres minutos, se centrifuga en un microcentrifugador durante 10 segundos y el sobrenadante se retira. Después, las partículas cubiertas de ADN se lavan una sola vez en 400 µ? de etanol al 70 % y se resuspenden en 40 µ? de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se puede sonicarse tres veces durante un segundo cada una. Después, se carga 5 µ? de las partículas de oro cubiertas de ADN en cada disco del macroportador .

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas se coloca en una caja petri de 60x15 mm vacía y el líquido restante del tejido se retira con una pipeta. Para cada experimento de transformación se bombardea, normalmente, aproximadamente 5-10 placas de tejido. La fuerza de ruptura de la membrana se ajusta a 7.6 MPa (1100 psi) y la cámara se evacúa al vacío con 94.8 kPa (28 pulgadas de mercurio) . El tejido se coloca aproximadamente a 8.9 cm (3.5 pulgadas) del ensayo de retención y se bombardea tres veces . Después del bombardeo el tej ido se puede dividir a la mitad y se puede colocar nuevamente en el líquido para cultivarlo como se describió anteriormente.

Cinco a seis días después del bombardeo, los medios líquidos se pueden intercambiar con medios frescos y de once a doce días después del bombardeo con medios frescos que contienen 50 mg/ml de higromicina. Estos medios selectivos se pueden refrescar semanalmente . Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar tejido verde transformado que crece de grupos embriogénicos necróticos no transformados. El tejido verde aislado se extrae e inocula en matraces individuales para generar cultivos en suspensión embriogénicos nuevos, transformados y propagados por clonación. Cada línea nueva se puede tratar como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcultivar y mantener como grupos de embriones inmaduros o se pueden regenerar en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Después, las plantas transformadas de frijol de soya con genes validados se pueden analizar para estudiar las características agronómicas con relación a las plantas control o de referencia. Por ejemplo, se puede analizar el aumento y/o estabilidad de la producción bajo condiciones con bajo y alto contenido de nitrógeno (por ejemplo, condiciones limitantes de nitrógeno y condiciones con suficiente nitrógeno) .

Ejemplo 11 Transformación de maíz con genes guía de Arabidopsis validados mediante bombardeo de partículas Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de varias especies para examinar el fenotipo resultante.

El mismo clon de entrada GATEWAY® descrito en el Ejemplo 5 se puede usar para clonar direccionalmente cada gen en un vector de transformación de maíz. La expresión del gen en el vector de transformación del maíz puede estar bajo control de un promotor constitutivo, tal como el promotor de ubiquitina del maíz (Christensen et al., Plant Mol. Biol . 12:619-632 (1989) y Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18 : 675-689 (1992) ) .

El constructo de ADN recombinante descrito anteriormente se puede introducir en células de maíz mediante el procedimiento siguiente. Los embriones inmaduros de maíz se pueden separar de los cariopsos en desarrollo derivados de cruces de las líneas endogámicas de maíz H99 y LH132. Los embriones se aislan diez a once días después de la polinización cuando tienen 1.0 a 1.5 mm de longitud. Después, los embriones se colocan con el lado del eje hacia abajo y en contacto con medio N6 solidificado con agarosa (Chu et al., Scí. Sin. Peking 18:659-668 (1975)). Los embriones se conservan en la oscuridad a 27 °C. El callo embriogénico friable consistente de masas indiferenciadas de células con proembrioides somáticos y embrioides de las estructuras suspensoras prolifera del escutelo de estos embriones inmaduros . El callo embriogénico aislado del explanto primario se puede cultivar en medio N6 y subcultivar en este medio cada dos o tres semanas.

El plásmido p35S/Ac (obtenido de Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) se puede usar en experimentos de transformación para determinar un marcador seleccionable . Este plásmido contiene el gen pat (ver la publicación de patente de Europa núm. 0 242 236) que codifica la fosfinotricina acetil transferasa (PAT) . La enzima PAT confiere resistencia a inhibidores herbicidas de la glutamina sintetasa, tales como la fosfinotricina . El gen pat en p35S/Ac está bajo control del promotor 35S del virus mosaico de coliflor (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)) y la región 3" del gen de la nopalina sintasa del T-ADN del plásmido Ti de Agrobacterium turnefaciens .

El método de bombardeo de partículas (Klein et al., Nature 327:70-73 (1987)) se puede usar para transferir genes a las células de cultivos callosos. De conformidad con este método, las partículas de oro (1 µt? de diámetro) se recubren con ADN con la siguiente técnica. Se agrega 10 ]ig de ADN plasmídicos a 50 µ?? de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mi) . Se agrega cloruro cálcico (50 iL de una solución de 2.5 M) y base libre de espermidina (20 ]iL de una solución de 1.0 M) a las partículas. La suspensión se agita en vórtice durante la adición de estas soluciones . Después de diez minutos los tubos se centrifugan brevemente (5 s a 15,000 rpm) y se retira el sobrenadante. Las partículas se resuspenden en 200 L de etanol absoluto, se centrifugan otra vez y se retira el sobrenadante. El enjuague del etanol se realiza otra vez y las partículas se resuspenden en un volumen final de 30 µL de etanol. Un alícuota (5 µL) de las partículas de oro recubiertas con ADN se pueden colocar en el centro de un disco de vuelo KAPTON™ (Bio-Rad Labs) . Después las partículas se aceleran en el tejido de maíz con un BIOLISTIC™ PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) , con una presión de helio de 6.9 MPa (1000 psi) , una distancia de separación de 0.5 cm y una distancia de vuelo de 1.0 cm.

Para el bombardeo, el tejido embriogénico se coloca en papel de filtro sobre el medio N6 solidificado con agarosa. El tejido se coloca como un césped poco denso y cubre un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La caja petri que contiene el tejido se puede colocar en la cámara del PDS-1000/He a aproximadamente 8 cm del ensayo de terminación. El aire en la cámara después se evacúa al vacío con 94.8 kPa (28 pulgadas de Hg) . El macroportador se acelera con una onda expansiva de helio con el uso de una membrana de ruptura que se rompe cuando la presión del He en el tubo de choque alcanza 6.9 MPa (1000 psi) .

Siete dias después del bombardeo el tejido se puede transferir al medio N6 que contiene bialafos (5 mg por litro) y carece de caseína o prolina. El tejido continúa creciendo lentamente en este medio. Después de dos semanas adicionales el tejido se puede transferir al medio N6 fresco que contiene bialafos. Después de seis semanas, se puede identificar áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro del callo que crece activamente en algunas placas que contienen el medio suplementado con bialafos. Estos callos pueden continuar el crecimiento cuando se subcultivan en el medio selectivo.

Las plantas pueden regenerarse a partir del callo transgénico al transferir primeramente grupos de tej ido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tej ido se puede transferir al medio regenerativo (Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990)).

Las plantas transgénicas T0 se pueden regenerar y su fenotipo se puede determinar siguiendo los procedimientos de HTP. Se puede recolectar semillas TI.

Las plantas TI se pueden cultivar bajo condiciones limitantes de nitrógeno, por ejemplo, 1 mM de nitrato y se pueden analizar para detectar cambios fenotípicos. Los siguientes parámetros se pueden cuantificar con el uso del análisis de imágenes: el área de la planta, el volumen, el Indice de crecimiento y el análisis del color se pueden recolectar y cuantificar. Los constructos de sobreexpresión que se producen en una alteración, en comparación con plantas control adecuadas, en verdor (cubeta de color verde) , producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco o seco en la maduración, producción de frutos o semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos o semillas, contenido de nitrógeno en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en la planta completa, contenido de aminoácidos libres en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos o semillas, contenido proteico en los frutos o semillas o contenido proteico en un tej ido vegetativo se pueden considerar como evidencia de que un gen líder de Arabidopsis funciona en el maíz para aumentar la tolerancia a la reducción de nitrógeno (tolerancia aumentada al nitrógeno) .

Además, se puede introducir un constructo de ADN recombinante que contiene un gen de Arabidopsis validado en una línea de maíz endogámica, ya sea mediante transformación directa o introgresión de una línea transformada por separado. E emplo 12 Electroporación de LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (Descripción general) Las células competentes de electroporación (40 µ?) , tales como LBA4404 de Agrobacterium turnefaciens (que. contienen PHP10523) , se descongelan en hielo (20-30 min) . El PHP10523 contiene genes VIR para la transferencia de T-ADN, un origen de replicación de plásmido con un número de copia bajo de Agrobacterium, un gen de resistencia a la tetraciclina y un sitio Cos para la recombinación biomolecular de ADN in vivo. Mientras tanto, la cubeta de electroporación se enfría en hielo. La configuración del electroporador se determina para ser 2.1 kV. Un alícuota de ADN (0.5 de ADN progenitor a una concentración de 0.2 ]ig -1.0 \ig en regulador con bajo contenido de sal o H20 dos veces destilada) se mezcla con las células LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens descongeladas mientras se mantienen en hielo. La mezcla se transfiere al fondo de la cubeta de electroporación y se mantiene en reposo sobre hielo durante 1-2 min. Las células se electroporan (electroporador 2510 de Eppendorf) al presionar el botón "pulso" dos veces (idealmente, hasta alcanzar un pulso de 4.0 milisegundos) . Posteriormente, se agrega 0.5 mi de medio 2xYT (o medio SOC) a temperatura ambiente a la cubeta y se transfiere a un tubo con tapa a presión de 15 mi (por ejemplo, un tubo FALCON™} . Las células se incuban a 28-30 °C, 200-250 rpm durante 3 h.

Los alícuotas de 250 mi se distribuyen en placas que contienen medio YM y 50 pg/ml de espectinomicina y se incuban 3 días a 28-30 °C. Para incrementar la cantidad de transformantes, se puede realizar uno de dos pasos opcionales: Opción 1. Recubrir las placas con 30 mi de rifampicina de 15 mg/ml . El LBA4404 tiene un gen de resistencia cromosómica para la rifampicina. Esta selección adicional elimina algunas colonias contaminantes observadas cuando se usa preparaciones más deficientes de células competentes de LBA4404.

Opción 2. Realizar dos réplicas de la electroporación para compensar las células electrocompetentes más deficientes.

Identificación de transformantes : Cuatro colonias independientes se seleccionan y se dispersan en placas que contienen medio mínimo AB y 50 µg/ml de espectinomicina para aislar las colonias simples. Las placas se incuban a 28 °C durante dos a tres días. Se escoge una sola colonia para cada cointegrado putativo y se inocula con 4 mi de 10 g/1 de bactopeptona, 10 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de cloruro sódico y 50 mg/1 de espectinomicina. La mezcla se incuba durante 24 h a 28 °C con agitación. El ADN de plásmidos de 4 mi de cultivo se aisla con el uso de minipreparación de Qiagen y un lavado con regulador PB opcional . El ADN es eluido en 30 µ? . Los alícuotas de 2 µ? se usan para electroporar 20 µ? de DHlOb + 20 µ? de H20 dos veces destilada tal como se mencionó anteriormente. Opcionalmente, se puede usar un alícuota de 15 µ? para transformar 75-100 µ? de Library Efficiency DH5a de INVITROGEN™. Las células se distribuyen en placas que contienen medio BI y 50 µg/ml de espectinomicina y se incuban a 37 °C durante la noche.

Se selecciona de tres a cuatro colonias independientes para cada cointegrado putativo y se inoculan con 4 mi de medio 2xYT (10 g/1 de bactopeptona, 10 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de cloruro sódico) con 50 mg/ml de espectinomicina. Las células se incuban a 37 °C durante la noche con agitación. Después se aisla el ADN de plásmidos de 4 mi de cultivo con el uso de la minipreparación de QIAprep® con lavado de regulador PB adicional (eluido en 50 mi) . Se usa 8 mi para la digestión con Salí (con el uso del ADN progenitor y PHP10523 como controles) . Se realiza otras tres digestiones más con el uso de las enzimas de restricción BamHI, EcoRI y HindIII para 4 plásmidos que representan 2 cointegrados putativos con patrón de digestión de Salí correcto (con el uso del ADN progenitor y PHP10523 como controles) . Se recomienda geles electrónicos para comparación.

Alternativamente, para aplicaciones de gran productividad tales como las descritas para líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint (Ejemplo 16), en vez de evaluar los vectores cointegrados resultantes mediante el análisis de restricción, se puede usar simultáneamente tres colonias para la etapa de infección, tal como se describe en el Ejemplo 13 (transformación vía Agrobacterium) .

Ejemplo 13 Transformación del maíz por medio del uso de Agrobacterium plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de varias especies para examinar el fenotipo resultante.

La transformación de maíz mediada por Agrobacterium se realiza prácticamente como lo describen Zhao et al., en Meth. Mol. Biol. 318:315-323 (2006) (ver también Zhao et al., Mol. Breed. 8:323-333 (2001) y la patente de los Estados Unidos núm. 5,981,840 otorgada el 9 de noviembre de 1999, incorporada en la presente descripción como referencia) . El proceso de transformación requiere inoculación bacteriana, cocultivo, reposo, selección y regeneración vegetal. 1. Preparación de embriones inmaduros: Los embriones inmaduros de maíz se separan de las cariopses y se colocan en un microtubo de 2 mi que contiene 2 mi de medio PHI-A. 2. Infección de Agrobacterium y cocultivo de embriones inmaduros : 2.1 Etapa de infección: Se retira el medio PHI-A de (1) con una micropipeta de 1 mi, y se añade 1 mi de suspensión de Agrobacterium. El tubo se invierte cuidadosamente para mezclar. La mezcla se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. 2.2 Etapa de cocultivo: La suspensión de Agrobacterium se retira de la etapa de infección con una micropipeta de 1 mi. Con el uso de una espátula estéril, los embriones se desprenden del tubo y se transfieren a una placa de medio PHI-B en una caja petri de 100x15 mm . Los embriones se orientan con su eje hacia abajo sobre la superficie del medio. Las placas con los embriones se cultivan a 20 °C, en la oscuridad, durante tres días. Se puede usar L-cisteína en la fase de cocultivo. Con el vector binario estándar, el medio de cocultivo proporcionado con 100-400 mg/1 de L-cisteína es crítico para recuperar eventos transgénicos estables. 3. Selección de eventos transgénicos putativos : Para cada placa de medio PHI-D en una caja petri de 100x15 mm se transfiere 10 embriones, se conserva la orientación y los platos se sellan con parafilm. Las placas se incuban en la oscuridad a 28 °C. Se espera que los eventos putativos de crecimiento activo, como tejido embrionario amarillo pálido, sean visibles en seis a ocho semanas. Los embriones que no producen eventos pueden ser cafés y necróticos y el poco crecimiento de tej ido friable es evidente . El tej ido embrionario transgénico putativo se subcultiva en placas de PHI-D fresco en intervalos de dos a tres semanas, dependiendo del índice de crecimiento. Se registran los eventos.

. Regeneración de plantas T0 : El tejido embrionario propagado en medio PHI-D se subcultiva en medio PHI-E (medio de maduración de embrión somático) , en cajaB petri de 100x25 mm y se incuban a 28 °C, a oscuras, hasta que maduran los embriones somáticos, durante aproximadamente diez a dieciocho días. Los embriones somáticos maduros e individuales con escutelo y coleóptilo bien definidos se transfieren al medio de germinación de embriones PHI-F y se incuban a 28 °C en la luz (aproximadamente a 80 µ? de las lámparas de luz blanca o lámparas fluorescentes equivalentes) . En siete a diez días, las plantas regeneradas de aproximadamente 10 cm de altura se colocan en macetas en una mezcla hortícola y endurecida con el uso de métodos hortícolas estándar.

Medios para la transformación vegetal : 1. PHI-A: 4 g/1 de sales básales CHU, 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas Eriksson 1000X, 0.5 mg/1 de tiamina HCl, 1.5 mg/1 de 2,4-D, 0.69 g/1 de L- prolina, 68.5 g/1 de sacarosa, 36 g/1 de glucosa, pH 5.2. Se agrega 100 uM de acetosiringona (esterilizada con filtro) . 2. PHI-B: PHI-A sin glucosa, 2,4-D incrementado a 2 mg/1, sacarosa reducida a 30 g/1 y suplementado con 0.85 mg/1 de nitrato de plata (esterilizado con filtro), 3.0 g/1 de Gelrite®, 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro), pH 5.8. 3. PHI-C: PHI-B sin Gelrite® y acetosiringona, 2,4- D reducido a 1.5 mg/1 y suplementado con 8.0 g/1 de agar, 0.5 g/1 de regulador de ácido 2- [N- morfolino] etano sulfónico (MES), 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro) . 4. PHI-D: PHI-C suplementado con 3 mg/1 de bialafos (esterilizados con filtro) . 5. PHI-E: 4.3 g/1 de sales de Murashige and Skoog (MS) , (Gibco, BRL 11117-074), 0.5 mg/1 de ácido nicotínico, 0.1 mg/1 de tiamina HC1, 0.5 mg/1 de piridoxina HC1, 2.0 mg/1 de glicina, 0.1 g/1 de mio-inositol, 0.5 mg/1 de zeatina (Sigma, cat . núm. Z-0164) , 1 mg/1 de ácido indol acético (AIA) , 26.4 g/l de ácido abscísico (ABA), 60 g/1 de sacarosa, 3 mg/1 de bialafos (esterilizados con filtro) , 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro), 8 g/1 de agar, pH 5.6. 6. PHI-F: PHI-E sin zeatina, AIA ni ABA; sacarosa reducida a 40 g/1; reemplazo de agar con 1.5 g/1 de Gelrite®; pH 5.6.

Las plantas pueden regenerarse a partir del callo transgénico al transferir primeramente grupos de tej ido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tej ido se puede transferir al medio regenerativo (Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990)).

Las plantas transgénicas T0 se pueden regenerar, y se puede determinar su fenotipo. Se puede recolectar semillas TI.

Las plantas TI se pueden cultivar bajo condiciones limitantes de nitrógeno, por ejemplo, 1 mM de nitrato y se pueden analizar para detectar cambios fenotípicos. Los siguientes parámetros se pueden cuantificar con el uso del análisis de imágenes: el área de la planta, el volumen, el índice de crecimiento y el análisis del color se pueden recolectar y cuantificar. Los constructos de sobreexpresión que se producen en una alteración, en comparación con plantas control adecuadas, en verdor (cubeta de color verde) , producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco o seco en la maduración, producción de frutos o semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos o semillas, contenido de nitrógeno en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en la planta completa, contenido de aminoácidos libres en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos o semillas, contenido proteico en los frutos o semillas o contenido proteico en un tejido vegetativo se pueden considerar como evidencia de que un gen líder de Arabidopsis funciona en el maíz para aumentar la tolerancia a la reducción de nitrógeno (tolerancia aumentada al nitrógeno) .

Además, se puede introducir un constructo de ADN recombinante que contiene un gen de Arabidopsis validado en una línea de maíz endogámica, ya sea mediante transformación directa o introgresión de una línea transformada por separado .

Ejemplo 14A Preparación del vector de expresión para la transformación de líneas de maíz con el gen candidato de Arabidopsis validado (At2g06005) con el uso de Agrobacterium Con el uso de la tecnología GATEWAY® de INVITROGEM™, una reacción de recombinación LR se puede realizar con el mismo clon de entrada GATEWAY® descrito en el Ejemplo 5 (que contiene el gen de LNT6 de Arabidopsis) , clon de entrada PHP23112 (sec. con núm. de ident.:14), clon de entrada PHP20234 (sec. con núm. de ident.:9; Fig. 9) y el vector objetivo PHP22655 (sec. con núm. de ident.:10) para crear el plásmido precursor PHP30916, que tiene los siguientes casetes de expresión: 1. Promotor de ubiquitina :: moPAT :: cásete terminador Pinll que expresan el gen de resistencia a herbicidas PAT que se usa para la selección durante el proceso de transformación . 2. Promotor LTP2 : :DS~RED2 :: cásete terminador Pinll que expresan el gen marcador de color DS-RED que se usa para la clasificación de semillas . 3. Promotor de ubiquitina : :AT-LNT6 :: cásete terminador Pinll que sobreexpresan el gen de interés, LNT6 de Arabidopsis .

Ejemplo 14B Transformación de líneas de maíz con el gen candidato de Arabidopsis (At2g06005) con el uso de Agrobacteríum El cásete de expresión de LNT6 descrito en el Ejemplo 14A se puede introducir en una línea endogámica de maíz o en una línea transformable de maíz derivada de una línea endogámica élite de maíz con el uso de la transformación mediada por Agrobacteríum, tal como se describió en los Ejemplos 12 y 13.

El vector de expresión PHP30916 se puede electroporar en la cepa LBA4404 de Agrobacteríum que contiene el vector PHP10523 (sec. con núm. de ident . : 7 , Fig. 7) para crear un vector cointegrado, PHP30943, formado mediante recombinación por medio de los sitios COS contenidos en cada vector. El vector cointegrado tendría los mismos tres casetes de expresión que se mencionaron anteriormente (Ejemplo 14A) además de los otros genes (TET, TET, TRFA, terminador ORI, CTL, ORI V, VIR Cl, VIR C2 , VIR G, VIR B) necesarios para la cepa de Ag ojbacfcerium y la transformación mediada por Agrobacteríum. Se puede usar el protocolo de electroporación del Ejemplo 12, pero no se limita a éste.

Ejemplo 14C Preparación del vector de expresión para la transformación de líneas de maíz con homólogos del maíz Con el uso de la tecnología GATEWAY® de INVITROGEN™, se puede realizar una reacción de recombinación LR para un clon de entrada descrito en el Ejemplo 9, clon de entrada PHP23112 (sec. con núm. de ident.:14), clon de entrada PHP20234 (sec. con núm. de ident.:9; Fig. 9) y vector objetivo PHP22655 (sec. con núm'. de ident.:10) para crear un plásmido precursor (PHP33632) con los siguientes casetes de expresión: 1. Promotor de ubiquitina : -.moPAT : : cásete terminador Pinll que expresan el gen de resistencia a herbicidas PAT que se usa para la selección durante el proceso de transformación. 2. Promotor LTP2 : :DS-RED2 :: cásete terminador Pinll que expresan el gen marcador de color DS-RED que se usa para la clasificación de semillas. 3. Promotor de ubiquitina :: homólogo de LNT6 de maíz:: cásete terminador Pinll que sobreexpresan el gen de interés (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica la sec. con núm. de ident . : 18) .

Ejemplo 14D Transformación de líneas de maíz con líneas homologas de maíz con el uso de Agrobacterium El cásete de expresión que contiene el homólogo de LNT6 de maíz, descrito en el Ejemplo 14C, puede introducir en una línea endogámica de maíz o una línea transformable de maíz derivada de una línea endogámica élite de maíz, con el uso de la transformación mediada por Agrohacterium tal como se describió en los Ejemplos 12 y 13.

El vector de expresión (plásmido precursor PHP33632 descrito en el Ejemplo 14C) se puede electroporar en la cepa LBA4404 de Agrohacterium que contiene el vector PHP10523 (sec. con núm. de ident. :7, Fig. 7) para crear un vector cointegrado PHP33706 formado mediante recombinación por medio de los sitios COS contenidos en cada vector. El vector cointegrado contiene los mismos tres casetes de expresión que se mencionaron anteriormente (Ejemplo 14C) además de los otros genes (TET, TET, TRFA, terminador ORI, CTL, ORI V, VIR Cl, VIR C2, VIR G, VIR B) necesarios para la cepa de Agrohacterium y la transformación mediada por Agrohacterium. Se puede usar el protocolo de electroporación del Ejemplo 12, pero no se limita a éste.

Ejemplo 15 Preparación del vector objetivo PHP23236 para la transformación en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint El vector objetivo PHP23236 (Fig. 6; sec. con núm. de ident.: 6) se obtuvo mediante la transformación de la cepa LBA4404 de Agrohacterium que contiene PHP10523 (Fig. 7; sec. con núm. de ident. :7) con el vector PHP23235 (Fig. 8; sec. con núm. de ident.: 8) y el aislamiento del producto cointegrado resultante.

El vector objetivo PHP23236 se puede usar en una reacción de recombinación con un clon de entrada, tal como se describe en el Ejemplo 16 para crear un vector de expresión del maíz para la transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint.

E emplo 16 Preparación de constructos de expresión para la transformación en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint Con el uso de la tecnología de recombinación LR GATEWAY® de INVITROGEN™, el mismo clon de entrada descrito en el Ejemplo 5 (que contiene el gen de LNT6 de Arabidopsis) se puede clonar direccionalmente en el vector objetivo PHP23236 de GATEWAY® (sec. con núm. de ident.:6; Fig. 6) para crear un vector de expresión. Este vector de expresión tendría el ADNc de interés bajo control del promotor UBI y es un T-ADN binario para la transformación mediada por Agrobacterium en el maíz tal como se describe, pero que no se limita a, los ejemplos descritos en la presente invención.

Ejemplo 17A Transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint con el gen candidato de Arabidopsis validado (At2g06005) Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar el gen de At2g06005 de Arabidopsis (y los homólogos correspondientes de otras especies) para examinar el fenotipo resultante. Se puede usar constructos de expresión como el descrito en el Ejemplo 16.

Plantas receptoras Las células de plantas receptoras pueden ser de una línea de maíz uniforme con un ciclo de vida corto ("ciclo rápido") , de tamaño reducido y de alto potencial de transformación. Típico de estas células vegetales para maíz son las células vegetales de cualquiera de las variedades de, líneas de Gaspe Flint (6BF) disponibles al público. Una posible variedad de líneas de plantas candidatas es la de híbridos Fl de GBF x QTM (Quick Turnaround aize, una forma de Gaspe Flint disponible al público seleccionada para el crecimiento bajo condiciones de invernadero) que se describe en Tomes et al., (solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 10/367,416 presentada el 13 de febrero de 2003; publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0221212 Al publicada el 27 noviembre de 2003) . Las plantas transgénicas obtenidas de esta línea son de un tamaño reducido que se pueden cultivar en macetas de 10.2 cm (cuatro pulgadas) (1/4 del espacio requerido para una planta de maíz de tamaño normal) y maduran en menos de 2.5 meses. (Tradicionalmente, se requiere 3.5 meses para obtener semillas transgénicas T0 una vez que las plantas transgénicas se aclimatan al invernadero.) Otra línea adecuada incluye, pero no se limita a, una línea doble haploide GS3 (una línea altamente transformable) X Gaspe Flint. Otra línea adecuada adicional es una línea endogámica élite de maíz transformable que lleva un transgen que causa floración, estatura reducida o ambas Protocolo de transformación Se puede usar cualquier método adecuado para introducir los transgenes en las células de maíz; los métodos incluyen, pero no se limitan a, procedimientos tipo inoculación con el uso de vectores basados en Agrobacterium (véase, por ejemplo, el Ejemplo 12) . La transformación se puede realizar en embriones inmaduros de la planta receptora (objetivo) .

Cultivo de precisión y seguimiento de las plantas La población del evento de las plantas transgénicas (T0) resultante de los embriones de maíz transformado se cultiva en un ambiente controlado de invernadero con el uso de un diseño de bloqueo aleatorizado modificado para reducir o eliminar el error ambiental . Un diseño de bloques aleatorio es una presentación vegetal en donde las plantas experimentales se dividen en grupos (por e emplo, treinta plantas por grupo) denominados bloques y a cada planta se le asigna aleatoriamente una localización dentro del bloque.

Para un grupo de treinta plantas, veinticuatro plantas experimentales, transformadas y seis plantas de control (plantas con un fenotipo establecido) (colectivamente, un "grupo de réplicas") se colocan en macetas arregladas en matriz (también conocido como grupo de réplicas o de bloques) en una tabla ubicada dentro del invernadero. Cada planta, de control o experimental, se asigna aleatoriamente a una localización dentro del bloque mapeada hacia la localización física y única de un invernadero, así como al grupo de réplicas. Múltiples grupos de réplicas de treinta plantas cada una se pueden cultivar en el mismo invernadero en un solo experimento. La presentación (arreglo) de los grupos de réplicas debería determinarse para minimizar los requerimientos de espacio, así como los efectos ambientales dentro del invernadero. Tal presentación puede denominarse presentación de invernadero comprimido.

Una alternativa a la adición de un grupo de control específico es identificar las plantas transgénicas que no expresan el gen de interés. Una gran variedad de técnicas, tales como TI-PCR, se puede aplicar para analizar cuantitativamente el nivel de expresión del gen introducido. Las plantas TO que no expresan el transgen se pueden comparar con las que sí lo expresan.

Cada planta en la población del evento se identifica y se monitorea por todo el proceso de evaluación y la información recopilada de esa planta se asocia automáticamente con esa planta, de modo que la información recopilada se puede asociar con el transgen transportado por la planta. Por ejemplo, cada contenedor de plantas puede tener una etiqueta legible para computadora (tal como un código de barras del Código Universal de Productos (UPC, por sus siglas en inglés) ) que incluye la información de la identidad de la planta, que a su vez se correlaciona con una localidad del invernadero, de modo que la información obtenida de la planta se puede asociar automáticamente con esa planta.

Alternativamente, se puede usar cualquier sistema de identificación de plantas eficiente y legible para computadora, tal como códigos de matriz bidimensional o incluso etiquetas de identificación por radiofrecuencia (RFID, por sus siglas en inglés) , en donde la información se recibe y se interpreta por un receptor/procesador de radiofrecuencias. Véase la solicitud de los Estados Unidos núm. 10/324,288 presentada el 19 diciembre de 2002 (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2004/0122592 Al publicada el 24 de junio de 2004) , que se incorpora en la presente descripción como referencia.

Análisis fenotípico con el uso de imágenes tridimensionales Cada planta del invernadero en la población del evento T0, incluso cualquier planta control, se analiza por las características agronómicas de interés y la información agronómica para cada planta se registra o se almacena de modo que se asocie con información que la identifique (ver arriba) La confirmación de un fenotipo (efecto de los genes) se puede obtener en la generación TI con un diseño experimental similar al descrito anteriormente.

Las plantas T0 se analizan a nivel fenotípico con el uso de tecnología de imágenes cuantitativa y no destructiva por medio del ciclo de vida completo en invernadero de las plantas para analizar las características de interés. Se puede usar un analizador digital de imágenes para el análisis multidimensional automático de las plantas completas. La obtención de imágenes se puede realizar adentro del invernadero . Para ver la planta de todos lados se usa dos sistemas de cámara colocados en la parte superior y al lado, así como un aparato para girar la planta. Las imágenes se obtienen desde la parte superior, frontal y a un lado de cada planta. Las tres imágenes juntas proporcionan suficiente información para examinar, por ejemplo, la biomasa, el tamaño y la morfología de cada planta.

Debido al cambio en el tamaño de las plantas desde el momento en que aparece la primera hoja del suelo hasta el momento en que las plantas se encuentran en el final de su desarrollo, las etapas tempranas del desarrollo de la planta se pueden documentar con una magnificación mayor desde la parte superior. La obtención de imágenes se puede realizar con el uso de un sistema de lentes de acercamiento motorizado controlado completamente por un programa de imágenes .

En una sola operación de análisis de imágenes, ocurren los siguientes eventos: (1) la planta se lleva dentro del área del analizador, se gira 360 grados de modo que su etiqueta legible para la computadora se pueda leer y se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse; (2) la imagen lateral se toma y se ingresa en una base de datos; (3) la planta se gira 90 grados y nuevamente se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse y (4) la planta se retira del analizador.

Las plantas se dejan por lo menos seis horas en la oscuridad por un período de veinticuatro horas para que tengan un ciclo normal de día/noche.

Instrumentación de imágenes Se puede usar cualquier tipo de instrumentación de imágenes, incluso, pero sin limitarse a, la instrumentación de imágenes digital de espectro de luz comercialmente disponible de LemnaTec GmbH of Wurselen, Alemania. Las imágenes se toman y se analizan con un LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 con un dispositivo de obtención de imágenes IT Progressive Sean IEE CCD de 1/2". Las cámaras de imágenes pueden estar equipadas con acercamiento motorizado, apertura motorizada y enfoque motorizado. Toda la configuración de la cámara se puede realizar con el uso del programa LemnaTec. Por ejemplo, la varianza instrumental del analizador de imágenes es menor que aproximadamente 5 % para componentes mayores y menor que aproximadamente 10 % para componentes menores.

Programas El sistema de análisis de imágenes comprende un programa informático de LemnaTec HTS Bonit para análisis de color y arquitectura y una basa de datos del servidor para almacenar datos desde aproximadamente 500,000 análisis, que incluyen las fechas de análisis. Las imágenes originales y las imágenes analizadas se almacenan juntas para permitir que el usuario reanalice tanto como desee. La base de datos se puede conectar al hardware de imágenes para la recolección y almacenamiento automático de datos. Se puede usar una gran variedad de sistemas de programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Matlab y otros) para la interpretación cuantitativa de los datos de imágenes, así como cualquiera de estos sistemas de programas para aplicarlo al grupo de datos de imágenes.

Sistema transportador Se puede usar un sistema transportador con un dispositivo giratorio de plantas para transportar las plantas al área de imágenes y girarlas durante la obtención de las imágenes. Por ejemplo, hasta cuatro plantas, cada una con una altura máxima de 1.5 m, se colocan en carros para pasar sobre el sistema transportador circular y por el área de medición de imágenes. En este caso, la huella total de la unidad (analizador de imágenes y lazo del transportador) es de aproximadamente 5 m x 5 m.

El sistema transportador se puede agrandar para acomodar más plantas a la vez . Las plantas se transportan a lo largo del lazo del transportador hacia el área de imágenes y se analizan hasta 50 segundos por planta. Se toman las vistas de la planta. El sistema transportador, así como el equipo de imágenes, debe poder usarse en condiciones ambientales de invernadero.

Iluminación Cualquier modo adecuado de iluminación se puede usar para la captación de imágenes. Por ejemplo, se puede usar una luz en la parte superior sobre un fondo negro. Alternativamente, se puede usar una combinación de luz superior y posterior con un fondo blanco . El área iluminada se debe encerrar para asegurar condiciones constantes de iluminación. El alojamiento debe ser mayor que el área de medición de modo que prevalezcan las condiciones constantes de iluminación sin necesidad de abrir, cerrar o puertas. Alternativamente, la iluminación se puede variar para causar la activación ya sea del transgen (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés), proteína fluorescente roja (RFP, por sus siglas en inglés) ) o de fluoróforos endógenos (por e emplo, clorofila) .

Cálculo de la masa en base a imágenes tridimensionales Para el mejor cálculo de la biomasa, las imágenes de la planta se deben tomar por lo menos desde tres ejes, por ejemplo, la vista superior y dos vistas laterales (lados 1 y 2) . Después, estas imágenes se analizan para separar la planta del fondo, de la maceta y de la bolsa de control de polen (si aplica) . El volumen de la planta se puede calcular mediante el cálculo: Volumen (vóxelee) = ^jÁrea superior (píxeles) x-^Área del lado 1 [pxxeles) x-J Área del lado 2{píxeles) En la ecuación anterior las unidades de volumen y área son "unidades arbitrarias" . Las unidades arbitrarias son completamente suficientes para detectar efectos genéticos en el tamaño y crecimiento de las plantas en este sistema ya que lo que se desea es detectar las diferencias (tanto las mayores-positivas como las menores-negativas) del medio experimental o del medio de control . Las unidades arbitrarias de tamaño (por ejemplo, el área) se pueden convertir trivialmente en mediciones físicas mediante la adición de una referencia física para el proceso de imágenes. Por ejemplo, una referencia física de área conocida se puede incluir tanto en el proceso de imágenes superiores como en el de imágenes laterales . En base al área de estas referencias físicas, se puede determinar un factor de conversión para permitir la conversión de pixeles a una unidad de área tal como centímetros cuadrados (cm2) . La referencia física puede o no ser una muestra independiente. Por ejemplo, la maceta, con un diámetro y altura conocidos, podría servir como una referencia física adecuada.

Clasificación de color La tecnología de imágenes también se puede usar para determinar color de la planta y para asignar los colores de las plantas a varias clases de color. La asignación del color de las imágenes a las clases de color es una característica propia del programa LemnaTec. Con otros sistemas de programas de análisis de imágenes, la clasificación de color se puede determinar por una gran variedad de planteamientos computacionales .

Para la determinación de los parámetros del tamaño y crecimiento de las plantas se presenta un esquema de clasificación útil para definir un esquema simple de color que incluye dos o tres degradaciones de verde (por ejemplo, tonos 50-66, véase la Fig. 12) y, adicionalmente , una clase de color para clorosis, necrosis y blanqueamiento, si ocurrieran estas condiciones . También se usa una clase de color de fondo que incluye colores en la imagen que no son de plantas (por ejemplo, colores de macetas y suelo) y estos pixeles se excluyen, específicamente, de la determinación del tamaño. Las plantas se analizan bajo iluminación constante controlada de modo que no se pueda cuantificar ningún cambio dentro de una planta con el tiempo o entre plantas o diferentes lotes de plantas (por ejemplo, diferencias temporales) .

Además de su utilidad en determinar el crecimiento de la planta, la clasificación de color se puede usar para analizar otros rasgos del componente de producción. Para estos otros rasgos del componente de producción se puede usar esquemas adicionales de la clasificación del color. Por ejemplo, el rasgo conocido como "siempre verde", que se ha asociado con mejorías en el rendimiento, se puede analizar mediante la clasificación de color que separa las degradaciones de verde de las sombras de amarillo y café (que son indicativos de tejidos senescentes) . Si se aplica esta clasificación de color a las imágenes tomadas hacia el final del ciclo de vida de las plantas TO o TI, se puede identificar las plantas con cantidades aumentadas de colores de verde en relación con los colores amarillo o café (expresados, por ejemplo, como relación verde/amarillo). Las plantas con una diferencia importante en esta relación verde/amarillo se pueden identificar como transgenes portadores que impactan este rasgo agronómico importante.

El biólogo experto en plantas reconocerá que surgen otros colores de plantas que pueden indicar salud de la planta o respuesta al estrés (por ejemplo, antocianina) y que otros esquemas de clasificación de color pueden proporcionar medidas adicionales de la acción genética en rasgos relacionados con estas respuestas.

Análisis de la arquitectura de la planta Los transgenes que modifican los parámetros de la arquitectura de la planta también se pueden identificar con el uso de la presente invención, incluso los parámetros tales como altura y anchura máxima, distancias internodales, ángulo entre las hojas y el tallo, cantidad de hojas que surgen de los nodulos y longitud de las hojas. El programa del sistema LemnaTec se puede usar para determinar la arquitectura de la planta de la siguiente manera. La planta se reduce a su arquitectura geométrica principal en una primera etapa de imágenes y después, en base a esta imagen, se puede realizar la identificación parametrizada de los diferentes parámetros de arquitectura. Los transgenes que modifican cualquiera de estos parámetros de arquitectura, ya sea solos o combinados, se pueden identificar mediante la aplicación de los enfoques estadísticos descritos anteriormente.

Fecha de esparcimiento del polen La fecha de esparcimiento del polen es un parámetro importante de analizar en una planta transformada y se puede determinar mediante la primera aparición en la planta de una flor macho activa. Para encontrar el elemento de la flor macho, el extremo superior del tallo se clasifica por color para detectar anteras amarillas o violeta. Este análisis de la clasificación de color después se usa para definir una flor activa, que a su vez se puede usar para calcular la fecha de esparcimiento del polen.

Alternativamente, el personal responsable del cuidado de las plantas puede registrar la fecha de esparcimiento de polen y otras características de las plantas que se detectan visualmente con facilidad (por ejemplo, fecha de polinización, primer día de seda) . Para maximizar la integridad de los datos y la eficacia del proceso, esta información se monitorea mediante el uso de los mismos códigos de barra usados por el dispositivo de análisis digital de espectro de luz de LemnaTec . Una computadora con lector de códigos de barras, un dispositivo tipo palm o un ordenador portátil se pueden usar para facilitar la captura de datos por medio de registrar las horas de observación, el identificador vegetal y el operador que captó los datos.

Orientación de las plantas Las plantas maduras de maíz cultivadas a densidades que se aproximan a la siembra comercial usualmente tienen una arquitectura plana. Es decir, la planta tiene un lado ancho claramente observable y un lado estrecho. La imagen de la planta está determinada por el lado ancho. Para cada planta se asigna una orientación básica bien definida para obtener la máxima diferencia entre el lado ancho y las imágenes de lado. La imagen superior se usa para determinar el eje principal de la planta y se usa un dispositivo giratorio adicional para posicionar la planta en la orientación adecuada antes de empezar la captación principal de imágenes.

Ejemplo 17B Transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint con homólogos de maíz Con el uso de la tecnología de recombinación LR de GATEWAY® de I VITROGEN™ se puede crear un clon de entrada para un homólogo de maíz (sec. con núm. de ident .: 17/18) (véase el Ejemplo 9 para la preparación del clon de entrada) para después clonarlo direccionalmente en el vector objetivo PHP23236 de GATEWAY® (sec. con núm. de ident.:6; Fig. 6) para crear un vector de expresión. El vector de expresión tendría el ADNc de interés bajo control del promotor UBI y es un T-ADN binario para la transformación mediada por Agrobacterium en el maíz, tal como se describe en, pero que no se limita a, los ejemplos descritos en la presente invención.

Ejemplo 18 Ensayo de líneas de maíz derivadas de Gaspe Plint bajo condiciones limitantes de nitrógeno Las plantas transgénicas contendrán dos o tres dosis de Gaspe Flint-3 con una dosis de GS3 (GS3/ (Gaspe-3 ) 2X o de GS3/ (Gaspe-3) 3X) y segregarán 1:1 para un transgen dominante. Las plantas se sembrarán en TURFACE, un medio comercial para macetas y se regarán cuatro veces cada día con medio de crecimiento de 1 mM de N03 y con medio de crecimiento de 2 mM de KM03 o más (véase la Fig. 4) . Las plantas de control cultivadas en 1 mM de medio KN03 serán menos verde, producirán menos biomasa y tendrán una espiga más pequeña en la antesis (véase la Figura 5 para una ilustración de la información de muestra) . Las líneas derivadas de Gaspe se cultivarán hasta la etapa de floración.

Las estadísticas se usan para decidir si las diferencias observadas entre los tratamientos son realmente diferentes. La Fig. 14 ilustra un método que coloca letras después de los valores. Los valores en la misma columna que tienen después la misma letra (no grupo de letras) no son significativamente diferentes. Con el uso de este método, si no hay letras después de los valores en una columna, entonces no hay diferencias significativas entre ninguno de los valores en esa columna o, en otras palabras, todos los valores en esa columna son iguales.

La expresión de un transgen resultará en plantas con crecimiento mejorado en 1 mM de N03 en comparación con un nulo transgénico. De este modo, la biomasa y el verdor (tal como se describe en el Ejemplo 11) se monitorearán durante el crecimiento y se compararán con un nulo transgénico. Las mejorías en el crecimiento, el verdor y el tamaño de las espigas en antesis serán indicadores de la tolerancia aumentada al nitrógeno.

Ejemplo 19 Prueba de eficacia del uso de nitrógeno en plántulas Se realizaron dos experimentos por separado con el uso de eventos transgénicos de las semillas. En el primer experimento, los eventos transgénicos de las semillas se separaron en semillas transgénicas (Tratamiento 1; que contienen el constructo PHP30943) y nulas (Tratamiento 2) con el uso de un marcador de color de semillas. En el segundo experimento los eventos transgénicos de las semillas se separaron en semillas transgénicas (Tratamiento 1; que contienen el constructo PHP33706) y nulas (Tratamiento 2) con el uso de un marcador de color de semillas.

Cada uno de los tratamientos (transgénicos o nulos en masa) se asignó aleatoriamente a los bloques de 54 macetas (unidades experimentales) dispuestas en 6 filas y 9 columnas. Cada tratamiento (transgénico o nulo en masa) se replicó 9 veces.

Todas las semillas se sembraron en macetas cuadradas de 10.2 cm (4 pulgadas) que contenían Turface en centros escalonados de 20.3 cm (8 pulgadas) y se regaron cuatro veces cada día con una solución que contiene los siguientes nutrientes : Después de la emergencia las plantas se redujeron a una semilla por maceta. En la cosecha las plantas se retiraron de las macetas y se lavó el Turface de las raíces. Las raíces se separaron de los brotes, se colocaron en una bolsa de papel y se secaron a 70 °C durante 70 horas. Las partes secas de las plantas (raíces y brotes) se pesaron y se colocaron en un tubo cónico de 50 mi con bolas de acero de aproximadamente 51.2 cm (20 5/32 pulgadas) y después se trituraron con agitación en un agitador de pintura.

El analizador de nitrógeno/proteína de Thermo Electron Corporation (modelo FlashEA 1112 N) usa aproximadamente 30 mg del tejido triturado. Se extrae una muestra del automuestreador hacia el crisol dentro de la cámara de oxidación del reactor. A 900 °C y oxígeno puro, la muestra se oxida mediante una fuerte reacción exotérmica que produce una mezcla gaseosa de N2, C02, ¾0 y S02. Después de finalizar la combustión, se enciende el gas helio portador y la mezcla gaseosa fluye hacia la cámara de reacción de reducción. A 680 °C, la mezcla gaseosa fluye a través del cobre de reducción en donde los óxidos de nitrógeno probablemente formados se convierten en nitrógeno elemental y se retiene el exceso de oxigeno. Desde el reactor de reducción, la mezcla gaseosa fluye a través de una serie de dos filtros de absorción. El primer filtro contiene cal sodada y retiene los dióxidos de carbono y azufre. El segundo filtro contiene tamices moleculares y gel de sílice granular para retener el agua. Después, el nitrógeno se eluye en la columna cromatogr fica y se conduce hacia el detector de conductividad térmica que genera una señal eléctrica, que procesada adecuadamente por el programa Eager 300 proporciona el porcentaje de nitrógeno-proteína.

Con estos datos, se determinó los siguientes parámetros y las medias de los parámetros transgénicos se compararon con las medias de los parámetros nulos con el uso de una prueba t de Student : La varianza se determinó dentro de cada bloque con un cálculo del análisis de varianza (AOVA) y un modelo de diseño completamente aleatorio (CRD) . Se calculó el efecto global del tratamiento para cada bloque con el uso de una estadística F al dividir el cuadrado promedio del tratamiento global del bloque por el cuadrado promedio del error global del bloque. La probabilidad de una prueba t de Student mayor se calculó para cada medio transgénico en comparación con el nulo adecuado. Un mínimo (P < t) de 0.1 se usó para definir las variables que mostraron una diferencia significativa. La Tabla 5 y la Tabla 6 muestran la probabilidad de Student de dos colas para las plantas que contienen los constructos PHP30943 y PHP33706, respectivamente, en donde las medias de las plantas transgénicas se comparan con el nulo correspondiente. El signo matemático del valor p refleja el rendimiento relativo del evento en comparación con el nulo correspondiente, es decir, '+ ' = rendimiento incrementado, '-' = rendimiento disminuido. UNS" significa que el valor p no fue significativo.

Las comparaciones se pueden realizar entre los eventos transgénicos y un constructo nulo o un evento nulo. Cada evento tiene un segregante positivo y negativo. Un constructo nulo es una entrada negativa constituida por un muestreo de granos de los segregantes negativos y, por lo tanto, es una muestra representativa de todos los negativos. Un evento nulo es una entrada negativa que es una entrada correspondiente para el evento. Por ejemplo, el evento 1 podría tener 9 segregantes positivos y 9 segregantes negativos; el análisis experimental se realizarla como un diseño correspondiente.

Todos los eventos en la Tabla 5 se compararon con el constructo nulo y ninguno mostró un incremento significativo en ninguna de las variables fenotxpicas medidas en comparación con el constructo nulo.

En la Tabla 6, los eventos E8266.48.3.11, E8266.48.3.13, E8266.48.3.19, E8266.48.3.2 y E8266.48.3.6 se compararon con los constructos nulos, mientras que los eventos E8266.48.2.2, E8266.48.4.2, E8266. 8.5.10 y E8266.48.5.2 se compararon con los eventos nulos. En comparación con los eventos nulos correspondientes, los eventos E8266.48.3.11 y E8266.48.4.2 tenían una concentración de N en la planta y un % total de N vegetativo aumentados; el evento E8266.48.5.10 demostró una biomasa radicular aumentada y una relación raíz/brote aumentada; y el evento E8266.48.5.2 tuvo una biomasa de brotes y un N total de la planta incrementados.

Tabla 5 Resultados del ensayo de plántulas NUE (PHP30943) 10 15 Tabla 6 Resultados del ensayo de plántulas NUE (PHP33706) 5 10 Ejemplo 20A Análisis de producción de lineas de maíz con el lnt6 o un homólogo de maíz similar a lnt6 de Arabidopsis Las plantas transgénicas, ya sea endogámicas o híbridas de cruce, pueden experimentar experimentos de campo más vigorosos para estudiar el rendimiento y/o estabilidad de la producción bajo condiciones limitantes y no limitantes de nitrógeno. Una prueba de producción estandarizada incluye, típicamente, de 4 a 6 réplicas y por lo menos 4 localizaciones.

Los análisis de producción posteriores se pueden realizar para determinar si las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis (lnt6) validado o un homólogo de maíz de lnt6 tienen una mejoría en el rendimiento de la producción (bajo condiciones limitantes y no limitantes de nitrógeno) , en comparación con las plantas control (o de referencia) que son un constructo nulo (para su definición, véase el Ejemplo 19) o silvestre. Específicamente, las condiciones limitantes de nitrógeno se pueden imponer durante el período de floración y/o de llenado de granos para plantas que contienen ya sea el gen guía de Arabidopsis validado o un homólogo de maíz de lnt6 y las plantas control. La reducción en la producción se puede medir para ambas. Las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado o un homólogo de maíz de lnt6 tienen menos pérdida de producción con relación a las plantas control, por ejemplo, por lo menos 25 % menos pérdida de producción, bajo condiciones limitantes de nitrógeno o tienen una producción aumentada con relación a las plantas control bajo condiciones no limitantes de nitrógeno.

Ejemplo 20B Análisis de producción de líneas de maiz transformadas con PHP30943 que codifican el gen guía At2g06005 de Arabdopsis Los cruces de prueba de híbridos de maíz que contienen el cásete de expresión L T6 presente en el vector PHP30943 y sus controles se cultivaron en ambientes con bajo contenido de nitrógeno (LN) y contenido normal de nitrógeno (NN) en Woodland, CA y en York, NE. Un ambiente con bajo contenido de nitrógeno (LN) consiste de una cantidad menor que la normal de fertilizante con nitrógeno que se aplica a principios de la primavera o del verano, mientras que un ambiente con contenido normal de nitrógeno (NN) consiste en agregar la cantidad adecuada de nitrógeno para producciones normales, en base a las normas de pruebas de suelos que establecen los servicios de extensión federales y estatales para ciertas áreas específicas de cultivo. En condiciones con LN se observó una reducción en la producción en comparación con la producción que se obtuvo en condiciones con NN.

Se realizó pruebas de campo en nueve eventos transgénicos en el 2008, en dos localidades, York, NE y Woodland, CA y se analizó la producción. Los cruces de prueba de híbridos de maíz se compararon con los constructos nulos (CN) . Los resultados en la prueba de campo del 2008 se presentan en la Tabla 7.

En York, bajo condiciones con bajo contenido de nitrógeno, el evento E7899.30.2.8 mostró un significativo incremento en la producción en comparación con el constructo nulo, mientras que bajo condiciones con contenido normal de nitrógeno, dos eventos, E7899.30.2.8 y E7899.30.3.6, mostraron aumento en la producción en comparación con el constructo nulo. En Woodland, dos eventos, E7899.30.3.13 y E7899.30.4.3, mostraron significativos incrementos en comparación con el constructo nulo bajo condiciones con contenido normal de nitrógeno.

Tabla 7 Pruebas de campo de 2008 de maíz transformado con PHP30943 York, Nebraska EVENTO PRODUCCION CON LN PRODUCCION CON NN CN 106.6 185.5 E7899.30.2.8 117.9 200.2 E7899.30.3.1 113.3 190.3 E7899.30.3.13 107 176.7 E7899.30.3.6 99.6 199.1 E7899.30.3.7 113.9 190 E7899.30. .1 101.7 192.5 E7899.30.4.3 113.4 184.5 E7899.30.4.7 105.9 193.6 E7899.30.6.4 110.6 182.4 oodland, CA El recuadro gris representa un resultado mayor de sig. (P<0.1) en comparación con el constructo nulo (CN) .

Ejemplo 21 Transformación y evaluación de frijol de soya con homólogos del frijol de soya de genes guía validados En base a las búsquedas de homología, es posible identificar uno o más homólogos candidatos del frijol de soya de los genes guía de Arabidopsis, y también se puede examinar su capacidad de aumentar la tolerancia a las condiciones limitantes de nitrógeno en el frijol de soya. El constructo de vectores, la transformación de la planta y el análisis fenotípico serán similares a los descritos anteriormente en los ejemplos.

Ejemplo 22 Transformación y evaluación del maíz con homólogos del maíz de genes guía validados En base a las búsquedas de homología, es posible identificar uno o más homólogos candidatos del maíz de los genes guía de Arabidopsis validados (por ejemplo, sec. con núm. de ident .: 17/18) , y también se puede examinar su capacidad de aumentar la tolerancia a las condiciones limitantes de nitrógeno en el maíz. El constructo de vectores, la transformación de la planta y el análisis fenotípico pueden ser similares a los descritos anteriormente en los ejemplos.

Ejemplo 23 Transformación de Arabidopsis con homólogos del gen guía validado Los homólogos del gen guía de Arabidopsis validado se pueden transformar en Arabidopsis bajo control del promotor 35S, el promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis u otros promotores específicos del tejido y se puede examinar el área de las hojas y la acumulación en la cubeta de color verde cuando se cultivan en un medio con bajo contenido de nitrógeno. El constructo de vectores y la transformación de la planta pueden ser tal como se describió en los ejemplos de la presente invención. Las condiciones de los ensayos, la recopilación de datos y el análisis de datos pueden ser similares a los descritos anteriormente en los ejemplos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, caracterizada porque el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47, y en donde la planta muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

2. Una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, caracterizada porque el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47, y en donde la planta muestra cierta alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

3. La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la por lo menos única característica agronómica es por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de aminoácidos libres en la planta completa, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semillas, contenido proteico en los frutos, contenido proteico en las semillas, contenido proteico en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de las plántulas y emergencia de las plántulas bajo estrés por temperatura baja.

4. La planta de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizada porque la planta muestra cierta alteración de por lo menos la única característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con la planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

5. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada porque el por lo menos único rasgo agronómico es la producción o la biomasa, y en donde la alteración es un incremento.

6. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de: maíz, frijol de soya, cañóla, arroz, trigo, cebada y sorgo.

7. La semilla de la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la semilla comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 O 47, y en donde una planta producida a partir de esta semilla muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno o cierta alteración de por lo menos una característica agronómica o ambas, en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un método para incrementar la tolerancia al nitrógeno en una planta, caracterizado porque introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident. :18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y obtener una planta progenie a partir de la planta transgénica de la etapa (b) , en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra tolerancia aumentada al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

9. Un método para evaluar la tolerancia al estrés nitrógeno en una planta, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenératele un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.:18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) evaluar la planta progenie para detectar tolerancia al estrés por nitrógeno en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

10. Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta, caracterizado porque comprende : (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V, en comparación con la sec. con núm. de ident.:18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 33, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, o 47; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (d) determinar si la planta progenie muestra alguna alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la etapa de determinación (d) comprende determinar si la planta transgénica muestra o no cierta alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, bajo condiciones limitantes de nitrógeno, con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque la por lo menos única característica agronómica es por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de aminoácidos libres en la planta completa, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en la semillas, contenido proteico en los frutos, contenido proteico en las semillas, contenido proteico en un tejido vegetativo, tolerancia a la seguía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, vigor temprano de las plántulas y emergencia de las plántulas bajo estrés por temperatura baja.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque el por lo menos único rasgo agronómico es la producción o la biomasa, y en donde la alteración es un incremento.

14. El método de conformidad con las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste de: maíz, frijol de soya, cañóla, arroz, trigo, cebada y sorgo.

15. Un polinucleótido aislado caracterizado porque que comprende : (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad del polipéptido LNT6, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 90 % de identidad de secuencias, en base al método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados del alineamiento en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 , en comparación con la sec. con núm. de ident . : 20, 24, 26, 28, 37 O 40 O (b) el complemento total de la secuencia de nucleótidos de (a) .

16. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la sec. con núm. de ident.: 20, 24, 26, 28, 37 o 40.

17. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la sec. con núm. de ident.: 19, 23, 25, 27, 36 o 39.

18. Una planta o semilla que comprende un constructo de ADN recombinante, caracterizada porque el constructo de ADN recombinante comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora.