CN102575261B - 涉及编码自交不亲和性蛋白相关多肽的基因的耐旱植物和相关构建体及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的多核苷酸和多肽，以及用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接至在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SIPR多肽。

Description

涉及编码自交不亲和性蛋白相关多肽的基因的耐旱植物和相关构建体及方法

发明领域

本发明领域涉及植物育种和基因学，并且具体地讲涉及用于赋予植物耐旱性的重组DNA构建体。

发明背景

非生物胁迫是世界范围内作物损失的主要原因，它引起主要作物超过50％的平均产量损失(Boyer，J.S.(1982)Science 218：443-448；Bray，E.A.等人(2000)，Biochemistry and Molecular Biology of Plants，由Buchannan，B.B.等人编辑，Amer.Soc.，Plant Biol.，第1158-1249页)。在多种非生物胁迫中，干旱是限制世界范围内作物产量的主要因素。在不同发育阶段使植物暴露于水限制环境似乎活化了多个生理和发育变化。理解干旱胁迫感受、转导和耐受性的基本生物化学机制和分子机制是生物学上的主要挑战。已经公布了对非生物胁迫响应的分子机制和干旱胁迫耐受性的基因调控网络的回顾(Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.，(2006)Curr.Opin.Plant Biol.9：189-195；Wang，W.等人(2003)Planta218：1-14)；Vinocur，B.和Altman，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.(2004)J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等人(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6：410-417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(2005)Trends Plant Sci.10：88-94)。

在非生物胁迫响应的分子方面的较早期的工作通过差异和/或差减分析完成(Bray，E.A.(1993)Plant Physiol.103：1035-1040；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)Plant Physiol.115：327-334；Zhu，J.-K.等人(1997)Crit.Rev.Plant Sci.16：253-277；Thomashow，M.F.(1999)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.50：571-599)。其他方法包括选择候选基因并分析该基因的表达或其在胁迫条件下的活性产物，或者通过在明确界定的胁迫系统中进行功能互补(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)Physiologia Plantarum 112：152-166)。此外，正向和反向基因研究涉及鉴定和分离调节基因中的突变，该研究也已经用于提供在胁迫或暴露情况下基因表达中观察到的改变中的证据(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)Physiologia Plantarum 112：152-166)。

可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中使用该方法(Weigel，D.等人，(2000)PlantPhysiol.122：1003-1013)。插入转录增强子元件能够显著激活和/或提高附近内源性基因的表达。该方法能够用于选择涉及农学上重要的表型(包括胁迫耐受性)的基因。

发明概述

本发明包括：

在一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。

在另一个实施方案中，增强植物耐旱性的方法，包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，以及在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性；以及任选地，(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，以及在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。

在另一个实施方案中，评价植物耐旱性的方法，包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述转基因植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性；以及任选地，(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及任选地，(e)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

在另一个实施方案中，评价植物耐旱性的方法，包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：(a)编码自交不亲和性相关多肽(SIPR)的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34中的其中一个进行比较时具有至少90％或95％的序列同一性，或(b)所述核苷酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。所述多肽可包含SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34的氨基酸序列。所述核苷酸序列可包含核苷酸序列SEQID NO：17、19、21、23、25、27、29、31或33。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明任何分离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接至少一种调控序列，并且本发明涉及包含所述重组DNA构建体的细胞、植物和种子。

在另一个实施方案中，本发明包括包含本发明的任何分离的多核苷酸的载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明任何重组DNA构建体的细胞、植物或种子。所述细胞可为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者可为原核细胞，例如细菌。

附图简述和序列表

根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表构成本专利申请的一部分。

图1示出pHSbarENDs2激活标记构建体(SEQ ID NO：1)的示意图，该构建体用于制备拟南芥属种群。

图2示出载体pDONR^TM/Zeo(SEQ ID NO：2)的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985(互补链)。

图3示出载体pDONR^TM221(SEQ ID NO：3)的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985(互补链)。

图4示出载体pBC-yellow(SEQ ID NO：4)的图谱，该载体是用于构建拟南芥属表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷酸9695-9819(互补链)。

图5示出PHP27840(SEQ ID NO：5)的图谱，该载体是用于构建大豆表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸7310-7434；attR2位点位于核苷酸8890-9014。

图6示出PHP23236(SEQ ID NO：6)的图谱，该载体是用于构建Gaspe Flint来源的玉米品系的表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸2006-2130；attR2位点位于核苷酸2899-3023。

图7示出PHP10523(SEQ ID NO：7)的图谱，它是存在于农杆菌属菌株LBA4404中的质粒DNA(Komari等人，Plant J.10：165-174(1996)；NCBI通用标识符59797027)。

图8示出PHP23235(SEQ ID NO：8)的图谱，该载体是用于GaspeFlint来源的玉米品系的目的载体。

图9示出PHP28647(SEQ ID NO：9)的图谱，它是用于玉米近交来源的品系的目的载体。attR1位点位于核苷酸2289-2413；attR2位点位于核苷酸3869-3993。

图10示出PHP29634(SEQ ID NO：16)的图谱，该载体是用于构建Gaspe Flint来源的玉米品系的表达载体的目的载体。

图11A-11J给出如SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32、34-40所示的SIPR多肽氨基酸序列比对结果。

图12给出图11A-11J中给出的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。

SEQ ID NO：1是pHSbarENDs2激活标记载体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是GATEWAY供体载体pDONR^TM/Zeo的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是GATEWAY供体载体pDONR^TM221的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是pBC-yellow的核苷酸序列，pBC-yellow是用于拟南芥属的目的载体。

SEQ ID NO：5是PHP27840的核苷酸序列，PHP27840是用于大豆的目的载体。

SEQ ID NO：6是PHP23236的核苷酸序列，PHP23236是用于GaspeFlint来源的玉米品系的目的载体。

SEQ ID NO：7是PHP10523的核苷酸序列(Komari等人，Plant J.10：165-174(1996)；NCBI通用标识符59797027)。

SEQ ID NO：8是PHP23235的核苷酸序列，PHP23235是用于GaspeFlint来源的品系的目的载体。

SEQ ID NO：9是PHP28647的核苷酸序列，PHP28647是用于玉米近交来源的品系的目的载体。

SEQ ID NO：10是attB1位点的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11是attB2位点的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是At1g26797-5′attB正向引物的核苷酸序列，它包含attB1序列，用于扩增At1g26797蛋白编码区。

SEQ ID NO：13是At1g26797-3′attB反向引物的核苷酸序列，它包含attB2序列，用于扩增At1g26797蛋白编码区。

SEQ ID NO：14是VC062引物的核苷酸序列，它包含T3启动子和attB1位点，用于扩增克隆进BLUESCRIPTII SK(+)载体(Stratagene)的cDNA插入序列。

SEQ ID NO：15是VC063引物的核苷酸序列，它包含T7启动子和attB2位点，用于扩增克隆进BLUESCRIPTII SK(+)载体(Stratagene)的cDNA插入序列。

SEQ ID NO：16是PHP29634(也称为DV11)的核苷酸序列，它是用于Gaspe Flint来源的玉米品系的目的载体。

SEQ ID NO：17对应于NCBI GI No.30689649，它是来自编码拟南芥属自交不亲和性相关多肽(拟南芥)的基因座At1g26797的核苷酸序列。

SEQ ID NO：18对应于NCBI GI NO.30689650，它是由SEQ ID NO：17编码的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：19对应于NCBI GI No.145362293，它是来自基因座At1g26798的核苷酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：20对应于NCBI GI No.42571653，它是由SEQ ID NO：19的核苷酸序列编码的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：21对应于NCBI GI No.79318656，它是来自基因座At1g26796的核苷酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：22对应于NCBI GI No.79318657，它是由SEQ ID NO：21的核苷酸序列编码的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：23对应于NCBI GI No.18396056，它是来自基因座At1g26795的核苷酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：24对应于NCBI GI No.18396057，它是由SEQ ID NO：23的核苷酸序列编码的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：25对应于NCBI GI No.18416755，它是来自基因座At5g12060的核苷酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：26对应于NCBI GI No.15239857，它是由SEQ ID NO：25的核苷酸序列编码的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：27对应于NCBI GI No.79315207，它是来自基因座At3g55677的核苷酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：28对应于NCBI GI No.79315208，它是由SEQ ID NO：27的核苷酸序列编码的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：29对应于琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)序列，其编码DTP10多肽(琴叶拟南芥琴叶亚种(Arabidopsis lyrata subsp.lyrata))。它编码NCBI GI No.297850998提供的公开可用的琴叶拟南芥序列的截短形式。

SEQ ID NO：30对应于由SEQ ID NO：29的核苷酸序列编码的氨基酸序列(琴叶拟南芥琴叶亚种)。它是NCBI GI NO.297850998提供的序列的截短形式。

SEQ ID NO：31对应于NCBI GI No.224118733，它是编码DTP10多肽的核苷酸序列(毛果杨(Populus trichocarpa))。

SEQ ID NO：32对应于NCBI GI No.224118734，它是由SEQ ID NO：31的核苷酸序列编码的氨基酸序列(毛果杨)。

SEQ ID NO：33对应于NCBI GI NO：270257654的核苷酸3234493-3234978(葡萄(Vitis vinifera))。

SEQ ID NO：34对应于NCBI GI No.270257838，它是由SEQ ID NO：33的核苷酸序列编码的氨基酸序列(葡萄)。

SEQ ID NO：35是EP专利公布EP1033405的SEQ ID NO：18685提供的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：36是EP专利公布EP2152891的SEQ ID NO：49855提供的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：37是EP专利公布EP1033405的SEQ ID NO：226提供的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：38是美国专利公布US6855866的SEQ ID NO：9提供的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：39是EP专利公布EP2152891的SEQ ID NO：12314提供的氨基酸序列(拟南芥)。

SEQ ID NO：40对应于NCBI GI No.297850998(琴叶拟南芥琴叶亚种)。

序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。

此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

发明详述

本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。

本文以及所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及本领域的技术人员已知的等同物，等等。

如本文所用：

术语“AT-自交不亲和性蛋白相关多肽”、“AT-SIPR多肽”、“AT-耐旱表型10多肽”和“AT-DTP10多肽”本文互换使用并且指由拟南芥基因座At1g26797编码的拟南芥蛋白。

术语“自交不亲和性蛋白相关多肽”、“SIPR多肽”、“耐旱表型10多肽”和“DTP10多肽”本文互换使用并且指At-DTP10的同源物。

“自交不亲和性蛋白-相关多肽”指与虞美人(Papaver Rhoeas)的自交不亲和性蛋白S1相关的蛋白家族。(Foote HC，Ride JP，Franklin-Tong VE，Walker EA，Lawrence MJ，Franklin FC；，Proc NatlAcad Sci U S A 1994；91：2265-2269.：Cloning and expression of adistinctive class of self-incompatibility(S)gene from Papaver rhoeas L.)。

自交不亲和性(SI)指表面上健康的植物当自花授粉时不能产生种子。在一些开花植物中自花受精抑制通过其中所述植物能够识别自身花粉和非自身花粉的识别机制而发生。在大多数植物中SI系统受称为S-基因座的单个复等位基因基因座控制。在虞美人中SI响应在柱头表面发生并且由复杂信号级联系统调节，该级联系统涉及Ca2+和蛋白质磷酸化的瞬时增加。这个响应在由柱头分泌的S-蛋白和它们在花粉管中的同源受体相互作用后开始。S-蛋白是小信号分子，推测其能够结合花粉上的受体来介导细胞内信号途径，该途径最终介导花粉管生长的抑制。在拟南芥中的SIPR蛋白的功能是未知的，因为它是自花授精的植物(Matten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1994，第91卷，第1992-1997页；Foote等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1994，第91卷，第2265-2269页；Wheeler等人，J.Exp.Botany，2003，第54(380)卷，第131-139页)。

术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”本文互换使用。本发明的单子叶植物包括禾本科植物。

术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”本文互换使用。本发明的双子叶植物包括以下家族：十字花科植物、豆科植物和茄科植物。

术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”本文互换使用，指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成且是100％互补的。

“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获得。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。

“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于低温胁迫下的绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长、早期幼苗活力和出苗。

“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。

“植物”包括整个植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植物的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指无内含子且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“成熟”蛋白指经翻译后加工的多肽，即已经去除了存在于初始翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽。

“前体”蛋白质指mRNA的初级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组体”指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过导入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。

“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“在植物中有功能的启动子”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。

“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。

在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择替代形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

“叶绿体转运肽”是与蛋白协同翻译并将蛋白导向叶绿体或在其中制备蛋白的细胞中存在的其它质体类型。“叶绿体转运序列”指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白质共同被翻译并将蛋白导向分泌系统的氨基酸序列(Chrispeels，(1991)Ann.Rev.PlantPhys.Plant Mol.Biol.42：21-53)。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号(同上)，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号(同上)。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位信号替代(Raikhel，(1992)Plant Phys.100：1627-1632)。“线粒体信号肽”是指导前体蛋白质导进入线粒体中的氨基酸序列(Zhang和Glaser(2002)Trends Plant Sci 7：14-21)。

序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于LASERGENE生物信息计算包(DNASTARInc.(Madison，WI))的MEGALIGN程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。在序列比对后，使用Clustal V程序，通过参阅相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

现在来看实施方案：

实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。

分离的多核苷酸和多肽：

本发明包括下列分离的多核苷酸和多肽：

分离的多核苷酸包含：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列，其中(i)的核酸序列的全长互补序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。任何上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述多肽优选地为SIPR多肽。

分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。所述多肽优选地为SIPR多肽。

分离的多核苷酸，包括：(i)基于Clustal V比对方法在与17、19、21、23、25、27、29、31或33进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任何上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述分离的多核苷酸优选地编码SIPR多肽。

重组DNA构建体和抑制DNA构建体：

在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。

在一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列编码的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与16、18、20、22、24、26、28、30或32进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(i)核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SIPR多肽蛋白。SIPR多肽可来自拟南芥、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。

在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。

抑制DNA构建体可包含至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接：(a)以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或者(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或者(b)来源于所关注靶基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SIPR多肽；或者(c)以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30或32进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(c)(i)的核酸序列的全长互补序列。所述抑制DNA构建体可包含共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如siRNA构建体或miRNA构建体)。

应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。引起给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。引起多肽分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定编码产物生物活性的保留情况。

“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。

抑制DNA构建体可包含来源于受关注的靶基因的区域并且可包含受关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％同一性的同一性(如具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)。

抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定受关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。

“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；和Gura，Nature 404：804-808(2000))。

另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT公开WO 98/36083)。

RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature 391：806(1998))。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共享(Fire等人，Trends Genet.15：358(1999))。

小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。

小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。

微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science 294：853-858(2001)，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-739(2002)；Lau等人，Science 294：858-862(2001)；Lee和Ambros，Science 294：862-864(2001)；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619(2002)；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-728(2002)；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495(2002)；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626(2002))。它们是由大小为大约70nt至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。

微RNA(miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位点位于靶mRNA的3′非翻译区中(Lee等人，Cell 75：843-854(1993)；Wightman等人，Cell 75：855-862(1993)；Reinhart等人，Nature 403：901-906(2000)；Slack等人，Mol.Cell 5：659-669(2000))，并且在lin-4和let-7miRNA与其靶位点之间有几个错配。结合lin-4或let-7miRNA似乎引起由靶miRNA编码的蛋白的稳态水平的下调，而不影响自身的转录物(Olsen和Ambros，Dev.Biol.216：671-680(1999))。另一方面，最近有证据表明，在某些情况下，miRNA可以引起靶转录物在靶位点内特异性RNA裂解，并且该裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间具有100％的互补性(Hutvagner和Zamore，Science 297：2056-2060(2002)；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619(2002))。看来似乎miRNA可能以至少两种途径进入靶基因调控：(1)当靶互补性为＜100％时蛋白下调；和(2)当靶互补性为100％时RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。

用生物信息学鉴定miRNA的靶标在动物中没有成功，这可能是因为动物miRNA与它们的靶标具有低水平的互补性。另一方面，生物信息学方法已经成功地用于预测植物miRNA的靶标(Llave等人，PlantCell 14：1605-1619(2002)；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495(2002)；Rhoades等人，Cell 110：513-520(2002))，因此，似乎植物miRNA与其推定靶的整个互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码涉及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。

调控序列：

本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可包含至少一种调控序列。

调控序列可为启动子。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。

在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。

虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，Plant Cell 2：163-171(1990))；泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU启动子(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。

在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调控启动子。

组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列：该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。

种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、patatin(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人，1989，EMBO J.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人，1990，Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人，1988，Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等人，1987，EMBO J.6：3571-3577)、B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，1988，EMBO J.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等人，1988，Plant Mol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBO J.6：3559-3564)和甘薯贮藏蛋白(sporamin)(甘薯块根)(Hattori，T.等人，1990，Plant Mol.Biol.14：595-604)。可操作地连接嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。此类实例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人，Plant Sci.63：47-57(1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人，EMBO J 6：3559-3564(1987))。

可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括例如受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

本发明使用的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，(1999)，Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed inImmature Aleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”。Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；以及3)玉米启动子Zag2(“Identification and molecularcharacterization of ZAG1，the maize homolog of the Arabidopsis floralhomeotic gene AGAMOUS(ZAG1-拟南芥花同源异形基因AGAMOUS的玉米同系物的鉴定和分子表征)”，Schmidt，R.J.等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993)；“Structural characterization，chromosomallocalization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMO US-likeMADS-box genes from maize(两对来自玉米的AGAMOUS样MADS-box基因的结构表征、染色体定位及系统发育评价)”，Theissen等人，Gene156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7天至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4天至5天至授粉后6天至8天被检测到。其他可用的启动子包括可来源于其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。

用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的启动子是茎特异性启动子。这种茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号：EF030816；Abrahams等人，Plant Mol.Biol.27：513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登录号：EF030817)等等，将这些文献以引用的方式并入本文。

启动子可整体源于天然基因，或由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至可包含合成的DNA片段。

用于本发明的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶启动子、泛素启动子、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶启动子、R-等位基因启动子、维管组织优选的启动子S2A(Genbank登陆号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI保藏：U38790；GI No.1063664)，

本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

内含子序列可加至5′非翻译区、蛋白编码区或3′非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。

任何植物都可选择用来鉴定将用于本发明重组DNA构建体的调控序列和SIPR基因序列。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。

组合物：

本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获得自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交和近交。

在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的近交系植物。该近交系植物产生含有新导入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性(例如，任选地在水限制条件下农学特性增加)的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子。

植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米近交系植物。植物还可为向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。

重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。

具体实施方案包括但不限于下列的：

1.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。在与该对照植物比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。

2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SIPR多肽，并且其中在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出增强的耐旱性。在与该对照植物比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。

3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SIPR多肽，并且其中在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

4.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

5.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑制DNA构建体包含至少一种可操作地连接来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域的调控元件，所述区域的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SIPR多肽，并且其中所述植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

6.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接以下序列的全部或部分：(a)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(b)(a)的核酸序列的全长互补序列，并且其中所述植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

7.上述实施方案1-6中的植物的任何子代、上述实施方案1-6中的植物的任何种子、上述实施方案1-6中的植物的子代的任何种子以及来自上述实施方案1-6中的任何植物以及它们的子代的细胞。

在任何前述实施方案1-7或本发明的任何其他实施方案中，SIPR多肽可来自拟南芥、玉米、大豆、烟豆、野大豆或短绒野大豆。

在任何前述实施方案1-7或本发明的任何其他实施方案中，重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)可包含至少在植物中有功能的启动子作为调控序列。

在任何前述实施方案1-7或本发明的任何其他实施方案中，所述至少一种农学特性的改变是增加或减少。

在任何前述实施方案1-7或本发明的任何其他实施方案中，所述至少一种农学特性可选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长、早期幼苗活力和在低温胁迫下的出苗。例如，至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的增加。

在任何前述实施方案1-7或本发明的任何其他实施方案中，在与不包含所述重组DNA构建体(或所述抑制DNA构建体)的对照植物在水限制条件下进行比较时，植物可表现出至少一种农学特性的改变。

“干旱”指植物可利用的水不足，尤其是当时间延长时，能够引起植物损伤或阻止其正常发育(例如限制植物生长或种子产量)。

“耐旱性”指植物在干旱条件下存活较长时间并且基本上不表现出生理或物理退化的特性。

植物的“增强的耐旱性”相对于参比植物或对照植物进行测量，它是植物在干旱条件下存活较长时间，并且相对于在相似干旱条件下生长的参比或对照植物基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的特性。通常当转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体时，它相对于参比或对照植物表现出增强的耐旱性，所述参比或对照植物在其基因组中不包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。

本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件并评价植物耐旱性的规程，所述植物已经遭受了模拟的或天然存在的干旱条件。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需求较少的水或在一定时期内不提供水来模拟干旱条件，并且技术人员可通过寻找在生理和/或物理条件上的差异来评价耐旱性，包括但不限于活力、生长、大小或根长、或具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价耐旱性的其他技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率和换气速率。

干旱胁迫实验可涉及慢性胁迫(即缓慢干燥)和/或可涉及两种急性胁迫(即突然除去水)，它们由一天或两次恢复分开。慢性胁迫可持续8-10天。急性胁迫可持续3-5天。在对转基因植物和相应对照植物进行干旱胁迫以及良好灌溉处理期间可测量以下变量：

变量“％面积chg_慢性开始-急性2”是介于慢性胁迫第一天和第二次急性胁迫那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“％面积chg_慢性开始-慢性结束”是介于慢性胁迫第一天和慢性胁迫最后一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“％面积chg_慢性开始-收获”是介于慢性胁迫第一天和收获那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“％面积chg_慢性开始-恢复24小时”是介于慢性胁迫第一天和恢复24小时(急性胁迫2之后24小时)之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“psii_急性1”是在第一次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。

变量“psii_急性2”是在第二次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。

变量“fv/fm_急性1”是在第一次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量度-(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)

变量“fv/fm_急性2”是在第二次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量度-(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)

变量“叶片卷曲_收获”是在收获日的顶部图像对侧面图像的比率的量度。

变量“叶片卷曲_恢复24小时”是恢复24小时顶部图像对侧面图像的比率的量度。

变量“比生长速率(SGR)”指植物总表面积经过单独一天的变化(通过Lemna Tec Instrument测量)(Y(t)＝Y0*e^r*t)。Y(t)＝Y0*e^r*t等同于Y/Δt的变化％，其中各个术语含义如下：Y(t)＝t时的总表面积；Y0＝初始总表面积(估计值)；r＝比生长速率天数^-1，以及t＝种植后的天数(“DAP”)

变量“苗干重”是将苗置于104℃烘箱96小时后的苗重量的量度

变量“苗鲜重”是从植物切除后立即称重的苗重量的量度

下文实例描述一些用于模拟干旱条件和/或评价耐旱性的代表性规程和技术。

也可通过在田间测试中比较植物在模拟的或天然存在的干旱条件下(例如通过测量与非干旱条件下相比，在干旱条件下基本等同的产量，或测量与对照或参比植物相比，在干旱条件下更少的产量损失)保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％产量)的能力来评价耐旱性。

在评估或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(例如，如本文描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：

1.转化过的植物的子代，该转化过的植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植物：包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于不包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即不包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植物)。

2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进品种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或品种品系进行测量(即亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。

3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。

4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植物：该植物可以相对于这样的对照植物进行评估或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但具有与该植物相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植物相比，核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。

此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。

方法：

方法包括但不限于：用于增强植物耐旱性的方法、用于评价植物耐旱性的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法和用于制备种子的方法。所述植物可为单子叶或双子叶植物，例如玉米或大豆植物。植物还可为向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。所述种子可为玉米或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米近交种子。

方法包括但不限于如下方法：

转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在具体实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核，例如细菌。

生产转基因植物的方法，其包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体来转化植物细胞并从转化过的植物细胞再生出转基因植物。本发明也涉及由该方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获得的转基因种子。

用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组DNA构建体，所述多核苷酸可操作地连接至少一个调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。

改变宿主细胞中本发明多肽表达水平的方法，包括：(a)用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达所述重组DNA构建体的条件下培养转化过的细胞，其中重组DNA构建体的表达导致转化过的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。

增强植物耐旱性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，以及在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，以及在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出增强的耐旱性。

增强植物耐旱性的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；以及(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，以及在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，以及在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增强的耐旱性。

增强植物耐旱性的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的所述有义链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SIPR多肽；以及(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，以及在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，以及在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增强的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述转基因植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。所述方法还可包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，以及(e)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；以及(c)评价所述转基因植物与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。所述方法还可包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，以及(e)评价所述子代植物与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的所述有义链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SIPR多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；以及(c)评价所述转基因植物与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。所述方法还可包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，以及(e)评价所述子代植物与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)评价所述子代植物与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的所述有义链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SIPR多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；以及(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)评价所述子代植物与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)确定所述转基因植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。所述方法还可包括：(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(e)确定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)确定所述转基因植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。所述方法还可包括：(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(e)确定所述子代植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当，所述区域的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的所述有义链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SIPR多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(c)确定所述转基因植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。所述方法还可包括：(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(e)确定所述子代植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)确定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32或34进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)确定所述转基因植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)将抑制DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的所述有义链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SIPR多肽；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及(d)确定所述转基因植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在水限制条件下)是否表现出至少一种农学特性的改变。

产生种子(例如可作为提供耐旱性的产品销售的种子)的方法，该方法包括任何前述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。

在任何前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，在所述导入步骤中所述可再生的植物细胞可包括愈伤组织细胞、胚胎愈伤组织细胞、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞可来自近交玉米植物。

在任何前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，所述再生步骤可包括：(i)在包含促胚发生激素的培养基中培养所述转化的植物细胞，直至观察到愈伤组织；(ii)将步骤(i)的所述转化植物细胞转移到第一培养基中，所述培养基包括促组织形成激素；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。

在任何前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，所述至少一种农学特性可选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长、早期幼苗活力和在低温胁迫下的出苗。至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的增加。

在任何前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，在与不包含所述重组DNA构建体(或所述抑制DNA构建体)的对照植物在水限制条件下进行比较时，植物可表现出至少一种农学特性的改变。

在任何前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，存在供选择的替代方案用于将包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子、任选地作为转位因子的部件)导入可再生的植物细胞，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本发明多肽的内源性基因的事件。

将本发明的重组DNA构建体导入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化。植物转化和再生技术已经在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。

含有编码受关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。可将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反，将来自这些重要品系植物的花粉用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，可对本发明做出各种变化和修改，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。此类修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。

实施例1

具有激活标记基因的拟南芥属种群的制备

构建18.5kb的T-DNA基二元构建体，pHSbarENDs2(图1；SEQ IDNO：1)，其包含来源于花椰菜花叶病毒35S启动子的四个多聚增强子元件(对应于序列-341至-64，如Odell等人Nature 313：810-812(1985)所定义)。该构建体也包含允许质粒拯救的载体序列(pUC9)和多接头、再动员T-DNA的转座子序列(Ds)、以及允许草胺磷选择转基因植物的bar基因。原则上，仅将从右边界(RB)至左边界(LB)包含的10.8kb片段转移到寄主植物基因组中。因为增强子元件位于靠近RB处，它们可诱导T-DNA整合后的基因组位点顺式激活。

通过整个植物的农杆菌属转化制备拟南芥属激活标记种群。将pHSbarENDs2构建体转化到根癌农杆菌菌株C58中，在25℃下在LB中培养至OD600～1.0。然后离心沉淀细胞，并重悬在相等体积的5％蔗糖/0.05％Silwet L-77(OSI Specialties，Inc)中。在早期抽薹时，培育拟南芥生态型Col-0的土壤使用农杆菌属悬浮液进行顶部灌溉。一周后，相同植物再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌属菌株进行顶部灌溉。然后将该植物的种子设为标准。所得T1种子在土壤中播种，通过喷洒草胺磷(Finale；AgrEvo；Bayer Environmental Science)选择转基因幼苗。选择了总计100,000个草胺磷抗性T1幼苗。分开保存来自每个品系的T2种子。

实施例2

筛选以鉴定耐旱性增强的品系

定量干旱筛选：将来自每个96,000个分离T1激活标记品系的九个草胺磷抗性T2植物每株种植在有ScottsMetro-Mix200土壤的单个罐中。每个浅箱配置有8个方罐。每个方罐顶部填充有土壤。每个罐(或单元)均播种以产生3×3阵列的9个草胺磷抗性幼苗。

土壤浇水至饱和，然后植物在标准条件下生长(即16小时光照，8小时黑暗循环；22℃；～60％相对湿度)。不提供附加的水。

在可见的干旱胁迫症状出现时拍摄植物的数字图像。每天拍摄图像一次(在每天的相同时间)，直至植物变干。通常收集连续四天的数据。

使用颜色分析鉴定潜在的耐旱性品系。可使用颜色分析测量进入黄色区的叶片面积百分比的增加。使用色调、饱和度和强度数据(“HSI”)，黄色区由色调35至45组成。

叶片面积的保持也被用作鉴定潜在耐旱性品系的另一个标准，因为拟南芥属叶片在干旱胁迫期间萎蔫。叶片面积的保持可用莲座型叶丛面积随时间的减少来测量。

叶片面积根据使用LemnaTec成像系统获得的绿色像素数目进行测量。激活标记和对照(例如野生型)植物在浅箱中并列生长，所述浅箱包含72个植物(9个植物/罐)。当萎蔫开始时，拍摄图像多日以监控萎蔫过程。基于连续四天获得的绿色像素数，从这些数据中测定激活标记植物和伴随的对照植物的萎蔫特征图。该特征图选自发生最大程度萎蔫的四天中的一系列测量结果。耐旱能力通过激活标记植物与对照植物相比的抗萎蔫倾向来测量。

使用LemnaTec HTSBonitUV软件分析CCD图像。根据绿色像素数目获得对拟南芥属植物的叶片面积的评估。对每张图像的数据进行平均化以获得对激活标记植物和野生型植物的绿色像素值的平均值和标准偏差的评估。噪声函数的参数通过平方偏差对平均像素数的直线回归获得，使用批中的所有图像数据。平均像素数数据的误差估计使用噪声函数的拟合参数进行计算。激活标记植物和野生型植物的平均像素数相加以获得每张图像的总叶片面积的评估。具有最大萎蔫的四天间隔通过选择对应于植物生长最大差异的间隔获得。激活标记植物和野生型植物的单个萎蔫响应通过归一化使用间隔第一天的绿色像素数值的数据获得。激活标记植物与野生型植物相比的耐旱性通过相加经过两天至四天的激活标记植物和野生型植物间的萎蔫响应的加权差值来评分；加权数通过传递数据误差进行评估。耐旱性评分为正对应于激活标记植物与野生型植物相比萎蔫更慢。激活标记植物和野生型植物之间的萎蔫响应的差异显著性从平方偏差的加权和获得。

将在与整个浅箱的平均值进行比较时具有黄色积聚显著延迟和/或莲座型叶丛面积显著保持的品系命名为Phase 1hits。在相同分析条件下进行Phase 1hits的重复试样再筛选。当Phase 2平行测定的其中一个或全部显示与整个浅箱的平均值有显著差异时(评分大于0.9)，则认为该品系是经验证的耐旱性品系。

实施例3

激活标记基因的鉴定

在耐旱性品系中侧接T-DNA插入序列的基因使用以下两个标准方法中的一个或两个进行鉴定：(1)热不对称交错(TAIL)PCR(Liu等人，(1995)，Plant J.8：457-63)；和(2)SAIFF PCR(Siebert等人，(1995)Nucleic Acids Res.23：1087-1088)。至于复杂的多聚T-DNA插入序列品系，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鉴定候选基因。在这些情况下，可使用包括反式PCR、质粒拯救和/或基因组文库构建在内的其他程序。

成功的结果是其中单个TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA边界序列和拟南芥属基因组序列。

一旦获得侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与公开可用的拟南芥属基因组的序列比对来鉴定候选基因。

具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是激活的基因的候选基因。

为了验证鉴定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合伪克隆的可能性，用一个T-DNA中的寡核苷酸和一个候选基因特异性的寡核苷酸进行对基因组DNA的诊断PCR。将提供PCR产品的基因组DNA样本理解为表示T-DNA插入序列。该分析也验证了其中一种以上的插入事件发生在相同品系中的情况，例如，在TAIL和/或SAIFF PCR分析中鉴定是否有多个不同基因组片段。

实施例4A

激活标记SIPR基因的鉴定

进一步分析显示耐旱性的激活标记品系(No.104159)。提取来自该品系的DNA，并且在突变品系中侧接T-DNA插入序列的基因通过SAIFF PCR(Siebert等人，Nucleic Acids Res.23：1087-1088(1995))。鉴定一个PCR扩增的片段，它包含T-DNA边界序列和拟南芥属基因组序列。获得侧接T-DNA插入序列的基因组序列，通过与完全拟南芥属基因组的序列比对鉴定候选基因。就给定的T-DNA整合事件而言，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是品系中的活化候选基因。在品系104159的情况下，T-DNA位于At1g26796(NCBI GI NO.3766801)的密码子序列中，其具有指向候选基因At1g26797(SEQ ID NO：17；NCBIGI No.30689649)的35S增强子元件，编码SIPR多肽(SEQ ID NO：18；NCBI GI No.30689650)。

实施例4B

候选耐旱性基因表达水平的测定

功能性的激活标记等位基因将导致在其中它正常表达的组织中的候选基因上调、在其中它通常不表达该基因的组织中异常表达、或者两种情况都发生。

比较在同源突变品系和野生型品系中的候选基因的表达水平。使用标准RT-PCR程序如得自Qiagen的QuantiTectReverse Transcription。使用肌动蛋白基因的RT-PCR作为对照物以显示来自突变品系和野生型的样本的扩增和载入是相似的。

最优化各个基因的测定条件。在成熟的莲座型叶中检查表达水平。如果激活标记等位基因导致在其他组织(例如根)中的异常表达，通过该检测分析法它不被检出。同样地，阳性结果是有用的，但是阴性结果不排除基因不需要进行进一步的分析。

实施例5

经由转化到拟南芥属中验证拟南芥属候选基因At1g26797(SIPR多 肽)

可将候选基因转化到拟南芥属中并在35S启动子作用下过表达。如果在转基因品系中观察到与亲本激活标记品系相同或相似的表型，则将该候选基因认为是拟南芥属中验证过的“前导基因”。

用以下方法测试候选拟南芥属SIPR基因(At1g26797；SEQ ID NO：17；NCBI GI No.30689649)赋予耐旱性的能力。

用紧接Invitrogen^TM GatewayC1转化插入序列上游的1.3kb的35S启动子构建16.8kb的T-DNA基二元载体，称为pBC-yellow(SEQ ID NO：4；图4)。该载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-Yellow(Invitrogen^TM)，它赋予转化过的种子黄色荧光。

通过RT-PCR扩增At1g26797cDNA蛋白编码区，使用以下引物：

(1)At1g26797-5′attB正向引物(SEQ ID NO：12)：

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccatgctaatcacagttctag

(2)At1g26797-3′attB反向引物(SEQ ID NO：13)：

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcagtcaatctctaagatgtcc

正向引物包含attB1序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；SEQ ID NO：10)和共有的Kozak序列(CAACA)邻近蛋白编码区的前19个核苷酸(以所述cDNA的ATG起始密码子开头)。

反向引物包含attB2序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT；SEQ ID NO：11)，该序列邻近蛋白编码区的反向互补序列的后21个核苷酸(以所述cDNA的终止密码子的反向互补序列开头)。

使用INVITROGEN^TM GATEWAYCLONASE^TM技术，用pDONR^TM/Zeo(SEQ ID NO：2；图2)进行BP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TM/Zeo移除并定向地克隆了在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆PHP32324。该入门克隆与目的载体一起用于随后的LR重组反应如下。

用紧接INVITROGEN^TM GATEWAYC1转化插入序列上游的1.3kb35S启动子构建称为pBC-yellow(SEQ ID NO：4；图4)的16.8kb T-DNA基的二元载体(目的载体)，所述插入序列包含ccdB细菌致死基因以及侧接attR1和attR2序列的氯霉素抗性基因(CAM)。该载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-Yellow(INVITROGEN^TM)，它赋予转化过的种子黄色荧光。使用INVITROGEN^TM GATEWAY技术，对包含定向克隆PCR产物和pBC的PHP32324入门克隆进行LR重组反应。这允许迅速的和定向的克隆pBC中在35S启动子后的候选基因以制备35S启动子::At1g26797表达构建体，pBC-Yellow-At1g26797。

申请人然后使用如实施例1所述的相同农杆菌介导的转化程序将35S启动子::At1g26797表达构建体导入野生型拟南芥属生态型Col-0中。转基因T1种子通过黄色荧光进行选择，并且将T1种子紧邻着野生型种子种植并在水限制条件下生长。生长条件和成像分析如实施例2所述。发现来自激活标记的初始耐旱性表型可在用其中At1g26797通过35S启动子直接表达的构建体转化过的野生型拟南芥属植物中重现。通过实施例2的方法测定的耐旱性评分是1.934。

实施例6

cDNA文库的制备和cDNA克隆的分离和测序

cDNA文库可通过许多可用的方法中的任一种制备。例如，通过首先根据生产商的说明书(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)制备Uni-ZAP^TM XR载体中的cDNA文库，可将cDNA导入质粒载体中。根据Stratagene提供的说明书，将Uni-ZAP^TMXR文库转换成质粒文库。当转换的时候，将把cDNA插入序列包含于质粒载体pBLUESCRIPT中。此外，可使用T4连接酶(New England Biolabs)将cDNA直接导入预切过的BLUESCRIPTII SK(+)载体(Stratagene)中，随后按照制造商规程(GIBCO BRL Products)转染DH10B细胞。一旦cDNA插入序列处于质粒载体中，从随机选取的含重组pBLUESCRIPT质粒的细菌菌落制备质粒DNA，或者用对插入的cDNA序列旁侧的载体序列特异性的引物，通过聚合酶链式反应扩增插入的cDNA序列。将扩增的DNA插入序列或质粒DNA在引物标记法测序反应(dye-primersequencing reaction)中进行测序，以产生部分cDNA序列(表达序列标记或“EST”；参见Adams等人，1991，Science 252：1651-1656)。用Perkin Elmer Model 377荧光测序仪分析所得的EST。

用改进的转座规程产生全长插入序列(FIS)数据。从归档的甘油原种作为单一菌落回收确定了FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。将分离的DNA模板在基于PCR的测序反应中与载体引物M13正向和反向寡核苷酸反应并上样至自动化的测序仪上。通过与对其进行FIS查询的初始EST序列进行序列比对来确认克隆鉴定。

将确认的模板通过基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ty1转座因子(Devine和Boeke(1994)，Nucleic Acids Res.22：3765-3772)。该体外转座系统在整个一组大DNA分子中随机地放入独特的结合位点。随后将转座的DNA用于通过电穿孔转化DH10B电感受态细胞(GIBCOBRL/Life Technologies，Rockville，MD)。转座因子含有另外的可选标记(称为DHFR；Fling和Richards(1983)，Nucleic Acids Res.11：5147-5158)，使得能在琼脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每次转座反应随机地选择多个亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结合位点特异性的独特引物从转座事件位点向外进行测序(ABI PRISMdyeterminator ReadyReaction mix)。

收集序列数据(ABI PRISMCollections)并用Phred和Phrap(Ewing等人(1998)，Genome Res.8：175-185；Ewing和Green(1998)GenomeRes.8：186-194)。Phred是一种公用软件程序，该程序再次读取ABI序列数据，再次调出(recall)碱基，赋质量值，并将碱基序列(base call)和质量值写入可编辑的输出文件中。Phrap序列组装程序使用这些质量值来增加组装的序列重叠群的准确度。通过Consed序列编辑器(Gordon等人(1998)，Genome Res.8：195-202)。

在一些克隆中，cDNA片段可对应基因的3′端的一部分并且不会涵盖整个开放阅读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一种。这两种方法中的第一种方法导致产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开放阅读框的片段。这两种方法均使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有时基于以前的知识(特定的基因应该存在于某些组织中)选择文库，有时则进行随机地选择。获得相同基因的反应可平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库池通常用3至5个不同的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增中，两种方法均使用载体特异性的(正向)引物，同时还使用基因特异性的(反向)引物，该正向引物对应位于克隆5′端处的载体的一部分。第一种方法使用与已知基因序列的一部分互补的序列，而第二种方法使用与3′非翻译区(也称为UTR)的一部分互补的基因特异性引物。在第二轮扩增中，两种方法均使用套式引物组。按照生产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段连接进pBLUESCRIPT载体中。该试剂盒选自可得自包括INVITROGEN^TM(Carlsbad，CA)、Promega Biotech(Madison，WI)和Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)在内的一些供应商的许多试剂盒。如上所述，将质粒DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用Phred/Phrap进行装配。

实施例7

cDNA克隆的鉴定

编码受关注的多肽的cDNA克隆能通过BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool；Altschul等人(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；还可参见国立卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释)进行鉴定，寻找与BLAST“nr”数据库中所包含氨基酸序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译序列、来源于3维结构Brookhaven蛋白质数据库(Protein Data Bank)、SWISSPROT蛋白质序列数据库的最新的主要版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)的相似性。在所有的阅读框中翻译来自克隆的DNA并用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，1993，Nat.Genet.3：266-272)比较与“nr”数据库中包含的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析cDNA序列编码的多肽与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计算仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P值(概率)或E值(期望值)，在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P值或E值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA编码的序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。

EST序列能与如上所述的Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTN算法(Altschul等人(1997)，Nucleic Acids Res.25：3389-3402.)对杜邦(DUPONT^TM)专利数据库比较具有序列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5′端或3′端序列的EST。在两个或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可装配成单一的连续核苷酸序列，从而使最初的片段在5′或3′初始方向上延伸。一旦确定了最5′的EST后，可以如上所述，通过全长插入序列来确定其完整的序列。可用tBLASTn算法，通过将已知基因(来自专有来源或公开数据库的已知基因)的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找到属于不同物种的同源基因。tBLASTn算法对所有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库进行氨基酸查询的搜索。该搜索允许不同物种之间的核苷酸密码子使用的差异，并且允许密码子简并。

实施例8

编码SIPR多肽的cDNA克隆的表征

表1(非专利文献)和表2(专利文献)中显示的是本文所述的拟南芥属SIPR多肽(SEQ ID NO：18)及其同源物(SEQ ID NO：20、22、24、26、28、30、32和34)的BLASTP结果。SEQ ID NO：30由SEQ IDNO：29编码，并且是NCBI GI No.297850998提供的公开可用的琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)序列的截短型。

还显示了每对氨基酸序列的序列同一性百分比值：

表1

表2

图11A-11J给出如SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32、34-40所示的SIPR多肽氨基酸序列比对结果。

图12给出图11A-11J中给出的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。

用LASERGENE生物信息计算包(DNASTARInc.，Madison，WI)的MEGALIGN程序进行序列比对和同一性百分比计算。序列多重比对是用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)采用默认参数(缺口罚分＝10，缺口长度罚分＝10)来进行。使用Clustal方法的成对比对的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。

实施例9

包含拟南芥属前导基因同源物的植物表达载体的制备

与拟南芥属SIPR多肽同源的序列能使用序列比较算法如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)；也参见美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的万维网网址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法进行鉴定。编码同源SIPR多肽的序列可通过以下方法进行PCR扩增。

方法1(基于RNA的方法)：如果编码SIPR多肽同源物基因的蛋白编码区的5′和3′序列信息是可用的，能够如实施例5所述设计基因特异性引物。可将RT-PCR用于植物RNA来获得含有蛋白编码区的核酸片段，该EXST蛋白编码区侧接attB1(SEQ ID NO：10)和attB2(SEQID NO：11)序列。引物可含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。

方法2(基于DNA的方法)：作为另外一种选择，如果编码SIPR多肽同源物的基因的cDNA克隆是可用的，可以PCR扩增完整cDNA插入序列(含有5′和3′非编码区)。可设计正向引物和反向引物，使它们分别或者含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBulescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQ ID NO：14)和反向引物VC063(SEQ ID NO：15)。

方法1和方法2可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物可含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。

可利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与GATEWAY供体载体(例如pDONR^TM/Zeo(INVITROGEN^TM；图2；SEQID NO：2)或PDONR^TM221(INVITROGEN^TM；图3；SEQ ID NO：3)组合。这种方法将细菌致死CCDB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TM221移除并定向地克隆了该在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。使用INVITROGEN^TMGATEWAYCLONASE^TM技术，然后可将来自入门克隆的编码同源SIPR多肽的序列转移到合适的目的载体中，例如pBC-Yellow(SEQ ID NO：4；图4)、PHP27840(SEQ ID NO：5；图5)或PHP23236(SEQ ID NO：6；图6)，以获得植物表达载体，所述载体分别用于拟南芥、大豆和玉米。

供体载体pDONR^TM/Zeo或pDONR^TM221的attP1和attP2位点分别在图2和图3中显示。目的载体pBC-Yellow、PHP27840和PHP23236的attR1和attR2位点分别在图4、5和6中显示。

作为另外一种选择，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的Multi Site GatewayLR重组反应以产生表达载体。

实施例10

大豆表达载体的制备和用验证过的拟南芥属前导基因转化大豆

为了检查所得表型，可将大豆植物转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。

可将实施例5中所述的相同Gateway入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体(SEQ ID NO：5；图5)中，使得该基因的表达处于SCP1启动子的控制下。

然后可用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。大豆转化和再生技术已经在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。

T1植物可经受土壤基的干旱胁迫。使用图像分析，可在干旱胁迫之前和期间进行多次植物面积、体积、生长速率和颜色分析。导致萎蔫或叶片面积减少推迟、黄色积聚和/或在干旱胁迫期间生长速率提高的超表达构建体将被认为是拟南芥属基因在大豆中发挥功能以提高耐旱性的证据。

然后可在较严格的大田基研究条件下检测分析用验证基因转化的大豆植物以研究在灌溉良好和水限制条件下的产量增加和/或稳定性。

实施例11

使用粒子轰击用验证过的拟南芥属前导基因转化玉米

为了检查所得表型，可将玉米植物转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。

可以将实施例5中所述的相同GATEWAY入门克隆用于将每个基因定向克隆进玉米转化载体中。在玉米转化载体中的基因的表达可处于组成型启动子的控制下，例如玉米泛素启动子(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人(1992)，PlantMol.Biol.18：675-689)

然后可通过粒子轰击将上述重组DNA构建体导入玉米细胞中。通过粒子轰击进行玉米转化的技术已经在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。

T1植物可经受土壤基的干旱胁迫。使用图像分析，可在干旱胁迫之前和期间进行多次植物面积、体积、生长速率和颜色分析。导致萎蔫或叶片面积减少推迟、黄色积聚和/或在干旱胁迫期间生长速率提高的超表达构建体将被认为是拟南芥属基因在玉米中发挥功能以提高耐旱性的证据。

实施例12

根癌农杆菌LBA4404的电穿孔

将电穿孔感受态细胞(40μL)，例如含有PHP 10523的根癌农杆菌LBA4404(图7；SEQ ID NO：7)在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。将DNA等分试样(0.5μL亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H₂O中的浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的根癌农杆菌LBA4404细胞混合，同时仍然保持在冰上。将混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。按下“pulse(脉冲)”键两次(理想的是获取4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后，将0.5mL室温下的2×YT培养基(或SOC培养基)加入到电穿孔管并转移至15mL按压盖管(例如FALCON^TM管)中。将细胞在28-30℃、200-250rpm下培养3小时。

将250μL的等分试样散布在包含YM培养基和50μg/mL奇放线菌素的板上并在28-30℃下培养三天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个可选步骤中的其中一个：

选择1：用30μL 15mg/mL的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。

选择2：进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。

转化体的鉴定：

选取四个独立的克隆并划痕接种在包含AB基本培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上用于分离单个克隆。将平板在28℃下孵育二至三天。对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其接种在4mL的10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠和50mg/L奇放线菌素中。将该混合物在28℃下摇动培养24小时。采用QIAGENMiniprep和可选的PB缓冲液洗涤，从4mL培养物分离出质粒DNA。DNA在30μl中洗脱。如上所述，将2μL的等分试样用于电穿孔20μL DH10b+20μL双蒸H₂O。任选地，可将15μl等分试样用于转化75-100μl的INVITROGEN^TMLibrary Efficiency DH5α。将细胞散布在包含LB培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上并将其在37℃下培养过夜。

对于每个推定的共整合体选取三至四个独立克隆并将其接种在4mL的2×YT培养基(10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)和50μg/mL奇放线菌素中。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。接下来，使用QIAprepMiniprep，用任选PB缓冲液洗涤液(洗脱成50μL)从4mL培养物中分离质粒DNA。8μL质粒DNA用SalI(使用亲本DNA和PHP10523作对照物)进行消化。对于4个质粒，利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用亲代DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。

实施例13

使用农杆菌属转化玉米

为了检查所得表型，可将玉米植物转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。

农杆菌介导的玉米转化基本上按照以下文献中描述的方法进行：Zhao等人，在Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)(还参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840，所述文献以引用方式并入本文)。该转化过程涉及细菌接种、共培养、静止期、选择以及植物再生。

1.未成熟胚芽制备：

将未成熟玉米胚芽从颖果上切下来，并放置在含有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。

2.未成熟胚芽的农杆菌属感染和共培养：

2.1感染步骤：

用1mL微量吸移管将(1)的PHI-A培养基取出，并加入1mL农杆菌属悬浮液。将该管轻轻地倒置以混合。将该混合物在室温下培养5分钟。

2.2共培养步骤：

用1mL微量吸移管将农杆菌属悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。测定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚芽的平板在20℃下于黑暗中培养三天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。

3.选择推定的转基因事件：

向在100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的平板中转移10个胚芽，保持朝向，并用石蜡膜将培养皿密封。将平板在黑暗中于28℃下培养。预计在六至八周将看见作为黄色胚芽组织的主动生长推定事件。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆性组织生长。以二-三周的间隔将推定的转基因胚芽组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行传代培养，时间间隔取决于生长速度。记录事件。

4.T0植物的再生：

将在PHI-D培养基上繁殖的胚芽组织转移到在100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚芽成熟培养基)中进行传代培养，在28℃于黑暗中培养直至体细胞胚芽成熟，培养大约十天至十八天。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中，并且在28℃下于光中(约80μE，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在七至十天，将约10cm高的再生的植物置于盆中的园艺混合物中，并使用标准园艺方法进行耐寒锻炼(hardened-off)。

用于植物转化的培养基：

1.PHI-A：4g/L CHU基础盐，1.0mL/L 1000X Eriksson′s维生素混合物，0.5mg/L盐酸硫胺，1.5mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2。加入100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)。

2.PHI-B：PHI-A，不含有葡萄糖，将2，4-D增加至2mg/L，将蔗糖降低至30g/L，并补充0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌的)，3.0g/L Gelrite，100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)，pH5.8。3.PHI-C：PHI-B，不含Gelrite和乙酰丁香酮，将2，4-D降低至1.5mg/L，并补充8.0g/L琼脂，0.5g/L 2-[N-吗啉代]乙烷-磺酸(MES)缓冲液，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)。

4.PHI-D：PHI-C补充3mg/L双丙氨磷(过滤灭菌的)。

5.PHI-E：4.3g/L Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRL11117-074)，0.5mg/L烟酸，0.1mg/L盐酸硫胺，0.5mg/L盐酸吡哆醇，2.0mg/L甘氨酸，0.1g/L肌醇，0.5mg/L玉米素(Sigma，Cat.No.Z-0164)，1mg/L吲哚乙酸(IAA)，26.4μg/L脱落酸(ABA)，60g/L蔗糖，3mg/Lbialaphos(过滤灭菌的)，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)，8g/L琼脂，pH5.6。

6.PHI-F：PHI-E，不含有玉米素、IAA、ABA；将蔗糖降低至40g/L；用1.5g/L Gelrite替代琼脂；pH 5.6。

通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移到再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。

转基因T0植物可以再生，并可以确定其表型。可收集T1种子。

此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因掺入而将含有验证过的拟南芥属基因的重组DNA构建体导入优良玉米近交系内。

近交或杂交的转基因植物可通过更严苛的大田试验来研究在水限制条件下和水不限制条件下的产量增加和/或稳定性。

随后可进行产量分析以测定包含验证过的拟南芥属前导基因的植物在与不包含验证过的拟南芥属前导基因的对照植物(或参比植物)进行比较时是否具有产量改善(在水限制条件下或水不限制条件下)。具体地讲，可在包含验证过的拟南芥属前导基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加水限制条件。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物相对于对照植物将具有更少的产量损失，例如在水限制条件下产量损失减少至少25％，或在水不限制条件下相对于对照植物将具有提高的产量。

实施例14A

用于转化玉米的拟南芥属前导基因(At1g26797)表达载体的制备

使用INVITROGEN’s^TMGATEWAY技术，用入门克隆(PHP32324)和目的载体(PHP28647)进行LR重组反应以制备前体质粒PHP32330。载体PHP32330包含以下表达盒：

1.表达PAT抗除草剂性基因的泛素启动子::moPAT::PinII终止子盒；该基因用于转化过程期间的选择。

2.表达DS-RED颜色标记的LTP2启动子::DS-RED2::PinII终止子盒；该标记用于分选种子。

3.泛素启动子::At-SIPR::PinII终止子；过表达受关注基因的盒，拟南芥属SIPR多肽。

实施例14B

使用农杆菌属用拟南芥属前导基因(At1g26797)转化玉米

使用如实施例12和13所述的农杆菌属介导的转化，可将载体PHP32330(如实施例所述)中存在的SIPR多肽表达盒导入玉米近交系或来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系。

可将PHP32330载体电穿孔导入包含载体PHP10523(图7；SEQ IDNO：7)的LBA4404农杆菌属菌株中以制备共整合载体PHP32412。共整合载体是通过2个质粒PHP32330与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。共整合载体PHP32412除包含农杆菌属菌株和农杆菌介导转化所需的其他基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)之外，还包含同上(实施例14A)的3个表达盒。

实施例15

用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系的目的载体PHP23236的制备

目的载体PHP23236(图6，SEQ ID NO：6)是通过用质粒PHP23235(图8，SEQ ID NO：8)转化包含质粒PHP 10523(图7，SEQ ID NO：7)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP23236可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系的玉米表达载体。

实施例16

用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系的质粒的制备

使用INVITROGEN^TM GATEWAYLR重组技术，可将如实施例5所述的蛋白编码区定向克隆到目的载体PHP29634(SEQ ID NO：16；)中以形成表达载体PHP33118。目的载体PHP29634与目的载体PHP23236是相似的；但是，目的载体PHP29634具有位点特异性的重组位点FRT1和FRT87，并且还编码用于利用草甘膦对转化体进行选择的GAT4602选择性标记蛋白。该表达载体包含在UBI启动子控制下的受关注cDNA(编码SIPR多肽)，并且是T-DNA二元载体，用于通过如本文所述实施例所述(但不限于)的农杆菌属介导转化到玉米中。

实施例17

用验证过的拟南芥属前导基因转化Gaspe Flint来源的玉米品系

为了检查所得表型，可转化玉米植物以过表达拟南芥前导基因(或来自其他物种的对应同源物)。

受体植物：

受体植物细胞可来自具有短的生活周期(“快速循环”)、小的个体尺寸以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植物细胞是来自可公开获得的Gaspe Flint(GBF)品系品种的植物细胞。一种可能的候选植物品系品种是GBF×QTM(Quick Turnaround Maize(快速周转玉米)，选择用于在温室条件下生长的Gaspe Flint的可公开获得形式)的F1杂交种，其在Tomes等人的美国专利申请公开2003/0221212中有所公开。从该品系获得的转基因植物具有如此小的大小使得它们可在四英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植物所需空间的1/4)并且它们在少于2.5个月时间内成熟。(传统上，一旦转基因植物适应温室后需要3.5个月来获得转基因T0种子。)另一合适的品系是GS3(高度可转化的品系)×Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良近交系。

转化规程：

任何合适的方法可用于将转基因导入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌载体的接种类型的步骤。转化可在受体(靶标)植物的未成熟胚上进行。

精确的生长和植物跟踪：

将由转化的玉米胚产生的转基因(T0)植物的事件群体在受控的温室环境中栽培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植物布局，在该布局中，实验植物被分成组(如每组三十株植物)，称为块，并且每株植物随块被随机分配一个位置。

对于一组三十株植物，二十四株转化的实验植物和六株对照植物(具有设定好的表型的植物)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列(也叫做重复组或块)。每株植物(对照植物或实验植物)随块被随机分配一个位置，所述的块映射唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个三十株植物的重复组中的每一个可栽培在相同的温室中。应该测定重复组的布局(布置方式)以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。

对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达受关注基因的那些转基因植物。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评估导入基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植物与表达转基因的那些植物进行比较。

在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植物，并从那些植物收集的数据自动与那些植物相关联，使得所搜集的数据可与由该植物携带的转基因关联。例如，每个植物容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相关联。

作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国公布的专利申请2004/0122592，其以引用方式并入本文。

利用三维成像进行表型分析：

对T0事件群体中的每株温室植物(包括任何对照植物)分析所关注的农学特性，并且以这样一种方式记录或存储每株植物的农学数据，该方式使得数据与该植物的辨识数据(见上面)相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。

在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植物以评估所关注的性状。可将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。

由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变，最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。

在单次成像分析操纵中，进行如下事件：(1)将植物传送至分析仪区域内，旋转360度以便其机器可读标签可被读取，并让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧面图像并将其输入数据库；(3)将植物旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动，以及(4)将该植物传送出分析仪。

每二十四小时的周期让植物至少六个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。

成像仪器：

可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH(Wurselen，Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec ScanalyzerHTS LT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。例如对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5％，对于次要组成成像分析仪的仪器差异可小于约10％。

软件：

成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。可将多种可商购获得的软件系统(如Matlab等)用于定量判读成像数据，并且这些软件系统中的任何一种均可应用于图像数据集。

传送带系统：

具有植物旋转装置的传送带系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多四株植物(每株最高高度为1.5m)装上汽车，该汽车在循环的传送带系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占有面积为约5m×5m。

可扩大传送带系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送带系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。

照明：

任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择，可变化照明以引起转基因(如绿荧光蛋白(GFP)、红荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。

基于三维成像的生物量估计：

为了更好地估计生物量，应该从至少三个轴(例如顶部视图和两个侧面(侧面1和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可通过如下计算评价植物的总面积：

估计的总植物面积(像素)＝顶部面积(像素)+侧面1面积(像素)+侧面2面积(像素)

在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该系统中，任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值(正较大和负较小两者)。大小(如面积)的任意单位可通过将物理参照加入到成像过程而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中均包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积单位，例如平方厘米(cm²)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度的盆足可用作物理参照。

颜色类型：

成像技术还可用于测定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可通过多种计算方法测定颜色类型。

对于植物大小和生长参数的测定，有用的分类方案是定义单一色彩设计，包括绿色的两种或三种色调，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。

除了其在测定植物的大小、生长中的有效性以外，颜色类型还可用于评估其他产量构成性状。对于这些其他产量构成性状，可使用另外的颜色类型方案。例如，称为“保绿度(staygreen)”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可通过颜色类型来评估，该颜色类型将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色类型应用于在T0或T1植物生活周期末获取的图像，可鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如可表示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可被鉴定为携带影响这种重要农学特性的转基因。

熟练的植物学家将认识到可指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素)的出现，以及认识到其他颜色类型方案可提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。

植物构造分析：

改变植物构造参数的转基因也可用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可如下用于测定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何构造，并且随后基于该图像可进行不同构造参数的参数化鉴定。或者是单独地或者是组合地修改任何这些构造参数的转基因可通过应用此前所述的统计方法来鉴定。

花粉脱落日期：

花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可通过活性雄花第一次出现在植物上来测定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色类型分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日期。

作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授粉日期、第一穗丝日期)可由负责进行植物看护的工作任人员来记录。为了使数据完整性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操作者感觉舒适。

植物的取向：

以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的构造。也就是说，植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的最大差别。将顶部图像用于测定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。

实施例18

Gaspe Flint来源的玉米品系的耐旱性的评价

可用以下方法筛选具有耐旱性的含候选基因的转基因Gaspe Flint来源的玉米品系。

转基因玉米植物经受供水良好条件(对照)和干旱胁迫条件。在T1阶段或更晚的时期筛选转基因玉米植物。

就植物生长而言，土壤混合物由1/3TURFACE、1/3SB300和1/3沙土构成。所有罐装满相同量的土壤±10克。手动浇水使得罐达到最多100％的罐体容量(“FC”)。使用20-10-20(氮-磷-钾)125ppm氮营养溶液将所有植物保持在60％FC。在整个实验期间每张表监测pH每周至少三次。在种植后第13天开始(DAP)，所述实验可分成两个处理组，良好灌溉组和缺水组。将包括缺水处理组在内的所有植物保持在40％FC，而将良好灌溉处理组的植物保持在80％FC。缺水植物在慢性干旱胁迫条件下(40％FC)生长10天。在慢性胁迫期间所有植物每日拍照。在慢性干旱末期(22DAP)采集植物样品用于代谢特征分析。在慢性胁迫结束时给所有植物拍照并测量叶绿素荧光。缺水植物经过重度干旱胁迫期及随后的恢复期，分别为23-31DAP和32-34DAP。在重度干旱胁迫期间，限制水和营养物质直至植物达到8％FC。在重度胁迫期和回复期结束时给所有植物再次拍照并测量叶绿素荧光。计算更大的Student′s t检验的概率用于比较每个转基因平均值与合适的无效转基因平均值(分离无效转基因或构建体无效转基因)。使用最小值(P＜t)0.1作为具有统计意义上显著性的结果的临界值。

实施例18B

用PHP32412转化的玉米品系的转化和评价

如实施例14A和14B所述，将存在于共整合载体PHP32412中的SIPR多肽表达盒导入来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系中。

筛选出基本上如实施例2所述具有耐旱活性的八个转化事件。表3A-3C显示与无效分离相比显著改变的每个转基因事件的变量。将“正效应”定义为转基因事件的变量相对于无效对照植物发生了具有统计意义上的显著性的改善。将“负效应”定义为无效对照植物相对于转基因事件的变量发生了具有统计意义上的显著性的改善。

就评价的构建体PHP32412而言，与各个改善变量相关联的统计值如图表3A-3C所示。在双尾检验中显著阳性结果具有小于或等于0.1的P值。各个转化玉米品系的结果如表3A-3C所示。

表3A-3C表明八个事件中的一个显示在非胁迫条件下Fv′/Fm′(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)正效应(增加)(表3A)。

表3A

评价用PHP32412 ^* 转化过的个体玉米品系并在缺水条件下生长

^*显示的P值反映所述事件与参照的性能比较。显著效应具有小于或等于0.1的P值。

表3B

评估用PHP32412 ^* 转化并在缺水条件下生长的单个玉米品系

^*显示的P值反映所述事件与参照的性能比较。显著效应具有小于或等于0.1的P值。

表3C

评价用PHP32412 ^* 转化过的个体玉米品系并在缺水条件下生长

^*显示的P值反映所述事件与参照的性能比较。显著效应具有小于或等于0.1的P值。

实施例19

具有拟南芥属前导基因的玉米品系的产量分析

可通过直接转化或者从单独转化的品系基因掺入而将含有验证过的拟南芥属基因的重组DNA构建体导入优良玉米近交系内。

近交或杂交的转基因植物可通过更严苛的大田试验来研究在水限制条件下和水充分条件下的产量增加和/或稳定性。

可对产量进行后续分析以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植物在与不含有验证过的拟南芥属前导基因的对照植物比较时，在水限制条件下是否具有产量的改善。具体地讲，可在包含验证过的拟南芥属前导基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加干旱条件。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物具有相对于对照植物更少的产量损失，例如至少25％更少的产量损失。

可使用以上方法选择在水限制条件下和/或水充分条件下，与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有增加产量的转基因植物。

实施例19B

用编码拟南芥属前导基因At1g26797的PHP32412转化的玉米品系 的产量分析

如实施例14A和14B所述，将存在于共整合载体PHP32412中的自交不亲和性相关多肽(SIPR表达盒导入来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系中。

2009年在Johnston，IA(“JH”)，York，NE(“YK”)和Woodland，CA(“WO”)对十个转基因事件进行了大田试验。在Woodland，CA位置，在开花期间(“FS”；开花胁迫)和籽粒灌浆期间(“GFS”；籽粒灌浆胁迫)施加干旱条件。JH位置进行良好灌溉，并且YK位置不经受干旱。10个转基因事件的产量数据(蒲式耳/英亩；bu/ac)在表4中与批无效对照(BN)一起显示。单尾检验的统计学显著性报道为P＜0.1。在与批无效(BN)对照进行比较时，在YK环境中十个事件中的四个具有产量正效应。其他位置不显示任何显著的产量减少。一个事件E8266.07.7.3显示在正常条件下的Fv′/Fm′(实施例18B)正效应(增加)并且还显示田间产量正效应。

表4

用PHP32412转化的玉米的2009大田试验

^*产量的显著增益

^**产量的显著损失

na＝不适用

实施例20A

用于转化玉米的玉米SIPR多肽前导基因表达载体的制备

可将编码玉米SIPR多肽的玉米克隆蛋白编码区导入INVITROGEN^TM载体pENTR/D-TOPO以制备入门克隆。

可使用INVITROGEN’s^TM GATEWAY技术，用入门克隆和目的载体进行LR重组反应以制备前体质粒。前体质粒包含以下表达盒：

1.表达PAT抗除草剂性基因的泛素启动子::moPAT::PinII终止子盒；该基因用于转化过程期间的选择。

2.表达DS-RED颜色标记的LTP2启动子::DS-RED2::PinII终止子盒；该标记用于分选种子。

3.泛素启动子::Zm-SIPR多肽::PinII终止子；过表达受关注基因的盒，玉米SIPR多肽。

实施例20B

使用农杆菌属用玉米SIPR多肽前导基因转化玉米

使用如实施例12和13所述的农杆菌介导转化，可将如实施例20A所述的前体质粒中存在的玉米SIPR多肽表达盒导入玉米近交系或来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系。

可将前体质粒电穿孔导入包含载体PHP10523(图7；SEQ ID NO：7)的LBA4404农杆菌属菌株中以制备共整合载体。该共整合载体是通过2个质粒、来自实施例20A的前体质粒与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。共整合载体除包含农杆菌属菌株和农杆菌介导转化所需的其他基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)之外，还包含同上(实施例20A)的3个表达盒。

实施例21

用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系的玉米表达质粒的制备

可分离称为编码完整玉米SIPR同源物的玉米克隆。

使用如实施例9所述的INVITROGEN^TM GATEWAY重组技术，能够将编码玉米SIPR多肽同源物的克隆定向克隆进目的载体PHP23236(SEQ ID NO：6；图6)以制备表达载体。每个表达载体包含在UBI启动子控制下的受关注cDNA，并且是T-DNA二元载体，用于通过如本文所述实施例所述(但不限于)的农杆菌属介导转化到玉米中。

实施例22

用验证过的前导基因的大豆同源物转化和评价大豆

基于同源性搜索，可鉴定验证过的拟南芥属前导基因的一个或若干个候选大豆同源物，并且还可评估它们增强大豆耐旱性的能力。载体构建、植物转化和表型分析将类似于上文实施例所述的规程。

实施例23

用验证过的前导基因的玉米同源物转化和评价玉米

基于同源性搜索，可鉴定验证过的拟南芥属前导基因的一个或若干个候选玉米同源物，并且还可评估它们增强玉米耐旱性的能力。载体构建、植物转化和表型分析将类似于上文实施例所述的规程。

实施例23

用验证过的前导基因的玉米和大豆同源物转化拟南芥属

验证过的拟南芥属前导基因的大豆和玉米同源物能够在35S启动子的控制下被转化到拟南芥属中并评价它们提高拟南芥属耐旱性的能力。载体构建、植物转化和表型分析将类似于上文实施例所述的规程。

Claims (5)

1.增强植物耐旱性和/或产量的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成；以及

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，以及在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性和/或产量，

其中所述植物是玉米植物。

2.权利要求1的方法，还包括：

(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，以及在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性和/或产量。

3.评价植物耐旱性或测定植物产量改变的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)评价所述转基因植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性或测定所述转基因植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比是否表现出产量改变，

其中所述植物是玉米植物。

4.评价植物耐旱性或测定植物产量改变的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；

(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(d)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性或测定所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比是否表现出产量改变，

其中所述植物是玉米植物。

5.权利要求3的方法，其中在进行步骤(c)后，所述方法还包括：

(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(e)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性或测定所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比是否表现出产量改变。