CN112048489B - 水稻中两个二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因及其编码蛋白的工程应用 - Google Patents

水稻中两个二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因及其编码蛋白的工程应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻中两个二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因及其编码蛋白的工程应用。水稻二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因OsAGPL1和/或OsAGPS1在调控水稻对磷素的吸收及利用中的应用。一种促进水稻对磷素吸收和利用的方法，突变、沉默或抑制水稻中OsAGPL1和/或OsAGPS1的表达，以促进水稻对磷素吸收和利用。突变OsAGPL1和OsAGPS1单/双基因，有利于提高水稻在磷供应充足条件下对磷素吸收及无机磷在水稻体内的积累。

Description

水稻中两个二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因及其编码蛋白 的工程应用
技术领域
本技术发明属于植物基因工程领域，涉及两个水稻二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因 OsAGPL1和OsAGPS1及其编码的蛋白质的应用。
技术背景
水稻是世界重要的粮食作物之一，全球一半的人口以水稻为主食。水稻的生长发育离不开植物必需营养元素，这其中就包括了磷(Phosphorous,P)。磷广泛地参与到了植物的能量转移、信号转导、蛋白磷酸化与光合作用等重要过程。同时，磷也是一些关键生物大分子的不可替代的组成部分，如ATP、核酸和磷脂等。土壤中可被植物吸收的磷主要是无机正磷酸盐(Phosphate, Pi)，由于其易与金属离子形成沉淀的化学特性，土壤中磷的有效性往往很低，这也成了限制植物生长发育的主要限制因子之一。在缺磷条件下，植物会产生一系列生理学反应，如根系构型的改变、有机酸的分泌、与菌根真菌形成互惠共生体，并且伴随着一些典型症状，如地上部淀粉和蔗糖的积累以及蔗糖向根部运输的增强等。这些结果表明，水稻磷代谢的过程与碳代谢的过程存在着一定的交互作用。所有这些现象都是受一系列精密而复杂的分子机制调控的，研究植物缺磷响应基因是通过以转基因为主导技术的遗传改良方法培育磷素高效的农作物高产优质品种，开发土壤磷库，从而大幅度提高磷肥的利用效率的基础工作，具有重大的社会与经济意义。
二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase在植物淀粉合成反应第一步(限速步骤)中起催化作用。其通过催化一分子的一磷酸葡萄糖和一分子的ATP形成一分子的二磷酸腺苷葡萄糖和一分子副产物焦磷酸。生成的二磷酸腺苷葡萄糖将为淀粉链加长反应中葡萄糖基的供体参与到淀粉合成过程中。根据已有报道，植物体中具有酶活性的AGPase是由两个相同的AGPase大亚基和两个相同的AGPase小亚基组成的异源四聚体进而行使功能的。我们的研究从水稻中鉴定了一个负责编码大亚基的OsAGPL1和负责编码小亚基的OsAGPS1。研究表明，这两个基因在转录水平上受到缺氮和缺磷胁迫强烈上调表达。两个基因可以通过在转录水平上调控SPX2基因，从而调控其下游磷酸盐转运蛋白基因的表达，进而影响水稻体内的磷稳态。因此，本发明提出利用OsAGPL1和OsAGPS1来促进在磷供应充足条件下促进水稻对磷素的吸收和转运方面的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供水稻OsAGPL1和OsAGPS1基因及其编码蛋白的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
水稻二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因OsAGPL1和/或OsAGPS1在调控水稻对磷素的吸收及利用中的应用；OsAGPL1基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的登录号为： LOC_Os05g50380，在The Rice Annotation Project数据库的登录号为：Os05g0580000。OsAGPS1 基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的登录号为：LOC_Os09g12660，在The Rice Annotation Project数据库的登录号为：Os09g0298200。
水稻二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因OsAGPL1和OsAGPS1的编码产物在调控水稻对磷素的吸收及利用。
一种促进水稻对磷素吸收和利用的方法，其特征在于突变、沉默或抑制水稻中OsAGPL1 和/或OsAGPS1的表达，以促进水稻对磷素吸收和利用。
本发明的有益效果
1.本发明利用特异引物研究了OsAGPL1和OsAGPS1在水稻中的表达，发现两基因在水稻地上部受缺氮和缺磷胁迫诱导表达。
2.本发明构建了两个基因的启动子融合GUS报告基因的转基因材料，通过GUS染色实验发现两个基因在营养生长的水稻组织部位中均有表达。
3.突变OsAGPL1和OsAGPS1单/双基因，有利于提高水稻在磷供应充足条件下对磷素吸收及无机磷在水稻体内的积累。
附图说明
图1 RT-qPCR分析OsAGPL1和OsAGPS1在营养生长时期对各种缺素胁迫的响应情况。每个系列从左至右依次代表：Ctrl、L、K、Mg。
图2 RT-qPCR分析OsAGPL1和OsAGPS1在营养生长时期对低氮(LN)和低磷(LP)胁迫的响应情况。
图3利用启动子融合GUS报告基因分析OsAGPL1和OsAGPS1的组织定位情况。
图4 OsAGPL1 Tos17转座子插入突变体的鉴定
图5 CRISPR-Cas9技术创制的OsAGPS1突变体的鉴定
图6 CRISPR-Cas9技术创制的agpl1 agps1双突变体的鉴定
图7 OsAGPL1和OsAGPS1的突变体材料在全营养(Ctrl)、低氮和低磷条件下的表型(A图)、生物量(B图)及无机磷含量(C图)；其中B图和C图中每个系列从左至右依次代表：WT、突变体agpl1、突变体agps1、突变体agpl agps1。
图8利用放射性32P同位素标记法分析OsAGPL1和OsAGPS1的突变体材料在全营养、低氮和低磷条件下对磷素的吸收。
图中每个系列从左至右依次代表：WT、突变体agpl1、突变体agps1、突变体agplagps1。
具体实施方式
实施例1 OsAGPL1和OsAGPS1的表达研究
1)总RNA的提取和cDNA的合成
对野生型(Wild Type,WT)水稻日本晴品种(Oryza sativa L.ssp.japonicacv.Nipponbare)在不同缺素条件下培养10天，包括全营养、缺磷、缺氮、缺钾和缺镁处理。将WT种子用30％次氯酸钠消毒30min后，28度培养箱避光浸种约2d。露白后移至黑网做的飘上，0.5mM CaCl2 pH 5.6处理并用锡箔纸遮光，并将种子移至人工气候室培养(温度光照30℃/黑暗22℃，光照周期14h昼/10h夜)。第一片叶露尖，开始供应1/2Yoshida(国际水稻所改版后的)营养液，两天一换。长至三叶一心至四叶大小移苗，开始进行全营养、缺氮、缺磷、缺钾和缺镁处理，营养液同样两天一换至10d。把植物样品分割为根部、叶片和叶鞘三个部位，用液氮迅速冷冻并保存于-80℃冰箱中。将保存的样品在液氮中用研钵裂解组织和细胞，并用TRIzol Reagent (Invitrogen,USA)抽提总RNA。用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop仪器检测所提取总RNA的完整性与浓度。用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒进行cDNA的合成。 2)RT-PCR分析OsAGPL1和OsAGPS1对不同缺素胁迫的响应情况
分别以OsAGPL1和OsAGPS1的基因号Os05g0580000、Os09g0298200在数据库中获得其 cDNA序列，并根据序列保守型选择特异性较高的3’非翻译区(3’UTR)设计特异引物进行定量 RT-PCR(RT-qPCR)分析，引物序列如下：L1-Q-F:AGCTGCCCCGAGTGAAGTAG(SEQ IDNo.1)，L1-Q-R:ACACATGAGATGCACCAACGA(SEQ ID No.2)，S1-Q-F: TCCAGTGCACATCAAGCAATC(SEQ ID No.3)，S1-Q-R: GCTTGGTGAACTGGCAGCAT(SEQ ID No.4)。使用水稻Actin(Os03g0718100)基因作为内参基因。定量结果显示，OsAGPL1和OsAGPS1在营养生长时期的水稻的叶片和叶鞘中受到缺氮和缺磷胁迫诱导，而在水稻根部中没有显著诱导上调(图1)。
实施例2 OsAGPL1和OsAGPS1对不同时间点低氮和低磷胁迫的响应情况
与实施例1中的发苗过程一直，但处理设三个，全营养(Ctrl)、低氮(LN)和低磷(LP)，分别在处理第0、1、3、5、7、10天采取水稻地上部样品并对缺素处理回补所缺的营养元素，于第 11天和12天采集地上部的样品，提取RNA并反转录为cDNA。使用实施例1中的定量引物对OsAGPL1和OsAGPS1基因的表达情况进行检测。结果表明，两个基因在低氮处理下的第三天表达就有显著提高，并随着低氮处理时间的增加持续表达量持续提高并在处理7天时达到峰值。氮素回补1天，两个基因的表达量恢复到初始水平。两个基因在低磷胁迫处理的第7 天表达量发生显著上调，并于低磷处理第10天达到峰值。与低氮处理类似，磷素回补1天，两个基因的表达量即恢复到初始水平(图2)。
实施例3启动子融合GUS报告基因材料分析组织定位情况
1)基因组DNA的提取(TPS法)
TPS提取液的配制(500ml)
1M Tris-HCl(pH 8.0) 50ml
0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml
KCl 37.25g
剪一小段水稻日本晴品种叶片样品(样品质量不能太大，一般不超过0.05g)，用液氮研磨成粉末，然后转移到2ml Ep管中，加入500ml提取剂，涡旋混匀。将样品65℃水浴20min，期间上下颠倒两三次。将样品4℃，8000rpm，离心5min。转移上清液至新的1.5ml Ep管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min。再次将样品4℃，4000rpm，离心5min。弃上清，加入1ml 70％的乙醇，洗涤DNA沉淀。室温，4000rpm，离心2min，弃上清，空气干燥10min后ddH2O溶解DNA沉淀。
2)启动子融合报告基因材料的创制
选取AGPL1基因翻译起始密码子ATG前2300bp的长度和AGPS1基因翻译其实密码子ATG前2346bp的长度作为候选启动子序列，导入Primer Premier 5.0软件分析限制性内切酶分布情况。选用KpnI作为载体线性化的内切酶。设计扩增引物如下:
PL1-F:TCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCCGGTACTTCCTCCGTCTT(SEQ ID No.5)
PL1-R:TTTACCCTCAGATCTACCATGGTACCGTTGAAATTCACCTGCAAGGT(SEQ ID No.6)
PS1-F:TCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCTAGAGAGAGTCATTTTTGGAG(SEQ ID No.7)
PS1-R:TTTACCCTCAGATCTACCATGGTACCGGGAGAGCAACGGCCGA(SEQ ID No.8)
引物合成由金斯瑞公司完成。以日本晴基因组DNA为模板，用KOD FX高保真酶对目的片段进行扩增，跑胶后切割下与目的片段大小一致的胶块，用AXYGEN凝胶试剂盒回收。同时，用KpnI将载体pCAMBIA1300-GN线性化，并纯化。用诺唯赞Vazyme公司的一步法克隆试剂盒(
Figure RE-GDA0002751115110000051
II One Step Cloning Kit)将回收的启动子片段克隆到线性化后的载体上，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含有卡那霉素抗性的固体LB培养基上过夜。挑取部分菌落接菌到含有卡那霉素的液体LB培养基中，继续培养12h。将菌液送至测序企业进行测序，测序通过即为所需的表达载体。通过根癌农杆菌介导的水稻转基因方法将其转入水稻品种日本晴。待获得的转基因植株通过分子鉴定后，即为启动子融合GUS报告基因的转基因植株。
3)启动子材料的GUS染色
参考实施例1中的发苗方法，将启动子融合GUS报告基因材料进行全营养水培两周。分别取不同的组织部位浸泡在GUS染液中，37℃孵育3小时。地上部位用100％的乙醇进行反复脱色直至叶绿素被完全洗净。用体视镜观察GUS染色结果。
结果显示，AGPL1和AGPS1基因在水稻的叶片、叶鞘和茎基部节处均有表达，且两个基因在初生根和冠根根尖的伸长区和成熟区均有表达。仅AGPL1在根冠处有表达(图3)。
实施例4 AGPL1和AGPS1突变体材料的表型及无机磷含量测定
1)突变体材料的筛选与鉴定
在日本水稻Tos17插入突变体库中查找并购买了OsAGPL1基因的一个突变体株系，编号 NF3982。根据突变体网上已知，Tos17突变体插在OsAGPL1基因的第5个外显子上。通过两轮PCR法鉴定为纯合突变，鉴定引物为：NF3982-F：acctctctccaacaggagca(SEQ IDNo.9)；N F3982-R：atgatttgcgtggttgttga(SEQ ID No.10)；Tail6：aggttgcaagttagttaaga(SEQ ID No.11)，引物在基因组上位置见图4。此外，通过RT-PCR检测发现OsAGPL1被完全敲除(图4)，RT -PCR引物为上述SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，因此NF3982可作为OsAGPL1的功能缺失突变体。
本文又利用CRISPR/Cas9技术构建了OsAGPS1的突变体。选用的spacer序列如下，SS- 1:acgcggagttgaactgtgtc(SEQ ID No.12)。依照spacer的序列设计与之相匹配的引物并引入Bs aI酶切位点，序列为SS-1-BsaI-F：ggcaacgcggagttgaactgtgtc(SEQ ID No.13)，SS-1-BsaI-R：a aacgacacagttcaactccgcgt(SEQ ID No.14)，其中小写字母为BsaI位点酶切后的粘性末端。将正向和反向引物即SS-1-BsaI-F和SS-1-BsaI-R混合，并于PCR仪上温度由高到低退火形成双链 DNA，其条件为95℃30s,72℃30s,55℃30s,37℃30s,25℃30s，15℃hold。将克隆载体pOs-sgRNA用BsaI酶线性化，并用T4 ligase连入spacer双链DNA。将连有spacer且测序通过的克隆载体及表达载体pH-Ubi-cas9-7混合，利用gateway LR反应试剂盒将质粒重组，并转化大肠杆菌。测序通过后的载体转入农杆菌感受态中，利用农杆菌介导的水稻愈伤组织侵染法获得转基因植株。通过对转基因植株中OsAGPS1基因测序并分析其序列，选取了一个突变体株系，该株系的外显子中插入一个碱基并均导致移码突变(图5)，因此可作为OsAGPS1的功能缺失突变体以供后续工作中使用。
此外，为了获得agpl1 agps1双突变体，在OsAGPL1的Tos17突变体(图4)的基础上继续采用CRISPR-Cas9技术突变OsAGPS1，获得的突变体株系中出现一处单碱基替换(A变T)和一处2碱基缺失并分别导致氨基酸替换(苏氨酸变丝氨酸)和移码突变(图6)，因此该突变体可作为OsAGPL1和OsAGPS1双基因功能缺失突变体使用。
2)突变体材料的表型分析及无机磷含量的测定
水稻种子萌发及前期预处理与实施例1中相同，处理为全营养(Ctrl)、低氮(LN)和低磷(LP) 条件下培养两周。培养结束后对水稻植株拍照，并分地上部和根部进行采样与称重。无机磷浓度的测定选用高氯酸提取-钼蓝比色的方法。
结果显示，OsAGPL1和OsAGPS1基因的突变均未影响水稻营养生长时期的长势。突变体材料地上部和根部的生物量在Ctrl、LN和LP处理条件下与野生型材料均无显著差异。值得注意的是，突变体材料在Ctrl和LN，即供磷充足条件下，其地上部和根部的无机磷含量均显著高于相同处理下的野生型材料。而在低磷条件下，突变体的无机磷含量与野生型材料相比没有显著差异(图7)。
实施例5 AGPL1和AGPS1突变体材料对磷素吸收的检测
将日本晴WT与OsAGPL1和OsAGPS1基因的突变体种子经消毒，暗培后移至人工气候室中，用1/2国际水稻所营养液配方培养至3叶1心。挑选长势一致的苗进行全营养(Ctrl)、低氮(LN)和低磷(LP)处理。为了将水稻根部吸附的磷洗脱，将预处理中的水稻植株用Solution1 培养10min。(Solution1含0.5mM CaCl2,2mM MES,pH 5.5)预先配制的水稻营养液中加入放射性同位素32P标记的磷酸盐，至放射性终活度为10μCi/L，用玻璃棒混匀。要根据同为素的新鲜程度，计算所加同位素母液的量。将水稻苗置与含有同位素的培养液中培养5min。将吸收了同位素5min的水稻植株的根部浸入提前预冷的Solution 4中处理10min，以洗脱根表吸附的同位素32P。(Solution4含有0.5mM CaCl2,100μM KH2PO4,2mM MES,pH5.5)用无屑吸水纸将水稻根表沾有的多余水分吸干，用剪刀剪下根部称重，并置于10mL的离心管中。采用高氯酸-双氧水的方法进行消解。每0.1g根样品加入1mL的高氯酸，涡旋保证根部完全没入酸液中后放置过夜。每1mL的高氯酸中加入2mL的双氧水，涡旋混匀后置于70℃水浴锅中消解样品3h至样品变为澄清无色溶液。期间每半小时涡旋一次样品，促进消解过程的进行。吸取消解液上清300μL置于无刻度的5mL离心管中，加入3.5mL闪烁液(PerkinElmer Ultima Gold LLT)，用力混匀直至无乳白色沉淀。若仍有沉淀，说明消解液中有双氧水残留，需继续加热至双氧水完全分解。将混合液避光放置过夜以消除化学发光。将5mL离心管置于与利用液体闪烁计数仪(Beckman Counter LS6500)的型号相配的白色上样瓶中，并测定放射性活度。
结果显示，OsAGPL1和OsAGPS1的突变体材料根中所含放射性同位素32P在Ctrl和LN处理下显著高于野生型材料根中所含的32P。而LP条件下，突变体材料与野生型根中所含32P的含量没有显著差异(图8)。
上述实施例表明，通过反向调控本发明中的OsAGPL1和OsAGPS1基因可促进水稻对磷素的吸收及积累。
本发明人从单子叶植物水稻(Oryza sativa)筛选到了两个与淀粉合成相关的基因OsAGPL1 和OsAGPS1。RT-qPCR结果表明，这两个基因在水稻地上部均受到低氮和低磷胁迫的诱导表达且随着胁迫时间的增加表达强度有上升的趋势，而随着所缺营养元素的回补两个基因的表达量均可迅(1天)速恢复到正常水平。这两个基因的突变不会影响水稻营养生长时期的长势，但会促进水稻对无机磷的吸收及积累。本发明为培育高磷素吸收及积累水稻品种提供了保障。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 水稻中两个二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因及其编码蛋白的工程应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctgccccg agtgaagtag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acacatgaga tgcaccaacg a 21
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<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcttggtgaa ctggcagcat 20
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 7
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<400> 8
tttaccctca gatctaccat ggtaccggga gagcaacggc cga 43
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 9
acctctctcc aacaggagca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgatttgcg tggttgttga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggttgcaag ttagttaaga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgcggagtt gaactgtgtc 20
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcaacgcgg agttgaactg tgtc 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacgacacag ttcaactccg cgt 23

Claims (3)

1.水稻二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因OsAGPL1和/或OsAGPS1在调控水稻对磷素的吸收及利用中的应用；OsAGPL1基因在The Rice Annotation Project 数据库的登录号为：Os05g0580000；OsAGPS1基因在The Rice Annotation Project 数据库的登录号为：Os09g0298200。
2.水稻二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶基因OsAGPL1和OsAGPS1的编码产物在调控水稻对磷素的吸收及利用；OsAGPL1基因在The Rice Annotation Project 数据库的登录号为：Os05g0580000；OsAGPS1基因在The Rice Annotation Project 数据库的登录号为：Os09g0298200。
3.一种促进水稻对磷素吸收和利用的方法，其特征在于抑制水稻中OsAGPL1和/或OsAGPS1的表达，以促进水稻对磷素吸收和利用；OsAGPL1基因在The Rice AnnotationProject 数据库的登录号为：Os05g0580000；OsAGPS1基因在The Rice AnnotationProject 数据库的登录号为：Os09g0298200。
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