CN1614023A - 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在水稻中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的应用。将尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因连接到增强表达载体或抑制表达载体中，再将表达载体转入水稻之中，使转基因水稻中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达增强或表达抑制。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达增强的水稻，其生长加快，穗长、结实粒数和单株产量得到了提高。而尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达被抑制的水稻，表现为雄性不育，其花粉为100％典败型不育，自交不结实，异交结实正常。本发明为应用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因改良水稻品种开辟了新的途径。

Description

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在水稻中的应用

                        技术领域

本发明属于转基因植物领域，本发明涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的应用。具体地说，本发明涉及利用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因改变水稻的花粉育性和产量性状，在培育新型不育系和高产新品种中的应用。

                        背景技术

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose Pyrophosphorylase，UGPase)首先由Munch Petersen等于1953年在酵母细胞中发现(Munch Petersen A，Kalckar HM，Cutolo E et al 1953 Uridyl transferase and the formation of uridine triphosphate.Nature172：1036-1037)。该蛋白质在自然界广泛分布，目前已在较多的动、植物中发现并已分离纯化。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化一种依赖镁的可逆反应，即转移尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的尿苷至Mg-PPi形成葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)和Mg-UTP。反应式如下：

Glc-1-P+UTP＝PPi+UDPG

UDPG是高等植物中主要活化糖的形式，作为葡萄糖基供体参与蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢。在植物光合组织中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶与蔗糖磷酸盐合成酶(SPS)偶联，将光合作用产生的碳用于蔗糖合成。而发育种子和块茎等组织内，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶与胞液中的AGPase相偶联，形成ADPG，参与造粉体淀粉的合成。在生长旺盛的马铃薯块茎中，吸收的蔗糖被胞液内SuSy降解形成果糖和UDPG，UDPG为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶所用，最终合成淀粉。而发芽期的根茎则需要降解淀粉生成蔗糖，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化合成较多的UDPG，用于蔗糖合成，并衍生成其它的二磷酸核苷糖参与果胶质、半纤维素、糖脂和糖蛋白的合成。

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶处于蔗糖和淀粉途径的交叉点。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在蔗糖和淀粉代谢转换中的作用对于谷类作物的种子特别重要。例如，大麦种子中胞液尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶可直接与胞液AGPase偶联，将蔗糖生成的Glc-1-P用于ADPG的形成，在蔗糖代谢与淀粉形成间建立起重要的连接。这样，PPi在AGP反应与UGP反应间可被循环利用，假定两反应紧密偶联，则从UDPG至ADPG的转化无需PPi输入便可顺利进行(见下图)。

人们一直试图通过控制尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达来调控生长发育。研究证明，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶缺失的粘菌不能进行正常的生长、发育(Ragheb JA，Dottin PR 1987 Structure and sequence of a UDP glucosepyrophosphorylase gene of Dictyostelium discoideum.Nucleic Acids Res15：3891-3908)；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶缺失的大肠杆菌则不能参与Leloir途径的半乳糖代谢，因而不能形成正常的细胞壁和细胞膜(Weissbom AE，Liu Q，Rumley MK et al 1994 UTP-glucose-1-phosphate uridyltransferase of Escherichia coli：isolation and DNA sequence of the galU gene and purification of the emzyme.JBacteriol 176：2611-2618)。哺乳动物细胞中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶缺失会引起细胞膜糖蛋白合成的降低，影响细胞正常分化和完整性(Hassid WZ 1969Biosynthesis of oligosaccharides and polysaccharides in plants.Science 165：137-144)。在拟南芥中，通过抑制尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性降低了糖的含量(Johansson H 2003 Gene regulation of UDP-glucose synthesis and metabolism inplants.PhD thesis，Ume University，Ume，Sweden)。但在马铃薯中通过反义RNA抑制了96％的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的情况下，实验组和对照组的生长和发育却无显著的差异(Zrenner R，Willmitzer L，Sonnewald U 1993 Analysis of theexpression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and its inhibition byantisense RNA.Planta 190：247-252)。在酵母中，转入尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的转化子其酶活性高于对照组40倍，但生长率并没有得到提高(Daran JM，Dallies N，Thines-Sempoux D，Francois J(1995)Genetic and biochemicalcharacterization of the UGP1 gene encoding UDP-glucose pyrophosphorylase fromSaccharomyces cerevisiae.Eur J Biochem 233：520-530)。目前为止，人们还没有发现通过调控尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达能改变水稻的花粉育性和改良水稻的产量性状。而控制水稻等植物的育性，改良产量性状，提高产量，是人们从事作物育种所一直追求的目标。

                             发明内容

本发明的目的在于提供一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的应用，水稻植物生长更旺盛，结实更多，产量性状明显改善，使水稻的植株更为高大，结实粒数和单株粒重等产量性状得到明显改善。

实际上，本发明涉及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在提高水稻产量中的应用，水稻体内尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达增强，使植株的产量性状得到改善，产量提高，用于培育高产新品种。

还涉及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在控制水稻育性中的应用，水稻体内尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的转录和翻译受到抑制，并引起水稻的花粉败育，导致自交不结实，用于培育雄性不育系。

人们很早就知道尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是生物体内糖代谢过程中的一种重要的酶，然而，人们一直没有发现尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因具有控制植物育性和提高植物产量的功能。经研究发现，通过转基因技术，使水稻体内尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达增强时，植株更为高大，产量性状明显改善，产量提高。当水稻体内尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达被抑制时，水稻植株便出现雄性败育，花粉为100％典败型不育。

因此，本发明的第一个方面是通过转基因技术获得高效表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的植株，使转基因水稻的产量性状得到改良，提供了尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在提高水稻产量、培育高产新品种中的用途。

本发明的第二个方面是通过转基因技术抑制植物体内尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达，从而使水稻出现花粉不育，提供了尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在控制水稻育性、培育新型不育系中的用途。

在本发明中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因来源于植物的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。在本发明的实施例中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，更优选的是编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的基因。但是。编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶多肽的编码区序列可以与SEQID NO：1所示的编码区序列相同，或者是指编码具有SED ID NO：2的蛋白质但与SEDID NO：1所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

本发明中所指的转化包括花粉管通道法，基因枪法，农杆菌介导法，更优选农杆菌介导法。具体的，在有利于表达载体导入的条件下，将含有包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达载体导入水稻植株之中，使目的基因在植物体中的表达增强或表达抑制。

在本发明中通过选择性筛选出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达增强的转基因植株，并进一步筛选出生长和产量性状得到改良的植株。在此基础上更进一步筛选出显现生长和产量性状得到改良的植株的种子。

在本发明中通过选择性筛选出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达被抑制的转基因植株，并进一步筛选出花粉不育的植株。在此基础上，通过与正常可育植株的回交而获得种子。

众多文献报道已经分离了尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，不同生物的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因其核苷酸序列同源性较高，但均编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的氨基酸序列。本领域的技术人员可以通过在Gene bank^TM等数据库中检索得到尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的核苷酸序列。本发明从水稻克隆出的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

根据已知的核苷酸序列，利用分子生物学方法，可以直接从各种植物中分离用于本发明的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，构建表达载体。可选择地，利用已经分离和克隆到载体的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。或者，根据已知的核苷酸序列合成该基因。

在本发明中的具体实施例1中，应用两种引物：

UGPF(5’-ATTGGATCCATGGCGGTCGCCGCCGACGTG-3’)

UGPR(5’-CCGGGATCCTCAAAGATCCTCCGGACCGTTG-3’)

以克隆有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶全长基因的质粒作模板DNA，通过PCR方式合成并获得全长的水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。用BamHI 37℃消化该全长基因并克隆到表达载体中。

本发明中的“表达载体”包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增强表达载体和抑制表达载体。本发明提供的增强表达载体，其启动子能够使尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在植物细胞中能将该基因高效转录成mRNA。这样的启动子可以是非植物来源的启动子如椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)等，或植物来源的启动子。通过选择合适的启动子，可以产生生长加快产量增加的植株。优选的启动子是CaMV35S启动子和玉米泛素Ubiquitin启动子。

本发明提供的抑制表达载体包括RNAi载体或反义RNA载体。RNAi载体上克隆有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的一段双链RNA，转入植物中后，使得内源的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因不能表达，从而导致内源尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因基因的沉默。反义RNA载体上插入尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的反义RNA，转入植物中后，使得植物体内尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因mRNA降解，或翻译被抑制，达到抑制内源的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达的目的。

通过钙处理、冰冻和融化、或电穿孔等方法将构建的表达载体导入到具有植物感染能力的土壤农杆菌中，通过植物细胞与含有表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达载体的农杆菌的接触，在适当的条件下，可将目的基因导入植物细胞，然后再生出转基因植株。这些方法是本领域的技术人员公知的技术。同样，通过基因枪注射法和花粉管通道法也可获得所需要的转基因植物。

在本发明中的具体实施例3中，水稻的愈伤组织在农杆菌液中浸泡15-20分钟，然后共培养2天，再在选择性培养基上培养，选择性培养基为含有Carb和潮霉素的MS培养基。愈伤组织转移至选择培养基上每隔10-15天继代1次，然后转移至含有植物激素KT的MS培养基中再生出小苗，待再生苗长至5cm时移至含有NAA的生根培养基上。转基因植株生根后，移栽至盆栽或田间栽培，从而获得植物和种子。

在本发明中，转化增强表达载体的转基因T1代植株按照常规方法栽培，待到成熟后，通过考种，选择出生长旺盛和单株产量增加的植株，收获种子，进而培育成高产新品种。

转化抑制表达载体的转基因T1代植株按照常规方法栽培，抽穗时取出花药，通过碘化钾染色方法，观察花粉粒的育性，选择出完全不育的植株。通过与正常植株杂交，收获种子，培育出新型不育材料。

本发明具有如下优点：①指出了尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因不曾发现和记载的新性能。自1953年从酵母中分离出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶以来，人们知道尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是生物糖代谢中的一种重要酶。经研究发现，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达提高后，水稻植物生长更旺盛，结实更多，产量性状明显改善；而通过RNAi等方法抑制尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达后，水稻植株的生长没有受到影响，但是，花粉明显减少，花粉100％不育。这些都是不为人们所知的新性能而且，这些新的性能赋予转移因植物新的用途。②通过转基因手段，提高尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的表达水平，从而使水稻的植株更为高大，结实粒数和单株粒重等产量性状得到明显改善。而且这些性状能够在后代中稳定遗传，在育种中用于培养高产新品种。③通过RNAi和反义RNA等技术，抑制水稻中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达，从而使水稻的花粉败育，并且败育彻底，在育种中用于培育新的雄性不育水稻材料。

本发明中所用的术语“增强表达”，指尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因转入水稻中之后，使受体植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的转录水平和翻译水平提高。

本发明中所用的术语“抑制表达”，指尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因通过RNAi载体和反义RNA载体转入水稻中之后，使受体植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的转录水平和翻译水平降低。

本文中所用的术语“尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶”是指一类从植物中分离的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶。最优选的是具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质。

本文中的“基因”是指将编码构成蛋白质或多肽的氨基酸的核苷酸序列，这些序列可以是DNA形式或者RNA形式，DNA形式包括cDNA，基因组DNA，或人工化学合成的DNA。DNA可以是单链的或者是双链的，编码成熟蛋白质的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者为简并的变异体。简并的变异体在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差异的核苷酸序列。

本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地或瞬时地表达所导入的基因并产生具有特定的生物学性状的植物。

                           附图说明

图1植物表达载体T-DNA区示意图

A增强表达载体  B抑制表达载体-RNAi载体

hyp为潮霉素抗性基因，Ubil promoter为玉米泛素启动子，NOS尾巴为转录终止子。A中箭头所示为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的插入方向；该载体导入植物后，是转基因植物的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达增强；B中箭头所示为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因片断在intron两边正向和反向插入，导入植物后可形成具有抑制功能的hpRNA，是转基因植物中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达受到抑制。

图2转基因水稻的PCR鉴定

1为200bp ladder，2为阳性质粒对照，3为对照植株，4-15为转基因植株。结果显示在转基因植株中，外源尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因片已成功导入转基因植株中。

图3转基因水稻的Southern杂交鉴定

1为对照植株，2-8为转基因植株，箭头所指条带显示在转基因植株中不同拷贝数的外源尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的导入。

图4转基因水稻的Northern blotting鉴定

1为对照植株，2-9为转基因植株。结果显示，在转基因植株中，4号和9号植株的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达被抑制，其余植株均为增强表达。

图5转基因水稻花粉育性鉴定

A为对照植株的正常花粉；B为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达被抑制的水稻花粉，为100％典败型不育花粉；C为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增强表达的水稻花粉，为正常花粉。

图6转基因水稻与普通水稻的植株

图中A为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增强表达的水稻和对照植株，显示基因增强表达植株的生长和产量优势；B为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达被抑制的水稻和对照植株，显示表达被抑制的植株不能正常结实。

                            具体实施方式

下述实施例是对本发明的进一步详细说明，但不是以此限制本发明。

实施例1：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的增强表达载体构建

如图1A所示，本实验使用两种引物，其核酸序列分别为UGPF(5’-ATTGGATCCATGGCGGTCGCCGCCGACGTG-3’)和UGPR(5’-CCGGGATCCTCAAAGATCCTCCGGACCGTTG-3’)。以UGPF/UGPR作为引物组合，以克隆有水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶全长基因的质粒作模板DNA，通过PCR(94℃ 3min；94℃ 1min，68℃ 1min30s，26cycles；68℃ 10min)方式合成并获得全长的水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的全长基因。用限制性内切酶BamHI 37℃酶切尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，并将其连接入经限制性内切酶BamH1酶切、并经碱性磷酸酶去磷的中间载体pU1301中，使得尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因置于泛素启动子和NOS尾巴之间，得到增强表达载体；该表达载体的插入片段经DNA测序鉴定后，用来转化农杆菌。该表达载体转入植物中之后，可使转基因植株中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达增强。

实施例2：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的RNAi载体构建

如图1B所示，本实验使用四种引物，其核酸序列分别为：

F1(5’-TCTCTCGAGTCTAGACCTTATTGTGATTC 3’)

R1(5’-ATTAAGCTTATTCACATGCTCATCAGGGAC 3’)

F2(5’-CCTCTCGAGCCTTATTGTGATTCAAATTGAG 3’)

R2(5’-GAAAAGCTTGAATTCATTCACATGCTCATC 3’)

A、将尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的部分编码区正向插入到pHANNIBAL载体的第一个多接头位点中：

1目的片段的扩增  使用引物对F1/R1扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的编码区；

2酶切与连接  将纯化的PCR产物用Xho I和EcoR I双酶切后与同样双酶切的pHANNIBAL载体连接；

3重组质粒的酶切鉴定  构建的重组质粒转化大肠杆菌TOP10F’，小量抽提质粒，纯化后进行Xho I和EcoR I双酶切以鉴定阳性克隆，并将其命名为pKAN-1。

B、将尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的相同编码区反向插入到pKAN-1的另一多接头位点中：

1目的片段的扩增  使用引物对F2/R2扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的编码区；

2酶切与连接  将纯化的PCR产物用Xba I和Hind III双酶切后与同样双酶切的pHAN-1载体连接；

3重组质粒的酶切鉴定  构建的重组质粒转化大肠杆菌TOP10F’，小量抽提质粒，纯化后进行Xba I和Hind III双酶切以鉴定阳性克隆，并将其命名为pKAN-2。

C、将pKAN-2中的hpRNA片段克隆并连接到pU1301上，得到尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因抑制表达载体。该表达载体的插入片段经DNA测序鉴定后，用来转化农杆菌。

该载体转入植物中之后，可使转基因植株的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达受到抑制。

实施例3：农杆菌介导转化与转基因水稻植株的筛选

A.愈伤组织的诱导

1.剥去种子的外颖、内颖，选择成熟饱满的水稻种子，装入50ml离心管。

2.蒸馏水30ml清洗3次，70％乙醇浸泡2min，蒸馏水清洗3次，再用0.15％HgCl₂浸泡15-20min，同时100rpm振荡。

3.在无菌台打开离心管，倒出HgCl₂，用无菌水清洗种子4、5次后，把种子倒在灭菌的滤纸，放置约1h。

4.将种子置入N6固体培养基(10粒/25ml/瓶)，种胚朝上或接触培养基，28℃，暗培养4周，诱导出水稻愈伤组织。

5.观察诱导的愈伤组织，把淡黄色、致密的胚性愈伤与小盾牌分离后，转入新的N6，继代培养2周。

B.前培养

选择致密、相对干燥的胚性愈伤组织转移至新的N6培养基上，28℃下暗培养2天。

C.农杆菌的培养和悬浮

1.将带有表达载体的农杆菌适量涂布接种在含有相应抗生素的LB固体培养基上，对于LBA4404，28℃下暗培养36h即可。

2.向50ml离心管加入30ml 1/2 N6AS。然后，取灭菌小勺刮取农杆菌，用勺背面将菌体贴在管壁轻轻拍散，使细菌悬液的OD₆₀₀达到0.8～1.0。

D.感染和共培养

1.感染：把经过前培养的愈伤组织集中至一个平皿，一次性转入菌液中，轻轻转动管子使菌液均匀分布，感染时间约15-25min。

2.共培养：将菌液倒出，把愈伤组织在无菌滤纸上放置2h，保证菌液被吸干，接至1/2 N6AS中，20℃，暗培养1.5-2d。

E.农杆菌的去除

1.将共培养的愈伤组织装入50ml离心管，用无菌水清洗3次以上，至液体比较清亮。

2.最后一次倒出无菌水，加入含有头孢霉素(500mg/L)的N6液体培养基，于100rpm下，振荡15-20min，重复2-3次。

1.将愈伤组织倒在无菌滤纸上吸干2h以上。

F.愈伤组织的筛选

1.将干燥的愈伤组织转入含有头孢霉素(250mg/L)的N6培养基中，28℃暗培养7-10d。

2.将没有被农杆菌污染的愈伤组织转入含有头孢霉素(250mg/L)和潮霉素(50mg/L)的N6培养基中，28℃暗培养15～20d。

3.将愈伤组织转入仅含有潮霉素(50mg/L)的N6培养基中，28℃暗培养15～20d。

4.再一次将愈伤组织转入仅含有潮霉素(50mg/L)的N6培养基中，28℃暗培养15～20d。

G.分化与移栽

1.将最后一次筛选的愈伤组织移入含有潮霉素(50mg/L)的MS培养基中，28℃暗培养，12-15d。

2.选出长势良好的淡黄色愈伤组织，移入MS培养基中，光培养15-20d，可看到有绿芽长出，一般15d换一次培养基。

3.当绿芽的长度达到5cm左右时，剥去周围多余的愈伤组织，剪去根，移入1/2 MS生根培养中。长出根系后，将苗浸泡于自来水中，2天后即可将苗转入土壤中，按常规方法栽种至成熟。

H.PCR检测

小量法提取转基因水稻植株和对照植株的基因组DNA。分别用gus(5’-CTGTAGAAACCCCAACCCG-3’；5’-CCTTTGCCACGTAAGTCCG-3’)、hpt(5’AAAAGCCTGAACTCACCG-3’，5’-GCTCCATACAAGCCAACC-3’)、基因的相关引物扩增转基因植株和对照植株的基因组DNA，并以pU1301质粒作阳性对照。通过PCR(94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，33cycles；72℃ 10min；4℃ 5min)来筛选阳性植株。PCR产物用1％琼脂糖胶电泳分析，结果如图2所示，可以获得转基因植株。

实施例4：转基因水稻植株的Southern blotting鉴定

A CTAB法制备植物总DNA

1.称取水稻样本新鲜叶片8克，剪碎放入预冻的研钵中，用液氮磨成粉末。

2.转移粉末到预冻于-20℃的玻璃瓶中，加入适量预热至100℃的1.5×CTAB抽提液，迅速搅匀后置于56℃水浴中温浴20分钟。

3.取出玻璃瓶，冷却至室温(切忌低于15℃，以免CTAB发生沉淀)，将瓶中混合液倒入一支50ml离心管中，加入20ml氯仿/异戊醇(24∶1)。反复颠倒充分混匀，室温下以4000rpm的速度离心20分钟。

4.将上层液倒入另一新的50ml离心管，加入1/10体积10％CTAB(预热至56℃)及等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀，4000rpm室温离心20分钟。

5.转移上清液至另一新的50ml离心管，加入等量的1％CTAB沉淀液，轻轻摇晃直至形成DNA絮状沉淀。3000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底。

6.加入5ml 1M NaCl及5μl RNaseA，置于56℃水浴中过夜。待DNA完全溶解后，加10ml 95％冰乙醇使DNA沉淀。挑出DNA，用76％乙醇浸泡30分钟脱盐，再用95％乙醇脱水5分钟。

7.风干DNA，溶于适量TE溶液中，存于4℃备用。

B.DNA的限制性消化，电泳与Southern转移

1.电泳检测总DNA质量。调节所有样品DNA浓度至200-400ng/μl。

2.每样品取2.5ng总DNA，用限制性内切酶进行消化，反应体积为15μl。置于37℃恒温箱中6小时后，加入1.5μl溴酚兰终止酶切反应，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切质量。酶切反应液配方如下：

DNA                               2.5ng

10×buffer                        1.5μl

Restriction Enzyme                8.0unit

加水至15μl

3.通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，电泳缓冲液为1×TAE，电压40V，过夜。

4.将凝胶切成19.5×9.5cm大小，放在0.2N HCl中变性8分钟，迅速用0.4N NaOH溶液作为转移液通过毛细作用原理使胶上DNA片段转移到Hybond-N⁺尼龙膜上。转移24小时后取出膜，用2×SSC漂洗两次(各5分钟)，晾干放入100-120℃真空烘箱中烘烤3小时，使DNA固定于膜上。

C.探针标记

1.取适量待标记的探针DNA，加水至一定体积，于100℃干浴变性10分钟，冰浴5分钟。

2.预先配制dNTP、随机引物缓冲液和Klenow Fragment酶混合液，分装到装有探针DNA的Eppendorf管。

3.最后往管中加入适量体积α-³²P-dctp，混匀，25℃温浴2小时以上。

D.Southern杂交

1.将新杂交膜用2×SSC打湿，装入杂交袋中。加入适量体积(10-20ml)预热至65℃的预杂交液，赶出气泡，封口后于65℃恒温摇床预杂交10小时以上。使用过的旧膜杂交3小时左右即可。

2.取出标记好的探针，加入500μl杂交液，于100℃干浴变性10分钟，冰浴5分钟。

3.将变性探针加入杂交袋中，赶出气泡并封口，于65℃恒温摇床中杂交8-10小时。

E.洗膜，压片及显影

1、杂交完成后，取出杂交膜，用2×SSC，0.1％SDS洗液在室温下冷漂洗一次，再用预热至65℃的洗液(1×SSC或0.5×SSC，0.1％SDS)于65℃摇床热洗两次，各15分钟。晾半干，迅速用保鲜膜包裹，放入暗夹。

2、在暗室里装入X-光片，把暗夹放在-20℃冰箱中放射自显影4-7天，冲洗X-光片。

Southern blotting鉴定结果如图3所示，根据鉴定结果，可选择出外源尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因整合的转基因植株。

实施例5：转基因水稻植株的Northern blotting鉴定

A.RNA的提取：

RNA提取用TRIZOL Reagent试剂盒(GIBCOL/BRL)，按试剂盒提供的操作指南进行。

1.先将转基因水稻幼苗在液氮中研磨成粉。将粉末分装到Eppendorf中，每管分装100mg左右。每管加入1ml TRI_ZOL试剂，混匀，室温放置5min。加入氯仿200μl，用力振荡15sec，室温孵育2～3min。

2. 4℃下离心(12000×g，15min)，混合物分为红色的酚-氯仿相(下相)、白色的中间相以及无色的上层水相。RNA在上层水相中。

3.转移上层水相(500μl)到一个新的Eppendorf管中，加入1ml无水乙醇，以沉淀RNA。

4.室温孵育10min以上，4℃条件下离心(12 000×g，10min)，可见白色的RNA沉淀贴于管底壁。

5.吸弃上清，用70％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，4℃条件下离心(7 500×g，5min)

6.吸弃上清，空气中自然干燥，用DEPC水溶解沉淀，-70℃保存备用。用紫外分光光度计测定RNA浓度及存度，A₂₆₀/A₂₈₀＞1.8。

B.RNA电泳

1.MOPS/甲醛凝胶制备  含1.5％的琼脂糖，0.7M的甲醛，1×MOPS。

2.RNA样品的制备和电泳  向Eppendorf管中加入8μl RNA，5.5μl甲醛，15μl甲酰胺，1.5μl 10×MOPS。于55℃加热样品15min使RNA变性，再加入3μl溴酚兰和1μl溴化乙锭。上样后，选择最适条件进行电泳。持续电泳约3h，直到溴分兰到达凝胶底部。

C.通过毛细管原理将RNA转移至膜上

电泳后，用双蒸水漂洗凝胶15min，并轻缓摇动。然后，再用10×SSC浸泡凝胶两次，每次15min，轻缓摇动。用10×SSC作为转移液，通过毛细管作用原理使凝胶中的RNA转移到Hybond-N⁺尼龙膜上，转移24h后取出膜，晾干放入80℃烘箱中烘烤2h，使RNA固定于膜上。

D.探针标记

1.模板制备  调整DNA浓度至25ng/μl，95～100℃干浴变性2min，快速置于冰上。

2.在冰上依次向Eppendorf管中加入水35μl，Labeling 5×buffer 5μl，unlabeled dNTP(dATP，dGTP，dTTP均为1.5mM)2μl，变性DNA模板1μl，BSA2μl，[α-³²P]dCTP 5μl，DNA聚合酶Klenow片段1μl混匀，室温标记1h。

E.杂交、洗膜与放射自显影同Southern blotting。所得结果如附图4，根据Northern blotting鉴定结果，结合植株的形态分析，选择出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达增强或抑制的植株。

实施例6：转基因水稻的花粉育性鉴定

1水稻栽培

转基因水稻和作为对照的转基因受体水稻品种H1493于春季5月上旬播种于武汉大学水稻研究基点试验田，28天秧龄，按5×8寸规格移栽，其后，保持肥水供应，栽种植株至成熟按常规方法管理，记录生育期。

2花粉育性观察

在水稻抽穗期，每日早晨在田间从转基因植株和对照植株上选取已抽出1/3的稻穗，放置于4℃冰箱中备用。检查花粉粒育性时，在每个稻穗的中上部选取当天开放的颖花，取出花药放置于载玻片上，加1滴KI溶液，用镊子夹碎花药，除去残渣后，在显微镜下观察。根据形态和染色程度，将花粉分败育和正常可育2种类型。对照水稻植株(图5A)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达增强植株(图5C)的花粉粒饱满，经KI染为黑色；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达被抑制的植株的花粉数量少(图5B)，形状不规则，空瘪，不为KI染色。根据花粉育性和Northernblotting鉴定，选择出尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达被抑制的雄性不育水稻。

实施例7：转基因水稻的产量性状鉴定

1水稻栽培方法同上。

2产量性状鉴定

水稻正常成熟后，收割对照水稻植株和转基因水稻植株作产量性状考察。考察项目包括株高，穗数，结实粒数，千粒重和单株粒重。如表一和附图6A所示，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增强表达的植株比较高大，穗数、实粒数和单株产量均比对照大幅度增加，表现出明显的生长和产量优势。根据考种结果和Southernblotting、Northern blotting鉴定，选择出产量性状得到改良，产量提高的水稻。

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达抑制的植株(图6B)形态性状与对照基本相同，但成熟时不结实，穗为直立。

表一：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因增强表达水稻与对照的产量性状

材料              穗数    结实粒数     千粒重      单株产量    与对照比

                                       (g)         (g)         (％)

转基因水稻39-7    45      2677         23.66       63.3        203

转基因水稻39-1    46      2425         22.27       54          173

转基因水稻14-3    30      1842         23.89       44          141

H1493(对照)       44      1291         24.1        31.1        100

               SEQUENCE  LISTING

<110>武汉大学

<120>尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在水稻中的应用

<130>尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在水稻中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1707

<212>DNA

<213>水稻

<400>1

ggcacgaggc tcctctcctc tcatctgaca tatctcctcc cgtcctttcg aagcctctcg     60

aatcgcatcg ccgagccgga tggcggtcgc cgccgacgtg aagctcgagg gcctccgcgc    120

cgccaccgac aagctcgacc agatcagcga gaacgagaag tccgggttca tcagcctcgt    180

ttcgcgctac ctcagcggcg aggcggagca gatcgagtgg agtaagatcc agaccccgac    240

cgacgaggtg gtggttccct acgacacgct ctcggctgct cccgaagatc tcaacgagac    300

gaagaagctg ctcgacaaac tcgtcgtgct caagctcaat ggaggcctcg ggacgaccat    360

gggctgcact ggtcccaagt ctgtcattga agtccgcaat ggctttacgt ttctagacct    420

tattgtgatt caaattgagt ccctgaacaa gaagtatgga tgcaatgtcc ctttgcttct    480

aatgaactca ttcaacactc atgatgacac acagaagatt gttgagaagt actccaactc    540

caacattgaa attcacactt tcaaccagag ccaatatcct cgcattgtta ctgaagactt    600

cttgccactt ccaagcaagg ggaagactgg caaggatggc tggtatcccc caggccatgg    660

tgatgtgttc ccctccttga ataacagtgg aaaacttgat accttgttgg cacagggcaa    720

ggagtatgtc tttgtcgcga actcggacaa cttgggtgct attgttgaca tcaagatctt    780

aaaccacctg atccataacc agaacgagta ctgtatggag gttactccta aaacattggc    840

tgatgttaaa ggtggtaccc tcatctctta cgaagggaga gttcagctgt tggagattgc    900

tcaagtccct gatgagcatg tgaatgaatt caagtcaatt gagaagttca agatcttcaa    960

taccaacaac ctgtgggtaa acttgaaggc catcaagagg ctggtagaag ctgaagcact   1020

taagatggaa atcattccta accctaagga agttgatggt gtgaaagttc tgcaactcga   1080

aactgcagct ggagcagcca ttcggttctt tgaaaaagca attggcatta atgttccccg   1140

ctcgagattt ctgccagtca aggctacatc tgatttgttg cttgtacagt ctgatttgta   1200

caccttggtc gatggctttg tcatccgcaa cccagccaga acaaacccat caaacccttc   1260

gattgagctt ggacctgagt tcaagaaggt tgccaatttc ctggcccggt ttaagtcaat   1320

ccccagcatt gtcgagcttg acaccttgaa ggtctctggt gatgtctggt tcggctctgg   1380

agttacactc aagggtaagg tgaccatcac cgccaagtca gggaagttgg agatcccaga   1440

tggagccgtg cttgagaaca aggacatcaa cggtccggag gatctttgag gctgctcacg   1500

gaaaccttcc agatatattt agctgagcgt tttgtaattg tcgtgtgcat tcggcagcca   1560

gggctcgatg atcccattac agaataattg taatcatctt ggcacatccg tacttctgtt   1620

ttttggtgtg ccaagggcgt tgtatttcat ttacttaaat gatctcgtaa taccatagtt   1680

ttgcatgcac aaaaaaaaaa aaaaaaa                                       1707

<210>2

<211>469

<212>PRT

<213>水稻

<400>2

Met Ala Val Ala Ala Asp Val Lys Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ala Thr

1                 5                      10                      15

Asp Lys Leu Asp Gln Ile Ser Glu Asn Glu Lys Ser Gly Phe Ile Ser

             20                      25                       30

Leu Val Ser Arg Tyr Leu Ser Gly Glu Ala Glu Gln Ile Glu Trp Ser

         35                      40                      45

Lys Ile Gln Thr Pro Thr Asp Glu Val Val Val Pro Tyr Asp Thr Leu

     50                      55                      60

Ser Ala Ala Pro Glu Asp Leu Asn Glu Thr Lys Lys Leu Leu Asp Lys

65                       70                      75              80

Leu Val Val Leu Lys Leu Asn Gly Gly Leu Gly Thr Thr Met Gly Cys

                     85                      90               95

Thr Gly Pro Lys Ser Val Ile Glu Val Arg Asn Gly Phe Thr Phe Leu

                100                     105             110

Asp Leu Ile Val Ile Gln Ile Glu Ser Leu Asn Lys Lys Tyr Gly Cys

            115                     120             125

Asn Val Pro Leu Leu Leu Met Asn Ser Phe Asn Thr His Asp Asp Thr

    130                     135                     140

Gln Lys Ile Val Glu Lys Tyr Ser Asn Ser Asn Ile Glu Ile His Thr

145                     150                     155                160

Phe Asn Gln Ser Gln Tyr Pro Arg Ile Val Thr Glu Asp Phe Leu Pro

                    165                     170                 175

Leu Pro Ser Lys Gly Lys Thr Gly Lys Asp Gly Trp Tyr Pro Pro Gly

                180                     185                 190

His Gly Asp Val Phe Pro Ser Leu Asn Asn Ser Gly Lys Leu Asp Thr

            195                     200                 205

Leu Leu Ala Gln Gly Lys Glu Tyr Val Phe Val Ala Asn Ser Asp Asn

        210                     215                 220

Leu Gly Ala Ile Val Asp Ile Lys Ile Leu Asn His Leu Ile His Asn

225                     230                 235                     240

Gln Asn Glu Tyr Cys Met Glu Val Thr Pro Lys Thr Leu Ala Asp Val

                    245                 250                     255

Lys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Tyr Glu Gly Arg Val Gln Leu Leu Glu

                260                 265                     270

Ile Ala Gln Val Pro Asp Glu His Val Asn Glu Phe Lys Ser Ile Glu

            275                 280                     285

Lys Phe Lys Ile Phe Asn Thr Asn Asn Leu Trp Val Asn Leu Lys Ala

        290                 295                     300

Ile Lys Arg Leu Val Glu Ala Glu Ala Leu Lys Met Glu Ile Ile Pro

305                     310                     315                     320

Asn Pro Lys Glu Val Asp Gly Val Lys Val Leu Gln Leu Glu Thr Ala

                325                      330                     335

Ala Gly Ala Ala Ile Arg Phe Phe Glu Lys Ala Ile Gly Ile Asn Val

            340                       345                     350

Pro Arg Ser Arg Phe Leu Pro Val Lys Ala Thr Ser Asp Leu Leu Leu

        355                     360                     365

Val Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Val Asp Gly Phe Val Ile Arg Asn

    370                     375                     380

Pro Ala Arg Thr Asn Pro Ser Asn Pro Ser Ile Glu Leu Gly Pro Glu

385                     390                     395                 400

Phe Lys Lys Val Ala Asn Phe Leu Ala Arg Phe Lys Ser Ile Pro Ser

                  405                    410                      415

Ile Val Glu Leu Asp Thr Leu Lys Val Ser Gly Asp Val Trp Phe Gly

              420                    425                     430

Ser Gly Val Thr Leu Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Lys Ser Gly

         435                     440                     445

Lys Leu Glu Ile Pro Asp Gly Ala Val Leu Glu Asn Lys Asp Ile Asn

    450                     455                     460

Gly Pro Glu Asp Leu

465

Claims (3)

1、一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在水稻中的应用。

2、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在提高水稻产量中的应用。

3、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在控制水稻育性中的应用。

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