CN106164273B - 耐旱性植物以及涉及编码dn-dtp1多肽的基因的相关组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分离的多核苷酸和多肽、以及可用于赋予耐旱性的重组DNA构建体；包含这些重组DNA构建体的组合物(诸如植物或种子)；以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接到在植物中有功能的启动子的多核苷酸，所述多核苷酸编码DN‑DTP1多肽。

Description

耐旱性植物以及涉及编码DN-DTP1多肽的基因的相关组合物 和方法

技术领域

本领域涉及植物育种和遗传学，具体地，涉及可用于植物中以赋予耐旱性的重组DNA构建体。

背景技术

对植物的胁迫可由生物和非生物试剂造成。例如，胁迫的生物原因包括病原体感染、昆虫摄食、以及被另一种植物诸如槲寄生寄生。非生物胁迫包括例如过量或不足的可用水、温度极限、以及合成化学品诸如除草剂。

非生物胁迫是世界范围内作物减产的主要原因，造成主要作物的平均收率损失大于50％(Boyer，J.S.(1982)Science 218：443-448；Bray，E.A.等人(2000)In Biochemistryand Molecular Biology of Plants，Buchannan编辑，B.B.等人，Amer.Soc.Plant Biol.，第1158-1249页)。在各种非生物胁迫中，干旱是在世界范围内限制作物产量的主要因素，并且在各种发育阶段期间，将植物暴露于水分限制环境中似乎会激活各种生理和发育变化。尽管已出版了许多关于非生物胁迫应答的分子机制和干旱胁迫耐受性的基因调控网络的综述(Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.(2006)Curr.Opin.Plant Biol.9：189-195；Wang，W.等人，(2003)Planta 218：1-14；Vinocur，B.和Altman，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.(2004)J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等人(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6：410-417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(2005)Trends Plant Sci.10：88-94)，但是理解干旱胁迫感知、传导和耐受性的基本生物化学和分子机制也是生物学上的一个主要挑战。

非生物胁迫应答的分子方面的早期工作通过差异和/或差减分析(Bray，E.A.(1993)Plant Physiol.103：1035-1040；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)Plant Physiol.115：327-334；Zhu，J.-K.等人(1997)Crit.Rev.Plant Sci.16：253-277；Thomashow，M.F.(1999)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.50：571-599)；和其它方法实现，包括候选基因的选择以及这一基因或其活性产物在胁迫下的表达分析，或通过在良好限定的应激物系统中的功能性互补实现(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)PhysiologiaPlantarum 112：152-166)。另外，已使用涉及鉴定和分离调控基因突变的正向和反向遗传学研究为所观察到的在胁迫下基因表达的变化提供证据(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)Physiologia Plantarum 112：152-166)。

激活标签可用于鉴定能够影响性状的基因，这一方法已经用于拟南芥(模式植物物种)中(Weigel，D.等人(2000)Plant Physiol.122：1003-1013)。转录增强子元件的插入可主要激活和/或提高邻近内源性基因的表达，因此该方法可以用于选择涉及农学上重要的表型(包括非生物胁迫耐受性，诸如改善的耐旱性)的基因。

发明内容

本公开涵盖以下实施方案：

1.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：(a)编码包含与SEQ ID NO：4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；或(b)SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO：3的核苷酸序列；或(d)与(a)或(b)或(c)的全长核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；或(e)(a)或(b)或(c)或(d)的核苷酸序列的全长互补序列，其中全长互补序列和该核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补，多核苷酸在植物中的过表达增强耐旱性。分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽。核苷酸序列可包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

2.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个异源调控序列的根据实施方案1所述的分离的多核苷酸。

3.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ IDNO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的DN-DTP1(表达蛋白)多肽，并且其中与对照植物相比，所述转基因植物表现出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性。

4.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中与对照植物相比，所述植物表现出至少一个农学特性的改变。任选地，在水分限制条件下，与对照植物相比，该植物表现出所述至少一个农学特性的所述改变。至少一个农学性状可为谷粒收率或生物质，并且改变可为增加。

5.一种根据实施方案3或4所述的转基因植物，其中所述植物选自：稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

6.根据实施方案3或4或5所述的转基因植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：4相比具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中与对照植物相比，由所述种子产生的转基因植物表现出增加的耐旱性，或至少一个其它农学特性的改变，或两者。至少一个其它农学性状可为谷粒收率、生物质、或组合，并且改变可为增加。

7.一种增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)向可再生的植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由步骤(a)之后的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)获得来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且与对照植物相比表现出增加的耐旱性。

8.一种改善耐旱性的方法，所述方法还包括：(a)将根据实施方案3或4或5所述的植物与第二植物杂交以产生子代种子；(b)收获并种植所述子代种子以产生后续世代的至少一个子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含根据实施方案3所述的重组DNA构建体；(c)将所述子代植物与所述第二植物杂交以产生至少一个回交子代种子；以及任选地；(d)在附加的世代重复步骤(b)和(c)以产生与所述第二植物相比具有改善的耐旱性的植物。

9.一种评估植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)与对照植物相比，评估子代植物的耐旱性。

10.一种确定植物中至少一个农学特性的改变的方法，所述方法包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ IDNO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)与对照植物相比，确定子代植物是否表现出至少一个农学特性的改变。任选地，所述确定步骤(c)包括确定在水分限制条件下，与对照植物相比，转基因植物是否表现出至少一个农学特性的改变。至少一个农学性状可为谷粒收率、生物质、或组合，并且改变可为增加。

11.根据实施方案7-10中任一项所述的方法，其中所述植物选自：稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

12.一种包含增强内源性多核苷酸的表达的重组转录激活元件的稻转基因植物，其中所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：4具有90％同一性的氨基酸序列。

13.一种增加田间稻植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)在稻植物中表达编码稻DN-DTP1多肽的重组核酸；(b)使稻植物在田间在作物生长条件下生长，其中稻植物暴露于干旱条件；以及(c)增加稻植物的耐旱性。

14.一种增加田间稻植物的收率的方法，所述方法包括(a)在稻植物中表达编码稻DN-DTP1多肽的重组核酸；(b)使稻植物在田间在作物生长条件下生长，其中稻植物暴露于干旱条件；以及(c)增加稻植物的谷粒收率。

15.一种鉴定导致OsDN-DTP1多肽的表达或活性增加的OsDN-DTP1基因的等位基因的方法，所述方法包括以下步骤：(a)对突变型植株群体进行遗传筛选；(b)鉴定表现出OsDN-DTP1多肽或其同源物的表达或活性增加的一个或多个突变型植株；以及(c)从突变型植株鉴定OsDN-DTP1等位基因或其同源物。

16.一种筛选OsDN-DTP1的等位基因的方法，所述方法包括(a)利用靶向OsDN-DTP1基因的寡核苷酸引物对从一个或多个稻群体中分离的一个或多个基因组DNA片段进行测序；(b)分析OsDN-DTP1基因的调控或编码区中DNA序列的差异；以及(c)将OsDN-DTP1的等位基因与增加的耐旱性或收率相关联。

17.一种稻转基因植物，所述稻转基因植物在其基因组中包含导致OsDN-DTP1多肽的表达增加的重组构建体，其中所述多肽包含SEQ ID NO：4。

在另一个实施方案中，本公开涉及一种包含可操作地连接到至少一个调控序列的本公开的分离的多核苷酸中的任一个的重组DNA构建体，以及包含所述重组DNA构建体的细胞、植物、或种子。细胞可为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞，例如细菌细胞。

附图和序列表简述

由以下的“具体实施方式”及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更全面地理解本公开。

图1提供通过实时PCR分析获得的独立转基因稻事件的叶中OsDN-DTPl转基因的相对表达水平。在ZH11-TC中的基础表达水平设为1.00，在OsDN-DTP1事件中的表达水平示出为与ZH11-TC相比的成倍增加。

图2示出在生长季节海南田间不同发育阶段的土壤体积含水量的变化。

图3提供表明在CaMV 35S启动子下稻OsDN-DTP1基因在拟南芥中的过表达(事件AtDP0006.06、AtDP0006.09、AtDP0006.11)可显著增加耐旱性的照片和附图。A.转基因拟南芥中的OsDN-DTP1基因的半定量PCR分析；B.复水后第3天的存活率；以及C.在复水后第3天获得的照片。WT，野生型Columbia；VC，空载体DP0009转化体。

表1序列表中提供的核苷酸和氨基酸序列的SEQ ID NO

表2.T₁世代AH00838植株在温室条件下的耐旱性测定

表3.T₂世代AH00838植株在温室条件下的耐旱性测定

表4.T₂世代OsDN-DTP1稻植株在田间干旱条件下的谷粒收率测定

表5.T₂世代OsDN-DTP1转基因稻植株在转基因事件水平上(第1个实验)的百草枯耐受性测定

表6.T₂世代OsDN-DTP1转基因稻植株在转基因事件水平上(第2个实验)的百草枯耐受性测定

表1.序列表中提供的核苷酸和氨基酸序列的SEQ ID NO

序列表包含核苷酸序列的单字母密码和氨基酸序列的三字母密码，如根据Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中所述的IUPAC-IUBMB标准所定义的，所述文献通过引用并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。

具体实施方式

本文列出的每个参考文献的公开内容据此全文以引用方式并入。

如本文中和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/种”和“所述”包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如，提及“植物”包括多个这种植物；提及“细胞”包括一个或多个细胞以及本领域技术人员知道的其等同物，以此类推。

如本文所用：

术语“OsDN-DTP1”是指赋予耐旱性和/或百草枯耐受性表型并且由稻基因座Os04g0208800编码的稻蛋白。术语“DTP”和“耐旱性表型”在本文可互换使用。“DTP1多肽”是指具有耐旱性表型的蛋白质并且在本文指OsDN-DTP1多肽和来自其它生物体的其同源物。

OsDN-DTP1多肽(SEQ ID NO：4)由稻基因座Os04g0208800处的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)编码。此蛋白不具有任何先前指定的功能或注释。

术语“单子叶植物(monocot)”和“单子叶的植物(monocotyledonous plant)”在本文可互换使用。本公开的单子叶植物包括禾本科植物。

术语“双子叶植物(dicot)”和“双子叶的植物(dicotyledonous plant)”在本文可互换使用。本公开的双子叶植物包括以下科：十字花科、豆科和茄科。

术语“全长互补序列(full complement)”和“全长互补序列(full-lengthcomplement)”在本文可互换使用，并且是指给定核苷酸序列的互补序列，其中互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。

“表达序列标签”(“EST”)是来源于cDNA文库的DNA序列并且因此代表已转录的序列。EST通常通过cDNA插入片段的单程测序(single sequencing pass)获得。将整个cDNA插入片段的序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群(Contig)”序列是由可选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两种或更多种序列装配成的序列。编码整个或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)并且可源自FIS或重叠群。

术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。

“农学特性”是可测量参数，包括但不限于绿度、谷粒收率、生长速率、总生物质或累积速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、谷粒收率、总植株氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植株游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植株蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐旱性、氮吸收、根倒伏、收获指数、茎杆倒伏、植株高度、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序大小、早期幼苗活力以及低温胁迫下的出苗情况。

增加的生物质可测量为例如与对照植物相比植株高度、植株总叶片面积、植株鲜重、植株干重或植株谷粒收率的增加。

增加植株的生物质或大小的能力将具有若干重要的商业应用。作物栽培品种可发育以产生更高收率的待用于食物、饲料、纤维和/或生物燃料的植物的营养部分。

增大的叶尺寸可具有特别的意义。增加的叶生物质可以用于增加植物衍生的药用或工业产品的生产。增加的分檗数可具有特别的意义并且可用于增加收率。总植株光合作用的增加通常通过增加植株的叶片面积来实现。另外的光合作用能力可用于增加来源于特定植物组织的收率，包括叶、根、果实或种子，或允许植株在减小的光强度或在高光强度下生长。

另一种组织诸如根组织的生物质的改变可用于改善植株在苛刻环境条件(包括干旱或营养缺乏)下生长的能力，因为较大的根可更好地接触或吸收水或营养物质。

对于一些观赏植物，提供较大的品种的能力将为高度期望的。对于许多植物，包括结果子的树、用于木材生产的树、或充当观察或风遮挡物的树和灌木，增加的高度提供改善的有益效果，诸如以更大的收率或改善的遮挡的形式。

“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。

“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于度量其中已针对目的基因通过诸如转化实现了遗传改变的主题植物或植物细胞的表型变化的参考点，并且已被影响。主题植物或植物细胞可从作了如此改变的植物或细胞遗传而来，且将包含该改变。

对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传改变的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传改变会得到主题植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对目的性状不具有已知效果的构建体，诸如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为主题植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与主题植物或植物细胞相同但不暴露于会诱导目的基因的表达的条件或刺激因素的植物或植物细胞；或者(e)处于目的基因不被表达的条件下的主题植物或植物细胞本身。

在本公开中，WT、ZH11-TC、VC和CK指示对照植物。WT表示野生型稻或拟南芥植株，ZH11-TC表示从组织培养的中花11产生的稻植株，VC表示用DP0005或DP0009的空载体转化的植株，并且CK表示分离的无效植株。

“基因组”应用于植物细胞时，不仅涵盖细胞核内存在的染色体DNA，而且涵盖细胞的亚细胞组分(例如线粒体、质体)内存在的细胞器DNA。

“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。

“子代”包含植物的任何后续世代。

“转基因植物”包括对在其基因组内包含异源多核苷酸的植物的标引。例如，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独地或者作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。T₀植株直接从转化和再生过程中回收。T₀植株的子代称为T₁(第一代子代)、T₂(第二代子代)等。

与序列有关的“异源”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用并且是指单链或者双链的RNA和/或DNA的聚合物，其任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。-核苷酸(通常以其5′-单磷酸盐形式存在)通过如下的单字母代码指代：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，并且“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，分别对应RNA或DNA；“U”表示尿苷酸；“T”表示脱氧胸苷酸；“R”表示嘌呤(A或G)；“Y”表示嘧啶(C或T)；“K”表示G或T；“H”表示A或C或T；“I”表示肌苷；并且“N”表示任一核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可以包括如下修饰，包括但不限于：糖基化、脂质连接和硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指没有内含子且可被细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补且用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的，或者可用DNA聚合酶I从Klenow片段转化成双链形式。

“成熟”蛋白是指经翻译后加工的多肽；即，初级翻译产物中存在的任何前肽或原肽被移除。

“前体”蛋白是指mRNA的初级翻译产物；即，前肽和原肽仍然存在。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”是指这样的物质，诸如核酸分子和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常与其相伴随或相互作用的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组的”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸区段来实现的两个原本分离的序列区段的人工组合。“重组的”也包括指涉已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源自经过这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖天然发生的事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，所述天然发生的事件诸如不经蓄意人为干预而发生的那些事件。

“重组DNA构建体”是指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”在本文可互换使用。

“调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)并且影响相关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子、以及聚腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。

“启动子”是指能够控制另一核酸片段的转录的核酸片段。

“在植物中有功能的启动子”是指能够控制植物细胞中的基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可指主要但未必专门在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞或细胞类型中表达的启动子。

“发育调控的启动子”是指其活性由发育事件确定的启动子。

“可操作地连接”是指核酸片段联结成单一片段，使得一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段可操作地连接。

“表达”是指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(例如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

在将核酸片段(例如，重组DNA构建体)插入细胞中的语境中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

“转化的细胞”是任何其中已引入了核酸片段(例如重组DNA构建体)的细胞。

本文所用的“转化”是指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”是指核酸片段引入到宿主生物的基因组中而得到遗传学上稳定的遗传。一旦稳定转化，该核酸片段就稳定整合在该宿主生物及任何后续世代的基因组中。

“瞬时转化”是指核酸片段引入到宿主生物的细胞核或者含DNA的细胞器中而得到没有遗传学上稳定遗传的基因表达。

“等位基因”是基因占据染色体上给定基因座的两种或更多种另选形式之一。当二倍体植物中一对同源染色体上的给定基因座处存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上的给定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果在二倍体植物中一对同源染色体中的仅一条染色体上存在转基因，则该植物在该基因座处是半合的。

“叶绿体转运肽”是与蛋白质一起翻译并且将该蛋白质引导至叶绿体或其中制备该蛋白质的细胞中存在的其它质体类型的氨基酸序列。“叶绿体转运序列”是指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是与蛋白质一起翻译并且将该蛋白质引导至分泌系统的氨基酸序列(Chrispeels.(1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42：21-53)。如果蛋白质将被引导至液泡，那么还可添加液泡靶向信号(出处同上)，或者如果引导至内质网，那么可添加内质网滞留信号(出处同上)。如果蛋白质将被引导至细胞核，那么应去除任何存在的信号肽并且相反地包括核定位信号(Raikhel.(1992)Plant Phys.100：1627-1632)。“线粒体信号肽”是将前体蛋白引导到线粒体中的氨基酸序列(Zhang和Glaser.(2002)Trends Plant Sci 7：14-21)。

确定各种多核苷酸和多肽序列的关系的方法是已知的。如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的限定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；诸如全长cDNA或基因序列的区段，或者可以是完全的cDNA或基因序列。如本文所用，“比较窗口”是指多核苷酸或多肽序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续核苷酸或氨基酸，并且任选地可为30、40、50、100个或者更长。本领域技术人员应当理解，为避免由于在序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

任何两条序列之间的序列同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。用于序列比较的此类数学算法的示例包括Myers和Miller.(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch.(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部搜索比对方法；Karlin和Altschul.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如Karlin和Altschul.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中所改进的。

可利用这些数学算法的计算机执行进行序列的比较以确定序列同一性。此类执行包括但不限于：PC/Gene程序(可购自Intelligenetics，Mountain View，California)中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10(可购自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；以及

生物信息学计算软件包(

Inc.，Madison，WI)的

程序。

使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins等人(1988)Gene 73：237-244；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-10890；Huang等人(1992)CABIOS 8：155-165and Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与编码本公开蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTN程序、score(得分)＝50、wordlength(字长)＝3来进行，以获得与本公开的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述利用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。另选地，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可用于执行检测分子之间远源关系的迭代搜索(Altschul等人(1997)，出处同上)。当利用BLAST时，可使用Gapped BLAST、PSI-BLAST以及相应程序的默认参数(例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)(美国政府的国家卫生研究院(National Institutes of Health)的国家医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information))。比对可以通过手动检测进行。

配对序列同一性/相似性值可使用GAP版本10利用以下参数获得：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵；以及它们的任何等同程序。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两条所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的对应的比对，产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。

GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对使匹配数最大并使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它使得可以提供以匹配碱基为单位的空位形成罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位形成罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG WisconsinGenetics Software Package的版本10中的默认空位形成罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位形成罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位形成罚分和空位延伸罚分可以以选自0至200的整数来表示。因此，例如，空位形成罚分和空位延伸罚分可为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或更大。

GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其它成员不具有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因素：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了将序列进行比对而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短片段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似的符号的百分比。将相应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

除非另行指出，本文提供的序列的多重比对使用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp.(1989)CABIOS.5：151-153)，利用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行。用于使用Clustal V方法进行氨基酸序列的逐对比对和同一性百分比计算的默认参数是KTUPLE＝1、空位罚分＝3，窗口＝5以及对角线保存(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5，窗口＝4，对角线保存＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序上的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“趋异度”值。除非另行指出，本文提供并受权利要求书保护的同一性百分比和趋异度以此方式计算。

如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的情形中是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分比针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调序列同一性百分比以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于作出这个调整的手段是本领域技术人员熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的得分。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Califomia)中所执行那样进行计算。

如本文所用，“序列同一性百分比”通过以下方式计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且在如下文献中更全面地描述：Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文“Sambrook”)。

实施方案包括分离的多核苷酸和多肽，以及可用于赋予耐旱性的重组DNA构建体；包含这些重组DNA构建体的组合物(诸如植物或种子)；以及利用这些重组DNA构建体的方法。

分离的多核苷酸和多肽：

本公开包括以下分离的多核苷酸和多肽：

一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列，其中(i)的核酸序列和全长互补序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。上述分离的多核苷酸中的任一个可用于本公开的任何重组DNA构建体。编码的多肽的过表达增加植物耐旱性和/或百草枯耐受性活性。

一种具有氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。多肽优选为DN-DTP1多肽。多肽的过表达增加植物耐旱性和/或百草枯耐受性活性。

一种分离的多核苷酸，其包含(i)基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：3具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。上述分离的多核苷酸中的任一个可用于本公开的任何重组DNA构建体。分离的多核苷酸优选地编码DN-DTP1多肽。这种多肽的过表达改善植物耐旱性和/或百草枯耐受性活性。

重组DNA构建体：

在一个方面，本公开包括重组DNA构建体。

在一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)编码基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：3具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DN-DTP1多肽。此多肽具有耐旱性和/或百草枯耐受性活性，并且可来自例如水稻、澳洲野生稻(Oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(Oryza barthii)、光稃稻(Oryza glaberrima)(非洲稻)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄野生稻(Oryza longistaminata)、南方野生稻(Oryzameridionalis)、药用稻(Oryza officinalis)、斑点野生稻(Oryza punctata)、鬼仔稻(Oryza rufipogon)(普通野生稻或红稻)、尼伐拉稻(Oryza nivara)(印度野生稻)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycinetabacina)、野大豆(Glycine soja)或短绒野大豆(Glycine tomentella)。

应当理解，本领域的技术人员将会知道，本公开不仅仅涵盖特定的示例性序列。在给定位点产生化学等同的氨基酸，但不影响编码多肽的功能特性的核酸片段变化是本领域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性较小的残基诸如甘氨酸，或疏水性较大的残基诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子置换。类似地，还可预期一个带负电的残基置换为另一个，诸如天冬氨酸置换为谷氨酸，或一个带正电的残基置换为另一个，诸如赖氨酸置换为精氨酸的变化产生功能等同的产物。还可预期使多肽分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化不会改变多肽的活性。每个所推荐的改变均在本领域的常规技术内，正如确定编码产物的生物活性的保留。

调控序列：

本公开的重组DNA构建体可包含至少一个调控序列。

调控序列可为启动子。

多种启动子可用于本公开的重组DNA构建体。启动子可基于期望的结果进行选择，并且可包括组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或其它用于在宿主生物中的表达的启动子。

使得基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。

候选基因在35S或UBI启动子的控制下的高水平的组成型表达可具有多效作用，但是可估计在由组成型启动子驱动时候选基因的功效。组织特异性和/或胁迫诱导型启动子的使用可消除不期望的效果，但保持了增强耐旱性的能力。这种效应已经在拟南芥中观察到(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的Rsyn7启动子和其它组成型启动子的核心启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell 2：163-171)；遍在蛋白(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632以及Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026)，等等。其它组成型启动子包括例如以下美国专利中论述的那些：5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142、以及6,177,611。

在选择用于本公开的方法的启动子时，可希望使用组织特异性启动子或发育调控的启动子。

组织特异性启动子或发育调控的启动子是DNA序列，其选择性地调控DNA序列在植物的细胞/组织中，诸如在对于雄穗发育、种子形成、或两者至关重要的那些细胞/组织中的表达，并且通常将这种DNA序列的表达限于植物的感兴趣的发育期(例如雄穗发育或种子成熟)。使得期望的时间和空间表达的任何可鉴定的启动子可用于本公开的方法中。

许多叶优选的启动子在本领域中是已知的(Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.105：357-367；Yamamoto等人(1994)Plant CellPhysiol.35(5)：773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3：509-518；Orozco等人(1993)PlantMol.Biol.23(6)：1129-1138；以及Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590)。

为种子或胚特异性且可用于本公开的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg.(1989)Plant Cell 1：1079-1093)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人(1991)Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人(1990)Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人(1988)Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人(1988)EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：3320-3324)、植物凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等人(1987)EMBO J.6：3571-3577)、B-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等人(1988)EMBO J.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等人(1988)Plant Mol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等人(1987)EMBO J.6：3559-3564)。可操作地连接到嵌合基因构造中的异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时间和空间表达模式。此类示例包括：用以在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥2S种子贮藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人(1989)Bio/Technology 7：L929-932)、用以表达荧光素酶的菜豆凝集素和菜豆β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人(1989)PlantSci.63：47-57)、以及用以表达氯霉素乙酰转移酶的小麦麦谷蛋白启动子(Colot等人(1987)EMBO J 6：3559-3564)。

诱导型启动子响应于内源性或外源性刺激的存在，例如通过化学化合物(化学诱导剂)或响应于环境、激素、化学和/或发育信号选择性地表达可操作地连接的DNA序列。诱导型或调控型启动子包括例如，通过光、热、胁迫、洪涝或干旱、植物激素、创伤或化学品诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂调控的启动子。

在某些实施方案中使用的启动子包括以下：1)胁迫诱导型启动子RD29A(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-291)；2)胁迫诱导型启动子Rab17(Vilardell等人(1991)Plant Mol.Bio.17：985-993；Kamp Busk等人(1997)Plant J 11(6)：1285-1295)；3)大麦启动子B22E，其表达对于发育中的玉米谷粒的花梗是特异性的(“Primary Structureof a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers”.Klemsdal，S.S.等人(1991)Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16)；以及4)玉米启动子Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1，the maize homolog ofthe Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等人(1993)PlantCell 5(7)：729-737；“Structural characterization，chromosomal localization andphylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes frommaize”，Theissen等人(1995)Gene 156(2)：155-166；NCBIGenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后7至8天(“DAP”)检测到，并且指导在发育中的雌性花序的心皮中的表达，以及对于发育中的玉米谷粒的核具有特异性的Ciml。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天检测到。其它可用的启动子包括可来源于其表达与发育中的雌性小花母系相关的基因的任何启动子。

对于多核苷酸在发育中的种子组织中的表达，特别有意义的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期谷粒/胚启动子和晚期谷粒/胚启动子。授粉后谷粒发育大致分成三个主要阶段。谷粒生长的停滞期发生在授粉后约0至10-12天。在此期间，谷粒的质量不显著生长，而是发生将决定谷粒活力的重要事件(例如，建成细胞数目)。线性籽粒灌浆期(linear grain fill stage)起始于授粉后约10-12天并且持续至授粉后约40天。在谷粒发育的这一阶段，谷粒获得几乎所有其最终质量，并且产生了各种贮藏产物(即淀粉、蛋白质、油)。最后，成熟期发生于从授粉后约40天至收获。在谷粒发育的这一阶段，谷粒变得静止并且开始干燥，为发芽之前的长休眠期做准备。如本文所定义，“早期谷粒/胚启动子”是主要在发育的停滞期(即授粉后约0至约12天)期间驱动在发育中的种子中的表达的启动子。如本文所定义，“晚期谷粒/胚启动子”主要在授粉后约12天至成熟期间驱动在发育中的种子中的表达。在表达窗中可存在一些重叠。启动子的选择将取决于所用的ABA相关序列和期望的表型。

早期谷粒/胚启动子包括例如在特定组织中在授粉后5天具有活性的Ciml(WO 00/11177)，所述专利以引用方式并入本文。其它早期谷粒/胚启动子包括在授粉后7-10天具有活性的种子优选的启动子endl和在授粉后9-14天在整个谷粒中具有活性且在授粉后10天在胚乳和果皮中具有活性的end2(WO 00/12733)，所述专利以引用方式并入本文。可用于本公开的某些方法的另外的早期谷粒/胚启动子包括种子优选的启动子ltp2(美国专利5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利6,403,862)；玉米nuclc(美国专利6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利6,921,815和美国专利申请公布号2006/0037103)；玉米lecl启动子(美国专利7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公布号20040025206和20070136891)；玉米启动子eepl(美国专利申请公布号20070169226)；以及玉米启动子ADF4(美国专利申请60/963,878，2007年8月7日提交)。

用于调控本公开的核苷酸序列在植物中的表达的另外的启动子是茎特异性启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等人(1995)PlantMol.Biol.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)等，所述参考文献以引用方式并入本文。

启动子可以完全源自天然基因，或由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成性DNA区段。

用于本公开的某些实施方案的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、ubiquitin、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织优选的启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)，以及来自玉米的组成型启动子GOS2；根优选启的动子，诸如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公布于2006年7月13日；US 7,268,226，公布于2007年9月11日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公布于2005年7月14日；U.S.7,214,855，公布于2007年5月8日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公布于2006年5月26日；U.S.7,268,270，公布于2007年9月11日；U.S.7,456,334，公布于2008年11月25日)、CRWAQ81启动子(WO05035770，公布于2005年4月21日；U.S.7,411，112，公布于2008年8月12日)以及玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号U38790；GI No.1063664)。

本公开的重组DNA构建体还可包含其它调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子、以及聚腺苷酸化识别序列。在某些实施方案中，重组DNA构建体还包含增强子或沉默子。

可将内含子序列添加至5′非翻译区、蛋白质编码区或3′非翻译区以增加在细胞溶胶中积聚的成熟信息的量。在植物和动物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白水平上都能增加基因表达最高达1000倍(Buchman和Berg.(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis等人(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。

任何植物可被选择用于鉴定待用于本公开的重组DNA构建体的调控序列和DN-DTP1多肽基因。用于分离基因和调控序列的合适的植物靶标的示例将包括但不限于：苜蓿、苹果、杏、拟南芥、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、芽甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽叶、柑橘、克莱门式小柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、越橘、黄瓜、花旗松、茄子、莴苣菜、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子、蜜露、豆薯、奇异果、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、蜜桃、坚果、燕麦、油棕、芸苔、秋葵、橄榄、洋葱、桔子、观赏植物、棕榈、番木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜籽、树莓、稻、裸麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柳枝稷、橘子、茶树、烟草、番茄、黑小麦、草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、山药以及西葫芦。

组合物：

本公开的组合物是一种植物，所述植物在其基因组中包含本公开的重组DNA构建体中的任一个(诸如以上论述的构建体中的任一个)。组合物还包括所述植物的任何子代，以及由植物或其子代获得的任何种子，其中子代或种子在其基因组内包含重组DNA构建体。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交获得的后续世代。子代还包括杂交种和近交系。

在杂交种子繁殖的作物中，可将成熟的转基因植物进行自花授粉以产生纯合的近交植物。近交植物产生含有新引入的重组DNA构建体的种子。这些种子可生长以产生将表现出改变的农学特性(例如，任选在水分限制条件下具有增强的农学特性)的植株，或这些种子用于育种程序以产生杂交种子，所述杂交种子可生长以产生将表现出此类改变的农学特性的植株。种子可为玉米种子或稻种子。

植物可以是单子叶植物或双子叶植物，例如稻或玉米或大豆植物，诸如玉米杂交植物或玉米近交植物。植物还可以是向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。

重组DNA构建体可稳定整合到植物的基因组中。

具体实施方案包括但不限于以下：

1.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物(例如，稻或玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中与对照植物相比，所述植物表现出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性。与对照植物相比，所述植物还可表现出至少一个农学特性的改变。

2.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物(例如，稻或玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DN-DTP1多肽，并且其中与对照植物相比，所述植物表现出增加的耐旱性。与对照植物相比，所述植物还可表现出至少一个农学特性的改变。

3.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物(例如，稻或玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DN-DTP1多肽，并且其中与对照植物相比，所述植物表现出至少一个农学特性的改变。

4.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物(例如，稻或玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中与对照植物相比，所述植物表现出至少一个农学特性的改变。

5.根据实施方案1-4中所述的以上植物的任何子代，根据实施方案1-4中所述的以上植物的任何种子，根据实施方案1-4中所述的以上植物的子代的任何种子，以及来自根据实施方案1-4中所述的以上植物及其子代中的任一个的细胞。

在前述实施方案1-5或其它实施方案中的任一个中，DN-DTP1多肽可来自水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野生大豆(Glycine soja)或短绒野大豆(Glycinetomentella)。

在前述实施方案1-5或其它实施方案中的任一个中，重组DNA构建体可包含至少一个在植物中有功能的启动子作为调控序列。

在前述实施方案1-5或其它实施方案中的任一个中，至少一个农学特性的改变可以是增加也可以是降低。

在前述实施方案1-5或其它实施方案中的任一个中，至少一个农学特性可选自绿度、谷粒收率、生长速率、生物质、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实收率、谷粒收率、总植株氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植株游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植株蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐旱性、氮吸收、根倒伏、收获指数、茎杆倒伏、植株高度、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序大小、早期幼苗活力以及低温胁迫下的出苗情况。例如，至少一个农学特性的改变可以是谷粒收率、绿度或生物质的增加。

在前述实施方案1-5或其它实施方案中的任一个中，在水分限制条件下，与对照植物相比，植物可表现出至少一个农学特性的改变。

在前述实施方案1-5或其它实施方案中的任一个中，在氧化胁迫(例如百草枯)条件下，与对照植物相比，植物可表现出至少一个农学特性的改变。

“干旱”是指植物可用水的减少，特别是较长时间的缺水或者在关键生长时间段发生，可造成植物损伤，或阻止植物的成功生长(例如，限制植物生长或谷粒收率)。

“耐旱性”是指植物在干旱下存活并且没有表现出实质性的生理或物理退化的能力，和/或一段时间干旱后复水时恢复的能力。

多肽的“耐旱活力”表示相对于参考植物或对照植物，该多肽在转基因植物中的过表达赋予增加的转基因植物耐旱性。

植物“增加的耐旱性”是相对于参考植物或对照植物进行测量的，并且反映了植物在干旱条件下存活的能力，并且与在类似干旱条件下生长的参考植物或对照植物相比，具有较小的生理或物理退化，或者植物在一段时间干旱后复水时，比对照植物更显著和/或更快速地恢复的能力。

“百草枯”(1，1-二甲基-4，4-联吡啶鎓二氯化物)是叶面施用的非选择性的联吡啶鎓除草剂，并且导致进一步对植物造成损害或阻止其成功生长的光致氧化胁迫。

“百草枯耐受性”是植物的性状，反映了与参考植物或对照植物相比，当用百草枯溶液处理时改善的存活和/或生长能力。

植物“增加的百草枯耐受性”是相对于参考植物或对照植物测量的，并且反映了植物在用百草枯溶液处理后存活的能力，并且与参考植物或对照植物相比，具有较小的生理或物理退化。一般来讲，对相对低水平的百草枯的耐受性可用作非生物胁迫耐受性诸如耐旱性的标记。

“氧化胁迫”反映了在反应性氧物质的系统性表现和生物系统易于去除反应性中间体或修复所造成的损伤的能力之间的失衡。细胞正常氧化还原状态的紊乱可通过过氧化物和自由基的产生造成毒性作用，所述过氧化物和自由基损害细胞的所有组分，包括蛋白质、脂质和DNA。http：//en.wikipedia.org/wiki/Oxidative_stress.

以下示例描述了用于模拟干旱条件和/或评估耐旱性的一些代表性方案和技术。

还可通过在模拟或天然存在的干旱条件下，在田间测试中植物保持足够收率(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％收率)的能力来评估耐旱性(例如，通过测量在干旱条件下与非干旱条件相比基本上相等的收率，或者通过测量在干旱条件下与对照或参考植物表现出的收率损失相比较小的收率损失)。

诸如恢复度、存活率、百草枯耐受率、基因表达水平、水使用效率、编码蛋白的水平或活性、以及其它参数的参数通常相对于对照细胞或对照植物展示。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供度量其中已针对目的基因实现了遗传改变(诸如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此改变的植物或细胞遗传而来，且将包含该改变。本领域的普通技术人员将易于认识到在使用如本文所述的组合物或方法评估或测量转基因植物的农学特性或表型时待利用的合适的对照或参照植物。例如，通过非限制性例示：

1.转化植物的子代，其相对于重组DNA构建体为半合的，使得子代分成包含或不包含重组DNA构建体的植物：包含重组DNA构建体的子代通常将相对于不包含重组DNA构建体的子代进行测量。不包含重组DNA构建体的子代是对照或参考植物。

2.将重组DNA构建体渗入到近交系中，诸如在稻或玉米中，或者渗入到一个品种中，诸如在大豆中：渗入系将通常相对于亲本近交系或品系进行测量(即，亲本近交系或品系为对照或参考植物)。

3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，并且第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是，亲本近交系中的一个包含重组DNA构建体：第二杂交系将通常相对于第一杂交系进行测量(即，第一杂交系为对照或参考植物)。

4.包含重组DNA构建体的转基因植物：该植物可相对于不包含重组DNA构建体但是具有与该植物相当的遗传学背景的对照植物进行评估或测量(例如，与包含重组DNA构建体的植物相比共享至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的核遗传物质序列同一性)。存在许多可用于植物遗传学背景的分析、比较和表征的基于实验室的技术；其中有同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、随机引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹识别(DAF)、序列特征性扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性

和简单序列重复(SSR)(也称为微卫星)。

对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型(WT)植物或细胞，即具有与用于进行遗传改变的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传改变得到主题植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对目的性状不具有已知效果的构建体，诸如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为主题植物或植物细胞的子代中的非转化分离体的植物或植物细胞；(d)遗传上与主题植物或植物细胞相同但未暴露于将诱导目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于其中目的基因不表达的条件下的主题植物或植物细胞本身。对照可包括多个代表一个或多个以上类别的个体；例如，“c”类的非转化分离体的集合通常称为批量无效对照(bulk null)。

方法：

方法包括但不限于用于增加植物耐旱性的方法、用于评估植物耐旱性的方法、用于增加百草枯耐受性的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于确定植物农学特性改变的方法、以及用于生产种子的方法。植物可以是单子叶植物或双子叶植物，例如，稻、玉米或大豆植物。植物也可以是向日葵、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗或高粱。种子可以是玉米或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米近交种子。

方法包括但不限于以下；

一种用于转化细胞的方法，包括使用本公开的分离的多核苷酸中的一种或多种转化细胞，其中，在特定实施方案中，细胞为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞，例如细菌细胞。

一种用于生产转基因植物的方法，包括使用本公开的分离的多核苷酸或重组DNA构建体中的任一个转化植物细胞，以及由转化的植物细胞再生转基因植物，其中，由该方法获得的转基因植物和转基因种子可以在本公开的其它方法中使用。

一种用于从细胞或细胞培养物中分离本公开的多肽的方法，其中细胞包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列的本公开的多核苷酸，并且其中转化的宿主细胞在适合重组DNA构建体表达的条件下生长。

一种用于改变本公开的多肽在宿主细胞中的表达水平的方法，包括：(a)使用本公开的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)使转化的宿主细胞在适合重组DNA构建体表达的条件下生长，其中重组DNA构建体的表达导致本公开的多肽在转化的宿主细胞中的水平改变。

一种增加植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括：(a)向可再生的植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由步骤(a)之后的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且与对照植物相比表现出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性；以及(c)获得来源于转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且与对照植物相比表现出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性。

一种评估植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)获得转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)与对照植物相比，评估子代植物的耐旱性和/或百草枯耐受性。

一种确定植物农学特性改变的方法，包括(a)获得转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含基于ClustalV比对方法与SEQ ID NO：4相比具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)确定任选地在水分限制条件下，与对照植物相比，子代植物是否表现出至少一个农学特性的改变。

一种生产种子(例如，可以作为耐旱性出售产品销售的种子)的方法包括前述方法中的任一个，还包括由所述子代植物获得种子，其中所述种子在它们的基因组中包含所述重组DNA构建体。

在前述方法中的任一个或本公开的方法的任何其它实施方案中，在所述引入步骤中，所述可再生的植物细胞可包括愈伤组织细胞、胚性愈伤组织细胞、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽的细胞。可再生的植物细胞可以来源于近交玉米植株。

在前述方法中的任一个或本公开的方法的任何其它实施方案中，所述再生步骤可包括以下：(i)在包含胚性促进激素的培养基中培养所述转化植物细胞直至观察到愈伤组织；(ii)将步骤(i)的所述转化植物细胞转移至包括组织促进激素的第一培养基；以及(iii)将步骤(ii)之后的所述转化植物细胞在第二培养基上传代培养，以允许芽伸长、根发育或两者。

在前述方法中的任一个或本公开的方法的任何其它实施方案中，至少一个农学特性可选自绿度、谷粒收率、生长速率、生物质、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实收率、谷粒收率、总植株氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植株游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的氨基酸含量、总植株蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐旱性、氮吸收、根倒伏、收获指数、茎杆倒伏、植株高度、穗高、穗长、分蘖数、圆锥花序大小、耐盐性、早期幼苗活力以及低温胁迫下的出苗情况。至少一个农学特性的改变可以是谷粒收率、绿度或生物质的增加。

在前述方法中的任一个或本公开的方法的任何其它实施方案中，在水分限制条件下，与对照植物相比，植物可表现出至少一个农学特性的改变。

在前述方法中的任一个或本公开的方法的任何其它实施方案中，存在另选方案将包含可操作地连接到至少一个调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体引入可再生的植物细胞中。例如，可以将调控序列(诸如一个或多个增强子，任选地作为转座元件的部分)引入可再生的植物细胞，然后对其中调控序列可操作地连接到编码本公开的多肽的内源基因的事件进行筛选。

可以通过任何合适的技术将本公开的重组DNA构建体引入植物中，包括但不限于直接DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。用于植物转化和再生的技术已在国际专利公布WO 2009/006276中有所描述，所述专利公布的内容以引用方式并入本文。

此外，修改或改变宿主内源基因组DNA的方法是可用的。这包括改变宿主天然DNA序列或预先存在的转基因序列，所述转基因序列包括调控元件、编码和非编码序列。这些方法也用于使核酸靶向基因组中预先工程改造的靶标识别序列。例如，本文所述的经基因修饰的细胞或植物使用“定制的”大范围核酸酶生成，所述大范围核酸酶的产生用于修饰植物基因组(例如WO 2009/114321；Gao等人(2010)Plant Journal 1：176-187)。另一个定点工程改造通过使用限制性酶的限制特性结合的锌指结构域识别(例如，Urnov等人(2010)NatRev Genet.11(9)：636-46；Shukla等人(2009)Nature 459(7245)：437-41)。

包含编码感兴趣的蛋白质的外来的、外源的分离的核酸片段的植物的发育或再生在本领域是熟知的。可使再生植株自花授粉以提供纯合的转基因植株。另外，将从再生植株获得的花粉与农学上重要的株系的种子培育植株进行杂交。反过来，用来自这些重要株系的植株的花粉对再生植株进行授粉。用本领域技术人员熟知的方法来培植含有所需多肽的转基因植株。

技术人员还将理解，可通过核酸序列的突变引入变化，从而引起所编码的mRNA的表达或所编码的多肽的氨基酸序列的变化，从而分别导致mRNA或蛋白质或两者的生物活性的改变。参见例如2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687中描述的方法，所述专利申请全文以引用的方式并入本文。因此，变体核酸分子可通过向本文所公开的相应的核酸序列或周围序列中引入一个或多个核苷酸置换、添加和/或缺失而产生。此类变体核酸序列也被本发明涵盖。

变体核酸序列可通过沿着基因区的全部或部分随机引入序列变化来制备，包括但不限于化学或辐射诱变以及寡核苷酸介导的诱变(OMM)(Beetham等人1999；Okuzaki和Toriyama 2004)。另选地或除此之外，序列变化可在特定选定位点使用双链断裂技术引入，所述技术诸如ZNF、定制归巢核酸内切酶、TALEN、CRISPR/CAS(也称为向导RNA/Cas核酸内切酶系统)(2014年8月20日提交的美国专利申请14/463687)、或其它基于蛋白质和/或核酸的诱变技术。可针对改变的活性对所得变体进行筛选。应当理解，所述技术通常不互相排斥。事实上，所述各种方法可单独或组合使用、并行或连续使用，以产生或获得多样的序列变体。

实施例

以下实施例进一步说明本公开的某些实施方案，其中份和百分比是按重量计，度是摄氏度，除非另行指出。应当理解，这些实施例虽然说明本公开的各实施方案，但仅以举例说明的方式给出。由以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本公开的必要特征，并且在不脱离本公开的实质和范围的前提下，可作出本公开的各种变化和修改以使本公开适合于各种应用和条件。因此，除了本文显示和描述的那些之外，本领域技术人员由前文的描述将显而易见地知道本公开的各种修改。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

实施例1

具有激活标签构建体的稻群体的创建

在该研究中，使用基于4X CaMV 35S增强子的二元构建体，并且由通过农杆菌介导的转化进行转化的中花11(中花11水稻)建立稻激活标签群体。中花11由中国农业科学院作物研究所培育。本研究中使用的第一批种子由Beijing Weiming Kaituo AgricultureBiotech Co.，Ltd.提供。用具有载体的农杆菌转化由胚芽诱导的愈伤组织。建立所生成的转基因事件并且收获转基因种子以形成稻激活标签群体。

实施例2

鉴定在温室条件下具有增强耐旱性的株系的幼苗筛选

耐旱性的幼苗筛选在温室中进行。提供两种类型的灯作为光源，即钠灯和金属卤化物灯，比率为1∶1。灯提供16h/8h的光照/黑暗周期，并且放置在苗床上部大约1.5m处。晴天时，苗床上部30cm处的光强度测量为10,000-20,0001x，而阴天时为6,000-10,0001x，相对湿度在30％至90％的范围内，并且温度在20℃至35℃的范围内。

在第一轮筛选中，使用T₁种子。耐旱性筛选中，使用来自突变型稻株系的14株生长一致的幼苗和16株ZH11-TC幼苗(由组织培养过程产生的中花11)。幼苗种植在装有种植土壤(来自北京辉业盛达中心(Beijing HuiYeShengDa Center)的FangJie土)、蛭石(北京清源世纪园艺中心(Beijing QingYuanShiJi Garden Center))和沙子(北京顺屯建材市场(Beijing Shuntun Construction Material Market))的混合物(V∶V∶V＝3∶3∶2)的一个托盘中。在所有幼苗生长到三叶期时，停止浇水，并将托盘放在干燥的位置，直至叶片卷曲(根据季节大约9-15天)。将托盘转移到水池中，使幼苗恢复5-7天，然后对植物的恢复度进行评分。使用以下评分系统：一个绿茎＝1，一个绿叶＝1，半个绿茎或绿叶＝0.5，三分之一绿叶＝0.2，零绿叶或零绿茎＝O。恢复度是绿色组织得分的总和，并且数据采用SAS软件进行统计分析。与对照表现出明显不同的株系被认为是最初的阳性株系。

在以下测试中使用T₂种子。筛选20或60株植株，并且仅相对于通过组织培养过程由中花11产生的植株，使用SAS软件进行分析(P＜0.05)。

存活率也用作筛选参数，其为存活植株占总植株数的百分比。

将通过以上筛选的株系种植在温室土壤中或田中(根据季节)，以用于收获叶材料并且进行T-DNA旁侧序列和候选基因的分子克隆。一般来讲，从同一株系的30株生长一致的幼苗中收获20-30g新鲜的叶组织，将其在液氮中冷冻并且储存于-80℃冷冻机中。

实施例3

株系AH00838的结果

在重复的温室干旱筛选测定中，株系AH00838始终显示出与ZH11-TC(由组织培养过程产生的中花11)相比增强的耐旱性。

如表2中所示，来自株系AH00838的14株T₁植株中的9株(64.3％)在温室干旱胁迫条件下恢复或存活；然而仅31.2％ZH11-TC植株存活。结果表明，与ZH11-TC相比，AH00838具有显著增强的耐旱性。

还在T₂世代进行观察。进行三轮筛选。在第一轮筛选中，70％的AH00838植株存活，而仅19％ZH11-TC存活。AH00838稻植株的存活率和平均恢复度显著优于ZH11-TC，尽管在以下两轮筛选中干旱胁迫增加(表3)。这些结果进一步说明，AH00838在幼苗期在温室干旱条件下具有增强的耐旱性。

表2.AH00838植株在T₁世代在温室条件下的耐旱性测定

表3.AH00８３8稻植株在T₂世代在温室条件下的耐旱性测定

按照这些结果，进行另外的工作以鉴定有助于增强AH00838植株耐旱性的基因。

实施例4

激活标签基因的鉴定

耐旱性株系AH00838中T-DNA插入基因座侧翼基因使用以下两个标准程序中的一者或两者鉴定：(1)质粒拯救(Friedrich J.Behringer和June I.Medford.(1992)，PlantMolecular Biology Reporter第10卷，2：190-198)；以及(2)反向PCR(M.J.McPherson和Philip Quirke.(1991)，PCR：a practical approach，137-146)。对于具有复合的多聚T-DNA插入物的株系，质粒拯救和反向PCR均被证明不足以鉴定候选基因。在这些情况下，可采用其它程序，包括TAIL PCR(Liu等人(1995)，Plant J.8：457-463)。

成功的测序结果是单个DNA片段含有一个T-DNA边缘序列和侧翼基因序列。当获得位于T-DNA插入物侧翼的基因序列的标签时，可以通过与公开获得的稻基因组序列比对来鉴定候选基因。具体地，离增强子元件/T-DNA RB和LB最近的注释基因是激活的候选基因。

为了证实鉴定的基因邻近T-DNA并排除DNA片段是嵌合克隆产生物的可能性，利用T-DNA中的一个oligo和对于局部基因组DNA特异的一个oligo对基因组DNA进行诊断PCR。给出PCR产物的基因组DNA样品被认为代表T-DNA插入。这个分析也验证了同一个株系中发生多于一个插入事件的情况，例如，如果在质粒拯救和/或反向PCR分析中鉴定了多个不同的基因组片段。

使用CTAB方法从AH00838株系的叶组织中分离基因组DNA(Murray，M.G.和W.F.Thompson.(1980)Nucleic Acids Res.8：4321-4326)。

通过2μL限制性酶BglII(NEB)酶切10μg来自AH00838的基因组DNA。在自连和通过电穿孔转化到感受态大肠杆菌DH5α中之后，使用P2up 5389和P2down 3534引物，通过菌落PCR验证含氨苄青霉素平板上的存活菌落。

P2up 5389：5′-ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC-3′(SEQ ID NO：5)

P2down 3534：5′-AACCCACTCGTGCACCCAACTGATC-3′(SEQ ID NO：6)

PCR反应混合物和程序：

PCR循环：

对含氨苄青霉素平板上的所有存活菌落进行分析并且它们全部在琼脂糖凝胶电泳产生大小为约4kb的条带。对4kb DNA片段测序之后，获得AH00838中T-DNA的旁侧序列。此核苷酸序列示出为SEQ ID NO：1。

T-DNA插入AH00838基因组的4号染色体中，并且在AH00838的稻基因组中仅存在一个T-DNA插入基因座。

OsDN-DTP1基因邻近T-DNA插入基因座，并且AH00838株系具有增强的耐旱性，因此克隆了该基因并验证了其在耐旱性和其它农学性状改善中的功能。

实施例5

OsDN-DTP1基因克隆和载体构建

使用KOD-FX PCR混合液(TOYOBO)，使用中花11稻的cDNA作为PCR模板扩增OsDN-DTP1(Os04g0208800)基因。引物为：

45-Os04g0208800-F：5′AAAGGATCCTACATTATTACATATGTTCCGTTC-3′(SEQ ID NO：7)

45-Os04g0208800-R：5′-GGCGTTGCTGGTGCCGTTCAG-3′(SEQ ID NO：8)

在引物45-Os04g0208800-F中设计加有下划线的BamHI位点。扩增预期的400bpDNA片段，将其纯化、通过BamHI酶切，并且与通过BglII和NruI酶切的过表达载体DP0005连接。通过限制性图谱和DNA测序确认正确的克隆(DP0006)。OsDN-DTP1 cDNA和CDS的核苷酸序列以及其编码的蛋白分别在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中示出。

实施例6

DP0005和DP0009的载体构建

由pCAMBIA1300(Cambia，Brisbane，Australia)构建DP0005。使用模板pCAMBIA1300以及引物35sF和35sR扩增CaMV 35S启动子。限制性酶位点HindIII和PstI分别添加在35S CaMV启动子5’端和3’端。

35sF：5′-AAGCTTAGAGCAGCTTGGCAACATGGTGGAGCAC-3′(SEQ ID NO：9)

35sR：5′-CTGCAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAG-3′(SEQ ID NO：10)

该扩增的CaMV35S启动子片段通过HindIII和PstI酶切并且连接到HindIII-PstI酶切的pCAMBIA1300中以产生pCAMBIA1300-35s。

使用模板pCAMBIA1303以及引物TnosF和TnosR扩增终止子NOSpolyA。限制性酶位点PstI+BglII+KpnI+NcoI+salI和BamHI分别设计在终止子NOS polyA 5’端和3’端引物中。

TnosF：5′-CTGCAGAGATCTGGTACCGGTCGCCACCATGGAAGTCGACGTTTCTTGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTG-3′(SEQ ID NO：11)

TnosR：5′-GGATCCTCTAGTCCCGATCTAGTAACATAG-3′(SEQ ID NO：12)

使用PstI和BamHI酶切终止子NOS polyA片段并且将其连接到PstI-BamHI酶切的载体中。所制备的载体设计为pCAMBIA1300-35s-Tnos。

使用来自pAsRED2(Clontech Laboratories Inc.)的AsRED基因并且将其插入pCAMBIA1300-35s-Tnos载体中以制备pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos。为了便于构建基因表达载体，新的终止子NOS polyA片段在5′端具有BamHI+NruI+SalI位点并且在3′端具有EcoRI。引物为：

TnosF2：5′-CCGGGATCCTCGCGAGTCGACCTCCAAGCTGGGCCACAACTGAAG-3′(SEQ ID NO：13)

TnosR2：5′-CGAGAATTCTCTAGTCCCGATCTAGTAACATAG-3′(SEQ ID NO：14)

使用pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos作为模板通过PCR扩增新的终止子NOS polyA片段。将此DNA片段用BamHI和EcoRI酶切，并且连接至用BamHI和EcoRI酶切的pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos以制备DP0005，即用于OsDN-DTP1的过表达载体骨架。将DP0005用BglII和BamHI酶切，然后自连，用于从DP0005中消除AsRED基因，以制备DP0009。

实施例7

OsDN-DTP1转基因稻事件

通过农杆菌介导的转化方法将空载体(DP0005，VC)和过表达载体(DP0006)单独转化到中花11中。

在T₂世代进行耐旱性测定。将幼苗在75mg/L潮霉素溶液中培养至约1-2cm的长度，持续3-5天。只有存活的植株(潮霉素抗性)用于田间干旱测定。

通过实时PCR分析测量OsDN-DTP1转基因在转基因DP0006稻植株中的表达水平。从不同的DP0006稻植株收集叶样品，并且使用实时PCR程序，诸如来自

的

反转录试剂盒和Real Time-PCR(SYBR^RPremix Ex Taq^TM，TaKaRa)。使用EF-1基因作为对照以显示来自标签株系和VC的样品的扩增和上样量是类似的。优化每个基因的测定条件。

使用RNAiso Plus试剂盒(Takara)根据制造商的说明书，从4叶期DP0006植株的约50mg叶组织中提取总RNA。通过RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas)，由500ng总RNA制备cDNA。根据手册(ABI)使用7,500Fast实时PCR设备进行实时PCR(SYBR^RPremix ExTaq^TM，TaKaRa)。

用于OsDN-DTP1基因的实时PCR的引物在以下列出：

DP0006-1：5′-CAACCACAACGCGTATG-3′(SEQ ID NO：15)

DP0006-2：5′-CCTACCAGCTGCAATGC-3′(SEQ ID NO：16)

如图1中所示，OsDN-DTP1基因在DP0006事件中过表达，但是在VC(空载体DP0005)植株中没有可检测的表达。在事件DP0006.09中的表达水平显著高于在其它事件中的表达水平。

实施例8

通过OsDN-DTP1基因的过表达增强耐旱性

转化稻植株的田间干旱筛选在海南省进行。对于待测试的每个转基因事件，将100粒阳性种子在水中室温浸泡16h，在培养箱中于35-37℃萌发36h，并且种植在田间苗床。在三叶期时，将幼苗移植到测试田中，每个转基因事件进行4次重复，每次重复10株植株，并且四次重复种植在同一块地中。将在绿色荧光灯下不显示红色(分离的无效对照)的阴性种子在同一块地上种植在转基因事件旁边，并且在统计分析中用作对照。

水稻植株使用杀虫剂和化肥正常管理。孕穗期停止浇水，以在开花期产生干旱胁迫，这取决于天气条件(温度和湿度)。在海南省的三亚，在1-2月，移植后25天稻植株停止浇水。在干旱胁迫期间稻植株复水一或两次，以避免苛刻的条件并保持合理的收率。使用TDR300(Spectrum Technologies，Inc.)在每块地的10个位点每三天测量土壤含水量。

在实验期间观察并记录植株表型。表型包括抽穗时间、叶片卷曲度、以及敏旱性和耐旱性。尤其要注意中午时的叶片卷曲度。季节结束时，每个株系在每行中间收获24株代表性的稻植株，并测量每株的籽粒重量。

籽粒重量数据通过ASReml程序使用SAS-AN0VA-综合模型进行统计分析。

图2显示，在抽穗期和成熟期，土壤体积含水量从28％降低至10％，典型的开花期干旱胁迫。在成熟期期间，据发现，在干旱胁迫后，与VC(DP0005产生的事件)植株和CK(分离的无效对照)植株相比，转基因事件DP0006.04、DP0006.05和DP0006.15具有显著较好的穗结实率和籽粒饱满度。收率数据的统计分析表明，4个OsDN-DTP1转基因事件(表4)的收率显著高于VC(数据未示出)和CK(表4)。结果表明，在田间干旱条件下，OsDN-DTP1转基因在稻中的过表达提高耐旱性和穗结实率以及籽粒饱满度，并且增强的耐旱性与OsDN-DTP1转基因表达水平相关。

表4.OsDN-DTP1稻植株在T₂世代在田间干旱条件下的谷粒收率测定

株系	每株的谷粒收率(g)	P值	P≤0.05
				DP0006.04	11.78	0.027	Y
CK	9.03
				DP0006.05	11.73	0.008	Y
CK	8.44
				DP0006.14	11.12	0.010	Y
CK	8.44
				DP0006.15	12.27	0.001	Y
CK	8.67

实施例9

转基因稻植株的实验室百草枯测定

百草枯(1，1-二甲基-4，4-联吡啶鎓二氯化物)是叶面施用的非选择性的联吡啶鎓除草剂，并且是世界上最广泛使用的除草剂之一，控制多种农作物如玉米、稻、大豆等中的杂草。在植物细胞中，百草枯通过从光合体系I接收电子并接着与氧反应以产生超氧化物和过氧化氢而主要靶向叶绿体，其改变植物抵抗光致氧化胁迫的能力。干旱胁迫通常在植物中引起增加的反应性氧物质(ROS)，有时植物的耐旱性与增强的抗氧化能力相关联。百草枯是有效的氧化胁迫诱导剂；其大大增加ROS产生并且抑制抗氧化剂体系的活性所必需的还原性等效物和化合物的再生。ROS生成在非生物胁迫条件下增强，并且植物应答从耐受至死亡变化，这取决于胁迫强度和其相关ROS水平。相对低的百草枯水平可模拟胁迫相关ROS产生并且用作植物胁迫生物学中的胁迫耐受性标记(Hasaneen M.N.A.(2012)Herbicide-Properties，Synthesis and Control of Weeds，检索自http：//www.intechopen.com/books/ISBN 978-953-307-803-8)。因此，测试了耐旱性转基因稻植株的百草枯耐受性。

百草枯测定方法：

通过百草枯测定对来自OsDN-DTP1转基因稻株系的9-10个转基因事件的转基因稻植株进行测试。使用组织培养的中花11植株(ZH11-TC)作为对照。将T₂转基因种子灭菌并使其发芽，并且在具有28-30℃的温度和～30％的湿度的生长室中培养。将发芽的种子置于底部有孔的管中，并且在30℃下在水中培养5天，直到一叶和一顶芽期。选择高度为约3.5-4cm的生长一致的幼苗进行百草枯测试。在本实验中使用随机化区块设计。存在5个区块，每个区块具有16×12个孔。将各转基因事件置于一排中(12株植株/事件)，并且将ZH11-TC对照在一个区块中随机放置在3排(3×12植株)中。然后将幼苗在10h光照/14h黑暗循环下用0.8μM百草枯溶液处理7天，并且处理的幼苗首先遇到黑暗并吸收百草枯溶液，百草枯溶液每两天更换。处理7天后，对绿色的幼苗进行计数。总体上保持绿色的没有损伤的那些幼苗被视为百草枯耐受性幼苗；而具有变白的叶或茎的那些幼苗不被视为百草枯耐受性幼苗。

使用耐受率作为该性状筛选的参数，其为保持绿色并显示出耐受性表型的植物占总植株数的百分比。

使用统计模型“Y～seg+事件(seg)+rep+误差”、随机效应“rep”、以及统计方法“SAS Proc Glimmix”，在构建体水平(所有转基因植株与对照相比较)和转基因事件水平(不同转基因事件与对照相比较)上对数据进行分析。

在百草枯测定中对OsDN-DTP1转基因稻测试3次。

在第一个实验中，在百草枯溶液处理7天之后，600株OsDN-DTP1转基因幼苗中的387株(65％)保持绿色并且显示出百草枯耐受性表型，而来自ZH11-TC幼苗的180株幼苗中的93株(52％)显示出百草枯耐受性表型。所筛选的全部OsDN-DTP1转基因幼苗的耐受率显著大于ZH11-TC对照的耐受率(P值＝0.0015)。这些结果表明，在构建体水平上，与ZH11-TC对照相比，OsDN-DTP1转基因幼苗表现出百草枯耐受性增强。在转基因事件水平上的进一步分析表明，与ZH11-TC对照相比，10个事件中的6个具有显著更大的耐受率。这些结果说明，在幼苗期，在构建体和转基因事件水平上，与ZH11-TC稻植株相比，OsDN-DTP1转基因稻植株具有增强的百草枯耐受性。

进行另两个实验以进一步验证OsDN-DTP1转基因稻的百草枯耐受性。在第二个实验中，564株OsDN-DTP1转基因幼苗中的284株(50％)保持绿色并且显示出百草枯耐受性表型，而来自ZH11-TC幼苗的216株幼苗中的76株(35％)显示出百草枯耐受性表型。所筛选的全部OsDN-DTP1转基因幼苗的耐受率显著大于ZH11-TC对照的耐受率(P值＝0.0003)。在第三个实验中，564株OsDN-DTP1转基因幼苗中的297株(53％)保持绿色并且显示出百草枯耐受性表型，而来自ZH11-TC幼苗的216株幼苗中的59株(27％)显示出百草枯耐受性表型。所筛选的全部OsDN-DTP1转基因幼苗的耐受率显著大于ZH11-TC对照(P值＝0.0000)。第二个实验的在转基因事件水平上的分析在表6中示出。这些结果说明，在幼苗期，在构建体和转基因事件水平上，与ZH11-TC稻植株相比，OsDN-DTP1转基因稻植株具有增强的百草枯耐受性。OsDN-DTP1基因在增强转基因植物的百草枯耐受性或抗氧化能力中具有功能。

OsDN-DTP1基因的过表达可增强发育期间转基因植物的田间耐旱性，如实施例8中所述；并且百草枯测定中的交叉验证结果进一步证实了OsDN-DTP1在增强植物的耐旱性中起作用。

表5.OsDN-DTP1转基因稻植株在T₂世代在转基因事件水平上(第1个实验)的百草 枯耐受性测定

表6.OsDN-DTP1转基因稻植株在T₂世代在转基因事件水平上(第2个实验)的百草 枯耐受性测定

实施例10

用OsDN-DTP1基因转化拟南芥

为了了解OsDN-DTP1基因是否可改善双子叶植物的耐旱性或其它性状，使用花浸法将OsDN-DTP1基因(载体DP0006)和空载体DP0009(VC)转化到拟南芥中并且鉴定转基因植株(Clough，S.T.和Bent，A.F.(1998)The Plant Journal 16，735-743；Zhang，X.等人(2006)Nature Protocols 1：641-646)。

为了鉴定转基因子代，通过首先用70％乙醇处理1min，接着用50％漂白剂/50％水/0.05％

X-100处理8min对拟南芥种子进行表面灭菌；在无菌水中冲洗3次，直到水看起来澄清并且没有任何黄色；并且重悬于无菌水中并铺在包含适当抗生素的选择平板上。将平板干燥，直到水干燥并且种子在平板上变得稳定。通过在4℃放置3天使种子春化；然后将种子移到处于长日照条件下的生长室中。在选择平板上生长7-10天之后，具有健康的绿色子叶和真叶以及延伸到MS选择培养基中的根的幼苗被视为转化体。然后将转化体移栽在装有水饱和土壤的托盘中，并且将托盘移到生长室中以允许植株在持续光照下生长，以收集种子。通过PCR分析进一步确认转基因植株。

OsDN-DTP1基因在转基因拟南芥中的表达水平通过半定量PCR测定进行分析。转化的拟南芥幼苗的总RNA如实施例7中所述进行提取。获得cDNA，使用肌动蛋白基因作为对照，并且使用DP0006-1和DP0006-2作为OsDN-DTP1转基因的引物。肌动蛋白的引物列出如下：

肌动蛋白-F：5′-AGGCACCTCTTAACCCTAAAGC-3′(SEQ ID NO：17)

肌动蛋白-R：5′-GGACAACGGAATCTCTCAGC-3′(SEQ ID NO：18)

PCR反应混合物和程序：

PCR循环：

如图3A中所示，OsDN-DTP1转基因在AtDP0006.06、AtDP0006.09和AtDP0006.11中过表达。在野生型和VC植株中没有可检测的表达。事件AtDP0006.06中的表达水平显著低于事件AtDP0006.09和AtDP0006.11。

为了表征OsDN-DTP1转基因拟南芥植株在干旱胁迫下的性能，将野生型(Columbia)、VC植株(DP0009转化体)以及3株AtDP0006转基因事件种植在种植土壤中，在正常浇水条件下生长4周。在干旱处理之前将种植土壤浇水至饱和，并且使拟南芥植株在不浇水的情况下生长约12天。当土壤的相对水含量降低至约3％时，使拟南芥植株复水3天。进行3次测量并且使用12株植株。在干旱处理期间，野生型植株和VC植株的萎蔫程度比AtDP0006事件更明显，并且在复水后第3天，转基因AtDP0006事件比野生型植株和VC植株生长得好(图3C)。在复水之后，多于50％的转基因植株存活，而野生型植株和VC植株的相应的存活率小于18％。

这些结果说明，OsDN-DTP1转基因的过表达显著增强了双子叶植物拟南芥的耐旱性。此外，这些结果进一步显示，单子叶植物的基因(来自稻的OsDN-DTP1)可以在双子叶植物(拟南芥)中具有功能。

Claims (14)

1.一种生产转基因植物或种子的方法，包括将重组DNA构建体引入植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸是：(a)SEQ ID NO:2的多核苷酸序列；(b)SEQ ID NO:3的多核苷酸序列；(c)编码SEQ IDNO:4的氨基酸序列所示的多肽的多核苷酸序列；或(d)与以上(a)、(b)或(c)的全长多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸在植物中的过表达增强耐旱性和/或百草枯耐受性。

2.一种生产转基因植物的方法，包括将重组DNA构建体引入植物的基因组中，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的多肽，并且其中与对照植物相比，所述植物表现出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在水分限制条件下，与所述对照植物相比，所述植物表现出谷粒收率的所述增加。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述植物选自：稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

5.一种生产种子的方法，包括从根据权利要求2所述的方法生产的转基因植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的多肽，并且其中与对照植物相比，由所述种子产生的植物表现出至少一个性状的增加，所述性状选自耐旱性和谷粒收率。

6.一种增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)向可再生的植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的多肽；(b)由步骤(a)之后的所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)获得来源于步骤(b)的所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且与对照植物相比表现出增加的耐旱性。

7.一种评估植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的多肽；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)与对照植物相比，评估所述子代植物的耐旱性。

8.一种确定植物的谷粒收率的改变的方法，所述方法包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的多肽；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)测量所述子代植物的所述谷粒收率并且将所述测量结果与对照植物的谷粒收率进行比较。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述子代植物和对照植物的谷粒收率在水分限制条件下测量。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述子代植物的所述谷粒收率相对于所述对照植物有所增加。

11.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述植物选自：稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

12.一种增加田间稻植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)在稻植物中表达编码SEQ IDNO:4所示的稻OsDN-DTP1多肽的重组核酸；(b)使所述稻植物在所述田间在作物生长条件下生长，其中所述稻植物暴露于干旱条件；以及(c)增加所述稻植物的所述耐旱性。

13.一种增加田间稻植物的收率的方法，所述方法包括(a)在稻植物中表达编码SEQ IDNO:4所示的稻OsDN-DTP1的重组核酸；(b)使所述稻植物在田间在作物生长条件下生长，其中所述稻植物暴露于干旱条件；以及(c)相对于对照植物的收率增加所述稻植物的所述谷粒收率。

14.一种获得具有增加的耐旱性的稻植物的方法，所述方法包括获得与对照植物群体相比具有增加的SEQ ID NO:4所示的DN-DTP1表达的稻植物以及使具有增加的SEQ ID NO:4所示的DN-DTP1表达的所述稻植物在干旱条件下生长。

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