CN103261422B - 涉及编码dtp6多肽的基因的耐旱植物以及相关构建体和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离的多核苷酸和多肽、以及用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物（例如植物或种子）、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接至植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP6多肽。

Description

涉及编码DTP6多肽的基因的耐旱植物以及相关构建体和方法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2010年10月28日提交的美国临时申请61/407612的权益，其全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明领域涉及植物育种和基因学，并且具体地讲，涉及用于赋予植物耐旱性的重组DNA构建体。
背景技术
非生物胁迫是世界范围内作物损失的主要原因，它引起主要作物超过50%的平均产量损失（Boyer，J.S.（1982）Science218：443-448；Bray，E.A.等人，（2000），BiochemistryandMolecularBiologyofPlants，由Buchannan，B.B.等人编辑，Amer.Soc.PlantBiol.，第1158-1203页）。在多种非生物胁迫中，干旱是限制世界范围内作物产量的主要因素。在不同发育阶段使植物暴露于水限制环境似乎激活了多个生理和发育变化。理解干旱胁迫感受、转导和耐受性的基本生物化学和分子机制是生物学上的主要挑战。已经发表了对非生物胁迫响应的分子机制和干旱胁迫耐受性的基因调控网络的综述（Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.，（2006）Curr.Opin.PlantBiol.9：189-195；Wang，W.等人，（2003）Planta218：1-14；Vinocur，B.和Altman，A.（2005）Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.（2004）J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等人，（2003）Curr.Opin.PlantBiol.6：410-417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.（2005）TrendsPlantSci.10：88-94）。
在非生物胁迫响应的分子方面的较早期的工作通过差异和/或差减分析完成（Bray，E.A.，（1993）PlantPhysiol.103：1035-1040；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.（1997）PlantPhysiol.115：327-334；Zhu，J.-K.等人（1997）Crit.Rev.PlantSci.16：253-277；
Thomashow，M.F.（1999）Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.50：571-599）。其它方法包括选择候选基因并分析该基因或其活性产物在胁迫下的表达，或者通过在明确定义的胁迫体系中的功能互补进行选择（Xiong，L.和Zhu，J.-K.（2001）PhysiologiaPlantarum112：152-166）。此外，正向和反向基因研究涉及鉴定和分离调节基因中的突变，该研究也已经用于提供在胁迫或暴露情况下基因表达中观察到的改变中的证据（Xiong，L.和Zhu，J.-K.（2001）PhysiologiaPlantarum112：152-166）。
可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模式植物物种拟南芥（Arabidopsisthaliana）中使用该方法（Weigel，D.等人（2000）PlantPhysiol.122：1003-1013）。插入转录增强子元件能够显著激活和/或提高附近内源基因的表达。该方法能够用于选择涉及农学上重要的表型（包括胁迫耐受性）的基因。
发明内容
本发明包括：
在一个实施例中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。
在一个实施例中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对三重胁迫、或百草枯（Paraquat）、或两者表现出提高的耐受性。
另一个实施例是在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至第二多核苷酸的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码多肽，所述多肽包含SEQIDNO:90的氨基酸序列，并且所述第二多核苷酸编码多肽，所述多肽包含：（a）基于ClustalV比对方法，在与SEQIDNO:18、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性的氨基酸序列；或（b）成熟DTP6多肽，所述成熟DTP6多肽具有图13A-图13Y中给出的HMM特征谱，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自耐旱性、三重胁迫耐受性、百草枯耐受性的性状的提高。
在另一个实施例中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。任选地，在水限制条件下，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时表现出所述至少一种农学特性的所述改变。所述至少一种农学特性可以是产量、生物量、或两者，并且所述改变可以是提高。所述至少一种农学特性还可以是至少在选自耐旱性、三重胁迫耐受性和百草枯耐受性的性状上的提高。在一种或多种这些性状上的提高可能处于以下一种或多种胁迫条件下：干旱胁迫、三重胁迫或百草枯胁迫条件。
在另一个实施例中，在基因组中包含多核苷酸的植物，所述多核苷酸可操作地连接至少一种重组调控元件，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组调控元件的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。
在另一个实施例中，本发明包括本发明的任何植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
在另一个实施例中，本发明包括本发明的任何植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中由所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种选自耐旱性、三重胁迫耐受性、百草枯耐受性、产量和生物量的性状的提高。
本发明的另一个实施例是鉴定DTP6蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：（a）使用图13A-图13Y的特征谱在氨基酸序列数据库中鉴定至少一种候选序列；（b）针对来自步骤（a）的至少一种候选序列测定E值得分；（c）对来自步骤（b）的至少一种候选序列进行选择，其中所述E值得分<10-3；以及（d）进一步对来自步骤（c）的至少一种候选序列进行选择，其中所述至少一种候选序列与图13A-图13Y的特征谱在该特征谱的整体长度上匹配至少80%。
在另一个实施例中，提高植物耐旱性的方法，所述方法包括：（a）将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。
在另一个实施例中，评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。
在另一个实施例中，测定至少一种植物农学特性改变的方法，所述方法包括：（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；（c）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（d）测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。任选地，所述测定步骤（d）包括在水限制条件下，测定所述转基因植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。所述至少一种农学特性可以是产量、生物量、或两者，并且所述改变可以是提高。
在另一个实施例中，提高植物三重胁迫耐受性的方法，所述方法包括：（a）将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对三重胁迫表现出提高的耐受性。
在另一个实施例中，提高植物百草枯耐受性的方法，所述方法包括：（a）将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对百草枯表现出提高的耐受性。
提高植物胁迫耐受性的方法，其中所述胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫，所述方法包括：（a）将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽包含具有图13A-图13Y中给出的HMM特征谱的成熟DTP6多肽；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对至少一种选自干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫的胁迫表现出提高的耐受性。
在另一个实施例中，本发明包括本发明的任何方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
在另一个实施例中，本发明包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：（a）编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少90%的序列同一性，（b）编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有包含成熟DTP6多肽的氨基酸序列，所述成熟DTP6多肽具有图3中给出的HMM特征谱；或（c）所述核苷酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。所述多肽可包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103的氨基酸序列。所述核苷酸序列可包含SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、74、76、78、80、82、84、86和88的核苷酸序列。
在另一个实施例中，本发明涉及包含本发明任何分离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接至少一种调控序列，并且本发明涉及包含所述重组DNA构建体的细胞、植物和种子。所述细胞可以是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者是原核细胞，例如细菌细胞。
附图说明和序列表
根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。
图1示出pHSbarENDs激活标记构建体（SEQIDNO:1）的示意图，它用于制备拟南芥属（Arabidopsis）种群。
图2示出载体pDONRTM/Zeo（SEQIDNO:2）的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754至2985（互补链）。
图3示出载体pDONRTM221（SEQIDNO:3）的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985（互补链）。
图4示出载体pBC-yellow（SEQIDNO:4）的图谱，它是用于构建拟南芥属表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸11276-11399（互补链）；attR2位点位于核苷酸9695-9819（互补链）。
图5示出PHP27840（SEQIDNO:5）的图谱，它是用于构建大豆表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸7310-7434；attR2位点位于核苷酸8890-9014。
图6示出PHP23236（SEQIDNO:6）的图谱，它是用于构建GaspeFlint来源的玉米品系的表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸2006-2130；attR2位点位于核苷酸2899-3023。
图7示出了PHP10523（SEQIDNO:7）的图谱，它是存在于农杆菌属（Agrobacterium）菌株LBA4404中的质粒DNA（Komari等人，PlantJ.10：165-174（1996）；NCBI通用标识符No.59797027）。
图8示出PHP23235（SEQIDNO:8）的图谱，它是用于构建目的载体PHP23236的载体。
图9示出PHP28647（SEQIDNO:9）的图谱，它是用于玉米自交系来源的品系的目的载体。attR1位点位于核苷酸2289-2413；attR2位点位于核苷酸3869-3993。
图10示出了PHP29634（又称为DV11）的图谱，它是用于GaspeFlint来源的玉米品系的目的载体。
图11A-11E示出了SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、75、77、79、81、83、85和56的DTP6多肽的氨基酸序列的多重比对。在所比对的氨基酸序列上存在着主要共有序列。方框内圈入了在给定的位置上与给定位置上的所述主要共有序列的残基相同的残基。所述DTP6多肽中存在三个保守的氨基酸基序。
图12示出了图11A-11E中展示的每对DTP6多肽氨基酸序列的百分比序列同一性和趋异值。
图13A-图13Y示出了DTP6多肽的HMM特征谱。
SEQIDNO:1是pHSbarENDs激活标记载体的核苷酸序列。
SEQIDNO:2是供体载体pDONRTM/Zeo的核苷酸序列。
SEQIDNO:3是供体载体pDONRTM/221的核苷酸序列。
SEQIDNO:4是pBC-yellow的核苷酸序列，它是用于拟南芥属的目的载体。
SEQIDNO:5是PHP27840的核苷酸序列，它是用于大豆的目的载体。
SEQIDNO:6是PHP23236的核苷酸序列，它是用于GaspeFlint来源的玉米品系的目的载体。
SEQIDNO:7是PHP10523的核苷酸序列（Komari等人，PlantJ.10：165-174（1996）；NCBI通用标识符No.59797027）。
SEQIDNO:8是PHP23235的核苷酸序列，它是用于GaspeFlint来源的品系的目的载体。
SEQIDNO:9是PHP28647的核苷酸序列，它是用于玉米自交来源品系的目的载体。
SEQIDNO:10是attB1位点的核苷酸序列。
SEQIDNO:11是attB2位点的核苷酸序列。
SEQIDNO:12是At1g68490-5′attB正向引物的核苷酸序列，它包含attB1序列，用于扩增At1g68490蛋白编码区。
SEQIDNO:13是At1g68490-3′attB反向引物的核苷酸序列，它包含attB2序列，用于扩增At1g68490蛋白编码区。
SEQIDNO:14是VC062引物的核苷酸序列，它包含T3启动子和attB1位点，用于扩增克隆进IISK（+）载体（Stratagene）的cDNA插入序列。
SEQIDNO:15是VC063引物的核苷酸序列，它包含T7启动子和attB2位点，用于扩增克隆进IISK（+）载体（Stratagene）的cDNA插入序列。
SEQIDNO:16是PHP29634（也称为DV11）的核苷酸序列，它是用于GaspeFlint来源的玉米品系的目的载体。
SEQIDNO:17对应于NCBIGINo.29028823，它是来自基因座At1g68490的核苷酸序列。
SEQIDNO:18对应于SEQIDNO:17编码的At1g68490的氨基酸序列。
表1给出了获自来自于玉米、大豆、百喜草、复活草（resurrectiongrass）和干草蕨的克隆的cDNA的核苷酸序列的SEQIDNO。还给出了由所述cDNA所编码的对应氨基酸序列的SEQIDNO。
表1
编码DTP6多肽的cDNA
*“全长插入序列”（“FIS”）是完整cDNA插入物的序列。
SEQIDNO:37是对应于来自BACZMMBBc0382C02（AC200490）（玉米（Zeamays））的预测CDS的核酸序列。
SEQIDNO:38是来自BACZMMBBc0382C02的预测蛋白的氨基酸序列，并且是由SEQIDNO:37（玉米）编码的氨基酸序列。
SEQIDNO:39是对应于来自Phytozome数据库的At1g64890（木薯（Manihotesculenta））的肽同源物的氨基酸序列。
SEQIDNO:40是对应于NCBIGINo.255581637（蓖麻（Ricinuscommunis））的氨基酸序列。
SEQIDNO:41是对应于NCBIGINo.224108468（毛果杨（Populustrichocarpa））的氨基酸序列。
SEQIDNO:42是对应于NCBIGINo.224101735（毛果杨）的氨基酸序列。
SEQIDNO:43是对应于NCBIGINo.158564576（牡丹（Paeoniasuffruticosa））的氨基酸序列。
SEQIDNO:44是对应于Glyma20g24980.1的氨基酸序列，它是来自USDepartmentofenergyJointGenomeInstitute的大豆JGIGlyma1.01基因组序列的预测编码序列的大豆（Glycinemax）预测蛋白。
SEQIDNO:45是对应于Glyma07g10220.1的氨基酸序列，它是来自USDepartmentofenergyJointGenomeInstitute的大豆JGIGlyma1.01基因组序列的预测编码序列的大豆（Glycinemax）预测蛋白。
SEQIDNO:46是对应于Glyma09g31670.1的氨基酸序列，它是来自USDepartmentofenergyJointGenomeInstitute的大豆JGIGlyma1.01基因组序列的预测编码序列的大豆（Glycinemax）预测蛋白。
SEQIDNO:47是对应于NCBIGINo.225423987（葡萄（Vitisvinifera））的氨基酸序列。
SEQIDNO:48是对应于NCBIGINo.225452037（葡萄）的氨基酸序列。
SEQIDNO:49是对应于NCBIGINo.224127662（毛果杨）的氨基酸序列。
SEQIDNO:50是对应于NCBIGINo.255560420（蓖麻）的氨基酸序列。
SEQIDNO:51是对应于NCBIGINo.90657583（醉蝶花（Cleomespinosa））的氨基酸序列。
SEQIDNO:52是对应于NCBIGINo.90657618（醉蝶花）的氨基酸序列。
SEQIDNO:53是对应于NCBIGINo.217071284（蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula））的氨基酸序列。
SEQIDNO:54是对应于NCBIGINo.30683268（拟南芥）的氨基酸序列。
SEQIDNO:55是美国专利公开US20090019601的SEQIDNO:7047（甘蓝型油菜（Brassicanapus））中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:56是美国专利公开US20070214517的SEQIDNO:23781（拟南芥）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:57是对应于NCBIGINo.226502893（玉米）的氨基酸序列。
SEQIDNO:58是美国专利公开US20070271633的SEQIDNO:51344（高粱（Sorghumbicolor））中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:59是对应于NCBIGINo.226510375（玉米）的氨基酸序列。
SEQIDNO:60是美国专利公开US20090087878的SEQIDNO:291825（玉米）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:61是对应于NCBIGINo.242086136（高粱）的氨基酸序列。
SEQIDNO:62是美国专利公开US20090087878的SEQIDNO:305885（玉米）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:63是美国专利公开US20090087878的SEQIDNO:322258（玉米）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:64是对应于NCBIGINo.226510044（玉米）的氨基酸序列。
SEQIDNO:65是美国专利公开US20090087878的SEQIDNO:292701（玉米）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:66是PCT国际专利公开WO2009134339的SEQIDNO:64538（小麦（Triticumaestivum））中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:67是对应于NCBIGINo.255640685（大豆）的氨基酸序列。
SEQIDNO:68是美国专利公开US20070214517的SEQIDNO:52070（大豆）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:69是对应于NCBIGINo.255632129（大豆）的氨基酸序列。
SEQIDNO:70是PCT国际专利公开WO2009134339的SEQIDNO:58426（大豆）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:71是本发明的DTP6多肽的氨基末端附近存在的保守基序（基序1）的序列。
SEQIDNO:72是本发明的DTP6多肽中存在的保守基序（基序2）的序列。
SEQIDNO:73是本发明的DTP6多肽的羧基末端附近存在的保守基序（基序3）的序列。
SEQIDNO:86是对应于GINo.39569725（小麦）的核苷酸序列。
SEQIDNO:87是由SEQIDNO:86（小麦）给出的核苷酸序列所编码的多肽序列。
SEQIDNO:88是对应于GINo.16321621（多棱大麦（Hordeumvulgare））的核苷酸序列。
SEQIDNO:89是由SEQIDNO:88（多棱大麦）给出的核苷酸序列所编码的多肽序列。
SEQIDNO:90是AT-DTP6蛋白（SEQIDNO:18）的预测叶绿体转运肽的氨基酸序列。
SEQIDNO:91是预测成熟AT-DTP6蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:92是美国专利公开US20110214206的SEQIDNO:333737（玉米）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:93是对应于NCBIGINo.195612706（玉米）的氨基酸序列。
SEQIDNO:94是美国专利公开US20110214206的SEQIDNO:292701（玉米）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:95是对应于NCBIGINo.223949655（玉米）的氨基酸序列。
SEQIDNO:96是PCT国际专利公开WO2010083178的SEQIDNO:43585（大豆）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:97是对应于NCBIGINo.238006286（玉米）的氨基酸序列。
SEQIDNO:98是美国专利公开US20110214205的SEQIDNO:77016（小米（Setariaitalica））中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:99是对应于NCBIGINo.194703114（玉米）的氨基酸序列。
SEQIDNO:100是美国专利公开US20110214205的SEQIDNO:85465（小米）中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:101是对应于NCBIGINo.57900114（稻（Oryzasativa））的氨基酸序列。
SEQIDNO:102是EP2336332的SEQIDNO:67537（西加云杉（Piceasitchensis））中给出的氨基酸序列。
SEQIDNO:103是对应于NCBIGINo.116790833（西加云杉）的氨基酸序列。
序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。
此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如NucleicAcidsRes.13:3021-3030（1985）和BiochemicalJ.219（No.2）：345-373（1984）所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们引入本文以供参考。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。
具体实施方式
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。
如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及本领域的技术人员已知的等同物等等。
如本文所用：
术语“AT-DTP6”是指拟南芥蛋白，其产生耐旱性（DT）表型并且由拟南芥基因座At1g68490编码。术语“DTP”和“耐旱性表型”在本文中可互换使用。“DTP6多肽”是指具有耐旱性表型的蛋白，并且在本文是指AT-DTP6多肽及其来自其它生物的同源物。术语Zm-DTP6和Gm-DTP6分别是指与AT-DTP6同源的玉米和大豆蛋白。
由位于基因座At1g68490的核苷酸序列（SEQIDNO:17）编码的AT-DTP6多肽（SEQIDNO:18）据报道受到细胞分裂素处理的上调（Brenner等人，PlantJournal（2005）44，314-333）。在苗期致死的dpa1（质体ATP合酶1缺陷）拟南芥属突变体中，其受到下调（Bosco等人，J.Biol.Chem.（2004）279（2）：1060-1069）。这一蛋白并不具有此前认定的任何功能或标注。本文给出的DTP6序列具有三个保守基序，以基序1、基序2和基序3示出（分别为SEQIDNO:71、72和73）。
根据本文所公开，AT-DTP6蛋白据预测定位于叶绿体并且在N末端具有预测叶绿体转运肽（SEQIDNO:90）。
根据本文所公开，AT-DTP6蛋白还产生针对高热、高光照和干旱的组合三重胁迫的耐受性。过表达AT-DTP6的植物还表现出对百草枯的抗性，这显示了对于氧化胁迫的更好耐受性。
术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”本文互换使用。本发明的单子叶植物包括禾本科植物。
术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”本文互换使用。本发明的双子叶植物包括以下家族：十字花科植物、豆科植物和茄科植物。
术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”本文互换使用，指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。
“表达序列标签”（“EST”）是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获得。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”（“FIS”）。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”（“CGS”），该序列能得自FIS或重叠群。
“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特征。在某些情况下，这种特征是人眼可见的，例如种子或植物大小，或者能够通过生物化学技术测量，例如检测种子或叶片的蛋白质、淀粉、或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，如通过测量缺水耐受性或特定盐或糖浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农学观察如渗透胁迫耐受性或产量。
“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长、耐盐性、早期幼苗活力和低温胁迫下的出苗。
能够测量提高的生物量，例如测量植物高度、植物总叶片面积、植物鲜重、植物干重或植物种子产量与对照植物相比的提高。
提高植物生物量或植物尺寸的能力将具有若干个重要的商业应用。可生成产量较高的作物品种，产生较高的产量，例如在其中营养组织部分用作食物、生物燃料或以上两种用途的植物中。
增大的叶片尺寸可受到特别的关注。提高的叶片生物量能够用于提高植物来源的制药或工业产品的产量。总植物光合作用的提高通常通过提高植物叶片面积来完成。附加的光合作用容量可用于提高特定植物组织来源的产量，包括叶片、根、果实或种子、或者允许植物在较低光强度下或高光强度下生长。
另一种组织（例如根组织）的生物量的改变可用于改善植物在严酷环境条件下生长的能力，包括干旱或营养缺乏条件，因为较大的根系可较好的获取水或营养物质或吸收水或营养物质。
就一些观赏植物而言，将高度期望提供较大品种的能力。就包括果树、产木材树木、或者观赏或防风树木和灌木在内的多种植物而言，尺寸提高以产量提高或防护效果改善的形式提供改善的有益效果。
玉米须的生长和出现在测定干旱下的产量中具有相当的重要意义（Fuad-Hassan等人，2008PlantCellEnviron.31：1349-1360）。当在开花前发生土壤水分缺乏时，玉米须在玉米壳外的出现受到延迟，而开花基本上不受影响，这导致了提高的开花-抽丝（anthesis-silking）间隔（ASI）（Edmeades等人，2000PhysiologyandModelingKernelsetinMaize（M.E.Westgate和K.Boote编辑；CSSA（CropScienceSocietyofAmerica）特别版No.29.Madison,WI:CSSA,43-73）。针对降低的ASI进行选择已经成功地用于提高玉米的耐旱性（Edmeades等人，1993CropScience33：1029-1035；Bolanos和Edmeades1996FieldCropsResearch48：65-80；Bruce等人，2002J.Exp.Botany53：13-25）。
本文用于描述热时间（thermaltime）的术语包括“生长度日”（GDD）、“生长度单位”（GDU）和“热单位”（HU）。
“转基因”指其基因组因异源核酸（如重组DNA构建体）的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组（染色体基因组或染色体外基因组）改变。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分（如线粒体、质粒）中的细胞器DNA。
“植物”包括整个植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植物的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。
基因改良种质的商业开发也已经进展至向作物植物导入多个性状的阶段，其通常称为基因堆叠法（genestackingapproach）。在该方法中，可将产生不同所关注特性的多种基因导入植物。基因堆叠可通过许多方法实现，包括但不限于共转化、再转化以及具有不同转基因的品系的杂交。
“转基因植物”还包括对在其基因组中包含超过一种异源多核苷酸的植物的引述。各异源多核苷酸均可对所述转基因植物产生不同的性状。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸（通常以它们的5′-单磷酸形式存在）可以用它们的单字母名称指代如下：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸（分别对应RNA或DNA），“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤（A或G），“Y”表示嘧啶（C或T），“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA（mRNA）”指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过导入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件（如自发突变、自然转化/转导/转座）对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。
“调控序列”指位于编码序列的上游（5′非编码序列）、中间或下游（3′非编码序列），并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“植物启动子功能”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录（如生成mRNA或功能RNA的转录）和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征。
有关将核酸片段（例如重组DNA构建体）插入细胞内的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组（如染色体、质粒、质体或线粒体DNA）内，转变成自主的复制子或瞬时表达（如转染的mRNA）。
“转化细胞”是将核酸片段（如重组DNA构建体）导入其中的任何细胞。
在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而无基因稳定遗传。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
“叶绿体转运肽”是与蛋白质共同被翻译，并将该蛋白质导向叶绿体或导向产生该蛋白质的细胞中存在的其它质体类型的氨基酸序列（Lee等人，（2008）PlantCell20：1603-1622）。术语“叶绿体转运肽”和“质体转运肽”在本文可互换使用。“叶绿体转运序列”指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白质共同被翻译并将蛋白导向分泌系统的氨基酸序列（Chrispeels，（1991）Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.42：21-53）。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号（同上），或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号（同上）。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位信号替代（Raikhel，（1992）PlantPhys.100：1627-1632）。“线粒体信号肽”是指导前体蛋白质导进入线粒体中的氨基酸序列（Zhang和Glaser（2002）TrendsPlantSci7：14-21）。
术语“表达类物（Expressolog）”或“表达同源物”在本文可互换使用并且是指跨两种或更多种不同物种存在的同源基因集组，其在特定条件下在基因表达模式中共有类似性。最佳的表达类物并不一定在序列水平上最为相似。
术语“特征性HMM”或“HMM特征谱”在本文可互换使用，本文使用的是多序列比对（甚至单一序列）的统计模型。它们捕获关于比对中的每一列的保守程度以及最可能存在的残基的位点特异性信息。
序列比对和百分比同一性可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于生物信息计算包（Inc.，Madison，WI）的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用ClustalV比对方法（Higgins和Sharp（1989），CABIOS.5：151-153）进行，默认参数（GAPPENALTY=10，GAPLENGTHPENALTY=10）。使用ClustalV方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1，GAPPENALTY=3，WINDOW=5，以及DIAGONALSSAVED=5。对于核酸，这些参数为KTUPLE=2，GAPPENALTY=5，WINDOW=4，以及DIAGONALSSAVED=4。用ClustalV程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的百分比同一性和趋异度是以该方式计算的。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor，1989（下文称为“Sambrook”）。
现在来看实施例：
本发明涵盖了符合图13A-图13Y给出的DTP6特征性HMM的全部蛋白质序列。
在本发明的一个实施例中，AT-DTP6多肽在N末端具有叶绿体转运肽。
在一个实施例中，成熟的AT-DTP6多肽可以可操作地连接至任何叶绿体转运肽序列。在一个实施例中，所述叶绿体转运肽序列包含SEQIDNO:90的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明中公开的任何DTP6蛋白可以可操作地连接至叶绿体转运肽序列。
在一个实施例中，公开于SEQIDNO:90中的预测叶绿体转运肽可以可操作地连接至另一种DTP6多肽。
实施例包括分离的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物（例如植物或种子），以及利用这些重组DNA构建体的方法。
分离的多核苷酸和多肽：
本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：
分离的多核苷酸，其包含：（i）编码多肽的核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或者（ii）（i）的核苷酸序列的完全互补序列，其中所述完全互补序列和（i）的核苷酸序列由相同数目的核苷酸构成并且是100%互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）。所述多肽优选地为DTP6多肽。所述多肽优选地具有一种或多种以下活性：耐旱活性、三重胁迫耐受活性或百草枯耐受活性。
分离的多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQID：18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性。所述多肽优选地为DTP6多肽。所述多肽优选地具有一种或多种以下活性：耐旱活性、三重胁迫耐受活性或百草枯耐受活性。
分离的多核苷酸，其包含：（i）核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述核酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；或者（ii）（i）的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）。所述分离的多核苷酸优选地编码DTP6多肽。所述DTP6多肽优选地具有一种或多种以下活性：耐旱活性、三重胁迫耐受活性或百草枯耐受活性。
分离的多核苷酸，包括：（i）编码多肽的核酸序列，所述多肽具有包含选自SEQIDNO:71、72和73的至少一个序列、或至少两个序列或至少三个序列的氨基酸序列，或者（ii）（i）的核酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和（i）的核酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。所述多肽优选地为DTP6多肽。所述多肽优选地具有一种或多种以下活性：耐旱活性、三重胁迫耐受活性或百草枯耐受活性。
分离的多肽，所述多肽具有包含选自SEQIDNO:71、72和73的至少一个序列、或至少两个序列或至少三个序列的氨基酸序列。所述多肽优选地为DTP6多肽。所述多肽优选地具有一种或多种以下活性：耐旱活性、三重胁迫耐受活性或百草枯耐受活性。
分离的多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有一种或多种以下活性：耐旱活性、三重胁迫耐受活性或百草枯耐受活性，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103的全长互补序列的DNA分子杂交；
分离的多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有一种或多种以下活性：耐旱活性、三重胁迫耐受活性或百草枯耐受活性，其中所述核苷酸序列产生自SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103（通过选自缺失、取代、添加或插入的至少一种方法而进行的一个或多个核苷酸变异而产生）。
应当理解（正如本领域技术人员将会理解的），本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸（一种疏水性氨基酸）的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基（例如甘氨酸）或疏水性较强的残基（例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸）的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基（例如，天冬氨酸替代谷氨酸）或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基（例如，赖氨酸替换精氨酸）的改变也可以预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定编码产物生物活性的保留情况。
本发明的蛋白也可为包含在其中包括删除、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQIDNO:27、32、41、42、45、46、52、54、56、58、60、62、64和66。所述取代可为保守取代，它指某个氨基酸残基用另一个具有相似物理和化学特性的残基取代。保守取代的非限制性例子包括在包含脂族基团的氨基酸残基如Ile、Val、Leu或Ala之间的取代，以及在极性残基如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn之间的取代。
通过氨基酸缺失、取代、添加或插入而产生的蛋白质可在对编码它们的野生型蛋白质的DNA进行，例如，著名的位点特异性突变的时候制备（例如，参见NucleicAcidResearch，第10卷，第20期，第6487-6500页，1982，其全文以引用的方式并入）。如本文所用，术语“一个或多个氨基酸”旨在表示可通过定点诱变删除、取代、插入和/或添加可能数目的氨基酸。
可如下使用例如与将发生突变的单链噬菌体DNA互补、不同的是具有特定错配（即，期望的突变）的合成寡核苷酸引物完成定点诱变。即，上述合成寡核苷酸用作引发噬菌体互补链合成的引物，并且然后所得双工DNA用于转化宿主细胞。将转化的细菌培养物置于琼脂上，从而从包含噬菌体的单细胞形成菌斑。因此，理论上50%的新菌落包含具有突变的单链噬菌体，而剩余的50%具有初始序列。在允许与具有上述期望突变的DNA完全相同的DNA杂交、但是不与具有初始链的DNA杂交的温度下，允许所得噬菌体与通过激酶处理标记的合成探针杂交。随后，挑取与探针杂交的菌斑并进行培养以收集它们的DNA。
允许在生物活性肽如酶中删除、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸，同时保留它们的活性的技术包括上文提到的定点诱变和其它技术如用诱变剂处理基因的那些，以及其中选择性中断基因以移除、取代、插入或添加选择的一个或多个核苷酸、然后连接的那些。
本发明的蛋白也可为由核酸编码的蛋白，所述核酸包含的核苷酸序列在其中删除、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:26、31、39、40、43、44、51、53、55、57、59、60、63和65。核苷酸的删除、取代、插入和/或添加可通过定点诱变或其它上文提到技术完成。
本发明的蛋白也可为由核酸编码的蛋白，所述核酸包含的核苷酸序列能够在严格条件下与选自SEQIDNO:26、31、39、40、43、44、51、53、55、57、59、60、63和65的核苷酸序列的互补链杂交。
术语“在严格条件下”指两个序列在中或高严格条件下杂交。更具体地讲，中严格可由本领域的普通技术人员通过例如根据DNA长度来容易地测定。基本条件如Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第三版，第6章和第7章，ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001所示，并且包括使用硝化纤维滤膜的预洗涤溶液5×SSC，0.5%SDS，1.0mMEDTA（pH8.0），杂交条件为约50%的甲酰胺，2×SSC至6×SSC，在约40-50℃下进行（或其它类似的杂交溶液，例如Stark溶液，在约50%的甲酰胺中，在约42℃下进行）并且洗涤条件为例如约40-60℃，0.5-6×SSC，0.1%SDS。优选地，中严格条件包括在约50℃和6×SSC条件下杂交（并洗涤）。高严格条件也可由本领域的技术人员通过例如根据DNA长度来容易地测定。
一般来讲，此类条件包括在比中严格条件更高的温度和/或更低的盐浓度下杂交和/或洗涤（例如在约65℃，6×SSC至0.2×SSC，优选地6×SSC，更优选地2×SSC，最优选地0.2×SSC条件下杂交）。例如，高严格条件可包括如上所述杂交并在大约65-68℃，0.2×SSC，0.1%SDS条件下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中可以用SSC（1×SSC为0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠）取代SSPE（1×SSPE为0.15MNaCl，10mMNaH2PO4和1.25mMEDTA，pH7.4）；在完成杂交后洗涤15分钟。
使用可商购获得的杂交试剂盒也是可能的，所述试剂盒无放射性的底物作为探针。特异性的样品包括与ECL直接标记和检测系统杂交（Amersham）。严格条件包括例如使用所述试剂盒包括的杂交缓冲液在42℃杂交4小时，所述缓冲液补充有5%（w/v）封闭液和0.5MNaCl，并在0.4%SDS，0.5×SSC中，在55℃下洗涤两次，每次20分钟，然后在2×SSC中，在室温下洗涤一次，时间5分钟。
重组DNA构建体和抑制DNA构建体：
在一个方面，本发明包括重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）。
在一个实施例中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列（如，在植物中有功能的启动子）的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含（i）编码氨基酸序列的核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；或者（ii）（i）的核酸序列的全长互补序列。
在另一个实施例中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列（例如，在植物中有功能的启动子）的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含（i）核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述核酸序列在与SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、74、76、78、80、82、84、86和88进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；或者（ii）（i）的核酸序列的全长互补序列。
在另一个实施例中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列（如，在植物中有功能的启动子）的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP6多肽。所述DTP6多肽优选地具有一种或多种以下活性：耐旱活性、三重胁迫耐受活性或百草枯耐受活性。
所述DTP6多肽可来自拟南芥、玉米、大豆、烟豆（Glycinetabacina）、野大豆（Glycinesoja）、短绒野大豆（Glycinetomentella）、毛果杨、葡萄、蓖麻、牡丹、木薯、醉蝶花、甘蓝型油菜、高粱、小麦、百喜草、草香碗蕨（Dennstaedtiapunctilobula）和画眉草（Eragrostisnindensis）。
在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。
抑制DNA构建体可包含至少一种调控序列（例如，在植物中有功能的启动子），该调控序列可操作地连接至：（a）以下序列的全部或部分：（i）编码多肽的核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或者（ii）（a）（i）的核酸序列的全长互补序列；或者（b）源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分区域，当与所述区域所来源的所述有义链或反义链的全部或部分比较时，基于ClustalV比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码DTP6多肽；或者（c）以下序列的全部或部分：（i）核酸序列，基于ClustalV比对方法，核酸序列在与SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、74、76、78、80、82、84、86和88进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或者（ii）（c）（i）的核酸序列的全长互补序列。所述抑制DNA构建体可包含共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、双链RNA生成构建体、RNAi构建体或小RNA构建体（例如，siRNA构建体或miRNA构建体）。
应当理解（正如本领域技术人员将会理解的），本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸（一种疏水性氨基酸）的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基（例如甘氨酸）或疏水性较强的残基（例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸）的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基（例如，天冬氨酸替代谷氨酸）或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基（例如，赖氨酸替换精氨酸）的改变也可以预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定编码产物生物活性的保留情况。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。
抑制DNA构建体可以包含源自所关注的靶基因的区域并且可以包含所关注的靶基因的有义链（或反义链）的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可具有所关注基因的有义链（或反义链）的全部或部分100%同一性或者少于100%同一性（如具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）。
抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi（RNA干扰）构建体和小RNA构建体，例如siRNA（短干扰RNA）构建体和miRNA（微RNA）构建体。
“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物（美国专利5,107,065）。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。
“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列（其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少）设计出了植物中的共抑制构建体（参见Vaucheret等人，PlantJ.16：651-659（1998）；以及Gura，Nature404：804-808（2000））。
另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制（于1998年8月20日公开的PCT专利公开WO98/36083）。
RNA干扰是指由短干扰性RNA（siRNA）介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程（Fire等人，Nature391：806（1998））。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默（PTGS）或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用（quelling）。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共享（Fire等人,TrendsGenet.15：358（1999））。
小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程（包括开花）的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。
小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。
微RNA（miRNA）是长度为约19至约24个核苷酸（nt）的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA（Lagos-Quintana等人，Science294：853-858（2001），Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-739（2002）；Lau等人，Science294：858-862（2001）；Lee和Ambros，Science294：862-864（2001）；Llave等人，PlantCell14：1605-1619（2002）；Mourelatos等人，GenesDev.16：720-728（2002）；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495（2002）；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626（2002））。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。
微RNA（miRNA）看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径：（1）翻译抑制；（2）RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰（RNAi）期间以及在植物中转录后基因沉默（PTGS）期间产生的21-25nt短干扰RNA（siRNA）类似，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物（RISC）内。
调控序列：
本发明的重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）可包含至少一种调控序列。
调控序列可为启动子。
多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异启动子、诱导型启动子或其它启动子。
在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应（Kasuga等人（1999）NatureBiotechnol.17：287-91）。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子以及在WO99/43838和美国专利6,072,050中公开的其它组成型启动子；CaMV35S核心启动子（Odell等人，Nature313：810-812（1985））；稻肌动蛋白（McElroy等人，PlantCell2：163-171（1990））；泛素（Christensen等人，PlantMol.Biol.12：619-632（1989）和Christensen等人，PlantMol.Biol.18：675-689（1992））；pEMU（Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588（1991））；MAS（Velten等人，EMBOJ.3：2723-2730（1984））；ALS启动子（美国专利5,659,026）等。其它组成型启动子包括例如公开于美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中的启动子。
在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异启动子或发育调控启动子。
组织特异启动子或发育调控启动子是这样的DNA序列：该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子都可用于本发明的方法中。
可用于本发明的种子或胚芽特异性启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂启动子（Kti3，Jofuku和Goldberg，PlantCell1：1079-1093（1989））、马铃薯块茎特异蛋白启动子（patatin启动子）（马铃薯块茎）（Rocha-Sosa，M.等人（1989），EMBOJ.8：23-29）、convicilin启动子、豌豆球蛋白启动子和豆球蛋白启动子（豌豆子叶）（Rerie，W.G.等人，（1991）Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人（1990）Planta180：461-470；Higgins，T.J.V.等人（1988）Plant.Mol.Biol.11：683-695）、玉米蛋白启动子（玉米胚乳）（Schemthaner，J.P.等人，（1988），EMBOJ.7：1249-1255）、菜豆蛋白启动子（菜豆子叶）（Segupta-Gopalan，C.等人，（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324）、植物血球凝集素启动子（菜豆子叶）（Voelker，T.等人，（1987），EMBOJ.6：3571-3577）、B-伴球蛋白启动子和大豆球蛋白启动子（大豆子叶）（Chen，Z-L等人，（1988）EMBOJ.7：297-302）、谷蛋白启动子（大米胚乳）、大麦醇溶蛋白启动子（大麦胚乳）（Marris，C.等人，（1988）PlantMol.Biol.10：359-366）、麦谷蛋白启动子和麦醇溶蛋白启动子（小麦胚乳）（Colot，V.等人，（1987）EMBOJ.6：3559-3564）和甘薯贮藏蛋白启动子（甘薯块根）（Hattori，T.等人，（1990）PlantMol.Biol.14：595-604）。可操作地连接至嵌合基因构建体中的异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的例子包括在拟南芥和甘蓝型油菜（Brassicanapus）种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子（Vanderkerckhove等人，Bio/Technology7：L929-932（1989））、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子（Riggs等人，PlantSci.63：47-57（1989）），以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子（Colot等人，EMBOJ6:3559-3564（1987））。
可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如通过化合物（化学诱导剂），或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括例如受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
用于本发明的启动子包括以下启动子：1）胁迫可诱导的RD29A启动子（Kasuga等人，1999，NatureBiotechnol.17：287-91）；2）大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的（“PrimaryStructureofaNovelBarleyGeneDifferentiallyExpressedinImmatureAleuroneLayers”，Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228（1/2）：9-16（1991））；和3）玉米启动子，Zag2（“IdentificationandmolecularcharacterizationofZAG1，themaizehomologoftheArabidopsisfloralhomeoticgeneAGAMOUS”，Schmidt，R.J.等人，PlantCell5（7）：729-737（1993）；“Structuralcharacterization，chromosomallocalizationandphylogeneticevaluationoftwopairsofAGAMOUS-likeMADS-boxgenesfrommaize”，Theissen等人，Gene156（2）：155-166（1995）；NCBIGenBank登录号X80206））。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后（DAP）7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其它可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的启动子是茎特异性启动子。这种茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子（GenBank登录号EF030816；Abrahams等人，PlantMol.Biol.27：513-528（1995））和S2B启动子（GenBank登录号EF030817）等等，这些文献以引用的方式并入本文。
启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。
本发明使用的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织优选启动子S2A（GenBank登录号EF030816）和S2B（GenBank登录号EF030817）及来自玉米的组成型启动子GOS2。其它启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子（US2006/0156439，公开于2006年7月13日）、玉米ROOTMET2启动子（WO05063998，公开于2005年7月14日）、CR1BIO启动子（WO06055487，公开于2006年5月26日）、CRWAQ81（WO05035770，公开于2005年4月21日）和玉米ZRP2.47启动子（NCBI登录号：U38790；GINo.1063664）。
本发明的重组DNA构建体也可包括其它调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施例中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可以加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上都增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8：4395-4405（1988）；Callis等人，GenesDev.1：1183-1200（1987）。
任何植物都可以选择用来鉴定将用于本发明重组DNA构建体的调控序列和DTP6多肽基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的例子应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属植物、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柳枝稷、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。
组合物：
本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体（包括任何抑制DNA构建体）（例如上面所讨论的任何一种构建体）的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获得自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂种和近交系。
在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该近交系植物产生含有新导入的重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性（例如，任选地在水限制条件下农学特性增加）的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子。
植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉、稻、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。
重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。
具体实施例包括但不限于下列的：
1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物（例如玉米、稻或大豆植物），所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对以下胁迫中的一种或多种表现出提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。在与所述对照植物进行比较时，所述植物还可表现出至少一种农学特性的改变。
2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物（例如玉米、稻或大豆植物），所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP6多肽序列，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对以下胁迫中的一种或多种表现出提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。在与所述对照植物进行比较时，所述植物还可表现出至少一种农学特性的改变。
3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物（例如玉米、稻或大豆植物），所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP6多肽序列，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
4.在基因组中包含重组DNA构建体的植物（例如玉米、稻或大豆植物），所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：（a）在严格条件下与包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103的全长互补序列的DNA分子杂交；或（b）产生自SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103（通过选自缺失、取代、添加或插入的至少一种方法而进行的一个或多个核苷酸变异而产生）；并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对以下胁迫中的一种或多种表现出提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。
5.在基因组中包含重组DNA构建体的植物（例如玉米、稻或大豆植物），所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
6.在基因组中包含重组DNA构建体的植物（例如玉米、稻或大豆植物），所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：（a）在严格条件下与包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103的全长互补序列的DNA分子杂交；或（b）产生自SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103（通过选自缺失、取代、添加或插入的至少一种方法而进行的一个或多个核苷酸变异而产生）；并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
7.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物（例如玉米、稻或大豆植物），所述抑制DNA构建体包含至少一种可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域的调控元件，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于ClustalV比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码DTP6多肽，并且其中所述植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
8.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物（优选玉米、稻或大豆植物），所述抑制DNA构建体包含至少一种可操作地连接至以下序列的全部或部分的调控元件：（a）编码多肽的核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或（b）（a）的核酸序列的全长互补序列，并且其中所述植物在与不包含所述重组构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
9.在另一个实施例中，在基因组中包含可操作地连接至少一种重组调控元件的多核苷酸的植物，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组调控元件的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。所述至少一种重组元件可包括启动子、增强子或两者，其中所述启动子和所述增强子在植物细胞中具有功能。所述启动子和所述增强子可能是组成型或可能具有选自以下的特性：组织特异型、发育特异型和诱导型。
10.上述实施例1-9中的植物的任何子代、上述实施例1-9中的植物的任何种子、上述实施例1-9中的植物的子代的任何种子以及来自上述实施例1-9中的任何植物以及它们的子代的细胞。
在前述实施例1-10中任一项或本发明的任何其它实施例中，所述DTP6多肽可来自拟南芥、玉米、大豆、烟豆、野大豆、短绒野大豆、毛果杨、葡萄、蓖麻、牡丹、木薯、醉蝶花、甘蓝型油菜、高粱、小麦、百喜草、草香碗蕨和画眉草。
在前述实施例1-10中任一项或本发明的任何其它实施例中，所述重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）可包含至少一种在植物中有功能的启动子作为调控序列。
在前述实施例1-10中任一项或本发明的任何其它实施例中，所述至少一种农学特性的改变是提高或降低。
在前述实施例1-10中任一项或本发明的任何其它实施例中，所述至少一种农学特性可选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长、盐耐受性、早期幼苗活力和在低温胁迫下的出苗。例如，至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的提高。
在前述实施例1-10中任一项或本发明的任何其它实施例中，在水限制条件下，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体（或所述抑制DNA构建体）的对照植物进行比较时可表现出至少一种农学特性的改变。
在前述实施例1-10中任一项或本发明的任何其它实施例中，在三重胁迫条件下，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体（或所述抑制DNA构建体）的对照植物进行比较时可表现出至少一种农学特性的改变。
在前述实施例1-10中任一项或本发明的任何其它实施例中，在百草枯胁迫条件下，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体（或所述抑制DNA构建体）的对照植物进行比较时可表现出至少一种农学特性的改变。
“干旱”指植物可利用的水不足，尤其是当时间延长时，能够引起植物损伤或阻止其正常发育（例如限制植物生长或种子产量）。
术语“干旱”、“干旱胁迫”、“低可用水”、“水胁迫”和“降低的可用水”可互换地使用，并且指的是低于最佳生长和生产所需的植物可用水。
“耐旱性”指植物在干旱条件下存活较长时间并且基本上不表现出生理或物理退化的特性。
多肽的“耐旱活性”指在转基因植物中过表达所述多肽赋予转基因植物相对于参照植物或对照植物提高的耐旱性。
植物的“提高的耐旱性”相对于参照植物或对照植物进行测量，它是植物在干旱条件下存活较长时间，并且相对于在相似干旱条件下生长的参照或对照植物基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的特性。通常当转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体时，它相对于参照或对照植物表现出提高的耐旱性，所述参照或对照植物在其基因组中不包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。
如本文使用，“三重胁迫”是指由干旱胁迫、高温胁迫和高光照胁迫施加于植物的非生物胁迫。
术语“热胁迫”和“高温胁迫”可互换使用，并且定义为环境温度以充分的时间热到足够使这些温度导致植物功能或发育的损害的情况，其在损害上是可逆或不可逆的。“高温”可以是“高空气温度”或“高土壤温度”、“高日间温度”或“高夜间温度”、或这些超过一种的组合。
在本发明的一个实施例中，所述环境温度可以处于30℃至36℃的范围。在本发明的一个实施例中，所述高温的时长可以处于1-16小时的范围内。
“高光照强度”和“高照射”以及“光照胁迫”可互换使用，并且是指通过对植物实施充分时间高得足以使其对该植物导致光抑制损害的光照强度而施加的胁迫。
在本发明的一个实施例中，所述光照强度可以处于250μE至450μE的范围内。在本发明的一个实施例中，所述高光照强度胁迫的时长可处于12-16小时的范围内。
“三重胁迫耐受性”是植物在干旱、高温和高光照强度的组合胁迫条件下存活长时间而不表现出实质性生理或物理退化的性状。
“百草枯”是对植物实施氧化胁迫的除草剂。联吡啶类除草剂百草枯通过拦截来自PSI中的电子传递链的电子而发挥作用。这一反应导致联吡啶自由基的产生，其易于与分子氧进行反应而产生过氧化物。植物中的百草枯耐受性已被关联于氧自由基的清理能力（Lannelli，M.A.等人，（1999）JExpBotany，第50卷，第333期，第523-532页）。据报道百草枯抗性植物对于其它氧化胁迫也具有较高的耐受性。
“百草枯胁迫”被定义为通过对植物给以0.03至0.3μM的百草枯浓度而对它们施加的胁迫。
大量的不良环境条件（诸如干旱、盐胁迫以及除草剂的使用）促进了反应性氧物质（ROS）在植物细胞中的过量产生。ROS（诸如单线态氧、过氧化物自由基、过氧化氢（H2O2）和羟自由基）据认为是导致急性细胞损害的主要因素，这是由于它们与膜脂、蛋白质和DNA的高反应性导致的（Mittler，R.（2002）TrendsPlantSci，第7卷，第9期）。
植物的“提高的胁迫耐受性”相对于参照植物或对照植物进行测量，它是相对在相似干胁迫条件下生长的参照或对照植物而言植物在胁迫条件下存活较长时间并且基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的特性。
具有“提高的胁迫耐受性”的植物可对一种或多种胁迫条件表现出提高的耐受性。胁迫的例子包括但不限于盐分、干旱、温度、病原、金属、化学物和氧化胁迫相关联的亚最佳条件。
多肽的“胁迫耐受活性”指在转基因植物中过表达所述多肽赋予转基因植物相对于参照植物或对照植物提高的胁迫耐受性。具有“三重胁迫耐受活性”的多肽指在转基因植物中过表达所述多肽赋予转基因植物相对于参照植物或对照植物提高的三重胁迫耐受性。具有“百草枯胁迫耐受活性”的多肽指在转基因植物中过表达所述多肽赋予转基因植物相对于参照植物或对照植物提高的百草枯胁迫耐受性。
通常当转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体时，它相对于参照或对照植物表现出提高的胁迫耐受性，所述参照或对照植物在其基因组中不包含所述重组DNA构建体或抑制DNA构建体。
本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件并评价植物耐旱性的规程，所述植物已经遭受了模拟的或天然存在的干旱条件。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需求较少的水或在一定时期内不提供水来模拟干旱条件，并且技术人员可通过寻找在生理和/或物理条件上的差异来评价耐旱性，包括但不限于活力、生长、大小、或根长、或具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价耐旱性的其它技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率和换气速率。
干旱胁迫实验可涉及慢性胁迫（即缓慢干燥）和/或可涉及两种急性胁迫（即突然除去水），它们由一天或两次恢复分开。慢性胁迫可持续8-10天。急性胁迫可持续3-5天。在对转基因植物和相应对照植物进行干旱胁迫以及良好灌溉处理期间可测量以下变量：
变量“%面积chg_慢性开始-急性2”是介于慢性胁迫第一天和第二次急性胁迫那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。
变量“%面积chg_慢性开始-慢性结束”是介于慢性胁迫第一天和慢性胁迫最后一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。
变量“%面积chg_慢性开始-收获”是介于慢性胁迫第一天和收获那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。
变量“%面积chg_慢性开始-恢复24小时”是介于慢性胁迫第一天和恢复24小时（急性胁迫2之后24小时）之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。
变量“psii_急性1”是在第一次急性胁迫末期的光系统II（PSII）效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。
变量“psii_急性2”是在第二次急性胁迫末期的光系统II（PSII）效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。
变量“fv/fm_急性1”是在第一次急性胁迫末期的最佳量子产率（Fv/Fm）的量度-（最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光）。
变量“fv/fm_急性2”是在第二次急性胁迫末期的最佳量子产率（Fv/Fm）的量度-（最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光）。
变量“叶片卷曲_收获”是在收获日的顶部图像对侧面图像的比率的量度。
变量“叶片卷曲_恢复24小时”是恢复24小时顶部图像对侧面图像的比率的量度。
变量“比生长速率（SGR）”指植物总表面积的单日变化（通过LemnaTecInstrument测量）（Y（t）=Y0*er*t）。Y（t）=Y0*er*t等同于在Y/Δt中的%变化，其中的单个术语如下所述：Y（t）=在t时的总表面积；Y0=初始总表面积（估计的）；r=比生长速率天-1，并且t=种植后的天数（“DAP”）。
变量“苗干重”是将苗置于104℃烘箱96小时后的苗重量的量度。
变量“苗鲜重”是从植物切除后立即称重的苗重量的量度。
下文实例描述一些用于模拟干旱条件和/或评价耐旱性的代表性规程和技术。
也可通过在田间测试中比较植物在模拟的或天然存在的干旱条件下（例如通过测量与非干旱条件下相比，在干旱条件下基本等同的产量，或测量与对照或参照植物相比，在干旱条件下更少的产量损失）保持足够产量（至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%产量）的能力来评价耐旱性。
在评估或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施例（例如，如本文描述的组合物或方法）中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：
1.转化过的植物的子代，该转化过的植物对于重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体（或抑制DNA构建体）的植物：包含该重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）的子代来进行测量（即，不包含该重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）的子代是对照或参照植物）。
2.重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）基因渗入自交系中，例如在玉米中，或基因渗入变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量（即，亲本近交系或变种品系是对照或参照植物）。
3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本自交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本自交系产生，不同的是其中一个亲本自交系含有重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量（即第一杂交系为对照植物或参照植物）。
4.包含重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）的植物：该植物可相对于对照植物进行评估或测量，所述对照植物不包含重组DNA构建体（或抑制DNA构建体），但具有与该植物相当的遗传背景（例如，与包含重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）的植物相比较，核遗传物质具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性）。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、任意引物聚合成酶链反应（AP-PCR）、DNA扩增指纹（DAF）、序列特异扩增区域（SCAR）、扩增片段长度多态性和也称为微卫星的简单序列重复（SSR）。
此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。
方法：
方法包括但不限于用于提高植物耐旱性、三重胁迫耐受性和百草枯耐受性的方法，在植物中评价耐旱性、三重胁迫耐受性和百草枯耐受性的方法，用于在植物中改变农学特性的方法，用于在植物中测定农学特性的变化的方法，以及用于产生种子的方法。所述植物可为单子叶或双子叶植物，例如玉米或大豆植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉、稻、大麦、粟、甘蔗或高粱。所述种子可为玉米或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米自交系种子。
方法包括但不限于如下方法：
转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在具体实施例中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核细胞，例如细菌细胞。
生产转基因植物的方法，所述方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）来转化植物细胞并从转化的植物细胞中再生转基因植物。本发明也涉及由该方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获得的转基因种子。通过该方法获得的转基因植物可被用于本发明的其它方法中。
用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组DNA构建体，所述多核苷酸可操作地连接至少一种调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。
改变本发明的多肽在宿主细胞中的表达水平的方法，所述方法包括：（a）使用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及（b）在适于表达所述重组DNA构建体的条件下培养转化过的细胞，其中重组DNA构建体的表达导致转化过的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。
在一个实施例中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对三重胁迫、或百草枯、或两者表现出提高的耐受性。
鉴定DTP6蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：（a）使用图13A-图13Y的特征谱在氨基酸序列数据库中鉴定至少一种候选序列；（b）针对来自步骤（a）的至少一种候选序列测定E值得分；（c）对来自步骤（b）的至少一种候选序列进行选择，其中所述E值得分<10-3；以及（d）进一步对来自步骤（c）的至少一种候选序列进行选择，其中所述至少一种候选序列与图13A-图13Y的特征谱在该特征谱的整体长度上匹配至少80%。通过这一方法获得的编码DTP6多肽的多核苷酸可用于本发明的其它方法。
本发明的另一个实施例是鉴定DTP6蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：（a）通过使用选自以下的至少一种序列开发HMM特征谱：SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102、103以及表5中所示的序列；（b）使用步骤（a）的特征谱在氨基酸序列数据库中鉴定至少一种候选序列；（c）针对来自步骤（b）的至少一种候选序列测定E值得分；（d）对来自步骤（c）的至少一种候选序列进行选择，其中所述E值得分<10-3；以及（e）进一步对来自步骤（d）的至少一种候选序列进行选择，其中所述至少一种候选序列与步骤（a）的特征谱在该特征谱的整体长度上匹配至少80%。通过这一方法获得的编码DTP6多肽的多核苷酸可用于本发明的其它方法。
提高植物对以下一种或多种胁迫的耐受性的方法：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫；所述方法包括：（a）将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列（例如在植物中有功能的启动子）的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；以及（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对以下一种或多种胁迫表现出提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。所述方法还可包括（c）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。
提高植物对以下一种或多种胁迫的耐受性的方法：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫；所述方法包括：（a）将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：（a）在严格条件下与包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103的全长互补序列的DNA分子杂交；或（b）产生自SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103（通过选自缺失、取代、添加或插入的至少一种方法而进行的一个或多个核苷酸变异而产生）；以及（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。所述方法可进一步包括（c）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对以下一种或多种胁迫表现出提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。
提高植物对以下一种或多种胁迫的耐受性的方法：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫；所述方法包括：（a）将抑制DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列（例如在植物中有功能的启动子）的以下序列的全部或部分：（i）编码多肽的核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，或者（ii）（a）（i）的核酸序列的全长互补序列；以及（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体并且在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。所述方法可进一步包括（c）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体并且在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时对以下一种或多种胁迫表现出提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。
提高植物对以下一种或多种胁迫的耐受性的方法：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫；所述方法包括：（a）将抑制DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列（例如植物中有功能的启动子），所述调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于ClustalV比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码DTP6多肽；和（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体并且在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时对以下一种或多种胁迫表现出提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。所述方法还可包括（c）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。
评价植物对以下一种或多种胁迫的耐受性的方法：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫；所述方法包括（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列（例如在植物中有功能的启动子）的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）评价所述子代植物对以下一种或多种胁迫的提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。
评价植物对以下一种或多种胁迫的耐受性的方法：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫；所述方法包括：（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：（a）在严格条件下与包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103的全长互补序列的DNA分子杂交；或（b）产生自SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103（通过选自缺失、取代、添加或插入的至少一种方法而进行的一个或多个核苷酸变异而产生）；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）评价所述子代植物对以下一种或多种胁迫的提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。
评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列（例如在植物中有功能的启动子），所述调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：（i）编码多肽的核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；或（ii）（i）的核酸序列的全长互补序列；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及（c）评价所述子代植物对以下一种或多种胁迫的提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。
评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列（例如植物中有功能的启动子），所述调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于ClustalV比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码DTP6多肽；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及（c）评价所述子代植物对以下一种或多种胁迫的提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫。
测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列（例如在植物中有功能的启动子）的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）任选地在水限制条件下，测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：（a）在严格条件下与包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103的全长互补序列的DNA分子杂交；或（b）产生自SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103（通过选自缺失、取代、添加或插入的至少一种方法而进行的一个或多个核苷酸变异而产生）；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及（c）任选地在水限制条件下，测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列（例如在植物中有功能的启动子），所述调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：（i）编码多肽的核酸序列，基于ClustalV比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38-70、75、77、79、81、83、85、87、89、91、92-102或103进行比较时具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性；或（ii）（i）的核酸序列的全长互补序列；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及（c）任选地在水限制条件下，测定所述子代植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
测定植物农学特性的改变的方法，所述方法包括：（a）获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列（例如植物中有功能的启动子），该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于ClustalV比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码DTP6多肽；（b）获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及（c）任选地在水限制条件下，测定所述子代植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
产生种子（例如可作为提供耐旱性的产品销售的种子）的方法，该方法包括任一上述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体（或抑制DNA构建体）。
在前述方法中任一项或本发明方法的任何其它实施例中，在所述导入步骤中所述可再生的植物细胞可包括愈伤组织细胞、胚胎愈伤组织细胞、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞可来自近交系玉米植物。
在前述方法中任一项或本发明方法的任何其它实施例中，所述再生步骤可包括以下步骤：（i）在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞直至观察到愈伤组织；（ii）将所述步骤（i）的转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成的激素的第一培养基；以及（iii）在第二培养基上传代培养步骤（ii）后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。
在前述方法中任一项或本发明方法的任何其它实施例中，所述至少一种农学特性可选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长、盐耐受性、早期幼苗活力和在低温胁迫下的出苗。至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的提高。
在前述方法中任一项或本发明方法的任何其它实施例中，在水限制条件下，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体（或所述抑制DNA构建体）的对照植物进行比较时可表现出至少一种农学特性的改变。
在前述方法中任一项或本发明方法的任何其它实施例中，存在供选择的替代方案用于将包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中。例如，可将调控序列（例如一种或多种增强子、任选地作为转位因子的部件）导入可再生的植物细胞，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本发明多肽的内源基因的事件。
将本发明的重组DNA构建体导入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌（Agrobacterium）介导的转化。植物转化和再生技术已经在国际专利公布WO2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。
含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。可将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。
实例
本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。因此，除了那些本文所示和所述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。
实例1
制备具有激活标记基因的拟南芥种群
18.4kb的T-DNA基二元构建体pHSbarENDs（SEQIDNO:1）经构建而包含来源于花椰菜花叶病毒35S启动子的四个多聚增强子元件，其对应于序列-341至-64，如Odell等人，（1985）Nature313：810-812所述。该构建体也包含允许质粒救援的载体序列（pUC9）、再动员T-DNA的转座子序列（Ds）、以及允许草胺磷选择转基因植物的bar基因。原则上，仅将从包含边界在内的右边界（RB）至左边界（LB）的10.8kb片段转移到宿主植物基因组中。因为增强子元件位于靠近RB处，它们可诱导T-DNA整合后的基因组位点顺式激活。
通过全植物农杆菌（Agrobacterium）转化建立拟南芥属激活标记种群：种群1和种群2。
对于种群1，将pHSbarENDs构建体（图1）转化进入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株C58，在LB中25℃下生长至OD600～1.0。然后离心沉淀细胞，并重悬在相等体积的5%蔗糖/0.05%SilwetL-77（OSISpecialties，Inc）中。在早期抽薹时，培育拟南芥属生态型Col-0的土壤使用农杆菌悬浮液进行顶部灌溉。一周后，相同植物再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌菌株进行顶部灌溉。然后将该植物的种子设为标准。所得T1种子在土壤中播种，并且通过喷洒草胺磷（AgrEvo；BayerEnvironmentalScience）选择转基因幼苗。从大约35,000个单个草胺磷抗性T1植物中收集T2种子。培养T2植物并收集来自96个分离T2品系的相同体积的T3种子。这组成了360个亚群。
对于种群2，将pHSbarENDs构建体稍加改进。
第5775位的PacI限制性位点被替换成下列多聚链接序列接头：
GATCACTAGTGGCGCGCCTAGGAGATCTCGA
GTAGGGATAACAGGGTAAT（SEQIDNO:104）
，其添加了BclI、SpeI、AscI、BlnI、BglII、XhoI和I-SceI限制性位点。这一改进质粒命名为pHSbarENDs2。
农杆菌菌株和全植物转化根据对种群1的描述进行。
选择了总计100,000个草胺磷抗性T1幼苗。分开保存来自每个品系的T2种子。
实例2A
筛选以鉴定具有提高的耐旱性的品系（种群1）
幼苗活力/干旱筛选（种群1）：来自360个成批亚种群（各96个品系）的每一种群的约1000颗种子在4℃下吸胀4天，随后均匀地播种于经除草剂处理的填以标准土壤的10×25英寸浅箱上。这是对各亚种群进行约10×的采样（1000颗种子，96个品系/亚种群）。
当植物大致处于3-4叶莲座期（种植后～2.5周），将浅箱用水饱和，并且随后撤去水以鉴定对干旱胁迫的进行性提高表现出耐受性的拟南芥属突变体（即，在～14天期间）。
出于这一筛选的目的，我们通过每天至少一次观察检测所述植物来估测耐旱性。将花青苷积累的相对程度、叶大小、叶变黄和叶萎蔫的量与各浅箱中的对照植物进行比较。相对所述浅箱中的其它植物表现出花青苷积累、叶变黄和/或叶萎蔫的延迟的个体植物标注为耐旱性。
对表现出进行性干旱胁迫条件耐受性的个体（与敏感型相邻植物相比）进行计数。在该平板中小心地复水2-3天并最小化对周边植物的复水，并且随后转移至单个罐中进行种子生成。在转移至个体罐之前在所述浅箱中的复水是一个较好的方法，这是因为其使得植物在转移之前施加的进一步胁迫之前从该干旱胁迫中部分地恢复。
在区别首度可见时，对表现出提高的幼苗生长或形态变化的植物进行计数。
402株个体植物经鉴定相对于各浅箱的其它植物为潜在的耐旱型或干旱敏感型。总计104个亚种群（浅箱）产生了由其潜在的耐旱性表型而被选择的植物。
在类似的条件下生长来自各品系的T4种子并进行再度筛选。在发芽后约15至20天起始干旱胁迫。与初始的筛选不同，所述植物在远为更低的密度下生长（32个植物/浅箱），各浅箱包含24个“突变”植物和8个未转化对照植物。
阳性命中在外观上定义为具有延迟的萎蔫和/或保持绿色。来自10个亚种群的37个品系具有提高的耐旱性。此外，来自单一亚种群的8个品系具有“提高的幼苗生长/活力”，而一个品系根据其在干旱胁迫期间的快速萎蔫而被描述为干旱超敏感型。
实例2B
筛选以鉴定具有提高的耐旱性的品系（种群2）
定量干旱筛选：将来自每个96,000个分离T1激活标记品系的九个草胺磷抗性T2植物每株种植在有200土壤的单个罐中。每个浅箱配置有8个方罐。每个方罐顶部填充有土壤。每个罐（或单元）均播种以产生3×3阵列的9个草胺磷抗性幼苗。
土壤浇水至饱和，然后植物在标准条件下生长（即，16小时光照，8小时黑暗的循环；22℃；～60%的相对湿度）。不提供附加的水。
在可见的干旱胁迫症状出现时拍摄植物的数字图像。每天拍摄图像一次（在每天的相同时间），直至植物变干。通常收集连续四天的数据。
使用颜色分析鉴定潜在的耐旱性品系。可使用颜色分析测量进入黄色区的叶片面积百分比的提高。使用色调、饱和度和强度数据（“HSI”），黄色区由色调35至45组成。
叶片面积的保持也被用作鉴定潜在耐旱性品系的另一个标准，因为拟南芥属叶片在干旱胁迫期间萎蔫。叶片面积的保持可用莲座型叶丛面积随时间的减少来测量。
叶片面积根据使用LemnaTec成像系统获取的绿色像素数目进行测量。激活标记和对照（例如野生型）植物在浅箱中并列生长，浅箱包含72株植物（9株/罐）。当萎蔫开始时，拍摄图像多日以监控萎蔫过程。基于连续四天获取的绿色像素数，从这些数据中测定激活标记植物和伴随的对照植物的萎蔫特征图。该特征图选自发生最大程度萎蔫的四天中的一系列测量结果。耐旱能力通过激活标记植物与对照植物相比的抗萎蔫倾向来测量。
使用LemnaTecHTSBonitUV软件分析CCD图像。根据绿色像素数目获取对拟南芥属植物的叶片面积的评估。对每张图像的数据进行平均化以获取对激活标记植物和对照植物的绿色像素值的平均值和标准偏差的评估。噪声函数的参数通过平方偏差对平均像素数的直线回归获得，使用批中的所有图像数据。平均像素数数据的误差估计使用噪声函数的拟合参数进行计算。激活标记植物和野生型植物的平均像素数相加以获取每张图像的总叶片面积的评估。具有最大萎蔫的四天间隔通过选择对应于植物生长最大差异的间隔获得。激活标记植物和野生型植物的单个萎蔫响应通过归一化使用间隔第一天的绿色像素数值的数据获得。激活标记植物与野生型植物相比的耐旱性通过相加经过两天至四天的激活标记植物和野生型植物间的萎蔫响应的加权差值来评分；加权数通过传递数据误差进行评估。耐旱性评分为正对应于激活标记植物与野生型植物相比萎蔫更慢。激活标记植物和野生型植物之间的萎蔫响应的差异显著性从平方偏差的加权和获取。
将在与整个浅箱的平均值进行比较时具有黄色积聚显著延迟和/或莲座型叶丛面积显著保持的品系命名为Phase1hits。在相同分析条件下进行Phase1hits的重复试样再筛选。当Phase2平行测定的其中一个或全部显示与整个浅箱的平均值有显著差异时（评分大于0.9），则认为该品系是经验证的耐旱性品系。
实例3A
鉴定激活标记基因
使用下述两个标准程序中的一个或两个在耐旱性品系中鉴定侧接T-DNA插入序列的基因：（1）热不对称交错PCR（TAIL）PCR（Liu等人，（1995），PlantJ.8：457-63）；以及（2）SAIFFPCR（Siebert等人，（1995）NucleicAcidsRes.23：1087-1088）。至于复杂的多聚T-DNA插入序列，TAILPCR和SAIFFPCR可能均不足以鉴定候选基因。在这些情况下，可使用包括反式PCR、质粒拯救和/或基因组文库构建在内的其它程序。
成功的结果是其中单个TAIL或SAIFFPCR片段包含T-DNA边界序列和拟南芥属基因组序列。
一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与公开可用的拟南芥属基因组的序列比对来鉴定候选基因。
具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNARB的注释基因是激活的基因的候选基因。
为了验证鉴定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合伪克隆的可能性，用一个T-DNA中的寡核苷酸和一个候选基因特异性的寡核苷酸进行对基因组DNA的诊断PCR。将提供PCR产品的基因组DNA样本理解为表示T-DNA插入序列。此分析也验证了其中一种以上的插入事件发生在相同品系中的情况，例如，在TAIL和/或SAIFFPCR分析中鉴定是否有多个不同基因组片段。
实例3B
鉴定激活标记基因
对于实例2A中的种群1，在一开始仅仅从各亚种群的单一品系中克隆候选基因。使用相同的寡聚物验证T-DNA的基因组插入，PCR分析显示来自相同亚种群的所有品系具有相同的T-DNA插入事件。我们因而从来自所述10个亚种群的37个品系中独立地分离了相同的插入事件以作为具有耐旱性。
因此，我们通过种群1筛选而鉴定了十一个候选品系：10个提高的耐旱性候选品系和1个干旱敏感型候选品系。
实例4A
鉴定激活标记的AT-DTP6多肽基因
进一步分析表现出耐旱性的激活标记品系（No.900067）。提取来自该品系的DNA，并且在突变品系中侧接T-DNA插入序列的基因通过SAIFFPCR（Siebert等人，NucleicAcidsRes.23：1087-1088（1995））。鉴定一个PCR扩增的片段，它包含T-DNA边界序列和拟南芥属基因组序列。获得侧接T-DNA插入序列的基因组序列，通过与完全拟南芥属基因组的序列比对鉴定候选基因。就给定的T-DNA整合事件而言，最靠近35S增强子元件/T-DNARB的注释基因是品系中的活化候选基因。对于品系900067，35S增强子存在于基因At1g68490（SEQIDNO:17；NCBIGINo.30697690）的3’UTR中，该基因编码DTP6多肽（SEQIDNO:18；NCBIGINO.18409044）。
实例4B
候选耐旱性基因表达水平的测定
功能性的激活标记等位基因将导致在其中它正常表达的组织中的候选基因上调、在其中它通常不表达该基因的组织中异常表达、或者两种情况都发生。
比较在同源突变品系和野生型品系中的候选基因的表达水平。使用标准RT-PCR程序如ReverseTranscription试剂盒，购自使用肌动蛋白基因的RT-PCR作为对照物以显示来自突变品系和野生型的样本的扩增和载入是相似的。
最优化各个基因的测定条件。在成熟的莲座型叶中检查表达水平。如果激活标记等位基因导致在其它组织（例如根）中的异常表达，通过该检测分析法它不被检出。同样地，阳性结果是有用的，但是阴性结果不排除基因不需要进行进一步的分析。
实例5
经由转化到拟南芥属中验证拟南芥属候选基因At1g68490（AT-DTP6 多肽）
可将候选基因转化到拟南芥属中并在35S启动子作用下过表达。如果在转基因品系中观察到与亲本激活标记品系相同或相似的表型，则将该候选基因认为是拟南芥属中验证过的“前导基因”。
候选拟南芥属DTP6多肽基因（At1g68490；SEQIDNO:17；NCBIGINo.30697690）以如下方式针对其产生耐旱性的能力进行了测试。
16.8-kbT-DNA基二元载体（称为pBC-yellow（SEQIDNO:4；图4）与1.3-kb35S启动子一起构建于紧邻INVITROGENTM C1转换插入序列的上游。该载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-Yellow（InvitrogenTM），它赋予转化过的种子黄色荧光。
通过RT-PCR扩增At1g68490cDNA蛋白编码区，使用以下引物：
(1)At1g68490-5′attB正向引物（SEQIDNO:12）：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGAAGAAAAGATGAATCACTTTGCGG
(2)At1g68490-3′attB反向引物（SEQIDNO:13）：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCAAAAGGGTTCGTTTCGGGTTTCG
正向引物包含attB1序列（ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；SEQIDNO:10），邻近于相距5’UTR10个核苷酸和相距At1g68490的蛋白质编码区16个核苷酸的位置。
反向引物包含attB2序列（ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT；SEQIDNO:11），邻近于相距At1g68490的3’UTR23个核苷酸的反向互补序列的位置。
使用INVITROGENTM CLONASETM技术，用pDONRTM/Zeo（SEQIDNO:2；图2）进行BP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因（CAM）从pDONRTM/Zeo移除并定向地克隆了侧接attB1和attB2位点的PCR产物，从而产生入门克隆PHP31329。该入门克隆与目的载体一起用于随后的LR重组反应如下。
16.8-kbT-DNA基二元载体（称为pBC-yellow（SEQIDNO:4；图4）与1.3-kb35S启动子一起构建于紧邻INVITROGENTM C1转换插入序列的上游，其包含细菌致死ccdB基因以及侧接attR1和attR2序列的氯霉素抗性基因（CAM）。该载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-Yellow（InvitrogenTM），它赋予转化过的种子黄色荧光。使用INVITROGENTM 技术，对包含定向克隆PCR产物和pBC的入门克隆PHP31329进行LR重组反应。这允许迅速和定向地将候选基因在pBC-yellow中克隆于35S启动子之后以制备35S启动子::At1g68490表达构建体pBC-Yellow-At1g68490。
申请人随后使用如实例1所述的相同农杆菌介导的转化程序将35S启动子::At1g68490表达构建体导入野生型拟南芥属生态型Col-0中。转基因T1种子通过黄色荧光进行选择，并且将T1种子紧邻着野生型种子种植并在水限制条件下生长。生长条件和成像分析如实例2所述。来自激活标记的初始耐旱性表型据发现可在用通过35S启动子直接表达At1g68490的构建体转化过的野生型拟南芥属植物中重现。通过实例2的方法测定的耐旱性评分是1.264。
实例6
cDNA文库的制备和cDNA克隆的分离和测序
cDNA文库可以通过许多可用的方法中的任一种制备。例如，通过首先根据生产商的说明书（StratageneCloningSystems，LaJolla，CA）制备Uni-ZAPTMXR载体中的cDNA文库，可将cDNA导入质粒载体中。根据Stratagene提供的说明书，将Uni-ZAPTMXR文库转换成质粒文库。当转换的时候，将把cDNA插入序列包含于质粒载体中。此外，可使用T4连接酶（NewEnglandBiolabs）将cDNA直接导入预切过的IISK（+）载体（Stratagene）中，随后按照制造商规程（GIBCOBRLProducts）转染DH10B细胞。一旦cDNA插入序列处于质粒载体中，从随机选取的含重组质粒的细菌菌落制备质粒DNA，或者用对插入的cDNA序列旁侧的载体序列特异性的引物，通过聚合酶链式反应扩增插入的cDNA序列。将扩增的DNA插入序列或质粒DNA在引物标记法测序反应（dye-primersequencingreaction）中进行测序，以产生部分cDNA序列（表达序列标记或“EST”；参见Adams等人，（1991）Science252：1651-1656）。用PerkinElmerModel377荧光测序仪分析所得的EST。
用改进的转座规程产生全长插入序列（FIS）数据。从归档的甘油原种作为单一菌落回收确定了FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。将分离的DNA模板在基于PCR的测序反应中与载体引物M13正向和反向寡核苷酸反应并上样至自动化的测序仪上。通过与对其进行FIS查询的初始EST序列进行序列比对来确认克隆鉴定。
将确认的模板通过基于酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Ty1转座因子（Devine和Boeke（1994），NucleicAcidsRes.22：3765-3772）进行转座。该体外转座系统在整个一组大DNA分子中随机地放入独特的结合位点。随后将转座的DNA用于通过电穿孔转化DH10B电感受态细胞（GIBCOBRL/LifeTechnologies，Rockville，MD）。转座因子含有另外的可选标记（称为DHFR；FlingandRichards（1983）NucleicAcidsRes.11：5147-5158），使得能在琼脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每次转座反应随机地选择多个亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结合位点特异性的独特引物从转座事件位点向外进行测序（dyeterminatorReadyReactionmix）。
收集序列数据（ABICollections）并用Phred和Phrap（Ewing等人（1998），GenomeRes.8：175-185；Ewing和Green（1998）GenomeRes.8：186-194）进行组装。Phred是一种公用软件程序，该程序再次读取ABI序列数据，再次调出（recall）碱基，赋质量值，并将碱基序列（basecall）和质量值写入可编辑的输出文件中。Phrap序列组装程序使用这些质量值来提高组装的序列重叠群的准确度。通过Consed序列编辑器阅览组装件（Gordon等人，（1998），GenomeRes.8：195-202）。
在一些克隆中，cDNA片段可对应基因的3’端的一部分并且不会涵盖整个开放阅读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一者。这两种方法中的第一种方法导致产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开放阅读框的片段。这两种方法都使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有时基于以前的知识（特定的基因应该存在于某些组织中）选择文库，有时则进行随机地选择。获得相同基因的反应可以平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库池通常用3至5个不同的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增中，两种方法均使用载体特异性的（正向）引物，同时还使用基因特异性的（反向）引物，该正向引物对应位于克隆5’端处的载体的一部分。第一种方法使用与已知基因序列的一部分互补的序列，而第二种方法使用与3’非翻译区（也称为UTR）的一部分互补的基因特异性引物。在第二轮扩增中，两种方法都使用套式引物组。按照生产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段连接进载体中。该试剂盒选自可得自包括InvitrogenTM（Carlsbad，CA）、PromegaBiotech（Madison，WI）和Gibco-BRL（Gaithersburg，MD）在内的一些供应商的许多试剂盒。如上所述，将质粒DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用Phred/Phrap进行装配。
用于制备cDNA文库和获取序列的替代性方法可以是如下：使用进行总RNA分离的RNA分离试剂盒分离mRNA，随后通过连接于来自Invitrogen（LifeTechnologies，Carlsbad，CA）的寡聚dTDynabeads进行mRNA分离，并且可使用标准mRNA-Seq试剂盒和来自Illumina，Inc.（SanDiego，CA）的方案制备测序文库。在这一方法中，使用ZnCl2溶液破坏mRNA，使用随机引物将其反转录成cDNA，进行末端修复以制备钝末端片段，3’A-加尾，并且用Illumina双末端文库接头进行连接。然后可使用Illumina双末端文库引物对连接好的cDNA片段进行PCR扩增，并且能够在用配有双末端模块的GenomeAnalyzerII测序前使用AgilentBioanalyzerDNA1000芯片检查纯化PCR产物的质量和数量。
测序运行中的读数可在组合之前进行软修剪以使观察到具有低于15的FASTQ质量评分的每个读数的首个碱基对和后面所有碱基对通过PythonScript进行修剪。Velvet装配器（Zerbino等人，GenomeResearch18：821-9（2008））能在不同kmer和覆盖截断（coveragecutoff）参数下运行以制备某一严格性范围内的若干个推定装配物。能够使用Vmatch软件（在Vmatch网站上可用）将在那些装配物内的邻接序列（重叠群）组合成组使得被鉴定为较长重叠群亚组的重叠群分组并被排除，留下最长“sentinel”重叠群的非冗余组。这些非冗余组能用于与来自已知模型植物种类的同源序列进行比对。
实例7
cDNA克隆的鉴定
编码DTP6多肽的cDNA克隆可通过进行BLAST（基本局部比对搜索工具；Altschul等人，1993，J.Mol.Biol.215：403-410；还可参见国家卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释）进行鉴定，寻找与BLAST“nr”数据库中所包含氨基酸序列（包括所有非冗余GenBankCDS翻译序列、源自3维结构Brookhaven蛋白质数据库（ProteinDataBank）、SWISSPROT蛋白质序列数据库的最新的主要版本、EMBL和DDBJ数据库的序列）的相似性。在所有的阅读框中翻译来自克隆的DNA并用NCBI提供的BLASTX算法（Gish和States，1993，Nat.Genet.3：266-272）比较与“nr”数据库中包含的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。采用国家生物技术信息中心（NCBI）提供的BLASTP算法，分析cDNA序列编码的多肽与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计算仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P值（概率）或E值（期望值），在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P值或E值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA编码的序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。
EST序列能与如上所述的Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTN算法（Altschul等人（1997），NucleicAcidsRes.25：3389-3402.）对杜邦（DUPONTTM）专利数据库比较具有序列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5′端或3′端序列的EST。在两个或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可以装配成单一的连续核苷酸序列，从而使最初的片段在5′或3′方向上延伸。一旦确定了最5′的EST后，可以如上所述，通过全长插入序列来确定其完整的序列。可用TBLASTN算法，通过将已知基因（来自专有来源或公开数据库的已知基因）的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找到属于不同物种的同源基因。TBLASTN算法对所有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库进行氨基酸查询的搜索。该搜索允许不同物种之间的核苷酸密码子使用的差异，并且允许密码子简并。
在所述序列组装件是片段的情况下，与其它同源基因的百分比同一性可用于推断代表单一基因的片段。可对表现为共同归属的片段进行计算性组装，从而使所产生的核苷酸序列的翻译应返回处于单一开放阅读框之中的同源蛋白质的氨基酸序列。这些计算机生成的组装件可随后与本发明的其它多肽进行比对。
实例8
编码DTP6多肽的cDNA克隆的表征
制备了代表来自玉米、大豆、百喜草和复活草的多种组织的cDNA文库，并且鉴定出编码DTP6多肽的cDNA克隆。
还从两种外来植物物种Paspalumnotatum（通常称为百喜草）和画眉草（Eragrostisnindensis）（又称为复活草）中鉴定出了DTP6多肽。这些包括于表1中。从复活草中鉴定出了一种DTP6同源物，En_NODE_47983（SEQIDNO:29），并且从百喜草中鉴定出了三种同源物，Pn_NODE_10482、epn2n.pk019.o1和Pn_NODE_38377（SEQIDNO:31、80和82）。通过以拟南芥属DTP6基因和所鉴定出的玉米DTP6同源物针对百喜草和复活草组装件实施TblastN来从复活草和百喜草中进行对同源物的发掘。所产生的命中序列基于该blast比对进行翻译；并且将翻译序列与其它已知的DTP6多肽进行比对。
所述玉米和大豆文库的特征如下文所描述。用于鉴定外来草类同源物的cDNA组装件描述于实例6B中。
表2
来自玉米、大豆和香味干草蕨的cDNA文库
*基本上如美国专利5,482,845所述对这些文库进行归一化处理
使用来自表2中列出的克隆的序列进行BLAST搜索揭示了所述cDNA所编码的多肽与来自不同生物的DTP6多肽的相似性。根据表3和图11A-11E中示出，某些cDNA编码类似于来自拟南芥属AT-DTP6多肽（GINo.18409044；SEQIDNO:18）的多肽。
对如下一种或多种序列进行了BLAST分析：单独的表达序列标签（“EST”）、包含标明的cDNA克隆的完整cDNA插入物的序列（“全长插入序列”或“FIS”）、由两个或更多个EST、FIS或PCR序列装配而成的重叠群序列（“Contig”）、或编码源自FIS或重叠群的完整蛋白或功能性蛋白的序列（“完整基因序列”或“CGS”）。表3（非专利文献）和表4（专利文献）中示出了多种DTP6多肽的CGS序列的BLAST结果。表3和表4还显示了使用ClustalV比对方法、使用默认参数计算的每对氨基酸序列的百分比序列同一性值。
表3
DTP6多肽的BLASTP结果
表4
DTP6多肽的BLASTP结果
图11A-11E示出了SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、75、77、79、81、83、85和56的DTP6多肽的氨基酸序列的多重比对。图12示出了图11A-11E中示出的每对序列的百分比序列同一性和趋异值。
用生物信息计算包（Inc.，Madison，WI）的程序进行序列比对和百分比同一性计算。用ClustalV比对方法（Higgins和Sharp（1989），CABIOS.5：151-153）进行序列的多重比对，默认参数（GAPPENALTY=10，GAPLENGTHPENALTY=10）。使用Clustal方法采用以下逐对比对的默认参数：KTUPLE=1，GAPPENALTY=3，WINDOW=5，DIAGONALSSAVED=5。
序列比对和BLAST计分以及概率显示包含本发明cDNA克隆的核酸片段编码DTP6多肽。
表5列出了从不同的植物种类中鉴定出的其它DTP6多肽。
表5
实例9
包含拟南芥属前导基因的同源物的植物表达载体的制备
可使用诸如BLAST（基本局部比对搜索工具；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410（1993）；也参见美国国家卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心的万维网网站上对BLAST算法的解释）之类的序列比较算法，鉴定与拟南芥属AT-DTP6多肽同源的序列。编码同源DTP6多肽的序列可通过以下方法进行PCR扩增。
方法1（基于RNA的方法）：如果编码DTP6多肽同源物基因的蛋白编码区或5’和3’UTR的5’和3’序列信息是可用的，则能够如实例5所述设计基因特异性引物。可以使用植物RNA进行RT-PCR来获得包含蛋白编码区的核酸片段，该蛋白编码区侧接attB1（SEQIDNO:10）和attB2（SEQIDNO:11）序列。引物可包含起始密码子上游的共有Kozak序列（CAACA）。
方法2（基于DNA的方法）：作为另外一种选择，如果编码DTP6多肽同源物的基因的cDNA克隆是可用的，可以以PCR扩增完整cDNA插入序列（包含5′和3′非编码区）。可设计正向引物和反向引物，使它们分别或者含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进入载体SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062（SEQIDNO:14）和反向引物VC063（SEQIDNO:15）。
方法1和方法2可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物可含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。
通过上文方法之一获得的PCR产物可以通过使用BP重组反应结合供体载体，诸如pDONRTM/Zeo（INVITROGENTM；图2；SEQIDNO:2）或pDONRTM221（INVITROGENTM；图3；SEQIDNO:3）。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因（CAM）从pDONRTM221移除并定向地克隆了具有侧接attB1和attB2位点的PCR产物而产生入门克隆。使用INVITROGENTM CLONASETM技术，然后能够将来自入门克隆的编码同源DTP6多肽的序列转移到合适的目的载体中，如pBC-Yellow（图4；SEQIDNO:4）、PHP27840（图5；SEQIDNO:5）或PHP23236（图6；SEQIDNO:6），以获得分别用于拟南芥属、大豆和玉米的植物表达载体。
供体载体pDONRTM/Zeo或pDONRTM221的attP1和attP2位点分别在图2和图3中显示。目的载体pBC-Yellow、PHP27840和PHP23236的attR1和attR2位点分别在图4、5和6中显示。
作为另外一种选择，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSiteLR重组反应以产生表达载体。
实例10
用验证过的拟南芥属前导基因制备大豆表达载体并转化大豆
为了检查所得表型，可将大豆植物转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。
可以使用例5中所述的相同入门克隆将各个基因定向克隆进入PHP27840载体中（SEQIDNO:图5），从而使所述基因的表达处于SCP1启动子（国际专利03/033651）的控制之下。
使用INVITROGENTM 技术，对包含定向克隆PCR产物和PHP27840的入门克隆PHP31329进行LR重组反应。这允许迅速和定向地将候选基因在PHP27840中克隆于SCP1启动子之后以制备SCP1启动子::At1g68490表达构建体PHP28053。
然后可以用包含编码所述DTP6多肽的序列的SCP1启动子::At1g68490表达载体转化大豆胚。大豆转化和再生技术已经在国际专利公布WO2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。
T1植物可经受土壤基的干旱胁迫。使用图像分析，可在干旱胁迫之前和期间进行多次植物面积、体积、生长速率和颜色分析。导致萎蔫或叶片面积减少推迟、黄色积聚和/或在干旱胁迫期间生长速率提高的超表达构建体将被认为是拟南芥属基因在大豆中发挥功能以提高耐旱性的证据。
然后可在较严格的大田基研究条件下检测分析用验证基因转化的大豆植物以研究在灌溉良好和水限制条件下的产量提高和/或稳定性。
实例11
采用粒子轰击法用验证过的拟南芥属前导基因转化玉米
为了检查所得表型，可将大豆植物转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。
可以将实施例5中所述的相同入门克隆用于将每个基因定向克隆进玉米转化载体中。在玉米转化载体中的基因的表达可处于组成型启动子的控制下，例如玉米泛素启动子（Christensen等人，（1989）PlantMol.Biol.12：619-632和Christensen等人（1992），PlantMol.Biol.18：675-689）
然后可通过粒子轰击将上述重组DNA构建体导入玉米细胞中。通过粒子轰击进行玉米转化的技术已经在国际专利公布WO2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。
T1植物可经受土壤基的干旱胁迫。使用图像分析，可在干旱胁迫之前和期间进行多次植物面积、体积、生长速率和颜色分析。导致萎蔫或叶片面积减少推迟、黄色积聚和/或在干旱胁迫期间生长速率提高的超表达构建体将被认为是拟南芥属基因在玉米中发挥功能以提高耐旱性的证据。
实例12
电穿孔根癌农杆菌LBA4404
将电穿孔感受态细胞（40μl），例如根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）LBA4404（含有PHP10523，图7；SEQIDNO:7），在冰上解冻（20-30分钟）。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔管（electroporationcuvette）在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。将DNA等分试样（0.5μL亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H2O中的浓度为0.2μg-1.0μg）与解冻的根癌农杆菌LBA4404细胞混合，同时仍然保持在冰上。将该混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。通过按下“pulse（脉冲）”键两次（理想的是获得4.0毫秒的脉冲）对细胞进行电穿孔（Eppendorf电穿孔仪2510）。随后，将0.5mL室温下的2xYT培养基（或SOC培养基）加入到电穿孔管并转移至15mL按压盖管（例如FalconTM管）中。将细胞在28-30℃、200-250rpm下培养3小时。
将250μL的等分试样散布在包含YM培养基和50μg/mL奇放线菌素的板上并在28-30℃下培养三天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个可选步骤中的其中一个：
选择1：用30μL15mg/mL的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。
选择2：进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。
转化体的鉴定：
选取四个独立的克隆并划痕接种在包含AB基本培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上用于分离单个克隆。将平板在28℃下孵育二至三天。对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其接种在4mL的10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，和50mg/L奇放线菌素中。将该混合物在28℃下摇动培养24小时。采用Miniprep和可选的PB缓冲液洗涤，从4mL培养物分离出质粒DNA。将DNA在30μL中洗脱。如上所述，将2μL的等分样用于电穿孔20μL的DH10b+20μL的双蒸H2O。任选地，可将15μl等分试样用于转化75-100μl的InvitrogenTMLibraryEfficiencyDH5α。将细胞散布在包含LB培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上并将其在37℃下培养过夜。
对于每个推定的共整合体选取三至四个独立克隆并将其接种在4mL的2xYT培养基（10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠）和50μg/mL奇放线菌素中。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。接下来，使用Miniprep，用任选PB缓冲液洗涤液（洗脱成50μL）从4mL培养物中分离质粒DNA。8μL质粒DNA用SalI（使用亲本DNA和PHP10523作对照物）进行消化。对于4个质粒，利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化（使用亲代DNA和PHP10523作为对照），这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶（Electronicgel）用于比较。
实例13
使用农杆菌属（Agrobacterium）细菌转化玉米
为了检查所得表型，可将大豆植物转化以过表达验证过的拟南芥属前导基因或来自不同物种的对应同源物。
农杆菌介导的玉米转化基本上按照以下文献中描述的方法进行：Zhao等人，在Meth.Mol.Biol.318：315-323（2006）（还参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333（2001）和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840，所述文献以引用方式并入本文）。该转化过程涉及细菌接种、共培养、静止期、选择以及植物再生。
1.未成熟胚芽制备：
将未成熟胚芽从颖果上切下来，并且放置在含有2mLPHI-A培养基的2mL微管中。
2.未成熟胚芽的农杆菌属细菌感染和共培养：
2.1感染步骤：
用1mL微吸移管将（1）的PHI-A培养基取出，并且加入1mL农杆菌属细菌悬浮液。将该管轻轻地倒置以混合。将该混合物在室温下培养5分钟。
2.2共培养步骤：
用1mL微量吸移管将农杆菌悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。测定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚芽的平板在20℃下于黑暗中培养三天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/LL-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。
3.选择推定的转基因事件：
向100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的每平板中转移10个胚，保持朝向，并用parafilm将培养皿密封。将平板在黑暗中于28℃下培养。预计在六至八周将看见作为黄色胚芽组织的主动生长推定事件。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆性组织生长。以二-三周的间隔将推定的转基因胚芽组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行传代培养，时间间隔取决于生长速度。记录事件。
4.T0植物的再生：
将在PHI-D培养基上繁殖的胚芽组织转移到在100×25mm培养皿中的PHI-E培养基（体细胞胚芽成熟培养基）中进行传代培养，在28℃于黑暗中培养直至体细胞胚芽成熟，培养大约十天至十八天。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中，并且在28℃下于光中（约80μE，来自冷光灯或同等荧光灯）培养。在七天至十天，将约10cm高的再生的植物置于盆中的园艺混合物中，并且使用标准园艺方法进行耐寒锻炼。
用于植物转化的培养基：
1.PHI-A：4g/LCHU基础盐，1.0mL/L1000XEriksson′s维生素混合物，0.5mg/L盐酸硫胺，1.5mg/L2,4-D，0.69g/LL-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2。加入100μM乙酰丁香酮（过滤灭菌的）。
2.PHI-B：PHI-A，不含葡萄糖，将2,4-D提高至2mg/L，将蔗糖降低至30g/L，并且补充0.85mg/L硝酸银（过滤灭菌的），3.0g/L100μM乙酰丁香酮（过滤灭菌），pH5.8。
3.PHI-C：PHI-B，不含和乙酰丁香酮，将2,4-D降低至1.5mg/L，并且补充8.0g/L琼脂，0.5g/L2-[N-吗啉代]乙烷-磺酸（MES）缓冲液，100mg/L羧苄西林（过滤灭菌）。
4.PHI-D：PHI-C补充3mg/L双丙氨磷（过滤灭菌的）。
5.PHI-E：4.3g/L的MurashigeandSkoog（MS）盐（Gibco，BRL11117-074）、0.5mg/L的烟酸、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.1g/L的肌醇、0.5mg/L的玉米素（Sigma，商品目录号Z-0164），1mg/L吲哚乙酸（IAA），26.4μg/L脱落酸（ABA），60g/L蔗糖，3mg/Lbialaphos（过滤灭菌的），100mg/L羧苄西林（过滤灭菌的），8g/L琼脂，pH5.6。
6.PHI-F：不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E；将蔗糖降低至40g/L；用1.5g/L替代琼脂；pH为5.6。
可通过首先将组织簇转移至补充以0.2mg每升2,4-D的N6培养基中来从转基因愈伤组织中再生植物。在两周后，可将所述组织转移至再生培养基（Fromm等人，Bio/Technology8：833-839（1990））。
转基因T0植物可再生，并且可确定其表型。可收集T1种子。
此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因掺入而将含有证实的拟南芥属基因的重组DNA构建体导入玉米优良自交系内。
自交或杂交的转基因植物可通过更严苛的大田试验来研究在水限制条件下和不限制水条件下的产量提高和/或稳定性。
随后可进行产量分析以测定包含验证过的拟南芥属前导基因的植物在与不包含验证过的拟南芥属前导基因的对照植物（或参照植物）进行比较时是否具有产量改善（在水限制条件下和不限制水条件下）。具体地讲，可在包含验证过的拟南芥属前导基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加水限制条件。包含验证过的拟南芥前导基因的植物在水限制条件下可具有比对照植物更少的产量损失，例如至少25%、20%、15%、10%或5%更少的产量损失，或者在非水限制条件下可具有比对照植物更高的产量，例如至少5%、10%、15%、20%或25%提高的产量。
实例14A
用于转化玉米的拟南芥前导基因（At1g68490）表达载体的制备
使用INVITROGENSTM 技术，用入门克隆（PHP31329）和目的载体（PHP28647）进行LR重组反应以制备前体质粒PHP31368。载体PHP31368包含以下表达盒：
1.泛素启动子::moPAT::PinII终止子；表达用于在转化过程中的选择的PAT抗除草剂性基因的表达盒。
2.LTP2启动子::DS-RED2::PinII终止子；表达用于种子分选的DS-RED颜色标记基因的表达盒。
3.泛素启动子::At1g68490::PinII终止子；过表达所关注基因拟南芥AT-DTP6多肽的框盒。
实例14B
使用农杆菌以拟南芥前导基因（At1g68490）转化玉米。
使用如实例12和13所述的农杆菌介导的转化，可将载体PHP31368中存在的AT-DTP6多肽表达盒导入玉米近交系或来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系。
可将载体PHP31368电穿孔进入LBA4404农杆菌属菌株中，所述菌株包含载体PHP10523（图7；SEQIDNO:7）以产生共整合载体PHP31378。所述共整合载体是通过2个质粒与PHP10523的重组（通过各个载体上包含的COS重组位点）而形成的。所述共整合载体PHP31378除包含农杆菌属菌株和农杆菌介导的转化所需的其它基因（TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORIV、VIRC1、VIRC2、VIRG、VIRB）之外，还包含同上（实例14A）的3个表达盒。
实例15
用于转化GaspeFlint来源的玉米品系的目的载体PHP23236的制备
目的载体PHP23236（图6，SEQIDNO:6）通过用质粒PHP23235（图8，SEQIDNO:8）转化农杆菌属菌株LBA4404并分离所得共整合产物而获得，所述菌株包含质粒PHP10523（图7，SEQIDNO:7）。目的载体PHP23236可被用于如实例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化GaspeFlint来源的玉米品系的玉米表达载体。
实例16
用于转化GaspeFlint来源的玉米品系的质粒的制备
使用INVITROGENTM LR重组技术，可将如实例5所述的候选基因蛋白编码区PHP31329定向克隆进入目的载体PHP23236（SEQIDNO:6；图6）中以形成表达载体PHP27927。该表达载体包含在UBI启动子控制下的受关注蛋白质编码区（编码AT-DTP6多肽），并且是T-DNA二元载体，其用于通过如本文所述实例所述（但不限于）的进入玉米的农杆菌介导的转化。
实例17
用验证过的拟南芥前导基因对GaspeFlint来源的玉米品系的转化
为了检查所得表型，可转化玉米植物以过表达拟南芥前导基因（或来自其它物种的对应同源物）。
受体植物：
受体植物细胞可来自具有短的生活周期（“快速循环”）、大小减少以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植物细胞是来自可公开获得的GaspeFlint（GBF）品系品种的植物细胞。一种可能的候选植物品系品种是GBF×QTM（QuickTurnaroundMaize（快速周转玉米），选择用于在温室条件下生长的GaspeFlint的可公开获得形式）的F1杂交种，其在Tomes等人的美国专利申请公开2003/0221212中有所公开。从该品系获得的转基因植物具有如此小的大小使得它们可在4英寸的盆中生长（是正常大小的玉米植物所需空间的1/4）并且它们在少于2.5个月时间内成熟。（传统上，一旦转基因植物适应温室后需要3.5个月来获得转基因T0种子。）另一合适的品系是GS3（高度可转化的品系）×GaspeFlint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良近交系。
转化规程：
任何合适的方法可用于将转基因导入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌载体的接种类型的步骤。转化可以在受体（靶标）植物的未成熟胚上进行。
精确的生长和植物跟踪：
将由转化的玉米胚产生的转基因（T0）植物的事件群体在受控的温室环境中栽培，该温室使用改良的随机分块（block）设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植物布局，在该布局中，实验植物被分成组（如，每组30株植物），称为块，而每株植物随块被随机分配一个位置。
对于一组30株植物，24株转化的实验植物和6株对照植物（具有设定好的表型的植物）（总起来说称为“重复组”）被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列（也叫做重复组或块）。每株植物（对照植物或实验植物）随块被随机分配一个位置，所述的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个30株植物的重复组中的每一个可栽培在相同的温室中。应该确定重复组的布局（布置方式）以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。
对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因植物。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评估导入基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植物与表达转基因的那些植物进行比较。
在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植物，并且从那些植物收集的数据自动与那些植物相关联，使得所搜集的数据可与由该植物携带的转基因关联。例如，每个植物容器具有机器可读的标签（例如通用货单代码（UPC）条形码），该标签包含了关于植物身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相关联。
作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签（RFID），其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国公布的专利申请2004/0122592，将其以引用的方式并入本文。
利用三维成像进行表型分析：
对T0事件群体中的每株温室植物（包括任何对照植物）分析所关注的农学特性，并且以这样一种方式记录或存储每株植物的农学数据，该方式使得数据与该植物的辨识数据（见上面）相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在T1代中完成对表型（基因效应）的确认。
在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植物以评估所关注的性状。可将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统（位于顶部和侧面）和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。
由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变，最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。
在单次成像分析操纵中，进行如下事件：（1）将植物传送至分析仪区域内，旋转360度以便其机器可读标签可以被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；（2）获取侧面图像并将其输入数据库；（3）将植物旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动，以及（4）将该植物传送出分析仪。
每24小时的周期让植物至少6个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。
成像仪器：
可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTecGmbH（Wurselen，Germany）商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″ITProgressiveScanIEECCD成像设备的LemnaTecScanalyzerHTSLT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。例如对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5%，对于次要组成成像分析仪的仪器差异可小于约10%。
软件：
成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTecHTSBonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据（包括分析数据）的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。可将多种市售的软件系统（如Matlab等）用于定量判读成像数据，并且这些软件系统中的任意一种均可应用于图像数据集。
传送系统：
具有植物旋转装置的传送系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多4株植物（每株最高高度为1.5m）装上汽车，该汽车在循环的传送系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位（成像分析仪和传送环线）的总占有面积为约5m×5m。
可扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。
照明：
任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择，可变化照明以引起转基因（如，绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP））的激发或者引起内源性（如叶绿素）荧光基团的激发。
基于三维成像的生物量估计：
为了更好地估计生物量，应该从至少三个轴（例如顶部视图和两个侧面（侧面1和侧面2）视图）获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景（盆和花粉控制袋（如果适用的话））分离。可通过如下计算评估植物的体积：
在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该体系中，任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值（正-较大和负-较小两者）。大小（如面积）的任意单位可通过将物理参照加至成像过程而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中都包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积单位，例如平方厘米（cm2）。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度的盆足可用作物理参照。
颜色分类：
成像技术还可用于确定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其它图像分析软件系统，可以通过多种计算方法确定颜色分类。
对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方案，包括绿色的两种或三种色调，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂泊（在这些条件出现时）的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色（例如盆和土壤颜色），并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变（如季节差异）。
除了其在测定植物的大小、生长中的有效性，颜色分类还可以用于评估其它产量构成性状。对于这些其它产量构成性状，可以使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度（staygreen）”的性状（已经将其与产量的提高相关联）可以通过颜色分类来评估，该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调（其指示老化的组织）相分离。通过将这种颜色分类应用于在T0或T1植物生活周期末获取的图像，可以鉴定绿色的量相对于黄色和棕色（例如，可以表示为绿色/黄色比率）提高的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可以被鉴定为携带影响这种重要农学特性的转基因。
熟练的植物学家将认识到可以指示植物健康或应激反应的其它植物颜色（花青素）的出现，以及认识到其它颜色分类方案可以提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。
植物结构分析：
改变植物结构参数的转基因也可用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可以如下用于确定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何结构，并且随后，基于该图像，可以进行不同结构参数的参数化识别。改变（或者是单独地或者是组合地）任意这些结构参数的基因可以通过应用此前所述的统计方法鉴定。
花粉脱落日期：
花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可通过活性雄花第一次出现在植物上来确定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日期。
作为另外一种选择，花粉脱落日期和其它易于在视觉上检测到的植物属性（如授粉日期、第一穗丝日期）可以由负责进行植物看护的工作人员来记录。为了使数据完整性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可以将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操纵者变得舒适。
植物的取向：
以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的结构。也就是说，植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧（edgewise）图像之间的最大差别。将顶部图像用于确定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。
实例18
对GaspeFlint来源的玉米品系耐旱性的评价
可用以下方法筛选具有耐旱性的含候选基因的转基因GaspeFlint来源的玉米品系。
转基因玉米植物经受供水良好条件（对照）和干旱胁迫条件。在T1阶段或更晚的时期筛选转基因玉米植物。
就植物生长而言，土壤混合物由1/31/3SB300和1/3沙土构成。所有罐装满相同量的土壤±10克。手动浇水使得罐达到最多100%的罐体容量（“FC”）。使用20-10-20（氮-磷-钾）125ppm氮营养溶液将所有植物保持在60%FC。在整个实验期间每张表监测pH每周至少三次。在种植后第13天开始（DAP），所述实验可分成两个处理组，良好灌溉组和缺水组。将包括缺水处理组在内的所有植物保持在40%FC，而将良好灌溉处理组的植物保持在80%FC。缺水植物在慢性干旱胁迫条件下（40%FC）生长10天。在慢性胁迫期间所有植物每日拍照。在慢性干旱末期（22DAP）采集植物样品用于代谢特征分析。在慢性胁迫结束时给所有植物拍照并测量叶绿素荧光。缺水植物经过重度干旱胁迫期及随后的恢复期，分别为23-31DAP和32-34DAP。在重度干旱胁迫期间，限制水和营养物质直至植物达到8%FC。在重度胁迫期和回复期结束时给所有植物再次拍照并测量叶绿素荧光。计算更大的Studentt检验的概率用于比较每个转基因平均值与合适的无效转基因平均值（分离无效转基因或构建体无效转基因）。使用最小值（P<t）0.1作为具有统计意义上显著性的结果的临界值。
实例19A
具有拟南芥前导基因的玉米品系的产量分析
可通过直接转化或者从单独转化的品系基因掺入而将含有证实的拟南芥属基因的重组DNA构建体导入玉米优良自交系内。
自交或杂交的转基因植物可通过更严苛的大田试验来研究在水限制条件下和水充分条件下的产量提高和/或稳定性。
可对产量进行后续分析以测定含有验证过的拟南芥属前导基因的植物在与不含有验证过的拟南芥属前导基因的对照植物比较时，在水限制条件下是否具有产量的改善。具体地讲，可在包含验证过的拟南芥属前导基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加干旱条件。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物具有相对于对照植物更少的产量损失，例如至少25%、20%、15%、10%或5%更少的产量损失。
可使用以上方法选择在水限制条件下和/或水充分条件下，与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有提高产量的转基因植物。
实例19B
用编码拟南芥前导基因At1g68490的PHP31378转化的玉米品系的产量 分析
如实例14A和14B所述，将存在于共整合载体PHP31378中的DTP6多肽导入来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系中。
于2009年在Johnston，IA（“JH”）、York，NE（“YK”）和Woodland，CA（“WO”）对七个转基因事件进行了大田试验。在Woodland，CA位置，在开花期（“FS”；开花胁迫）和籽粒灌浆期（“GFS”；籽粒灌浆胁迫）实施干旱条件。在籽粒灌浆期间在JH位置提供足量水，在YK位置经历轻度干旱。
于2010年在4个位置收集产量数据（York、Johnston、Woodland-2组水处理），每个位置具有4-8组重复。
所述7个转基因事件在2009年和2010年的产量数据（蒲式耳/英亩；bu/ac）与批量空对照（BN）一起示出于表6和表7之中。通过ASREML（VSNInternationalLtd）进行产量分析，数值为BLUP（最佳线性无偏预估）（Cullis，B.R等人，（1998）Biometrics54：1-18、Gilmour，A.R.等人，（2009）ASRemlUserGuide3.0，Gilmour，A.R.等人，（1995）Biometrics51：1440-50）。
为分析该产量数据，使用混合模型框架以实施单一和多个位置分析。
在单一位置分析中将构建体的主要效果考虑为固定效果。（然而，构建体的效果在其它环境下可考虑成为随机的）。将事件的主要效果考虑成为随机的。诸如重复组和重复组中的incblock（不完全组块设计）这样的组块因子被考虑成为随机的。
存在3个空间效果组分（x_adj、y_adj和自回归校正AR1*AR1）以用于消除大田的空间差异所导致的噪音。
在多位置分析中，将loc_id、构建体及其相互作用的主要效果在本分析中考虑为固定效果。将事件及其与loc_id的相互作用的主要效果考虑成为随机效果。诸如重复组和重复组中的incblock这样的组块因子被考虑成为随机的。
在表5中我们对每一年均实施single_loc分析并且在所述两年间实施across_loc（末栏）并且对各事件计算blup（最佳线性无偏预估）。使用0.1的p值在双尾检验中进行所述事件和BN之间的显著性检验，并将结果示出于表6和表7中。显著性值（在双尾检验中具有低于或等于0.1的p值）以黑体示出。
如表6和表7所示出，在2009年的四处位置中的三处以及在2010年的一处位置，所述转基因对产量的效果对于至少三个事件而言是显著的。这四处位置的产量水平为55至170bu/英亩，并且由于转基因而导致的产量优势为4至10bu/英亩。在跨位置分析中，所述转基因的总体效果是正面的，其中两个事件达到了统计上的显著性。JH和York在2010年是潮湿环境，并且所述基因对于产量无显著性效果。在植物或穗高或花期中未观察到显著性差异。在收割时具有略微较高的谷粒湿度的倾向；这一差异在York处对于1个事件是显著的，在Johnston处对于2个事件是显著的。数据示于表7中。显著性值（在双尾检验中具有低于或等于0.1的p值）以黑体示出。
表6
用PHP31378转化的玉米的2009年大田试验
*DNA“1”为BN_YSPNTIBA；DNA“2”为BN_YSPNTIDA；DNA“3”为PHP31378.
**Comp_Factor_Entry_Type
表7
用PHP31378转化的玉米的2010年大田试验
*DNA“1”为BN_YSPNTIBA；DNA“2”为BN_YSPNTIDA；DNA“3”为PHP31378.
**Comp_Factor_Entry_Type
表8示出了来自以PHP31378转化的玉米的2009年大田试验的数据。WO_ASI一栏示出了在WO渐次胁迫处理中的抽丝延迟。根据与BN对照相比显著更低的ASI所显示，七个事件中的两个表现出正面效果。没有一个事件表现出负面效果。
表8
2009年大田试验-抽丝延迟的测量值
事件ID WO_ASI（GDU）
E7899.54.1.3 40
E7899.54.5.1 40
E7899.54.5.2 60
E7899.54.5.4 14*
E7899.54.6.3 27*
E7899.54.8.10 41
E7899.54.8.5 40
WT 50
BN 70
*在p<0.1下显著优于空组
实例20A
用于玉米转化的玉米DTP6多肽前导基因表达载体的制备
克隆cfp5n.pk061.k20、cie3s.pk008.j21、cfp7n.pk001.j9、cds3f.pk005.m8和my.cco1n.pk088.j17编码完整的DTP6多肽并且命名为Zm-DTP6-1、Zm-DTP6-2、Zm-DTP6-3、Zm-DTP6-4和Zm-DTP6-5（分别在SEQIDNO:19、21、23、25和27中给出）。可将包含这些序列的这些克隆的蛋白质编码区导入INVITROGENTM载体以产生入门克隆。
可使用INVITROGENTM 技术，用入门克隆和目的载体进行LR重组反应以产生前体质粒。所述前体质粒包含以下表达盒：
1.泛素启动子::moPAT::PinII终止子；表达用于在转化过程中的选择的PAT抗除草剂性基因的表达盒。
2.LTP2启动子::DS-RED2::PinII终止子；表达用于种子分选的DS-RED颜色标记基因的表达盒。
3.泛素启动子::Zm-DTP6-多肽::PinII终止子；过表达所关注基因（拟南芥DTP6多肽）的盒。
实例20B
使用农杆菌以玉米DTP6多肽前导基因对玉米的转化
使用如实例12和13所述的农杆菌介导转化，可将所述前体质粒中存在的玉米DTP6多肽表达盒导入玉米近交系或来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系。
可将所述前体质粒电穿孔进入农杆菌属LBA4404菌株中，其包含载体PHP10523（图7；SEQIDNO:7）以产生共整合载体。该共整合载体是通过所述2个质粒（前体质粒与PHP10523）的重组（通过各载体上包含的COS重组位点）而形成。共整合载体除包含农杆菌属菌株和农杆菌介导转化所需的其它基因（TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORIV、VIRC1、VIRC2、VIRG、VIRB）之外，还包含同上（实例20A）的3个表达盒。
实例21
用于转化进入GaspeFlint来源的玉米品系的玉米表达质粒的制备
克隆cfp5n.pk061.k20、cie3s.pk008.j21、cfp7n.pk001.j9、cds3f.pk005.m8和my.cco1n.pk088.j17编码完整的DTP6多肽并且分别命名为Zm-DTP6-1、Zm-DTP6-2、Zm-DTP6-3、Zm-DTP6-4和Zm-DTP6-5（分别在SEQIDNO:19、21、23、25和27中给出）。
通过使用实例9中描述的INVITROGENTM 重组技术将编码玉米Zm-DTP6-1、Zm-DTP6-2和Zm-DTP6-3多肽同源物的克隆定向地克隆进入目的载体PHP23236（SEQIDNO:6；图6）以产生表6中列出的表达载体。各表达载体包含在UBI启动子控制下的受关注cDNA，并且是T-DNA二元载体，用于通过如本文所述实例所述（但不限于）的农杆菌属介导转化到玉米中。
表9
玉米DTP6多肽表达载体
实例22
用经验证的前导基因的大豆同源物对大豆进行的转化和评价
根据同源性搜索已经鉴定出经验证的拟南芥前导基因的多种候选大豆同源物。克隆sdp4c.pk004.f4和sfp1n.pk034.b12编码完整的DTP6多肽并且分别命名为Gm-DTP6-1和Gm-DTP6-2（在SEQIDNO:33和35中示出）。这些克隆还可针对其在大豆中提高的耐旱性的能力进行估测。载体构建、植物转化和表型分析可类似于上文实例所述的规程。
实例23
用经验证的前导基因的玉米和大豆同源物对拟南芥属进行的转化
验证过的拟南芥属前导基因的大豆和玉米同源物能够在35S启动子的控制下被转化到拟南芥属中并评价它们提高拟南芥属耐旱性的能力。载体构建、植物转化和表型分析可类似于上文实例所述的规程。
实例24
DTP6蛋白的HMM特征谱的创建
特异于DTP6的特征性HMM
特征性HMM是多序列比对（甚至单一序列）的统计模型。它们捕获关于比对中的每一列的保守程度以及最可能存在的残基的位点特异性信息。
描述：
（使用特征性隐马尔可夫模型进行的生物序列分析）用于针对蛋白质序列的同源性搜索序列数据库并且产生蛋白质序列比对。可用于以单一查询序列搜索序列数据库，但其在所述查询序列是某一序列家族的多序列比对的时候尤为有效。产生了所述查询序列的特征谱，其对于替换、插入和缺失设定了位点特异性计分系统。特征谱是概率性模型，称为“特征性隐马尔可夫模型”（特征性HMM）（Krogh等人，1994，J.Mol.Biol.，235：1501-1531；Eddy，1998，Curr.Opin.Struct.Biol.，6：361-365.；Durbin等人，ProbabilisticModelsofProteinsandNucleicAcids.CambridgeUniversityPress，CambridgeUK.1998，Eddy，SeanR.，2010年3月，HMMERUser’sGuideVersion3.0，HowardHughesMedicalInstitute，JaneliaFarmResearchCampus，AshburnVA，USA；美国专利公开US20100293118）。与BLAST、FASTA以及基于较早的计分方法的其它序列比对和数据库搜索工具相比，目的在于明显更为精确地和更具能力地检测偏远的同源物，这是由于其所基于的概率模型所导致的。
用于创建特异于DTP6基因家族的特征性HMM的方法
步骤1：DTP6同源物的鉴定：
通过递交AtDTP6的蛋白质序列使用PSI-BLAST（Altschul等人，1997；NucleicAcidsResearch25：3389-3402）进行查询而在自制蛋白质序列数据库中鉴定出AtDTP6的同源物，所述蛋白质序列数据库通过编辑来自Unipot和得自NCBI的多种植物基因组的翻译ORF而产生。得自该搜索的命中序列进行进一步筛选来根据在PSI-BLAST的第三次迭代中低于0.001的E值（Altschul等人，1997；NucleicAcidsResearch25：3389-3402）截取值并且以显著性范围匹配所述查询序列而鉴定同源物。使用软件MUSCLE（Edgar，RobertC.（2004），NucleicAcidsResearch19；32（5）：1792-7）比对由此而鉴定出的同源物。所鉴定出的全部DTP6同源物均对应于植物物种并且在其它的生物中未鉴定出显著性的同源物，这提示DTP6为植物特异性基因家族。
步骤2：创建DTP6的特征性HMM
我们已经使用3.0的HMMbuild组件来根据DTP6同源物的多序列比对（MSA）创建DTP6的特征性HMM。
步骤3：使用特征谱以搜索蛋白质数据库
以所创建的特征性HMM在步骤1中描述的蛋白质序列数据库中提交查询。所得的命中序列如步骤4中所述进行进一步检验。
步骤4：测定特征谱的特异性以鉴定DTP6相关的蛋白质序列
以低于0.001的E值在该HMM特征谱至少80%的长度上匹配DTP6的特征性HMM的全部蛋白质序列被认定是统计上显著的并且对应于基因家族。由于所获得的全部统计上显著的S蛋白质命中序列是DTP6基因家族的成员，因此这表明了本文所述的DTP6特征性HMM对于鉴定任何DTP6家族的成员均具有特异性。DTP6家族的HMM特征谱示出于图13A-13Y。
实例25
DTP6表达类物的鉴定
对玉米AtDTP6表达类物的鉴定：
通过搜索蛋白质数据库而鉴定AT-DTP6的蛋白质序列同源物（SEQIDNO:18），所述蛋白质数据库由来自多种生物（包括多种植物基因组，诸如拟南芥、稻、玉米和高粱）的序列组成。根据同源物之间的序列相似性而产生的系统发育树作为进化的框架用于交叠基因表达中的胁迫和激素依赖性变化。本分析中针对拟南芥和稻的基因表达数据获自于[NottinghamArabidopsisStockCentre’sMicroarraydatabase（NASCARRAYS）和GeneExpressionOmnibusdatabase（GEO）以及专有数据。玉米基因表达数据分析完全基于专有的基因表达数据。
多种同源物的胁迫相关基因表达变化的比较及其亚细胞定位将pco599449（SEQIDNO:74）鉴定为AT-DTP6的玉米表达类物。根据使用（TargetP软件；EmanuelssonO等人，（2000）JMolBio，7月21日；300（4）：1005-16）进行的计算预测，pco599449多肽（SEQIDNO:75）据提示定位于叶绿体中。基因表达分析显示了pco599449转录物冷处理下在芽（～6倍）和幼苗（～2倍）中的上调以及在干旱处理下在叶中的上调（～4倍）。这一基因上调表达特征类似于AT-DTP6，据发现其也在冷处理下在芽中上调（～4倍）。据发现AT-DTP6也在干旱中（～2.0倍）和其它干旱相关条件诸如渗透性胁迫（～2倍）和热胁迫（～2.5倍）下上调。综合亚细胞定位以及在胁迫条件下的基因表达的相似性，pco599449据预测为ATDTP6的表达类物表达类物近来在比较基因组组学中用于鉴定跨种属的功能同源物（Patel等人，2011，ExpressologIdentificationinPlantSpecies，PosterAbstractNo.209，第22版，InternationalConferenceonArabidopsisResearch，UniversityofWisconsin，Madison，Wisconcin，USA）。相关的生物信息学工具可获自UniversityofToronto，Canada的Bio-ArrayResourceforPlantBiology。
实例26
AT-DTP6多肽的叶绿体定位预测
通过使用TargetP软件（EmanuelssonO等人，（2000）JMolBio，Jul21；300（4）：1005-16）针对可能的叶绿体转运肽而分析AT-DTP6多肽的氨基酸序。通过TargetP软件根据切割位点预测的预测叶绿体转运肽的序列在SEQIDNO:90中给出并且所述预测成熟AT-DTP6多肽的序列在SEQIDNO:91中给出。
实例27
AT-DTP6多肽的百草枯耐受性分析
对Col-0和35S-DTP6转基因T2种子进行消毒并且随后在4℃下层积4天。各18粒种子种植于1/2×MS培养基中，其补充以0.03μM的百草枯（图1）。在设置为22℃下16h的光照、150μE的光照强度和50%的相对湿度的箱内生长7天后，转基因品系具有更大和更绿的子叶。
在另一种实验设置中，我们将～50粒Col-0种子种植于1/2×MS培养基中（补充以0.03或0.06μM的百草枯）并且随后将五粒35S-DTP6T2种子置于相同的浅箱上。在生长箱中进行7天孵育之后，转基因植物与对照种子易于区分。在两种百草枯浓度下所述转基因幼苗均具有更大和更绿的子叶（由红色箭头标出）（图2）。
实例28A
三重胁迫分析
提供了生长于三种非生物胁迫的组合下的拟南芥植物。具体地讲，将植物生长于同时进行的干旱胁迫、热胁迫和高光照胁迫的条件下。随后可鉴定出具有阳性的生长和/或衰败参数的突变体。
材料：
过表达转基因的拟南芥品系以及它们的非转基因近属。
方法：
1期筛选：将种子浸没于水中并且在黑暗中在4℃下孵育3天。将冷刺激的种子品系以受控制的密度和间距种植于土壤中。具体地讲，以3×3的网格将9个植物生长于每个5.5英寸的方型罐中，每个浅箱8个罐。对于DTP6试验，一个浅箱由4个罐的转基因植物和4个罐的非转基因近属组成。由此而将36株突变体直接与36株野生型植物进行比较。
将植物在非胁迫的条件下生长14天，所述条件涉及：（a）土壤：Metromix360；（b）肥料：Osmocote和Peter’s；（c）光照方案：16小时光照/8小时黑暗；（d）光照强度：150μE；（e）温度方案：日间22C/夜间20C；和（f）湿度：50%相对湿度。在非胁迫生长的最后一天，对浅箱给以100%土壤含水量并且进行照相并且使用LemnaTecScanalyzer进行分析以获得总绿色面积像素数。
随后将所述浅箱转移至“三重胁迫”条件下，其由以下组成：（a）无另行浇灌，（b）光照方案：16小时光照/8小时黑暗；（c）光照强度：350μE（d）温度方案：日间22C，在该日中期进行4小时的32C间歇/夜间20C；和（f）湿度：50%相对湿度。在这些条件下，对浅箱进行14天的每日照相。
通过LemnaTec数据，测定了生长面积、生长斜率和最大日面积、衰败面积和衰败斜率的p值。对于一种或多种所述参数具有<0.05的百草枯值的品系被认为是阳性。
实例28B
以AT-DTP6蛋白进行的三重胁迫分析
基本上如实例28A描述的三重胁迫分析过表达DTP6的植物进行分析。下文是与非转基因近属相比35S::DTP6在五种三重胁迫参数上的表现。
表10
35S::DTP6品系的表现
参数 值
gro_comp -
gro_area_p 0.095
slope_gro_comp -
gro_slope_p 0.086
max_comp -
max_p 0.381
decay_comp +
decay_area_p 0.225
slope_dec_comp +
decay_slope_p 0031
“+”的比较（“Comp”）数值显示，与非转基因近属相比35S::DTP6品系具有阳性数值。所述p值还相关于35S::DTP6与对照近属之间的差异。这表明DTP6的过表达降低了叶面积损失的斜率，p值为0.03。

Claims (9)

1.提高植物耐旱性的方法，包括：
(a)将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQIDNO:18中给出的氨基酸序列代表；
(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)获得来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性。
2.评价植物耐旱性的方法，包括：
(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQIDNO:18中给出的氨基酸序列代表；
(b)获得来源于(a)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)评价(b)的子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。
3.测定植物产量、生物量、或两者的改变的方法，包括：
(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQIDNO:18中给出的氨基酸序列代表；
(b)获得来源于(a)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)测定(b)的子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出产量、生物量或两者的改变。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述测定步骤(c)包括在水限制条件下，测定(b)的子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出产量、生物量或两者的改变。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述改变为提高。
6.提高植物三重胁迫耐受性的方法，包括：
(a)将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQIDNO:18中给出的氨基酸序列代表；
(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)获得来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对三重胁迫表现出提高的耐受性。
7.提高植物百草枯耐受性的方法，包括：
(a)将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQIDNO:18中给出的氨基酸序列代表；
(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)获得来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对百草枯表现出提高的耐受性。
8.提高植物胁迫耐受性的方法，其中所述胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫，所述方法包括：
(a)将重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽由SEQIDNO:18中给出的氨基酸序列代表；
(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)获得来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时对至少一种选自干旱胁迫、三重胁迫和百草枯胁迫的胁迫表现出提高的耐受性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
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