CN102203263A - 在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物和涉及编码lnt6多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了尤其可用于在氮限制条件下改变植物农学特性的分离的多核苷酸和多肽以及重组DNA构建体，包含这些重组DNA构建体的组合物(如植物或种子)、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接至在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码LNT6多肽或其同源物。

Description

在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物和涉及编码LNT6多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2008年10月29日的美国临时申请61/109,224的权益，其全部内容以引用方式并入本文。

发明领域

本发明领域涉及植物育种和遗传学，具体地讲涉及植物中可用的赋予氮利用效率和/或氮限制条件耐受性的重组DNA构建体。

发明背景

世界范围内非生物胁迫显著地限制了作物产量。据评估这些因素累积地造成平均70％的农业产量减少。植物是固着的，必须适应它们周边的主要环境条件。这已经导致它们发展出基因调控、形态发生和代谢的高可塑性。适应和防御机制策略涉及激活编码对适应或防御不同胁迫重要的蛋白。

植物氮吸收在它们的生长中起到重要作用(Gallais等人，J.Exp.Bot.55(396)：295-306(2004))。植物从环境中的无机氮合成氨基酸。因此，氮肥已经成为提高栽培植物如玉米和大豆的产量有力工具。为了避免硝酸盐污染并保持足够的利润率，如今农民期望减少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生长和产量的提高。概括地说，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品种是所期望的。

可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥属中使用该方法(Weigel等人，Plant Physiol.122：1003-1013(2000))。插入转录增强子元件能够显著激活和/或提高附近内源基因的表达。这种方法可以用于鉴定特定性状(例如植物的氮利用效率)的受关注的基因，当所述基因作为转基因进入生物中时能够改变该性状。

发明概述

本发明包括：

在一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。

在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。任选地，在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的所述对照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种农学特性的所述改变。

在另一个实施方案中，所述至少一种农学特性选自：在绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。

在另一个实施方案中，所述至少一种农学特性为产量或生物量并且所述改变为提高。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、卡诺拉(canola)、稻、小麦、大麦和高粱。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或47进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性或至少一种农学特性的改变，或者两者皆有。

在另一个实施方案中，增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或47进行比较时具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)获得源自步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体，并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。

在另一个实施方案中，评价植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或47进行比较时，具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)评价该转子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。

在另一个实施方案中，测定植物至少一种农学特性的改变的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或47进行比较时具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获取来源于转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。任选地，所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

在另一个实施方案中，所述至少一种农学特性选自：在绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。

在另一个实施方案中，所述至少一种农学特性为产量或生物量并且所述改变为提高。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：(a)编码多肽的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：20、24、26、28、37或40的氨基酸序列基于Clustal V比对方法具有至少或71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性，或(b)所述核苷酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。所述多肽可包含SEQ ID NO：20、24、26、28、37或40的氨基酸序列，并且所述核苷酸序列可包含SEQ ID NO：19、23、25、27、36或39的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明任何分离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一个调控序列，并且本发明涉及包含所述重组DNA构建体的细胞、植物和种子。所述细胞可为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者可为原核细胞，例如细菌。

附图简述和序列表

根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1示出pHSbarENDs2活化标记构建体的图谱，该构建体用于制备拟南芥属种群(SEQ ID NO：1)。

图2示出载体pDONR^TM Zeo(SEQ ID NO：2)，GATEWAY

供体载体的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985(互补链)。

图3示出载体pDONR^TM 221(SEQ ID NO：3)，GATEWAY

供体载体的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985(互补链)。

图4示出载体pBC-yellow(SEQ ID NO：4)的图谱，该载体是用于构建拟南芥属表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷酸9695-9819(互补链)。

图5示出载体PHP27840(SEQ ID NO：5)的图谱，该载体是用于构建大豆表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸7310-7434；attR2位点位于核苷酸8890-9014。

图6示出载体PHP23236(SEQ ID NO：6)的图谱，它是用于构建Gaspe Flint来源的玉米品系的表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸2006-2130；attR2位点位于核苷酸2899-3023。

图7示出载体PHP10523(SEQ ID NO：7)的图谱，该载体是存在于农杆菌菌株LBA4404中的质粒DNA(Komari等人，Plant J.10：165-174(1996)；NCBI通用标识符59797027)。

图8示出载体PHP23235(SEQ ID NO：8)的图谱，它是用于构建目的载体PHP23236的载体。

图9示出载体PHP20234(SEQ ID NO：9)的图谱。

图10示出目的载体PHP22655(SEQ ID NO：10)的图谱。

图11示出用于筛选的五个品系(标记为1至5-每个品系有十一个个体)，加上野生型对照品系C1(九个个体)的典型网格图案。

图12示出通过图像分析测定的若干个不同硝酸钾浓度对植物颜色的效应。绿色区(色调50至66)对氮剂量的响应证明该区可被用于指示氮同化作用。

图13为实施例18中用于半水栽玉米生长的培养基。

图14是列出实施例18中与不同硝酸盐浓度对Gaspe Flint衍生的玉米系生长和发育的影响相关的数据的图表。

图15A-15G示出拟南芥LNT6多肽(SEQ ID NO：30)的全长氨基酸序列与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、31、33、37、和38的LNT6同源物的多重比对。

图16示出图15A-15G中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值的图表。

本文所附的序列描述和序列表遵循在37 C.F.R.§1.821-1.825中所列出的用于专利申请公开中的核苷酸和/或氨基酸序列的规定。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB标准的核苷酸序列的单字母编码和氨基酸序列的三字母编码，IUPAC-IUBMB标准描述于Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(2)：345-373(1984)中，它们引入本文以供参考。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R.§1.822中所列出的规定。

表1列出了本文所述的某些多肽、包含编码多肽全部或其主要部分的核酸片段的cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQ ID NO：))。

表1

耐低氮蛋白(LNT)

SEQ ID NO：1是pHSbarENDs2激活标记载体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是pDONR^TM Zeo构建体的核苷酸序列(图2)

SEQ ID NO：3是pDONR^TM 221构建体的核苷酸序列(图3)

SEQ ID NO：4是pBC-yellow载体(图4)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是PHP27840载体(图5)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是目的载体PHP23236的核苷酸序列(图6)。

SEQ ID NO：7是PHP10523载体(图7)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是PHP23235载体的核苷酸序列(图8)。

SEQ ID NO：9是PHP20234载体的核苷酸序列(图9)。

SEQ ID NO：10是目的载体PHP22655的核苷酸序列(图10)。

SEQ ID NO：11是用于替代在pHSbarENDs2的位点5775处的PacI限制性位点的多接头核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是attB1序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13是attB2序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14是入门克隆PHP23112的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15是实施例5中的正向引物VC062。

SEQ ID NO：16是实施例5中的反向引物VC063。

SEQ ID NO：17-28(参见表1)。

SEQ ID NO：29是编码拟南芥“未知蛋白”(LNT6)(At2g06005；NCBI通用标识号42568965)的基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30是拟南芥“未知蛋白”(LNT6)(At2g06005；NCBI通用标识号18396221)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：31是NCBI通用标识号为115449029的水稻(Oryza sativa)“假定蛋白”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：32是NCBI通用标识号为125541346的水稻(Oryza sativa)“假定蛋白”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33是NCBI通用标识号为118482875的毛果杨(Populus trichocarpa)“未知蛋白”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：34是At2g06005-5’attB正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：35是At2g06005-3′attB反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：36-37(参见表1)。

SEQ ID NO：38是NCBI通用标识号为242063244的高粱(Sorghum bicolor)“假定蛋白”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：39-40(参见表1)。

SEQ ID NO：41对应于NCBI GI No.42567994，是At5g20580.1编码的拟南芥“未知蛋白”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：42对应于NCBI GI No.223544760，是蓖麻(Ricinus communis)“假定蛋白”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43对应于NCBI GI No.157342535，是葡萄(Vitis vinifera)“未命名蛋白产物”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：44对应于NCBI GI No.148907370，是北美云杉(Picea sitchensis)“未知蛋白”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：45对应于NCBI GI No.168067690，是小立碗藓亚种(Physcomitrella patens subsp.patents)“预测蛋白”的氨基酸序列。

SEQ ID NO：46对应于NCBI GI No.242063244，是高粱(Sorghum bicolor)“假定蛋白”Sb04g034890的氨基酸序列。

SEQ ID NO：47对应于来自江南卷柏(Selaginella moellendorffi)的预测蛋白的氨基酸序列(jgi|Selmo1|114771|e_gw1.49.312.1；JGI＝联合基因组研究所(Joint Genome Institute))。

发明详述

本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。

如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

如本文所用：

“氮限制条件”指其中可用氮总量(例如来自硝酸盐、氨、或其他已知氮源的氮)不足以维持植物的最佳生长和发育的条件。本领域的技术人员将会识别其中总可用氮足以维持植物最佳生长和发育的条件。本领域的技术人员将会识别什么组成足够量的总可用氮，什么组成用于向植物提供氮的土壤、培养基和肥料输入。取决于许多因素，氮限制条件将发生变化，包括但不限于特定的植物和环境条件。

“lnt6”指拟南芥基因座At2g06005(SEQ ID NO：29)。“LNT6”指由SEQ ID NO：29编码的蛋白质(SEQ ID NO：30)。

“lnt6-样”指拟南芥“lnt6”基因座At2g06005(SEQ ID NO：29)的来自不同物种，例如玉米和大豆，的核苷酸同源物，并且不受限制的包括任何以下核苷酸序列：SEQ ID NO：17、19、21、23、25、27、36和39。

“LNT6-样”指拟南芥“LNT6”(SEQ ID NO：30)的来自不同物种，例如玉米和大豆，的蛋白质同源物，并且不受限制的包括任何以下氨基酸序列：SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46和47。

术语“单子叶植物”和“单子叶的”植物本文互换使用。本发明的单子叶植物包括禾本科植物。

术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”本文互换使用。本发明的双子叶植物包括以下家族：十字花科植物、豆科植物、和茄科植物。

术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”本文互换使用，指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。

“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。

“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力和低温胁迫下的出苗

“收获指数”指粒重除以总株重。

“氮胁迫耐受性”是植物的性状，指植物在氮限制条件下存活的能力。

植物“提高的氮胁迫耐受性”相对于参照或对照植物进行测量，并意指植物的氮胁迫耐受性在与参照或对照植物进行比较时提高的任何量或量度。

“氮胁迫耐受性植物”是指表现出氮胁迫耐受性的植物。氮胁迫耐受性植物可以是在氮限制条件下相对于对照植物至少在一种农学特性上表现出提高的植物。

“环境条件”指植物生长的条件，例如水的可用性、营养物质(例如氮)的可用性或者昆虫或病害的存在。

“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。异源多核苷酸能被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组”指两个分离的不同序列片段的人工组合，例如通过基因工程技术化学合成或通过操纵分离的核酸片段合成。“重组体”也包括细胞或载体，它们已经通过引入异源核酸进行了修改，或者来源于进行如此修改的细胞，但是不涵盖由自然发生事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)改变的细胞或载体，例如那些无蓄意的人为干预产生的细胞或载体。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。

“调控序列”和“调控元件”可互换使用，并且指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但并非一定专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。

“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。

在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择替代形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

“叶绿体转运肽”是与蛋白质共同被翻译，并将该蛋白质导向叶绿体或导向该蛋白质在其中被生成的细胞中的其他质体类型的氨基酸序列。“叶绿体转运序列”是指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白质共同被翻译并将蛋白导向分泌系统的氨基酸序列(Chrispeels，(1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42：21-53)。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号(同上)，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号(同上)。如果将蛋白导向细胞核，则应移除任何存在的信号肽，并代之以加入核定位信号(Raikhel(1992)Plant Phys.100：1627-1632)。“线粒体信号肽”是指导前体蛋白质导进入线粒体中的氨基酸序列(Zhang和Glaser(2002)Trends Plant Sci 7：14-21)。

序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于LASERGENE

生物信息计算包(DNASTAR

Inc.，Madison，WI)的Megalign

程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.：5：151-153(1989))采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。逐对比对和使用Clustal V方法的蛋白序列百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，DIAGONALS SAVED＝4。在序列比对后，使用Clustal V程序，通过参阅相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

现在来看实施方案：

实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植株或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。

分离的多核苷酸和多肽

本发明包括下列分离的多核苷酸和多肽：

分离的多核苷酸包含：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列与(i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。多肽优选地是LNT6或LNT6-样蛋白。

分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。所述多肽优选地是LNT6或LNT6-样蛋白。

分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：(i)基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：17、19、21、23、25、27、29、36或39进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述分离的多核苷酸优选地编码LNT6或LNT6-样蛋白。

重组DNA构建体和抑制DNA构建体

在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。

在一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括：(i)核酸序列，所述核酸序列编码的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括：(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：17、19、21、23、25、27、29、36或39进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

图15A-15G示出SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47的氨基酸序列的多重比对。所述序列的多重比对使用LASERGENE

生物信息学计算软件包(DNASTAR

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程序进行；具体地讲，使用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))，多重比对预设参数为空位罚分＝10，空位长度罚分＝10，逐对比对预设参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5和DIAGONALS SAVED＝5。

图16是图15A-15G中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值的图表。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码LNT6或LNT6-样蛋白。

在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。

抑制DNA构建体可包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至(a)以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT6或LNT6-样蛋白；或(c)以下序列的全部或部分：(i)基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：17、19、21、23、25、27、29、36或39进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(c)(i)的核酸序列的全长互补序列。抑制DNA构建体可包含共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如，siRNA构建体或miRNA构建体)。

应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。

“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。靶基因可为植物内源基因或植物转基因。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。术语“抑制”和“沉默”本文互换使用，包括降低、减少、下降、减小、抑制、除去或阻止。“沉默”或“基因沉默”不指具体机制，它包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法、以及基于小RNA的方法。

抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要采用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％的同一性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性)。

抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。

“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA的RNA转录物，它能够在细胞内或体外被翻译成蛋白。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；以及Gura，Nature 404：804-808(2000))。

另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT公开WO 98/36083)。

RNA干扰是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature 391：806(1998))。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共享(Fire等人，Trends Genet.15：358(1999))。

小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。

小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。

微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science294：853-858(2001)，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-739(2002)；Lau等人，Science 294：858-862(2001)；Lee和Ambros，Science 294：862-864(2001)；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619(2002)；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-728(2002)；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495(2002)；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626(2002))。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。

微RNA(miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。miRNA似乎很可能能参与至少两种靶基因调控途径：(1)翻译抑制；(2)RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。

调控序列：

本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可包含至少一种调控序列。

调控序列可为启动子。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。

在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。

虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可以(或可以不)具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留氮耐受性的能力。在拟南芥中已经观察到了对干旱和寒冷耐受性的这种类型的效应(Kasuga等人，Nature Biotechnol.17：287-91(1999))。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，Plant Cell 2：163-171(1990))；泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)，以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。

在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调控启动子。

组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列：该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。

种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、马铃薯块茎特异蛋白(patatin)(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人，1989，EMBO J.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人，Mol.Gen.Genet.259：149-157(1991)；Newbigin，E.J.等人，Planta 180：461-470(1990)；Higgins，T.J.V.等人，Plant.Mol.Biol.11：683-695(1988))、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，EMBO J.7：1249-1255(1988))、菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324(1995))、植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等人，EMBO J.6：3571-3577(1987))、B-伴球蛋白(conglycinin)和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，EMBO J.7：297-302(1988))、谷蛋白(水稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等人，Plant Mol.Biol.10：359-366(1988))、麦谷蛋白和醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V等人，EMBO J.6：3559-3564(1987))和甘薯贮藏蛋白等启动子(甘薯块根)(Hattori，T.等人，Plant Mol.Biol.14：595-604(1990))。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。此类实例包括在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥2S种子贮藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和菜豆β-菜豆素启动子(Riggs等人，Plant Sci.63：47-57(1989))、以及表达氯霉素乙酰转移酶(Colot等人，EMBO J.6：3559-3564(1987))的小麦谷蛋白启动子。

可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

本发明使用的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，Nature Biotechnol.17：287-91(1999))；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”，Klemsdal等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；以及3)玉米启动子Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1，the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS(ZAG1-拟南芥花同源异形基因AGAMOUS的玉米同系物的鉴定和分子表征)”，Schmidt等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993))。“Structural characterization，chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize(两对来自玉米的AGAMOUS样MADS-box基因的结构表征、染色体定位及系统发育评价)”，Theissen等人，Gene 156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank Accession X80206))。Zag2转录物可在授粉前五天至授粉后天数(“DAP”)七至八天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前四至五天至授粉后六至八DAP被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。

用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的启动子是茎特异性启动子。这种茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号：EF030816；Abrahams等人，Plant Mol.Biol.27：513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登记号：EF030817)等等，将这些文献以引用的方式并入本文。

启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。

本发明使用的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织优选启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US公布2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROTMET2启动子(WO 2005/063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO 2006/055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO 2005/035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号U38790；NCBI GI No.1063664)。

本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987))。

任何植物都可以选择用来鉴定将用于本发明重组DNA构建体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属植物、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、玉米、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。

组合物

本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和近交系。

在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该近交系植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性(例如，任选地在氮限制条件下农学特性增加)的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子。

植物可以是单子叶植物或双子叶植物，例如，玉米或大豆植物，例如玉米植物，如玉米杂交植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或小米。

重组DNA构建体被稳定地整合进所述植物的基因组中。

实施方案包括但不限于如下实施方案：

1.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。在与该对照植物比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。

2.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含：

(a)可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％的序列同一性；或

(b)抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：

(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％的序列同一性，或(B)(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或者

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT6或LNT6-样多肽，

并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出至少一种农学特性的改变。

3.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码LNT6或LNT6-样多肽，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出增加的氮胁迫耐受性。在与该对照植物比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。LNT6多肽可来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)或短绒野大豆(Glycine tomentella)。

4.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码LNT6或LNT6-样多肽，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物表现出在氮限制条件下至少一种农学特性的改变。LNT6多肽可来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)或短绒野大豆(Glycinetomentella)。

5.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出在氮限制条件下至少一种农学特性的改变。

6.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含至少一种可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域的调控元件，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT6或LNT6-样多肽，并且其中在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物表现出在氮限制条件下至少一种农学特性的改变。

7.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至以下序列的全部或部分：(a)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(b)(a)的核酸序列的全长互补序列，并且其中所述植物在氮限制条件下在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

8.上述实施方案1-7中的植物的任何子代、上述实施方案1-7中的植物的任何种子、上述实施方案1-7中的植物的子代的任何种子以及来自上述实施方案1-7中的植物以及它们的子代的细胞。

在前述实施方案1-8中任一项或本发明的任何其他实施方案中，所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)可包含至少一种在植物中有功能的启动子作为调控序列。

在前述实施方案1-8中任一项或本发明的任何其他实施方案中，至少一种农学特性的改变是增加或减少。

在前述的实施方案1-8中任一项或本发明的任何其他实施方案中，所述至少一种农学特性可选自：在绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。例如，所述至少一种农学特性的改变可以是产量、绿度或生物量的提高。

在前述实施方案1-8中任一项或本发明的任何其他实施方案中，在与不包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的对照植物在氮胁迫条件下进行比较时，植物可表现出至少一种农学特性的改变。

本领域的普通技术人员熟悉模拟氮条件(限制性的或非限制性的)的规程，以及用于评价已经经受过模拟的或天然存在的氮条件(限制性的或非限制性的)的植物的规程。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需求更少的氮或在一定时期内不提供氮来模拟氮条件，并且技术人员可通过寻找农学特性的差异来评价此类植物，例如在生理学和/或物理条件上的变化，包括(但不限于)活力、生长、大小、或根长、或具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价此类植物的其他技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率、根生长或换气速率。

下面的实施例描述了一些用于模拟氮限制条件和/或在此类条件下评价植物的代表性规程和技术。

技术人员也可通过植物在田间测试中，在模拟的或天然存在的低氮或高氮条件下保持足够产量的能力(例如通过测量在低氮或高氮条件下，与标准氮条件下相比基本上等同的产量，或通过测量在低氮或高氮条件下与对照或参照植物相比更少的产量损失)来评价氮胁迫耐受性(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的产量)。

在评估或测量其中利用了对照的本发明任何实施方案(如，如本文描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照或参照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：

1.转化过的植物的子代，该转化过的植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植株)。

2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。

3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。

4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：该植株可以相对于这样的对照植株进行评估或测量，该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株相比较，核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP

)和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。

此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。

方法

方法包括但不限于用于提高植物氮胁迫耐受性的方法、用于评价植物氮胁迫耐受性的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法、和用于制备种子的方法。所述植物可为单子叶或双子叶植物，例如玉米或大豆植物。植物还可为向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或小米。所述种子可为玉米或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米自交系种子。

方法包括但不限于如下方法：

转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在具体实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核，例如细菌。

生产转基因植物的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体来转化植物细胞并从转化过的植物细胞中再生转基因植物。本发明也涉及由该方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获取的转基因种子。

用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组DNA构建体，所述多核苷酸可操作地连接到至少一个调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。

改变宿主细胞中本发明多肽表达水平的方法，所述方法包括：(a)用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达所述重组DNA构建体的条件下培养转化过的细胞，其中重组DNA构建体的表达导致转化过的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。

提高植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。

提高植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；和(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。

提高植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT6或LNT6-样多肽；和(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的氮胁迫耐受性。

评价植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。该方法还可包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。

评价植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性；该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。

评价植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT6或LNT6-样多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性；该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。

评价植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)评价该转子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。

评价植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)评价该转子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。

评价植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT6或LNT6-样多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)评价该转子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物任选地在氮限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法还可包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物任选地在氮限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物任选地在氮限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物任选地在氮限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT6或LNT6-样多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物任选地在氮限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物任选地在氮限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物任选地在氮限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物任选地在氮限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码LNT6或LNT6-样多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物任选地在氮限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

产生种子(例如可作为提供氮胁迫耐受性的产品销售的种子)的方法，该方法包括任一上述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。

在任一前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，测定转基因植物中农学特性改变的步骤(如果适用的话)可包括测定在改变的环境条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时该转基因植物是否表现出至少一种农学特性的改变。

在任一前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，测定子代植物中农学特性改变的步骤(如果适用的话)可包括测定在改变的环境条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时该子代植物是否表现出至少一种农学特性的改变。

在任何前述方法或本发明的方法的任何其他实施方案中，在所述引入步骤中所述可再生的植物细胞可包括愈伤组织细胞、胚胎愈伤组织细胞、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞可来自近交系玉米植物。

在任何前述方法或本发明的方法的任何其他实施方案中，所述再生步骤可包括：(i)在包含促胚发生激素的培养基中培养所述转化的植物细胞，直至观察到愈伤组织；(ii)将步骤(i)的所述转化植物细胞转移到第一培养基中，所述培养基包括促组织形成激素；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。

在任何前述方法或本发明的方法的任何其他实施方案中，所述至少一种农学特性可选自：在绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的增加。

在任一上述方法或本发明的任一其他方法中，在与不包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的对照植物在氮限制条件下进行比较时，植物可表现出至少一种农学特性的改变。

在任一前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，存在供选择的替代方案用于将包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体引入可再生的植物细胞中。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子、任选地作为转位因子的部件)引入可再生的植物细胞，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本发明多肽的内源基因的事件。

将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于DNA直接摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、病毒介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。植物转化和再生技术已经在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。

含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系植物的花粉用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书的范围内。

实施例1

制备具有激活标记基因的拟南芥种群

构建18.49kb的T-DNA基二元构建体，pHSbarENDs2(SEQ ID NO：1；图1)包含四个来源于花椰菜花叶病毒35S启动子的四个多聚增强子元件(对应于序列-341至-64，如Odell等人Nature 313：810-812所述(1985))。该构建体也包含允许质粒救援的载体序列(pUC9)和多接头(SEQ ID NO：11)、再动员T-DNA的转座子序列(Ds)、以及允许草胺磷选择转基因植物的bar基因。原则上，仅将从右边界(RB)至左边界(LB)包含的10.8kb片段转移到寄主植物基因组中。因为增强子元件位于靠近RB处，它们可诱导T-DNA整合后的基因组位点顺式激活。

通过整个植株的农杆菌转化制备拟南芥属激活标记种群。将pHSbarENDs2构建体转化到根癌农杆菌菌株C58中，该菌株在溶菌肉汤培养基中，在25℃生长至OD600～1.0。然后将细胞离心沉淀并重悬在相同体积的5％蔗糖/0.05％Silwet L-77(OSI Specialties，Inc)中。在早期抽薹时，培育拟南芥属生态型Col-0的土壤使用农杆菌悬浮液进行顶部灌溉。一周后，相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌菌株进行顶部灌溉。然后将该植物的种子设为标准。所得T1种子在土壤中播种，通过喷洒草胺磷(FINALE

；AgrEvo；Bayer Environmental Science)选择转基因幼苗。选择了总计100,000个草胺磷抗性T1幼苗。分开保存来自每个品系的T2种子。

实施例2

筛选以鉴定具有低氮耐受性的品系

来自100,000个分离的T1激活标记品系中每一个的十一株T2植物被种植在方板(15mm×15mm)上，方板包含0.5x N-Free Hoagland’s，0.4mM硝酸钾，0.1％蔗糖，1mM MES和0.25％Phytagel^TM(低氮培养基)。每个板种植五个品系，并且每个板包括9个野生型个体以使总计64个个体排列成8×8的网格图案(参见图11)。在暗处、4℃条件下保持平板三天以使种子分层，然后在22℃光照和20℃黑暗交替条件下水平放置九天。光周期为十六小时光照；八小时黑暗，平均光照强度为～200mmol/m²/s。每天旋转并振动每个架子中的平板。在第十二天(生长九天)，对整个板拍照以评价幼苗状态。

在掩蔽该平板图像以去除背景颜色后，每个个体收集两个不同的测量数据：总罗赛塔面积和进入绿色区的颜色百分比。使用色调、饱和度和强度数据(HSI)，绿色区由色调50至66组成。总罗赛塔面积用作植物生物量的量度，而绿色区通过剂量-响应研究已经显示指示氮同化作用(参见图12)。

将在与野生型对照植物进行比较时具有显著的总罗赛塔面积和/或绿色区增加的品系命名为Phase 1 hits。在相同分析条件下进行Phase 1 hits的重复试样再筛选(Phase 2筛选)。还使用Phase 3筛选进一步验证了通过了Phase 1和2的突变体。在Phase 3中，将每个品系分别置于低氮培养基上，使得32个T2个体在一个平板上紧邻着32个野生型个体生长，为分析提供更高的统计学严谨性。如果一个品系显示与Phase 3中对照的显著差异，则可认为该品系是经验证的氮缺乏抗性品系。

实施例3

鉴定激活标记基因

在氮耐受性品系中侧接T-DNA插入序列的基因使用以下两个标准程序中的一个或两个进行鉴定：(1)热不对称交错(TAIL)PCR(Liu等人，Plant J.8：457-63(1995))；以及(2)SAIFF PCR(Siebert等人，Nucleic Acids Res.23：1087-1088(1995))。至于复杂的多聚T-DNA插入序列，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鉴定候选基因。在这些情况下，可使用包括反式PCR、质粒拯救和/或基因组文库构建在内的其他程序。

成功的结果是其中单个TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA边界序列和拟南芥属基因组序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与公开可用的拟南芥属基因组的序列比对来鉴定候选基因。具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是激活的基因的候选基因。

为了验证鉴定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合伪克隆的可能性，用一个T-DNA中的寡核苷酸和一个候选基因特异性的寡核苷酸进行对基因组DNA的诊断PCR。将提供PCR产品的基因组DNA样本理解为表示T-DNA插入序列。该分析也验证了其中一种以上的插入事件发生在相同品系中的情况，例如，在TAIL和/或SAIFF PCR分析中鉴定是否有多个不同基因组片段。

实施例4

激活标记的LNT6基因的鉴定

进一步分析了显示出氮缺乏耐受性的激活标记品系(品系136595)。提取来自该品系的DNA，并且在突变品系中侧接T-DNA插入序列的基因通过连接介导PCR(Siebert等人，Nucleic Acids Res.23：1087-1088(1995))。鉴定一个单独扩增的片段，它包含T-DNA边界序列和拟南芥属基因组序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与完全拟南芥属基因组的序列比对鉴定候选基因。具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是品系中激活的基因的候选基因。就品系136595而言，最靠近35S增强子的基因是At2g06005(SEQ ID NO：29)，它编码本文称为LNT6(SEQ ID NO：30；NCBI GI 18396221)的拟南芥“未知蛋白”。

实施例5

通过转化拟南芥验证候选的拟南芥基因(At2g06005)

可将候选基因转化到拟南芥属中并在35S启动子作用下过表达。如果在转基因品系中观察到与亲本激活标记品系相同或相似的表型，则将该候选基因认为是拟南芥属中验证过的“前导基因”。

通过以下方法测试拟南芥属At2g06005基因(SEQ ID NO：29)的赋予氮缺乏耐受性的能力。

通过RT-PCR扩增了At2g06005cDNA，扩增使用以下引物：

1.At2g06005-5’attB正向引物(SEO ID NO：34)

正向引物包含attB1序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；SEQ ID NO：12)和共有的Kozak序列(CAACA)的所述cDNA蛋白编码区上游的前21个核苷酸(以ATG起始密码子开头)。

2.At2g06005-3’attB反向引物(SEO ID NO：35)

反向引物包含attB2序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT；SEQ ID NO：13)，该序列邻近所述cDNA蛋白编码区的反向互补序列的后21个核苷酸(以终止密码子的反向互补序列开头)。

使用INVITROGEN^TM GATEWAYCLONASE^TM技术，用pDONR^TM Zeo(SEQ ID NO：2；图2)进行了BP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TM Zeo移除并定向地克隆了在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。该入门克隆与目的载体一起用于随后的LR重组反应如下。

用紧接INVITROGEN^TM GATEWAY C1转化插入序列上游的1.3-kb 35S启动子构建称为pBC-yellow(SEQ ID NO：4；图4)的基于16.8-kb T-DNA的二元载体(目的载体)，所述插入序列包含ccdB细菌致死基因以及侧接attR1和attR2序列的氯霉素抗性基因(CAM)。该载体还包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-Yellow(INVITROGEN^TM)，它赋予转化过的种子黄色荧光。使用INVITROGEN^TM GATEWAY技术，对包含定向克隆的PCR产物的入门克隆和pBC-yellow载体进行LR重组反应。扩增允许迅速地定向克隆在pBC-yellow中的35S启动子之后的At2g06005基因。

申请人然后使用如实施例1所述的相同农杆菌介导的转化程序，将35S启动子：At2g06005表达构建体引入了野生型拟南芥属生态型Col-0。转基因T1种子通过黄色荧光进行选择，并且将32个这些T1种子紧邻着32个野生型拟南芥属生态型Col-0种子种植在低氮培养基上。所有随后的生长条件和成像分析均如实施例1所述。发现来自激活标记的、对氮限制条件具有耐受性的初始表型可在用其中At2g06005通过35S启动子直接表达的构建体转化过的野生型拟南芥属植物中重现。

实施例6

cDNA文库的组成，cDNA克隆的分离和测序

cDNA文库可通过许多可用的方法中的任一种制备。例如，通过首先根据生产商的说明书(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)制备UNI-ZAP^TM XR载体中的cDNA文库，可将cDNA引入质粒载体中。根据Stratagene提供的说明书，将Uni-ZAP^TM XR文库转换成质粒文库。当转换的时候，将把cDNA插入序列包含于质粒载体pBLUESCRIPT

中。此外，可使用T4连接酶(New England Biolabs)将cDNA直接引入预切过的Bluescript

II SK(+)载体(Stratagene)中，随后按照制造商规程(GIBCO BRL Products)转染DH10B细胞。一旦cDNA插入序列处于质粒载体中，从随机选取的含重组pBLUESCRIPT

质粒的细菌菌落制备质粒DNA，或者用对插入的cDNA序列旁侧的载体序列特异性的引物，通过聚合酶链式反应扩增插入的cDNA序列。将扩增的DNA插入序列或质粒DNA在引物标记法测序反应(dye-primer sequencing reaction)中进行测序，以产生部分cDNA序列(表达序列标记或“EST”；参见Adams等人，Science 252：1651-1656(1991))。用Perkin Elmer Model 377荧光测序仪分析所得的EST。

用改进的转座规程产生全长插入序列(FIS)数据。从归档的甘油原种作为单一菌落回收确定了FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。将分离的DNA模板在基于PCR的测序反应中与载体引物M13正向和反向寡核苷酸反应并上样至自动化的测序仪上。通过与对其进行FIS查询的初始EST序列进行序列比对来确认克隆鉴定。

将确认的模板通过基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ty1转座因子(Devine和Boeke，Nucleic Acids Res.22：3765-3772(1994))的Primer Island转座试剂盒(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)进行转座。22：3765-3772(1994))。该体外转座系统在整个一组大DNA分子中随机地放入独特的结合位点。随后将转座的DNA用于通过电穿孔转化DH10B电感受态细胞(GIBCO BRL/Life Technologies，Rockville，MD)。转座因子含有另外的可选标记(称为DHFR；Fling和Richards，Nucleic Acids Res.11：5147-5158(1983))，使得能在琼脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每次转座反应随机地选择多个亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结合位点特异性的独特引物从转座事件位点向外进行测序(ABI PRISM dyeterminator ReadyReaction mix)。

收集序列数据(ABI PRISM

Collections)并用Phred和Phrap(Ewing等人，Genome Res.8：175-185(1998)；Ewing等人，Genome Res.8：186-194(1998))。Phred是一种公用软件程序，该程序再次读取ABI序列数据，再次调出(recall)碱基，赋质量值，并将碱基序列(base call)和质量值写入可编辑的输出文件中。Phrap序列组装程序使用这些质量值来增加组装的序列重叠群的准确度。通过Consed序列编辑器(Gordon等人，Genome Res.8：195-202(1998))。

在一些克隆中，cDNA片段对应基因的3’端的一部分并且不会涵盖整个开放阅读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一种。这两种方法中的第一种方法导致产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开放阅读框的片段。这两种方法均使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有时基于已有的知识(即特定的基因应该存在于特定组织中)选择文库，有时则进行随机选择。获得相同基因的反应可平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库池通常用3至5个不同的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增中，两种方法均使用载体特异性的(正向)引物，同时还使用基因特异性的(反向)引物，该正向引物对应位于克隆5’端处的载体的一部分。第一种方法使用与已知基因序列的一部分互补的序列，而第二种方法使用与3’非翻译区(也称为UTR)的一部分互补的基因特异性引物。在第二轮扩增中，两种方法均使用套式引物组。按照生产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段连接进pBLUESCRIPT载体中。该试剂盒选自可得自包括Invitrogen^TM(Carlsbad，CA)、Promega Biotech(Madison，WI)和Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)在内的一些供应商的许多试剂盒。如上所述，将质粒DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用Phred/Phrap进行装配。

实施例7

cDNA克隆的鉴定

编码LNT6-1样多肽的cDNA克隆通过以下程序鉴定：进行BLAST(基本的局部比对搜索工具；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)；还可参见国立卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释)检索，寻找与BLAST“nr”数据库中所包含氨基酸序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译序列、源自3维结构Brookhaven蛋白质数据库(Protein Data Bank)、SWISSPROT蛋白质序列数据库的最新的主要版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)的相似性。在所有的阅读框中翻译来自克隆的DNA并用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，Nat.Genet.3：266-272(1993))比较与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析cDNA序列编码的多肽与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计算仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P值(概率)或E值(期望值)，在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P值或E值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA编码的序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。

EST序列可与如上所述的Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTN算法(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))对杜邦专利数据库比较具有序列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5′端或3′端序列的EST。在两个或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可装配成单一的连续核苷酸序列，从而使最初的片段在5′或3′初始方向上延伸。一旦确定了最5′的EST，即能通过全长插入序列来确定其完整的序列。

可用tBLASTn算法，通过将已知基因(来自专有来源或公开数据库的已知基因)的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找到属于不同物种的同源基因。tBLASTn算法对所有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库进行氨基酸查询的搜索。该搜索允许不同物种之间的核苷酸密码子使用的差异，并且允许密码子简并。

实施例8A

编码LNT6-样多肽的cDNA克隆的表征

制备了代表来自Zea mays(玉米)，Nepeta racemosa(总花猫薄荷)，Oryza sativa(水稻)，Glycine max(大豆)，Helianthus annuus(向日葵)和Triticum aestivum(小麦)的多种组织的mRNA的cDNA文库。下面描述了对该文库的特征。

表2

来自玉米、总花猫薄荷、水稻、大豆、小麦和向日葵的cDNA文库

如表3、图15A-15G和图16所示，表2中鉴定的cDNA编码与来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At2g06005；NCBI通用标识号18396221；SEQ ID NO：30)的LNT6多肽和来自水稻(Oryza sativa)(NCBI通用标识号115449029(SEQ ID NO：31))和毛果杨(Populus trichocarpa)(NCBI通用标识号118482875(SEQ ID NO：33))的LNT6-样多肽相似的多肽。

表3(非专利文献)和表4(专利文献)中所示的分别是单独的EST(“EST”)BLASTP结果、包含标明的cDNA克隆的整个cDNA插入物的序列(“FIS”)、由两个或更多个EST、FIS或PCR序列装配而成的重叠群序列(“Contig”)、或编码源自FIS或重叠群的完整蛋白或功能性蛋白的序列(“CGS”)。表3和表4中还显示了使用ClustalV比对方法、使用默认参数计算的每对氨基酸序列的序列同一性百分比值(描述于下文的实施例8C中)。

表3

LNT6的多肽同源物的BLASTP结果

^*在本专利申请的优先权日之后，该序列在GenBank数据库中被停止使用，因此在图15中已将其排除。

表4

LNT6的多肽同源物的BLASTP结果

实施例8B

其他与LNT6同源的序列的鉴定

采用美国国立生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析了At2g06005 locus(SEQ ID NO：29)编码的多肽与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。在所述BLAST分析中，鉴定了多种其他的LNT6同源物。At5g20580.1(NCBI GI No.42567994；SEQ ID NO：41)编码的拟南芥“未知蛋白”以112pLog值与SEQ ID NO：30有69％的同一性。蓖麻(Ricinus communis)的“假定蛋白”(NCBI GI No.223544760；SEQ ID NO：42)以118的pLog值与SEQ ID NO：30有70.5％的同一性。葡萄(Vitis vinifera)“未命名蛋白产物”(NCBI GI No.157342535；SEQ ID NO：43)以115的pLog值与SEQ ID NO：30有74.9％的同一性。北美云杉(Picea sitchensis)“未知蛋白”(NCBI GI No.148907370；SEQ ID NO：44)以83的pLog值与SEQ ID NO：30有52.5％的同一性。小立碗藓亚种(Physcomitrella patens subsp.patents)“预测蛋白”(NCBI GI No.168067690；SEQ ID NO：45)以57的pLog值与SEQ ID NO：30有47.2％的同一性。高粱(Sorghum bicolor)“假定蛋白”Sb04g034890(NCBI GI No.242063244；SEQ ID NO：46)以96的pLog值与SEQ ID NO：30有58.2％的同一性。来自江南卷柏(Selaginella moellendorffi)(SEQ ID NO：47)的预测蛋白以52的pLog值与SEQ ID NO：30有49.5％的同一性。上述序列同一性百分比的值使用Clustal V比对方法以默认参数测得(描述于下文实施例8C中)。

实施例8C

对LNT6及其同源物的序列比对和同一性百分比计算

图15A-15G显示如SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47所示的氨基酸序列的比对。图16是图15A-15G中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值的图表。

用LASERGENE

生物信息计算包(DNASTARInc.，Madison，WI)的MEGALIGN

程序进行序列比对和同一性百分比计算。用Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)，CABIOS.5：151-153)进行序列的多重比对，默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)。使用Clustal方法采用以下逐对比对的默认参数：KTUPLE 1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。

实施例9

包含拟南芥属前导基因的同源物的植物表达载体的制备

可使用诸如BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)；也参见美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的万维网网址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法，鉴定与先导LNT6基因同源的序列。同源的LNT6-样序列，例如实施例8所述的序列，可通过任何一种以下方法进行PCR扩增。

方法1(基于RNA的方法)：如果LNT6同源物的蛋白编码区域的5’和3’序列信息是可用的，可如实施例5所述设计基因特异性引物。可将RT-PCR用于植物RNA来获得含有蛋白编码区的核酸片段，该蛋白编码区旁侧为attB1(SEQ ID NO：12)和attB2(SEQ ID NO：13)序列。引物可含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。

方法2(基于DNA的方法)：作为另外一种选择，如果LNT6同源物的cDNA克隆是可用的，可以PCR扩增完整cDNA插入序列(含有5′和3′非编码区)。可设计正向引物和反向引物，使它们分别或者含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBluescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQ ID NO：15)和反向引物VC063(SEQ ID NO：16)。

方法1和方法2可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物可含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。

可利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与GATEWAY供体载体(例如pDONR^TM Zeo(SEQ ID NO：2；图2)或pDONR^TM 221(SEQ ID NO：3；图3)组合。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TM Zeo或pDONR^TM 221移除并定向地克隆了在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。使用INVITROGEN^TM GATEWAY

CLONASE^TM技术，然后可将来自入门克隆的编码同源LNT6多肽的序列转移到合适的目的载体中，例如pBC-Yellow(SEQ ID NO：4；图4)、PHP27840(SEQ ID NO：5；图5)、或PHP23236(SEQ ID NO：6；图6)，以获得植物表达载体，所述载体分别用于拟南芥、大豆、和玉米。

供体载体pDONR^TM/Zeo或pDONR^TM 221的attP1和attP2位点分别显示于图2和图3中。目的载体pBC-Yellow、PHP27840和PHP23236的attR1和attR2位点分别显示于图4、5和6中。

作为另外一种选择，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSite Gateway

LR重组反应以产生表达载体。

申请人能够使用如实施例1所述的相同的农杆菌介导的转化程序，将所述表达载体引入野生型拟南芥生态型Col-0。转基因T1种子可通过黄色荧光进行选择，并且可将32个这些T1种子紧邻着32个野生型拟南芥生态型Col-0种子种植在低氮培养基上。所有随后的生长条件和成像分析均如实施例1所述。类似的重复分析也可利用T2种子进行。

作为另外一种选择，所述表达载体可按照本文所述的规程被转入玉米或大豆中。

实施例10

用验证过的拟南芥属前导基因制备大豆表达载体并转化大豆

为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达每个验证过的拟南芥属(Arabidopsis)基因或来自不同物种的对应同源物。

可将实施例5中所述的相同GATEWAY

入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体(SEQ ID NO：5；图5)中，使得该基因的表达处于SCP1启动子的控制下。

然后可用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。

为了诱导体细胞胚，可以将子叶(长度为3-5mm，从大豆品种A2872的表面灭菌的未成熟种子解剖出来)于26℃在光下或黑暗下培养六至十周。然后切取体细胞胚(其产生次生胚)并将其置于合适的液体培养基内。在重复选择增殖为早期球形阶段胚的体细胞胚的簇后，按下面的描述保持该悬浮液。

可将大豆胚发生悬浮培养物在26℃下在摇床(150rpm)上的35mL液体培养基中保持，荧光光照采用16:8小时(白天/黑夜)的时间表。通过将大约35mg组织移植进35ml液体培养基中，每两周将培养物进行传代培养。

然后可通过基因枪轰击方法(Klein等人，Nature(London)327：70-73(1987)，美国专利4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。杜邦公司的Biolistic^TM PDS1000/HE仪器(氦气改进型)可以用于这些转化。

可用于帮助大豆转化的可选标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，Gene 25：179-188(1983))的潮霉素磷酸转移酶基因以及胭脂碱合成酶基因的3′区构成的嵌合基因，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的T-DNA。可用于帮助大豆转化的另一种可选标记基因是来自大豆或拟南芥的除草剂抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中的第一共用酶。已经鉴定出ALS中的突变导致对三类ALS抑制剂中的某些或全部具有抗性(美国专利5,013,659；其全部内容以引用的方式并入本文)。除草剂抗性ALS基因的表达可处于SAM合成酶启动子(美国专利申请US-2003-0226166-A1；其全部内容以引用方式并入本文)的控制下。

将下列物质(依次)加入50μL 60mg/mL的1μm金颗粒悬浮液：5μLDNA(1μg/μL)，20μL亚精胺(0.1M)，和50μL CaCl₂(2.5M)。然后搅拌该颗粒制备物三分钟，在微量离心机(microfuge)中离心10秒并除去上清液。然后将DNA包覆的颗粒在400μL 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μL无水乙醇中。可将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次，每次一秒钟。然后将五μL该DNA-包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。

将大约300-400mg两周大的悬浮培养物置于60×15mm的空培养皿中并用吸管将残留的液体从组织移除。对于每次转化实验，大约5-10板的组织受到正常轰击。膜破裂压力设定为1100psi并将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡网大约3.5英寸的地方并轰击三次。轰击后，可将组织分成两份并放回液体培养基中，如上所述进行培养。

轰击后五至七天，用新鲜培养基更换该液体培养基，并在轰击后十一至十二天，用含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换这种选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚芽发生簇长出来。移出分离的绿色组织并将其移植进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当成是独立的转化事件。然后可将这些悬浮培养物作为未成熟胚进行传代培养和维持，或者通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。

可分析用验证过的基因转化大豆植株以研究相对于对照或参照植株的农学特性。例如，可分析在低氮和高氮条件(如氮限制条件和氮充分条件)下的产量增加和/或稳定性。

实施例11

使用粒子轰击法用验证过的拟南芥属前导基因转化玉米

为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。

可以将实施例5中所述的相同GATEWAY

入门克隆用于将每个基因定向克隆进玉米转化载体中。在玉米转化载体中的基因的表达可以处于组成型启动子的控制下，例如玉米泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)，以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))

然后可通过下面的方法将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。可从源于近交玉米系H99和LH132杂交的发育中的颖果切取未成熟的玉米胚。在授粉后十至十一天分离胚，这时它们长为1.0至1.5mm。然后将胚以轴线侧朝下放置并与琼脂糖硬化的N6培养基(Chu等人，Sci.Sin.Peking 18：659-668(1975))接触。将胚在27℃下保持在黑暗中。从这些未成熟胚的胚芽增生出易脆的胚发生愈伤组织，该愈伤组织由未分化的细胞块构成，在胚柄结构上长有体细胞原胚状体和胚状体。可将从该原外植体分离的胚发生愈伤组织在N6培养基上培养，并每两至三周在这种培养基上进行传代培养。

可将质粒p35S/Ac(得自Peter Eckes博士，Hoechst Ag，Frankfurt，Germany)用于转化实验以便提供可选标记。该质粒含有pat基因(见欧洲专利公布0 242 236)，该基因编码草胺膦乙酰转移酶(PAT)。酶PAT赋予对除草性谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草胺膦的抗性。p35S/Ac的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature313：810-812(1985))和胭脂碱合成酶基因的3′区的控制下，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA。

可将粒子轰击方法(Klein等人，Nature 327：70-73(1987))用于将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法，利用下面的技术用DNA包覆金颗粒(直径1μm)。将十μg质粒DNA加入到50μL金颗粒悬浮液(60mg每mL)中。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)加入到该颗粒中。在加入这些溶液过程中涡旋该悬浮液。十分钟后，将试管粗略地离心(以15,000rpm进行5秒钟)并除去上清液。将该颗粒再悬浮于200μL的无水乙醇中，再次离心并除去上清液。再次进行乙醇冲洗并将颗粒再悬浮于终体积为30μL的乙醇中。可将DNA包覆的金颗粒等分试样(5μL)置于KAPTON^TM飞行圆盘(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用BIOLISTIC^TM PDS-1000/He(Bio-Rad Instruments，Hercules CA)，采用1000psi的氦气压、0.5cm的间隙距离以及1.0cm的飞行距离，将颗粒加速射入玉米组织中。

对于轰击，将胚发生组织置于琼脂糖硬化的N6培养基上的滤纸上。组织布置成薄薄一层，并覆盖直径为约5cm的圆形区域。然后可将包含组织的培养皿置于离阻挡网大约8cm的PDS-1000/He的腔室内。然后将该腔室中的空气抽出至28英寸汞柱的真空。利用在击波管中氦气压力达到1000psi时破裂的可破裂膜，宏载体被氦气冲击波加速。

轰击后七天，可将组织转移至N6培养基中，该培养基含有双丙氨磷(每升5mg)并缺少酪蛋白或脯氨酸。组织继续在这种培养基上缓慢生长。另外两周后，可将组织转移至含有bialaphos的新鲜N6培养基上。六周后，在某些装有补充了双丙氨膦的培养基的盘上，可辨别直径约1cm的区域上有活性生长的愈伤组织。当在选择培养基上传代培养时，这些愈伤组织可继续生长。

通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移到再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。

可再生出转基因的T0植株并按照下面的HTP步骤测定它们的表型。可收集T1种子。

可在氮限制条件下(例如1mM硝酸盐)栽培T1植株并分析表型变化。利用图像分析可定量下面的参数：可收集并定量植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。超表达构建体与合适的对照植物比较导致绿度(绿色区)、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重或干重、果实或种子产量、总植物氮含量、果实或种子氮含量、营养组织的氮含量、总植物游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、果实或种子中的游离氨基酸含量、果实或种子中的蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量发生变化，可认为它是拟南芥属前导基因在玉米中发挥功能提高对氮缺乏耐受性(增加的氮耐受性)的证据。

此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥属基因的重组DNA构建体引入玉米自交系内。

实施例12

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的电穿孔(一般 说明)

将电穿孔感受态细胞(40μL)，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(含有PHP10523)，在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。将DNA等分试样(0.5μL亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H₂O中的浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的根癌农杆菌LBA4404细胞混合，同时仍然保持在冰上。将混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。按下“pulse(脉冲)”键两次(理想的是获得4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后，将0.5mL室温下的2xYT培养基(或SOC培养基)加入到电穿孔管并转移至15mL按压盖管(例如FALCON^TM管)中。将细胞在28-30℃、200-250rpm下培养3小时。

将250μL的等分试样散布在包含YM培养基和50μg/mL奇放线菌素的板上并在28-30℃下孵育三天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个可选步骤中的其中一个：

选择1：用30μL 15mg/mL的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。

选择2：进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。

转化体的鉴定：

选取四个独立的克隆并划痕接种在包含AB基本培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上用于分离单个克隆。将平板在28℃下孵育二至三天。对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其接种在4mL的10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，和50mg/L奇放线菌素中。将该混合物在28℃下摇动培养24小时。采用QIAGEN Miniprep和可选的PB缓冲液洗涤，从4mL培养物分离出质粒DNA。DNA洗脱于30μL中。如上所述，将2μL的等分试样用于电穿孔20μL DH10b+20μL双蒸H₂O。任选地，可将15μL等分试样用于转化75至100μL的INVITROGEN^TM Library Efficiency DH5α。将细胞散布在包含LB培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上并将其在37℃下培养过夜。

对于每个推定的共整合体选取三至四个独立克隆并将其接种在4mL含50μg/mL奇放线菌素的2xYT培养基(10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)中。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。接下来，使用QIAprepMiniprep，用任选的PB缓冲洗涤液(稀释成50μl)从4mL培养物中分离质粒DNA。8μl质粒DNA被用于以SalI(使用亲本DNA和PHP10523作为对照物)进行消化。对于4个质粒利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用亲本DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。

作为另一种选择，对于高通量应用，例如针对Gaspe Flint衍生的玉米品系(实施例16)所描述的，代替通过限制性酶切分析来评价所得的共整合载体，可将三个克隆同时用于如实施例13(经由农杆菌转化)所述的感染步骤。

实施例13

使用农杆菌属(Agrobacterium)细菌转化玉米

为了检查所得表型，可将大豆植株转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。

农杆菌介导的玉米转化基本上按照Zhao等人，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)(还参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840，所述文献以引用方式并入本文)。该转化过程涉及细菌接种，共培养，静息，选择和植物再生。

1.未成熟胚芽制备：

将未成熟胚芽从颖果上切下来，并且放置在含有2mL PHI-A培养基的2mL微管中。

2.未成熟胚芽的农杆菌属细菌感染和共培养：

2.1感染步骤：

用1mL微吸移管将(1)的PHI-A培养基取出，并且加入1mL农杆菌属细菌悬浮液。将该管轻轻地倒置以混合。将该混合物在室温下培养5分钟。

2.2共培养步骤：

用1mL微量吸移管将农杆菌悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。测定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚芽的平板在20℃下于黑暗中培养三天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。

3.选择推定的转基因事件：

向在100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的平板中转移10个胚芽，保持朝向，并且用parafilm将培养皿密封。将平板在黑暗中于28℃下培养。预计在6-8周将看见作为黄色胚芽组织的主动生长推定事件。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆性组织生长。以二-三周的间隔将推定的转基因胚芽组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行传代培养，时间间隔取决于生长速度。记录事件。

4.T0植株的再生：

将在PHI-D培养基上繁殖的胚芽组织转移到在100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚芽成熟培养基)中进行传代培养，在28℃于黑暗中培养直至体细胞胚芽成熟，培养大约十至十八天。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中，并且在28℃下于光中(约80μE，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在七至十天，将约10cm高的再生的植株置于盆中的园艺混合物中，并且使用标准园艺方法进行耐寒锻炼(hardened-off)。

用于植物转化的培养基：

1.PHI-A：4g/L的CHU基础盐，1.0mL/L的1000X Eriksson维生素混合物，0.5mg/L的盐酸硫胺素，1.5mg/L的2，4-D，0.69g/L的L-脯氨酸，68.5g/L的蔗糖，36g/L的葡萄糖，pH为5.2。加入100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)。

2.PHI-B：PHI-A，不含有葡萄糖，将2，4-D增加至2mg/L，将蔗糖降低至30g/L，并且补充0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌的)，3.0g/L GELRITE

，100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)，pH5.8。3.PHI-C：PHI-B，不含GELRITE

和乙酰丁香酮，将2，4-D降低至1.5mg/L，并且补充8.0g/L琼脂，0.5g/L 2-[N-吗啉代]乙烷-磺酸(MES)缓冲液，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)。

4.PHI-D：PHI-C补充3mg/L双丙氨磷(过滤灭菌的)。

5.PHI-E：4.3g/L Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRL 11117-074)，0.5mg/L烟酸，0.1mg/L盐酸硫胺，0.5mg/L盐酸吡哆醇，2.0mg/L甘氨酸，0.1g/L肌醇，0.5mg/L玉米素(Sigma，Cat.No.Z-0164)，1mg/L吲哚乙酸(IAA)，26.4μg/L脱落酸(ABA)，60g/L蔗糖，3mg/L bialaphos(过滤灭菌的)，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)，8g/L琼脂，pH5.6。

6.PHI-F：不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E；将蔗糖降低至40g/L；用1.5g/L GELRITE替代琼脂；pH为5.6。

通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移到再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。

转基因T0植株可以再生，并且可以确定其表型。可收集T1种子。

可在氮限制条件下(例如1mM硝酸盐)栽培T1植株并分析表型变化。利用图像分析可定量下面的参数：可收集并定量植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。超表达构建体与合适的对照植物比较导致绿度(绿色区)、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重或干重、果实或种子产量、总植物氮含量、果实或种子氮含量、营养组织的氮含量、总植物游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、果实或种子中的游离氨基酸含量、果实或种子中的蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量发生变化，可认为它是拟南芥属前导基因在玉米中发挥功能提高对氮缺乏耐受性(增加的氮耐受性)的证据。

此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥属基因的重组DNA构建体引入玉米自交系内。

实施例14A

用于用经过验证的候选拟南芥基因(At2g06005)通过农杆菌转化玉 米品系的表达载体的制备

使用INVITROGEN^TM GATEWAY

技术，能够用相同的实施例5所述的GATEWAY

入门克隆(包含拟南芥LNT6基因)、入门克隆PHP23112(SEQ ID NO：14)、入门克隆PHP20234(SEQ ID NO：9；图9)、和目的载体PHP22655(SEQ ID NO：10)进行LR重组反应以制备具有以下表达盒的前体质粒PHP30916：

1.表达PAT抗除草剂性基因的泛素启动子：：moPAT::PinII终止子盒，该基因用于转化过程期间的选择。

2.表达DS-RED颜色标记的LTP2启动子：：DS-RED2::PinII终止子盒，该标记用于分选种子。

3.泛素启动子：：AT-LNT6::PinII终止子盒，它过表达所关注的基因拟南芥LNT6。

实施例14B

用于用经验证的候选拟南芥基因(At2g06005)通过农杆菌转化玉米品系使用如实施例12和13所述的农杆菌介导转化，可将LNT6表达盒(如实施例14A所述)引入玉米自交系或来源于优良玉米自交系的可转化玉米品系。

可将PHP30916表达载体电穿孔进入包含载体PHP10523(SEQ ID NO：7，图7)的LBA4404农杆菌属菌株以制备共整合载体PHP30943，该载体通过每个载体上含有的COS位点介导的重组形成。共整合载体除包含农杆菌属菌株和农杆菌介导的转化所需的其他基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)之外，还将包含同上(实施例14A)的三个表达盒。可使用(但不限于)实施例12中的电穿孔规程。

实施例14C

用于用玉米同源物转化玉米品系的表达载体的制备

使用INVITROGEN^TM GATEWAY

技术，能够用实施例9中所述的入门克隆、入门克隆PHP23112(SEQ ID NO：14)、入门克隆PHP20234(SEQ ID NO：9；图9)、和目的载体PHP22655(SEQ ID NO：10)进行LR重组反应以制备具有以下表达盒的前体质粒(PHP33632)：

1.表达PAT抗除草剂性基因的泛素启动子：：moPAT::PinII终止子盒，该基因用于转化过程期间的选择。

2.表达DS-RED颜色标记的LTP2启动子：：DS-RED2::PinII终止子盒，该标记用于分选种子。

3.泛素启动子：：来自玉米的LNT6同源物：：PinII终止子盒，该盒过表达所关注的基因(例如，编码SEQ ID NO：18的核苷酸序列)。

实施例14D

用玉米同源物通过农杆菌转化玉米品系

使用如实施例12和13所述的农杆菌介导的转化，可将实施例14C中所述的包含来自玉米的LNT6同源物的表达盒引入玉米自交系或来源于优良玉米自交系的可转化玉米品系。

所述表达载体(实施例14C中所述的前体质粒PHP33632)可通过电穿孔进入包含质粒PHP10523(SEQ ID NO：7，FIG.7)的LBA4404农杆菌属菌株中，以制备共整合载体PHP33706，该载体通过每个载体上含有的COS位点介导的重组形成。所述共整合载体除包含农杆菌属菌株和农杆菌介导的转化所需的其他基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)之外，还包含同上(实施例14C)的三个表达盒。可使用(但不限于)实施例12中的电穿孔规程。

实施例15

用于转入Gaspe Flint衍生的玉米品系的目的载体PHP23236的制备

目的载体PHP23236(图6，SEQ ID NO：6)是通过用载体PHP23235(图8；SEQ ID NO：8)转化包含PHP10523(图7；SEQ ID NO：7)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。

目的载体PHP23236可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化Gaspe Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。

实施例16

用于转入Gaspe Flint衍生的玉米品系的表达构建体的制备

利用INVITROGEN^TM GATEWAY

LR重组技术，相同的实施例5中所述的入门克隆(包含拟南芥LNT6基因)可被定向地克隆至GATEWAY

目的载体PHP23236(SEQ ID NO：6；FIG.6)以构建表达载体。该表达载体将包含处于UBI启动子控制下的所关注的cDNA，并且是用于农杆菌介导的向玉米内的转化的T-DNA二元载体，所述玉米如但不限于本文所述的实例。

实施例17A

用验证过的候选拟南芥基因(At2g06005)转化Gaspe Flint来源的 玉米品系

为了检查所得表型，可转化玉米植株以过表达拟南芥At2g06005基因(和来自其他物种的对应同源物)。可使用如实施例16所述的表达构建体。

受体植株

受体植株细胞可来自具有短的生活周期(“快速循环”)、小的个体尺寸以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Flint(GBF)品系品种的植株细胞。一种可能的候选植株品系变种是GBF×QTM(Quick Turnaround Maize(快速周转玉米)，选择用于在温室条件下生长的Gaspe Flint的可公开获得形式)的F1杂交种，其在Tomes等人(美国专利申请10/367,416，提交于2003年2月13日；美国专利公开2003/0221212 A1，公布于2003年11月27日)中公开。从该品系获得的转基因植株具有如此小的尺寸使得它们可在四英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植株所需空间的1/4)并且它们在少于2.5个月时间内成熟。(传统上，一旦转基因植株适应温室后需要3.5个月来获得转基因T0种子。)另一合适的品系包括但不限于GS3(高度可转化的品系)X Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良玉米自交系。

转化规程

任何合适的方法可用于将转基因引入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌载体的接种类型的步骤(参见例如实施例12)。转化可在受体(靶标)植株的未成熟胚上进行。

精确的生长和植株跟踪

将由转化的玉米胚产生的转基因(T0)植株的事件群体在受控的温室环境中栽培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植株布局，在该布局中，实验植株被分成组(如，每组三十株植株)，称为块，而每株植株随块被随机分配一个位置。

对于一组三十株植株，二十四株转化的实验植株和六株对照植株(具有设定好的表型的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列(也叫做重复组或块)。每株植株(对照植株或实验植株)随块被随机分配一个位置，所述的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个三十株植株的重复组中的每一个可栽培在相同的温室中。应该测定重复组的布局(布置方式)以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。

对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因植株。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评估引入基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植株与表达转基因的那些植株进行比较。

在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株，并且从那些植株收集的数据自动与那些植株相关联，使得所搜集的数据可与由该植株携带的转基因关联。例如，每个植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相关联。

作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国专利申请10/324,288，该专利申请提交于2002年12月19日(美国专利公布2004/0122592 A1，公布于2004年6月24日)，以引用方式并入本文。

利用三维成像进行表型分析

对T0事件群体中的每株温室植株(包括任何对照植株)分析所关注的农学特性，并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据，该方式使得数据与该植株的辨识数据(见上面)相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。

在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植株以评估所关注的性状。可将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价例如每株植物的生物量、大小和形态。

由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变，可从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这摄像可通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。

在单次成像分析操纵中，进行如下事件：(1)将植株传送至分析仪区域内，旋转360度以便其机器可读标签可被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧面图像并将其输入数据库；(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动，以及(4)将该植株传送出分析仪。

每二十四小时的周期让植物至少六个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。

成像仪器

可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH(Wurselen，Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。例如对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5％，对于次要组成成像分析仪的仪器差异可小于约10％。

软件

成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。多种可商购获得的软件系统(例如Matlab，其他软件)可用于定量解释图像数据，并且可将这些软件体系中的任何一种应用于所述图像数据集。

传送系统

具有植物旋转装置的传送系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多四株植物(每株最高高度为1.5m)装上汽车，该汽车在循环的传送系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占有面积为约5m×5m。

可扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。

照明

任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择，可变化照明以引起转基因(如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。

基于三维成像的生物量评价

为了更好地估计生物量，应该从至少三个轴(例如顶部视图和两个侧面(侧面1和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可通过如下计算评价植物的体积：

在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该系统中，任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值(正较大和负较小两者)。大小(如面积)的任意单位可以通过将物理参照加至成像过程而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中均包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积单位，例如平方厘米(cm²)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度的盆足可用作物理参照。

颜色分类

成像技术还可用于测定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可通过多种计算方法测定颜色分类。

对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方案，包括绿色的两种或三种色调(例如色调是50-66，参见图12)，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。

除了其在测定植物的大小、生长中的有效性以外，颜色分类还可用于评估其他产量构成性状。对于这些其他产量构成性状，可使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度(staygreen)”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可通过颜色分类来评估，该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用于在T0或T1植物生活周期末获取的图像，可鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如，可表示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可被鉴定为携带影响这种重要农学特性的转基因。

熟练的植物学家将认识到可指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素)的出现，以及认识到其他颜色分类方案可提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。

植物结构分析

改变植物构造参数的转基因也可用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可如下用于测定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何构造，并且随后基于该图像可进行不同构造参数的参数化鉴定。或者是单独地或者是组合地修改任何这些构造参数的转基因可通过应用此前所述的统计方法来鉴定。

花粉脱落日期

花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可通过活性雄花第一次出现在植物上来测定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日期。

作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授粉日期、第一穗丝日期)可以由负责进行植物看护的工作人员来记录。为了使数据完整性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操作者感觉舒适。

植物的取向

以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的构造。也就是说，植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的最大差别。将顶部图像用于测定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。

实施例17B

用玉米同源物转化Gaspe Flint衍生的玉米品系

使用INVITROGEN^TM GATEWAY

LR重组技术，可制备入门克隆用于玉米同源物(SEQ ID NO：17/18)(参见关于入门克隆制备的实施例9)，然后将所述入门克隆定向克隆到GATEWAY

目的载体PHP23236(SEQ ID NO：6；图6)中以制备表达载体。所述表达载体将包含处于UBI启动子控制下的所关注的cDNA，并且是用于农杆菌介导的向玉米内的转化的T-DNA二元载体，所述玉米如但不限于本文所述的实例。

实施例18

在氮限制条件下筛选Gaspe Flint来源的玉米品系

转基因植物将含有两个或三个剂量的Gaspe Flint-3与一个剂量的GS3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)，并且对于显性转基因将会以1∶1分离。将植物在商品化的盆栽培养基TURFACE中栽培，每天用1mM KNO₃生长培养基和2mM KNO₃或更高的生长培养基浇洒四次(参见图13)。在1mM KNO₃培养基中培养的对照植物的绿度较小，产生较少的生物量并且在开花期具有较小的穗(关于样本数据的图示请参见图14)。Gaspe来源的品系将生长至开花期。

用统计学确定处理株之间所观察到的差异是否真有差异。图14示出了一种方法，该方法将字母放在数值后面。同一列中其后具有相同字母(不是字母组)的那些值不具有显著的差异。使用该方法，如果在一列中的值的后面没有字母，则该列中的这些值的任何之间不存在显著的差异，换句话讲，该列中的所有这些值是均等的。

与无效转基因相比，转基因的表达将导致植物在1mM KNO₃中具有改善的植物生长。因此生物量和绿度(如实施例11中所述)将在生长期间受到监控，并与无效转基因植物比较。生长、绿度、开花期穗的大小的改善将表明氮耐受性增强。

实施例19

氮利用效率幼苗检测分析法

使用转基因事件的种子进行了两项单独的实验。在第一个试验中，利用种子颜色标记将转基因事件的种子分成了转基因的(处理1；包含构建体PHP30943)和无效的(处理2)。在第二个试验中，利用种子颜色标记将转基因事件的种子分成了转基因的(处理1；包含构建体PHP33706)和无效的(处理2)。

每一处理(转基因的或看上去无效的)被随机分配至54个盆(实验单位)组成的区块中，所述盆按6行9列排列。重复每个处理(转基因或看上去无效的)9次。

将所有种子种在4英寸的方盆中，盆中包含在8英寸交错中心上的Turface，每天用包含以下营养物质的溶液浇灌四次：

1mM CaCl₂     2mM MgSO₄     0.5mM KH₂PO₄    83ppm Sprint330

3mM KCl       1mM KNO₃      1μM ZnSO₄      1μM MnCl₂

3μM H₃BO₄    1μM MnCl₂    0.1μM CuSO₄    0.1μM NaMoO₄

植物出苗后，将其间苗至每盆一个种子。在收获时从盆中移除植物，并且将蒙脱石从根部洗脱。使根与苗分开，把根置于纸袋中并且在70℃干燥70小时。将干燥后的植物部分(根和苗)称重并置于50mL的圆锥管中，管中有大约20 5/32英寸的钢球，在涂料振荡器中进行振荡研磨。

The Nitrogen/Protein Analyzer来自Thermo Electron Corporation的氮/蛋白质分析器(型号FlashEA 1112 N)使用约30mg的基本组织。样品从自动取样机被点样至氧化反应室内部的坩埚内。在900℃和纯氧条件下，样品被强烈的放热反应氧化，产生N₂、CO₂、H₂O和SO₂的混合气体。燃烧结束后，打开载气氦，使气体混合物流入还原反应室。在680℃，使气体混合物流过还原铜，其中可能形成的氮氧化物被转化为氮元素而过量的氧气被保留。所述气体混合物从还原反应器流出，依次经过两个吸收过滤器。第一个过滤器包含碱石灰，留住了二氧化碳和二氧化硫。第二个过滤器包含分子筛和颗粒状的硅胶，以阻止水通过。然后，氮被洗脱进色谱柱，并被转至热导率检测器，热导率检测器生成电子信号，所述电子信号经Eager 300软件的适当处理，提供了氮-蛋白质百分比。

利用这些数据，测量了下列参数，并且采用Student t检验将转基因组的参数的平均值与无效组的参数的平均值进行了比较。

利用方差分析(ANOVA)计算和完全随机设计(CRD)模型，计算了每一区块内的方差。使用F统计，通过将总区块处理平均面积除以总区块误差平均面积对每个区块计算了总处理效应。计算了更大的Student′s t检验的概率用于比较每个转基因平均值与合适的无效转基因平均值。使用最小值(P＜t)0.1规定显示显著差异的变量。表5和表6显示了分别包含构建体PHP30943和PHP33706的植物的双尾Student t概率，其中转基因的植物的平均值被用于与对应的无效组相比较。p值的数学符号反映所述事件对相应的无效组的相对表现，即“+”＝提高的表现，“-”＝降低的表现。“NS”表示p-值不显著。

比较可以在转基因事件和无效的构建体或无效的事件之间进行。每一事件具有阳性和阴性的分离。无效的构建体是阴性的入门构建体，其由来自阴性分离子的果仁的抽样组成，并因此是全部阴性的代表性样本。无效的事件是作为所述事件的匹配的入门的阴性入门。例如，事件1可具有9个阳性分离子和9个阴性分离子；实验分析将按照相匹配的设计进行。

表5中的所有事件均被用于与无效的构建体相比较，当与无效的构建体相比较时，没有一个表现出在任何所测量的表型变量上有显著提高。

表6中，事件E8266.48.3.11、E8266.48.3.13、E8266.48.3.19、E8266.48.3.2和E8266.48.3.6是与无效的构建体相比较，而事件E8266.48.2.2、E8266.48.4.2、E8266.48.5.10和E8266.48.5.2是与无效的事件相比较。在与对应的无效组的比较中，事件E8266.48.3.11和E8266.48.4.2均具有显著提高的植物N浓度和总营养N％；事件E8266.48.5.10表现出提高的根生物量和提高的根/苗比率；事件E8266.48.5.2具有提高的苗生物量和总植物N。

表5

NUE幼苗分析结果(PHP30943)

表6

NUE幼苗分析结果(PHP33706)

实施例20A

具有拟南芥lnt6或lnt6-样玉米同源物的玉米品系的产量分析

自交或顶交杂交体的转基因植物可通过更严苛的大田试验来研究在氮限制条件下和无氮限制条件下的产量增加和/或稳定性。标准化的产量试验将通常包括4至6次重复，以及至少4个位置。

随后可进行产量分析，以测定与构建体无效的(定义参见实施例19)或野生型的对照(或参考)植物相比，包含经验证的拟南芥前导基因(lnt6)或lnt6的玉米同源物的植物是否具有产量表现方面的提高(在氮限制或非限制条件下)。具体地讲，对于包含经验证的拟南芥前导基因或lnt6的玉米同源物的植物和对照植物，可于开花和/或灌浆时期施加氮限制条件。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含经验证的拟南芥前导基因或lnt6玉米同源物的植物在氮限制条件下将具有比对照植物更少的产量损失，例如至少25％减少的产量损失，或者在非氮限制条件下将具有比对照植物更高的产量。

实施例20B

用编码拟南芥前导基因At2g06005的PHP30943转化的玉米品系的 产量分析

包含存在于载体PHP30943中的LNT6表达盒的玉米测交杂交体和它们的对照，被种植于Woodland，CA和York，NE的低氮(LN)和正常氮(NN)环境中。基于由Federal and State Extension服务对特定生长区域确定的土壤测试标准，低氮(LN)环境指氮量少于在早春或夏季施加的标准氮肥的量，而标准氮(NN)环境指加入正常产量所需的充足的氮。与NN条件中获得的产量相比，在LN条件中观察到了产量的降低。

2008年在York，NE和Woodland，CA两个地点对九个转基因事件进行了大田试验，并评估了产量。玉米测交杂交体被用于与构建体无效的(CN)相比较。2008年大田试验的结果显示于表7中。

在York，事件E7899.30.2.8在低氮条件下相对于构建体无效的，表现出产量的显著提高，而在正常氮条件下，E7899.30.2.8和E7899.30.3.6两个事件与构建体无效的相比，表现出产量的提高。在Woodland，E7899.30.3.13和E7899.30.4.3在正常氮条件下相对于构建体无效的表现出显著的提高。

表7

用PHP30943转化的玉米的2008年大田试验

York，Nebraska

Woodland，CA

灰色框表示与构建体无效的(CN)相比显著更高(P＜0.1)的结果。

实施例21

用经验证的前导基因的大豆同源物对大豆进行的转化和评估

基于同源性搜索，可鉴定验证过的拟南芥属前导基因的一个或若干个候选大豆同源物，并且还可评估它们增加大豆氮限制条件耐受性的能力。载体构建、植物转化和表型分析将类似于上文实施例所述的规程。

实施例22

转化和评价具有验证过的前导基因的玉米同源物的玉米

基于同源性搜索，可鉴定经验证的拟南芥前导基因的一个或若干个候选的玉米同源物(例如SEQ ID NO：17/18)，并且还可评估它们增加玉米氮限制条件耐受性的能力。载体构建、植物转化和表型分析可类似于上文实施例所述的规程。

实施例23

用验证过的前导基因的玉米和大豆同源物转化拟南芥属

经验证的前导基因的同源物

经验证的拟南芥前导基因的同源物可于35S启动子、拟南芥泛素10启动子或其他组织特异性启动的控制下被转入拟南芥，并就在低氮培养基上生长时的叶片面积和绿色区累积进行分析。可如本文实施例所述进行载体构建和植物转化。检测分析的条件、数据采集和数据分析可类似于上文实施例所述的规程。

Claims (18)

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或47进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。

2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或47进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

3.权利要求2的植物，其中所述至少一种农学特性是选自下列的至少一种：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。

4.权利要求2或权利要求3的植物，其中在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的所述对照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种农学特性的所述改变。

5.权利要求2至4中任一项的植物，其中所述至少一种农学特性是产量或生物量，并且进一步地，其中所述改变是提高。

6.权利要求1至5中任一项的植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。

7.权利要求1至6中任一项的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中从所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性或至少一种农学特性的改变，或者它们两者。

8.增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和

(c)获得源自步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。

9.评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和

(d)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。

10.测定植物农学特性的改变的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和

(d)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

11.权利要求10的方法，其中所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

12.权利要求10或权利要求11的方法，其中所述至少一种农学特性是选自下列的至少一种：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。

13.权利要求10至12中任一项的方法，其中所述至少一种农学特性是产量或生物量，并且进一步地，其中所述改变是提高。

14.权利要求8至13中任一项的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。

15.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：

(a)编码具有LNT6多肽活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：20、24、26、28、37或40进行比较时具有至少90％的序列同一性，其中所述Clustal V比对方法采用以下逐对比对默认参数：KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，和DIAGONALS SAVED＝5，或

(b)(a)的核苷酸序列的全长互补序列。

16.权利要求15的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：20、24、26、28、37.或40。

17.权利要求15的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包括SEQ ID NO：19、23、25、27、36或39。

18.包含重组DNA构建体的植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的权利要求15至17中任一项的多核苷酸。

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