CN103320455B - 水稻类病变基因upg8及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻类病变基因upg8及其应用。所述upg8基因发生突变导致水稻产生典型的PCD特征，通过转基因技术创建所述upg8基因超达表的转基因水稻，获得的转基因植株具有对多种环境胁迫的耐受性，因此upg8基因在培育抗逆性增强的植物和农作物品种方面具有很好的应用价值。

Description

水稻类病变基因upg8及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种影响水稻类病变发生的基因及其在植物抗病与转基因的应用。

背景技术

水稻类病变指植株在无非生物胁迫、机械损伤、病原菌侵染下自发产生类似病原菌侵染的过敏性反应，在局部形成与病斑类似的斑点。根据叶斑形成的特点，突变体分为扩散型和起始型两类。扩散型在斑点形成后逐渐扩散到全叶或整个植株，如水稻spl1和lmm1；而起始型是指在植物叶片或其他部位的细胞坏死而自发和随机形成相对稳定分布和大小的斑点，如水稻blm和M1009。类病变发生既有植物内部基因的调控作用，也受光照、温度、湿度和养分等环境因素影响。如高温和紫外线诱导spl7的斑点形成，而低温和短日照促进Oslsd1斑点产生，表明相关基因可能参与光温调节的代谢途径，与植物光合作用以及逆境应答相关。此外许多突变体还伴随株高、育性、分蘖力和产量等农艺性状的改变和抗病性的增强。病菌感染后，植物体内ROS瞬间积累诱发HR反应，最终导致感染部位细胞程序性死亡并形成系统防御反应，而且突变体类病变发生与植物感病的PCD过程非常相似，但植物PCD的机理仍不清楚。因此，类病变突变体是阐释植物抗病性与PCD调控机制的理想材料与研究体系。

类病变突变体的抗病性与病原菌亲和性有关，大多数突变体对不同病菌表现出一定抗性，但对病菌的不同生理小种存在抗性差异，如spl21、spl22、spl24、cdr1~cdr3 等只对某一小种有抗性，spl0、spl13~spl15和blm等对多个小种有抗性，而spl4、spl5、spl7、spl11、Spl12、spl17和spl26 等对不同水稻病害表现出广谱抗性。因此，类病变突变体是研究植物PCD和抗病作用机理的理想材料。如水稻类病变突变体cdr1~cdr3叶片出现自体荧光、胼胝质沉积和细胞死亡，突变体中病程相关基因PBZ1 和 PR1的表达水平上调，而且稻内酯A积累是野生型的100多倍，这可能是突变体对稻瘟病显著抗性的主要原因。ttm1 突变体是OsPti1a(编码质膜蛋白激酶)突变所致，种植30天后叶片出现小斑点，突变体中PR基因和PAL的表达上调，稻内酯A的积累比野生型高150倍，对稻瘟病具有明显的抗性，而OsPti1a 过表则负调节水稻的防御反应。nls1突变体表现出对白叶枯病菌的组成型抗病反应，包括活性氧和水杨酸(SA)过量积累、PR基因表达上调。

已鉴定类病变突变体中，spl7编码一个热激转录因子蛋白，spl7突变体是其DNA结合域中高度保守的色氨酸突变为半胱氨酸，导致该蛋白的结构与功能发生改变。spl6在分蘖后期叶片出现棕红色斑点，突变体中二硫键异构酶、转酮醇酶、ATP合成酶、Rubisco大亚基、Rubisco活化酶小亚基和硫氧还蛋白、过氧化物酶等蛋白的表达显著下调，这些蛋白(酶)的缺乏破坏了突变体细胞中ROS的动态平衡，进而引发PCD过程和类病变发生。spl11突变体是单碱基突变导致蛋白翻译提前终止，突变体斑点在分蘖期沿中脉分布，且具有广谱的抗病性。spl11编码一个含有U2box/Armadillo结构域的E3连接酶，因此Spl11可能在植物细胞死亡与防御反应的泛素系统中起负反馈调节因子的作用。spl18 和spl28分别编码酰基转移酶和网格相关蛋白受体复合体的AP1M1亚基。spl28突变体中叶绿素含量与光系统II的效率降低，导致HR反应并诱发叶片死亡。但突变体中大量积累ROS、防卫素和胼胝质，对稻瘟病和白叶枯病的抗性显著增强。水稻中类病变相关基因鉴定与功能研究已经取得了卓有成效的进展，但是目前还只有50多份被鉴定和命名，且已克隆的类病变性状基因有编码热激蛋白因子、E3泛素连接酶、酰基转移酶、质膜蛋白激酶、锌指蛋白和锚蛋白等有限的蛋白。因此，挖掘新的水稻类病变基因及其作用机理还任重道远。

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（Upgase）在植物碳水化合物代谢和生长发育过程中发挥重要作用，Upgase催化1-磷酸葡萄糖与尿苷三磷酸生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)及焦磷酸。UDPG是淀粉合成的前体，在植物碳源组织中通过Upgase催化形成G-1-P，促进蔗糖的再合成，而在碳库组织中Upgase则催化蔗糖分解产生UDPG。水稻中有2个编码Upgase的基因OsUpg1 和OsUpg2。OsUpg1 影响花粉母细胞减数分裂阶段胼胝质积累和种子中糖类代谢，调控水稻花粉不育和育性转换过程。但目前有关糖类相关基因参与水稻类病变发生还未见报道。

发明内容

通过EMS诱变获得水稻(Kitakke)类病变突变体，其中M1和M209突变体在3周左右出现褐色斑点，然后扩散到整个植株，两份突变体是8号染色体上编码Upgase基因（Os08g0206900，命名为Upg8）的等位突变，研究发现该突变体的类病变过程中表现出典型的PCD特征：①细胞中DNA片段化产生200bp DNA小片段。②染色质高度浓缩、趋边和形成凋亡小体。③细胞中积累大量ROS。在转录水平上，本发明人发现UPG8在水稻根茎叶中都有表达，且乙烯诱导该基因的表达，但稻瘟病抑制其表达。特别重要的是突变体中乙烯合成关键酶基因OsACS2表达与乙烯含量都明显高于野生型水稻。水稻PR10家族蛋白PBZ1具有RNase活性，与PCD过程中DNA片段化密切相关；upg8突变体中PBZ1表达水平明显高于野生型，而且PBZ1在野生型水稻的表达受到乙烯显著诱导。这些研究结果表明UPG8可能通过乙烯调控PBZ1等基因表达，进而导致水稻PCD与类病变发生，表明UPG8通过乙烯调控水稻PCD和类病变发生的功能。

本发明提供的技术方案是：一种水稻类病变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，称为Upg8基因。该基因的突变导致水稻苗期类病变的发生。

本发明还提供包含所述的基因的表达载体，优选为植物表达载体。

本发明还提供所述的基因在培育抗逆作物品种的应用，是将包括所述基因的表达载体导入植物中，筛选获得抗逆性提高的植株，优选为水稻。

6

本发明具有以下有益效果：本发明研究表明Upg8在水稻应答干旱、盐碱、低温、氧化胁迫和病虫害等逆境胁迫反应以及水稻中正常生长发育进程中发挥重要的作用。通过转基因技术，利用upg8基因能有效改良水稻的抗逆性；通过超表达upg8基因，其转基因植株对相关胁迫具有耐性，可以培育抗逆性增强的转基因植物品种。

附图说明

图1 Upg8突变体基因突变的测序结果分析。

图2 upg8突变体的表型(A)和DNA片段化(B)分析。

图3 类病变叶片中细胞染色质形态(A)和活性氧积累(B)分析。

图4  A稻瘟病抑制Upg8表达；B乙烯诱导Upg8表达；C突变体中Pbz1和Acs2表达。

图5 转upg8水稻和非转基因水稻对10μΜ MV处理的氧化胁迫耐性比较。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

．Upg8基因发生突变使植株产生PCD反应

用1%的EMS（甲基磺酸乙酯）浸泡水稻（Kittake，粳稻）种子24小时创造突变体库。在稳定遗传的水稻突变体后代材料中筛选到类病变的突变体。利用突变体与Dular(籼稻)创造图位克隆的群体，利用839个单独的F2代分离单株进行图位克隆，测序结果证实突变体是8号染色体上编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因upg8（Os08g0206900）的突变。突变体是基因编码区的G₃₁₂突变为A导致蛋白翻译提前终止（图1）。UPG8氨基酸序列（如SEQ ID NO:2所示）与OsUpg1 和OsUpg2同源性仅为10.79%，暗示upg8 与OsUpg1 /OsUpg2在生理功能上可能存在差异，如图1所示。

2．突变体在苗期开始发生类病变

Upg8（Os08g0206900）突变体在3周左右苗期下部叶片开始出现褐色斑点(图2A)，然后斑点逐渐扩散至整个叶片；随后上部叶片也出现同样的症状。突变体在生长后期表现出植株的致死和结实不好。用CTAB法提取苗期突变体（类病变发生初期）和野生型水稻基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图2B。

3．突变体类病变发生过程中的PCD特征

大多数类病变突变体是研究植物PCD机制的理想材料。本发明人发现突变体在叶片类病变过程中表现出典型PCD特征：①病斑发生初期细胞DNA出现200bp片段化(图2B)。②染色质高度浓缩、趋边和产生凋亡小体(图3A)。③斑点叶中积累大量的活性氧(超氧阴离子和H₂O₂)(图3B)。这些表明UPG8的突变导致细胞程序化死亡和叶片中棕褐色斑点的产生。④UPG8在根茎叶中都有表达，且稻瘟病抑制该基因的表达(图4A)，暗示UPG8可能参与水稻对病害侵染的应答过程。

染色质形态观察：

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。透射电子显微镜观察细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱ期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；III期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

超氧阴离子和H ₂ O ₂ 定性分析

取3-5周苗龄的突变体、转基因水稻和野生型水稻叶片，细胞死亡鉴定用台盼兰(trypan blue)染色法；O^- ₂分析采用硝基蓝四氮唑(NBT)染色法，样品浸入O^- ₂显色液真空渗透，取出叶片室温光照至深蓝色斑点出现，用70-90%乙醇脱色拍照；H₂O₂的定性分析采用二氨基联苯胺(DAB)染色法，样品浸入H₂O₂显色液真空渗透，取出叶片室温避光至棕色斑点出现，用70-90%乙醇脱色拍照，结果如图3B所示。

4．UPG8影响生物合成与PCD相关基因的表达

基因表达分析方法：取突变体在类病变发生期(约播种后3周)叶片，用RNA大量提取试剂盒(MagMAX? Total RNA Isolation Kit，Life Technologies)提取突变体和野生型水稻叶片RNA。采用M-MLV试剂盒(Promega) 合成cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa)在ABI PRISM7000上分析候选基因的表达水平。PCR条件为95℃ 4 min、95℃ 15 s、59℃ 30s、72℃ 30s，共40个循环，以actin作为内参，用2-??CT法分析基因表达水平；电泳用1%的琼脂糖胶。

通过下述实验研究UPG8影响生物合成与PCD相关基因的表达：

稻瘟病处理：稻瘟菌菌株RB22在燕麦培养基上26℃暗培养7d，洗去菌丝，光照培养3-7d产孢。用0.02%吐温的无菌水洗下孢子，接种液分生孢子浓度为5×106 /ml。野生型水稻3叶一芯时，每20株幼苗用5mL菌液均匀喷雾，26℃保湿暗培养24h；然后移入植物生长箱湿度90%、16h光/8h暗、28℃培养，处理后12、24和48小时取叶片进行基因表达分析。

乙烯前体ACC处理：在突变体类病变即将发生时(约3周苗龄)用50mg/L浓度的乙烯利喷施野生型水稻，处理后6、12和24小时取叶片进行基因表达分析。

引物如下：Os08g0206900 /upg8：5-GATGAGATAGTTGGACTTGAGCTC-3 和  5- CATCTACATTTGAGCAGCACAA-3；

PBZ1：5-CGGGCACCATCTACACCA-3和5-GCCATAGTAGCCATCCAC-3）；

Actin：5-CATGCTATCCCTCGTCTCGACCT-3和

5-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT-3）；

Acs2：5-ACCGTACATGTAGCTTGGCTT-3和

       5-TTAACGCCTTAATCCGATCATT-3

研究发现水稻的UPG8表达受乙烯诱导(图4B)，而且upg8突变体中乙烯合成关键基因OsACS2表达明显高于野生型(图4C)，突变体中乙烯含量是野生型的1.4倍。水稻PBZ1是编码具有RNase活性的PR10家族蛋白，该蛋白的积累引起水稻细胞中DNA片段化，因此，PBZ1是水稻PCD发生的标志性组份，突变体中PBZ1表达明显高于野生型(图4C)，且乙烯处理能显著诱导pbz1表达，意味UPG8可能促进突变体中乙烯合成和上调PBZ1等基因表达，导致水稻PCD和类病变发生。

5、转基因水稻材料的创建及对胁迫的耐受性

(1) 转基因水稻的创建

为了全面阐释UPG8的特性与调控功能，通过农杆菌侵染法创建转upg8超表达转基因水稻，转基因水稻材料的创建采用农杆菌侵染水稻愈伤组织转化法：

1）水稻胚愈伤的诱导与继代：将水稻种子（越光）脱壳，用75%乙醇浸泡1min，用次氯酸钠溶液浸泡30min，无菌水冲洗，用次氯酸钠重复浸泡15min，用无菌水冲洗。将灭菌后的水稻种子于灭菌滤纸上晾干，种于诱导培养基中。28℃暗培养2周。分离愈伤组织转移至新的诱导培养基28℃继代培养3次。挑取颜色淡黄且质地松散的胚性愈伤颗粒继代培养基上28℃暗培养3天。

2）菌种活化及扩繁：在28℃条件下，将含有目的基因表达载体（PSB1300-upg8）的农杆菌于YEB固体培养基上划线培养2天。

3）农杆菌与愈伤组织的共培养：取适量菌体悬浮于100μM AS+AA液体培养基中，菌液OD值达0.3时，使愈伤组织浸入菌液中，轻摇20分钟。弃菌液，取出愈伤，滤干多余菌液，转移到NB固体培养基上22℃暗培养3天。

4）筛选抗性愈伤：挑选共培养的愈伤组织，无菌水漂洗，滤干后铺于筛选培养基上，28℃暗培养2周后继代一次。

5）预分化与分化：选出生长旺盛呈乳白色或微黄色的愈伤组织转至预分化培养基上，28℃暗培养1周，28℃光照培养2周，见到绿点时继代一次，4周后分化成苗。

6）生根与壮苗：将长势较好的幼苗移至生根培养基上，培养2周后移栽。

7）将生长正常的转基因苗移栽温室培养至种子的收获。

(2) 转基因水稻对胁迫的耐受性

由于该基因的突变导致水稻叶片中活性氧过度积累、导致细胞膜结构受到损伤和细胞凋亡，最终使水稻发生类病变和叶片枯死等症状，该基因的超表达则在维持植物细胞中活性氧的稳态平衡和减缓细胞凋亡过程中发挥重要的作用。甲基紫精(MV) 细胞内产生氧化逆境的促进剂，常被用来研究活性氧介导的植物氧化伤害，低浓度的MV被用作植物幼苗或细胞抗性诱导与筛选的指标。用10μΜ MV处理1周苗龄的转upg8基因水稻和非转基因水稻（对照）幼苗，3天后大部分非转基因的水稻幼苗由于氧化伤害而表现出叶片严重漂白的胁迫症状，而转upg8基因水稻绝大部分植株还生长良好，只有小部分表现出轻微的胁迫症状（图5），结果表明该基因超表达的水稻苗期对氧化胁迫的耐性明显比非转基因水稻提高，能有效提高转基因植物对干旱、盐碱、低温、氧化胁迫和病虫害等逆境胁迫的耐性。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 水稻类病变基因upg8及其应用

 

<160> 2

<210> 1

<211>1912

<212> DNA

<400> 1

1 actaataatctccccaagattggatcatactctcatctcatcatagtctccgcccatccg

61 ccatcgctcgcagatctctctcgctctcgctctagctctcgctcgaggaggagatggcgg

121 agatcgtggtggcgccgcgggcgccggcgccggcggggaggtggggcgccgcgccgccgc

181 aggagctggtcgagaggctcaaggactacggccaggagggcgccttcgcgctctgggacg

241 agctcgcccccgaggagcgcgacttcctcgtccgggacatcgagagcctagatcttgcta

 301 ggattgaccggatcgtccgatgctcgctcagatcacaaggtgttcctttgccagccgtcg

 361 agcctgtgccggagtcgagtgtctcgaccgtcgaagatagaactcctgaggacaagcaga

 421 ggtggtggaagaggggcttgaaagccatttcagaggggaaattggctgttgtccttttgg

 481 ctggtggtcagggaacaaggcttggcagttctgatcctaagggatgcttcagcatcgggc

 541 ttccatctggaaagtcacttttccaacttcaagctgaacgaattttgtgcatacagaagc

 601 tggctgctcagtccactgatggtactccacaaatacactggtatataatgactagcccct

 661 ttactgatgaagcgactcgaaaattttttgaaagccacagatattttggcttagagcctg

 721 accaagtaacatttttccagcaaggtactatcccatgtgtctcagctgatggaaggttta

 781 ttatggaaacaccatacaaggtagcaagggctcctgatggcaatggtggagtgtatgctg

 841 ctctaaaatctcaaaggttgctggacgatatggctggaagaggtgtgaaatatgtagatt

 901 gctatggagttgacaatgtattggtccgtgttgctgatccaacattcctaggatatttca

 961 ttgacaagggcgtgtctgctgctgcaaaggtcgtaaggaaggcatatccacaggagaaag

1021 ttggagtgtttgttcagcgtggcaggggtgggcctctttctgtagttgagtacagtgaaa

1081 tggatgcagctatgactactgaaataaatcaaggcacagggcgccttcgttattgttgga

1141 gcaatgtatgcctgcatatgtttactttggattttcttaatcaagtaacaaatagtcttg

1201 aaaaggacagcatttaccatttagcagagaagaagattccttcaatccatgggtacacgg

1261 caggcttaaagcttgaacagtttatatttgacgtgttcacctattctccatcaacagctc

1321 tttttgagattttgagggaggaggaatttgcaccagtaaagaatgctaatggtgcaactt

1381 atgatactcctgatagtgccagattaatgctgctccgccttcacagccgatgggtggtag

1441 ctgcaggtggctttttgactcattccgtgcccttgtatatgacaggtgttgaagtttctc

1501 cacttagctcttatgcgggagagaacctggaagccatatgccgtggacggacattccatg

1561 caccgagtgagatttcattttaggaatagtgtctgtcgaaagcaacagtctcagacccag

1621 ctaaaaagcatctgtctcaagaagagaatggcaggatccctcaattttcattgggacatg

1681 agatgagatagttggacttgagctcttgcagttagaatgttgatattagtcagcttgttg

1741 taatgccagtaattgtaattcaacaattggagttggctccctttccatgtaccatttttg

1801 tgctgctcaaatgtagatgatcaaacaatggctaaatcttctgtaaaaaataatacatct

1861 ctgtaagactggtctatgcacaattgttaattcaacgtgctctaaagtgag

 

<210> 2

<211> 489

<212> 氨基酸

<400> 2

1  Met Ala Glu Ile Val Val Ala Pro Arg Ala Pro Ala Pro Ala Gly Arg Trp Gly Ala Ala

21 Pro Pro Gln Glu Leu Val Glu Arg Leu Lys Asp Tyr Gly Gln Glu Gly Ala Phe Ala Leu

41 Trp Asp Glu Leu Ala Pro Glu Glu Arg Asp Phe Leu Val Arg Asp Ile Glu Ser Leu Asp

61 Leu Ala Arg Ile Asp Arg Ile Val Arg Cys Ser Leu Arg Ser Gln Gly Val Pro Leu Pro

81 Ala Val Glu Pro Val Pro Glu Ser Ser Val Ser Thr Val Glu Asp Arg Thr Pro Glu Asp

101Lys Gln Arg Trp Trp Lys Arg Gly Leu Lys Ala Ile Ser Glu Gly Lys Leu Ala Val Val

121Leu Leu Ala Gly Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gly Ser Ser Asp Pro Lys Gly Cys Phe Ser

141Ile Gly Leu Pro Ser Gly Lys Ser Leu Phe Gln Leu Gln Ala Glu Arg Ile Leu Cys Ile

161Gln Lys Leu Ala Ala Gln Ser Thr Asp Gly Thr Pro Gln Ile His Trp Tyr Ile Met Thr

181Ser Pro Phe Thr Asp Glu Ala Thr Arg Lys Phe Phe Glu Ser His Arg Tyr Phe Gly Leu

201Glu Pro Asp Gln Val Thr Phe Phe Gln Gln Gly Thr Ile Pro Cys Val Ser Ala Asp Gly

221Arg Phe Ile Met Glu Thr Pro Tyr Lys Val Ala Arg Ala Pro Asp Gly Asn Gly Gly Val

241Tyr Ala Ala Leu Lys Ser Gln Arg Leu Leu Asp Asp Met Ala Gly Arg Gly Val Lys Tyr

261Val Asp Cys Tyr Gly Val Asp Asn Val Leu Val Arg Val Ala Asp Pro Thr Phe Leu Gly

281Tyr Phe Ile Asp Lys Gly Val Ser Ala Ala Ala Lys Val Val Arg Lys Ala Tyr Pro Gln

301Glu Lys Val Gly Val Phe Val Gln Arg Gly Arg Gly Gly Pro Leu Ser Val Val Glu Tyr

321Ser Glu MET Asp Ala Ala MET Thr Thr Glu Ile Asn Gln Gly Thr Gly Arg Leu Arg Tyr

341Cys Trp Ser Asn Val Cys Leu His Met Phe Thr Leu Asp Phe Leu Asn Gln Val Thr Asn

361Ser Leu Glu Lys Asp Ser Ile Tyr His Leu Ala Glu Lys Lys Ile Pro Ser Ile His Gly

381Tyr Thr Ala Gly Leu Lys Leu Glu Gln Phe Ile Phe Asp Val Phe Thr Tyr Ser Pro Ser

401Thr Ala Leu Phe Glu Ile Leu Arg Glu Glu Glu Phe Ala Pro Val Lys Asn Ala Asn Gly

421Ala Thr Tyr Asp Thr Pro Asp Ser Ala Arg Leu MET Leu Leu Arg Leu His Ser Arg Trp

441Val Val Ala Ala Gly Gly Phe Leu Thr His Ser Val Pro Leu Tyr Met Thr Gly Val Glu

461Val Ser Pro Leu Ser Ser Tyr Ala Gly Glu Asn Leu Glu Ala Ile Cys Arg Gly Arg Thr

481Phe His Ala Pro Ser Glu Ile Ser Phe

 

Claims (2)

1.一种水稻类病变基因在培育抗逆植物品种的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的简并序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：将含所述基因的表达载体导入植物中，筛选获得抗逆性提高的植株。

3．如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物是水稻。

4. 如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述抗逆性是指抗干旱、抗氧化胁迫、抗盐碱、抗低温、或抗病虫害逆境胁迫。