CN1632123A - 沙蒿AdZFP1转录因子基因及其在培育耐旱植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从沙蒿中克隆了一个新的RING型锌指蛋白转录因子基因(AdZFP1)，并可利用此基因采用转基因技术来提高植物抗旱性。采用mRNA差异显示技术结合RACE技术从沙蒿中获得RING型锌指蛋白转录因子基因AdZFP1，该基因编码一条由445个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白的324－372位氨基酸为RING型锌指蛋白domain，该基因与拟南芥中的RING型锌指蛋白转录因子基因(_AAC79588)在氨基酸水平上有66％的同源性。构建了该基因的植物表达载体，采用农杆菌介导法和基因枪法将该基因转入植物中，在转基因实验体系中研究了该基因的耐旱相关功能。结果表明，转AdZFP1基因显著地提高植株的耐旱性。

Description

沙蒿AdZFP1转录因子基因及其在培育耐旱植物中的应用

技术领域：

本发明涉及从沙蒿中克隆了一个新的编码区为1335bp的干旱相关的RING型锌指蛋白转录因子基因(AdZFP1)，及以转基因技术利用其来提高植物抗旱性，研究其可能功能的方法。

背景技术：

干旱胁迫是影响植物生长发育的主要逆境因子，在许多地域是农业发展的一大障碍。干旱对农作物造成的损失在所有的非生物胁迫中居首位，仅次于生物胁迫病虫害所造成的损失。利用基因工程技术改良植物的遗传性状，对于农业的发展具有深远的意义。近年来的研究显示，转录因子在植物对干旱、低温和高盐等胁迫条件下的信号传导及基因表达调控中起着重要的作用，而且一个转录因子往往可以调控多个基因的表达(Chen et al，2002)。因此，在提高植物对环境胁迫抗性的分子育种中，与导入某个功能基因的常规方法相比，导入一个关键的转录因子基因，通过它促使多个功能基因发挥作用，获得综合改良效果，是提高植物抗逆性更为有效的途径。

转录因子是具备调控DNA转录作用的DNA结合蛋白，通常含有能与DNA特异性结合的基元。目前研究表明有四类结构不同的DNA结合蛋白控制着DNA的转录：螺旋-转折-螺旋(HTH)、亮氨酸拉链(Leucine zipper)、锌指蛋白(zinc finger)和β带(β-ribbon)。锌指蛋白是目前发现种类最多，在真核生物转录因子中最普遍存在的一类DNA结合基元。从酵母到人体，已在560多种蛋白中发现了4100多种不同的锌指序列，它们对基因的表达调控起着重要作用(Henikoff，1997)。

在锌指蛋白中，几个保守的氨基(通常是Cys和His)与一个Zn2+结合，形成一个相对独立的可以自我折叠的“手指状”蛋白结构域。由于锌指结构最早是从RNA聚合酶II和III的转录因子中发现的，所以一般认为，某个蛋白如果拥有一个或多个成簇的锌指结构域，那么它很可能就是转录因子(朱玉贤，2002)。根据锌指结构域中Cys和His残基的数量和排列方式的不同；锌指蛋白可分为C2H2、C3H、C2C2、C3HC4和C2HC5等五类(Li，1998)。目前研究得比较多的是C2H2型锌指蛋白。1992年，Takatsuji从矮牵牛中克隆了ZPT21基因，是植物中克隆的第一个C2H2型锌指蛋白基因，迄今，已经从拟南芥、矮牵牛、小麦、马铃薯、向日葵、豌豆等植物克隆了近30个C2H2型锌指蛋白基因。研究表明某些C2H2型锌指蛋白可能作为转录因子参与植物对逆境胁迫反应的调控(Takatsuji，1994)。

RING zinc finger是C3HC4型锌指(即环指型锌指)，于1991年首次被发现，其典型结构为：Cys-X2-Cys-X(9-39)-Cys-X(1-3)-His-X(2-3)-Cys/His-X2-Cys-X(4-48)-Cys-X2-Cys，包括C3HC4和C3H2C3(RING-H2)两种形式。与其他锌指不同，该类锌指呈双向不对称结构，每个锌指单元由4个Cys或3个Cys和一个His分别结合两个锌原子。由于其结构的特殊性，对该类锌指的研究倍受重视(RING被认为是Really Interesting New Gene的缩写)。10余年间，已经在人类、动物、植物、真菌、病毒等生物体内发现了80多个环指型锌指蛋白。研究表明，该类蛋白可能作为转录因子在基因转录调控和信号传导中起重要作用(Freemont，1993；Saurin，1996)，它不仅仅作为核酸结合蛋白发挥作用，更重要的是它可能参与蛋白质与蛋白质之间的互作(Saurin，1996)。目前，植物中仅发现了少数几个RING型锌指蛋白，且大多数是在拟南芥中发现的，其中COP1(constitutive photomorphogenic 1)是目前研究得相对最清楚的含RING锌指基元的调控蛋白。在暗处COP1作为拟南芥光形态建成的阻遏物，但其突变型即使在暗处也能导致组成型光形态建成，突变型分析和转基因实验可以充分说明COP1蛋白在光特异性信号转导途径中作为光抑制阻遏物发挥作用(MeNellis，1996)。研究还表明，COP1蛋白还参与调控病原物侵染、低氧胁迫、发育进程的信号转导途径(Mayer，1996)。因此，COP1很可能作为核酸调节蛋白充当多种基因表达的阻遏物，以此调控生物体多种信号的转导途径(Takatsuji，1998)。拟南芥BRH1编码C-端RING型锌指蛋白，该基因的表达受病原物的诱导和油菜素类固醇的负调控(Molnar，2002)。最近研究表明，拟南芥的RIE1基因编码RING型锌指蛋白，该基因在种子发育过程中起着极为重要的作用(Ruqiang，2003)。

沙蒿是生长在我国西北沙漠地带的一种菊科蒿属植物，主要分布在宁夏、甘肃、陕西、新疆、内蒙古等省区的腾格里沙漠、毛乌素沙漠、巴丹吉林沙漠地区以及青海省等地，是一种良好的耐旱野生植物(白寿宁等2000)。沙蒿根系十分发达，是一种优良的防风固沙先锋植物。沙蒿胶是沙蒿籽种皮上的多糖类植物胶，遇水后胶质迅速溶胀，形成蛋清样粘稠而滑腻的胶凝体。沙蒿胶化学性质十分稳定，是一种有广阔开发前景的天然植物胶。目前对于沙蒿的研究仅限于组培、化学成分分析及其食用价值等方面，而将其作为耐旱植物对其分子生物学方面的研究还少见报道，而有关从耐旱植物沙蒿中分离抗旱相关的RING型锌指蛋白转录因子的研究在国内外尚未见报道。

本实验采用mRNA差异显示技术及RACE技术从沙蒿中获得一个RING型锌指蛋白转录因子基因，构建了该基因的植物表达载体，并在转基因试验系统中研究了该基因的功能，对于从分子水平上揭示沙蒿的耐旱机理，改良植物耐旱品质有很重要的作用。

发明目的：

本发明的一个主要目的是为植物抗旱育种提供有价值的转录因子基因，通过该转录因子基因，调控转基因植物中一系列干旱相关基因的表达，从而使植物的抗旱性能得到综合的根本性改良，最终获得抗(耐)旱能力明显增强的优良植物品种。

技术方案：

1从沙蒿中获得新的RING型锌指蛋白转录因子基因AdZFP1

(1)采用mRNA差异显示技术分离RING型锌指蛋白转录因子基因片段：

mRNA差异显示技术是1992年由哈佛大学Liang Peng建立起来的一种用于检测基因表达改变较简捷而灵敏的方法，目前已广泛应用于基因克隆等领域。本实验即采用mRNA差异显示技术从沙蒿中分离RING型锌指蛋白转录因子基因片段。

(2)采用RACE技术获得RING型锌指蛋白转录因子基因全长cDNA

RACE技术是基于PCR的由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，由Frohman在1988年首次报道(M.A.Frohman，1988)。近年来在全长cDNA基因的克隆方面有较多的应用。本实验采用5′RACE技术获得RING型锌指蛋白转录因子基因5端未知序列。序列拼接后在两端设计引物，再次RT-PCR获得全长cDNA序列。

2.构建RING型锌指蛋白转录因子基因的植物表达载体：

我们首先选用了启动能力很强的、在双子叶植物中最常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子，将得到的沙蒿AdZFP1基因连于其后，构建成功双元表达载体，采用农杆菌介导法转化烟草。载体构建示意图见图4。

同时我们又将AdZFP1基因置于在单子叶中高效表达的Ubi启动子驱动下，通过基因枪法导入广泛应用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草等植物中。载体构建示意图见图5。

3.以烟草及草坪草为材料进行植物转基因操作：

本发明以烟草及草坪草为转化受体，导入RING型锌指蛋白转录因子基因AdZFP1，以便进一步探讨其可能的功能。

此外，还应该特别指出以下事项：

本发明利用我们所得到的RING型锌指蛋白转录因子基因AdZFP1，构建植物表达载体，但这并不意味着此基因只有这一个应用价值。使用本发明中的基因进行其他方面的应用均在本发明权利要求之内。

这里应特别指出的是，在本发明的一个实施方案中，我们选用烟草及草坪草(早熟禾、高羊茅、黑麦草)作为转基因植物材料。但这并不意味着本发明所构建的转基因载体只能用于转化烟草及草坪草(早熟禾、高羊茅、黑麦草)，还包括其它植物。使用含本发明中AdZFP1的正义及反义表达载体转化其他植物材料，均在本发明的权利要求之内。因为本领域的技术人员可以利用本专利构建好的AdZFP1基因表达载体，利用本专利提供的植物遗传转化方法转化其它植物。

在本发明的一个实施方案中，AdZFP1基因被置于CaMV35s启动子和nos polyA终止子的调控之下，再连至CAMBIA公司的双元表达载体pCAMBIA3300，构成一个植物表达载体，用于双子叶植物的转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了pCAMBIA3300之外，还可以选用CAMBIA公司的其它表达载体或者本领域技术人员所熟悉的其它如pGPTV系列，pBI系列，pCB系列等的植物表达载体，有关pCAMBIA3300载体的详细信息可以在CAMBIA公司网站 www.cambia.org.au中得到详细说明。

在本发明的一个实施方案中，AdZFP1基因被置于Ubiquitin启动子和nos polyA终止子的调控之下，再连至表达载体pAHC25，构成一个植物表达载体，用于单子叶植物的转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了pAHC25之外，还可以选用其它适合于单子叶植物的表达载体，或者本领域技术人员所熟悉的其它载体。有关pAHC25载体的详细信息可以在 www.defra.gov.uk网站中得到详细说明。

根据本发明的这一个实施方案，植物筛选所用的抗生素为除草剂，具体选用何种筛选要看选用植物表达载体所对应的标记基因。

根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株为LBA4404。

根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株除了LBA4404外，还应包括农杆菌的其它菌株，如EHA101。这些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白区，能够帮助转入的植物表达载体中的T-DNA转移到植物的基因组中。

在本发明的一个实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化烟草、草坪草等。本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本领域技术人员可以通过参考有关文献获得详情。

本发明中用于将转化细胞再生成植株的方法不是关键，可以使用任何对靶植物合适的方法。本领域技术人员可以通过参考有关文献得到详情。

有益效果：

1.得到一个新的来源于耐旱野生植物沙蒿的RING型锌指蛋白转录因子基因AdZFP1。

2.构建了该基因的植物表达载体，将此基因导入各类植物中，以提高植物的耐旱性。以烟草为例，将该基因转入烟草后，在水分胁迫条件下，转基因烟草表现出了明显的耐旱特征(图9，10，11，12)。在模拟干旱条件下，把转基因烟草T1代种子置于含有15％PEG6000的滤纸中萌发，转基因烟草的萌发速率明显高于对照植株(图13)，说明AdZFP1基因在烟草中的表达不仅能够提高转基因烟草植株的耐旱性能，同时也能够提高转基因烟草种子在萌发过程中对干旱的抵抗能力。

附图简要说明：

图1 由AdZFP1推测的氨基酸结构分析

采用NCBI的Protein Conservation Domain analyse软件分析，在AdZFP1蛋白质的C端，具有RING型锌指结构域。

图2 AdZFP1 RING锌指结构域与其它锌指蛋白RING结构域的序列比对

由上至下分别为：沙蒿AdZFP1，拟南芥AAC79588.1、AAN31869.1、NP_200582，菠萝AAM28286.1，假丝酵母EAR98859.1，挪威鼠TM26_RAT，猪TM26_PIG，黑猩猩XP_518326.1和人RING TM26_HUMAN。

图3 AdZFP1 RING锌指结构域与其它锌指蛋白RING结构域的系统数分析

图4 是植物表达载体p3300-AdZFP1构建流程的示图。

图5 是植物表达载体pAHC-AdZFP1构建流程的示图。

图6 AdZFP1基因转化烟草的PCR检测。

图中扩增条带大小为1.4kb，电泳带从左到右编号依次为M，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。M表示分子标记Marker，1为正对照，2为负对照，3-12为不同转基因株系。

图7 AdZFP1基因转化烟草的Southern检测。

谱带从左到右编号依次为1，2，3，4，5，6，7，8。1-7为不同转基因株系，8为负对照。

图8 AdZFP1基因转化烟草的Northern检测。

谱带从左到右编号依次为1，2，3，4，5，6，7。1-6表示不同转基因株系，7为负对照。

图9 转AdZFP1基因烟草单叶叶片的脱水处理实验

左边叶片为对照烟草叶片，右边为转基因烟草叶片。

图10 转AdZFP1基因烟草整株耐旱性检测(土壤含水量8％)

左边叶片为对照烟草叶片，右边为转基因烟草叶片。

图11 转AdZFP1基因的烟草在渐进的水分胁迫下的光合速率

图12 转AdZFP1基因的烟草复水过程的光合速率检测

图13 转AdZFP1基因的烟草T1代种子在15％PEG处理时的萌发情况

培养皿左半部分为对照烟草T1代种子，右半部分为转AdZFP1基因的烟草。

实施方式：

实验所涉及的药品均购自Invitrogen，Promega公司，Takara公司，Sigma公司及上海生工公司。具体实验操作依据《分子克隆》及相关文献。

实施例1：RING型锌指蛋白转录因子基因AdZFP1的获得：

1 RING型锌指蛋白转录因子基因片段的获得

为获得沙蒿中干旱胁迫下差异表达的序列标签，我们采用了mRNA差异显示(mRNAdifferent display)结合反向Northern(Reverse Northern blotting)的方法。分别抽取干旱诱导(失水约35％)及自然环境下生长未经干旱处理的沙蒿总RNA，定量后进行差异显示，获得可能差异表达的cDNA片段，用T7&M13引物重新扩增cDNA片段，用地高辛(DIG)标记的干旱诱导和未诱导的沙蒿cDNA作为探针，与差异显示所获得的cDNA片段进行反向Northern杂交，排除假阳性。

采用The HIEROGLYPHTM mRNA Profile Kit System for Differential DisplayAnalysis试剂盒进行。试剂盒中提供的引物：

ARP17：5’-ACAATTTCACACAGGA CTGCTAGGTA-3’

ARP18：5’-ACAATTTCACACAGGA TGATGCTACC-3’

ARP19：5’-ACAATTTCACACAGGA TTTTGGCTCC-3’

ARP20：5’-ACAATTTCACACAGGA TCGATACAGG-3’)

TMR-T7(dT12)AP3：5’-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGG-3’

TMR-T7(dT12)AP6：5’-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCC-3’

TMR-T7(dT12)AP7：5’-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCG-3’

TMR-T7(dT12)AP10：5’-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAG-3’

(注：TMR为荧光标记)

(1)沙蒿总RNA的获得(ConcertTM Plant RNA Reagent Invitrogen)

取0.1g～0.2g沙蒿叶片放入研钵中，加液氮迅速研磨成粉沫；将粉沫转入盛有0.5ml ConcertTM Plant RNA Reagent的DEPC处理的1.5ml离心管中；室温静置5min，室温小于12000g离心2min；将上清液转入新离心管，加入100ul 5mol/L NaCl，混匀；在加入300氯仿，混匀，4℃小于12000g离心10min；将上清液转入新离心管，加0.5ml异丙醇，15-30℃放置10min；4℃小于12000g离心10min；去上相，加1ml 75％乙醇涡恳洗涤沉淀；室温小于12000g离心1min；自然干燥(不要干透)，枪头吹打溶于50-100ulRNase-free water；

用RNase-free的DNase I处理总RNA，在PE UV/VIS spectrometer Lambda Bio40上测定A230nm至280nm波长范围内的吸光值，并计算A260/A280和A260/A230比值以检测样品的纯度。据RNA(ug/mL)＝OD260×37ug/ml×稀释倍数，计算样品的RNA浓度。

(2)RT-PCR

将对照组和处理组总RNA分别稀释成0.1μg/μl，各取2μl，用不同的anchored primer进行逆转录。

在0.2ml PCR管中加入(50μl体系)：

       ddH₂O                      1.95μl

       10×PCR buffer II           1.0μl

       25mM MgCl₂                 1.5μl

       250μM dNTPs                2.0μl

       5’ARP(2μM)                1.75μl

       3’TMR-AP(5μM)             0.7μl

       逆转录产物                  1.0μl

       Ampli Taq(5U/μl)           0.1μl

       PCR扩增条件为：

       预变性：       95℃  2min

       4个循环：      92℃  15s；  50℃  30s；72℃  2min

       30个循环：     92℃  30s；  60℃  30s；72℃  2min

       延伸：         72℃  7min

用High resolution fluoroDD Gel分离TMR标记的PCR片段，GenomyxSC FluorescentImaging Scanner进行DD凝胶成像分析，回收差异片段，用T7&M13引物重扩增。

(3)反向Northern杂交

逆转录标记：探针将1-5μg总RNA溶于8μl DEPC H2O，加入5μl Oligo(dT)18(Biolab，NewEngland)，混匀；70℃变性10min，迅速置于冰浴；按下列顺序，加入第一链合成Master Mix：6.0μl 5×First strand buffer；2.5μl 0.1M DTT；1.5μl RNaseOUT(40U/μl)；5.0μl dNTP labelling mix(1mMdATP，dGTP，dCTP，0.65mMdTTP，0.35mMdUTP)混匀，42℃ 2分钟；加入1μl SuperScript II RT(200U/μl)，混匀；42℃ 10分钟50℃ 50分钟；70℃ 15分钟，以终止反应。

确定探针的浓度后将差异显示所获cDNA片段固定于尼龙膜上。将T7&M13引物重扩增的PCR样品，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶转膜，预杂交，杂交，洗膜，地高辛检测(参见分子克隆)。

2 RING型锌指蛋白转录因子基因全长cDNA的获得

根据所获得的RING型锌指蛋白转录因子基因片段设计三条反向基因特异引物，参照5′RACE的操作说明进行操作。设计的三条反向基因特异引物序列如下：

GSP1：CGAGGTCTTGGTCAACTGTGCTAAC

GSP2：GATGGGTGCGGCTAGGGCAGAAG

GSP3：GACCACAATCTTGAACCTCG

5 RACE试剂盒提供的引物如下：

AAP：5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3

AUAP：5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3

将所获得目的片段回收，与pGEM-T easy载体连接后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行测序，并对序列进行分析，发现已得到了基因的起始序列。将5′RACE序列与差异显示所获得的序列拼接，获得拼接的基因序列，在此序列两端设计引物，再次RT-PCR扩增全长基因，并进行序列测定。扩增全长基因所用的引物：

DD20S1：5’-CGGGATCCATGGGACAGAATCTTAGC-3’(含BamHI和NcoI酶切位点)

DD20A1：5’-CAGAGCTCCACAAAGCACAATACTCGCC-3’(含SacI酶切位点)

实施例2：植物表达载体的构建：

植物表达载体p3300-AdZFP1的结构见图4。

植物表达载体p3300-AdZFP1的构建：将pCAMBIA3300以HindIII和XbaI酶切，连入35S启动子，然后再以SacI和EcoRI酶切，连入Tnos终止子，然后以BamHI和SacI酶切pCAMBIA3300，回收载体；同时将AdZFP1基因连接到pGEM-Teasy载体上，并命名为pT-AdZFP1，以BamHI和SacI酶切pT-AdZFP1，回收约1.4kb的小片段，以T4 DNA ligase将载体与1.4kb目的片断连接，转化DH5α并进行PCR和酶切鉴定后得到p3300-AdZFP1。AdZFP1基因的启动子为35S，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，bar基因的启动子亦为35S，终止子为Tnos。

植物表达载体pAHC-AdZFP1的结构见图5。

植物表达载体pAHC-AdZFP1的构建：将AdZFP1基因置于Ubiquitin(泛素蛋白基因的5’端调控区，在单子叶植物中组成型表达)启动子的调控之下，构建了适合于单子叶的植物表达载体pAHC-AdZFP1。将该基因连接到pGEM-Teasy载体上，并命名为pT-AdZFP1。NotI酶切pT-AdZFP1，回收约1.4kb的小片段，连接到pGEM-5Z上，得到中间载体p5Z-AdZFP1。将p5Z-AdZFP1用EcoRV和SacI酶切，回收小片段，同时将pAHC25用SmaI和SacI酶切，回收大片段，连接小片段和大片段，转化DH5α并进行PCR和酶切鉴定后得到pAHC-AdZFP1。该表达载体由于没有LB(Left Border)、RB(Right Border)，因此不能通过农杆菌介导的方法转化植物，而采取基因枪的方法转化植物。AdZFP1基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，bar基因的启动子亦为Ubiquitin，终止子为Tnos。

实施例3：农杆菌的转化：

(1)农杆菌感受态的制备

a.挑取土壤农杆菌单菌落接种于5ml含适当抗生素的LB/YEB液体培养基中，28℃、250rpm振荡培养过夜；

b.按1∶25-50接种于20ml含适当抗生素的LB/YEB液体培养基中继续培养4-6h；

c.4℃，5,000rpm离心10min，去上清；

d.用600μl冰预冷的TE缓冲液(PH7.5)洗涤菌体；

e.4℃，5,000rpm离心10min，去上清；

f.用200μl冰预冷的液体LB/YEB重悬菌体，液氮冷冻，于-70℃保存。

(2)转化

a.将感受态农杆菌置冰浴中溶化，然后加入约0.5-1.0μg质粒DNA，轻轻混匀，冰上放置5min；

b.置于液氮中5min；

c.37℃温育5min；

d.加入800μl LB/YEB液体培养基，28℃振荡培养5-6h；

e.6,000rpm离心5min，去大部分上清，剩50μl左右，悬浮菌体，

f.均匀涂布于含适当抗生素的LB/YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。

实施例4：烟草的遗传转化及再生：

在本发明的这一实施方案中，转化烟草的方法为农杆菌介导的叶盘法。

(1)接种转化菌单菌落于含适当抗生素的2ml YEB液体培养基中，28℃培养1-2天，转接入20ml YEB液体培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5；

(2)将健壮的烟草叶片剪成0.5-1cm见方，放入MS液体培养基稀释过的农杆菌中，浸泡10-15分钟，其间不断轻摇几次；

(3)取出材料，用无菌纸吸去多余菌液，于MS固体培养基中28℃暗培养两天；

(4)用无菌纸吸去生长过度的菌体，把材料转入含选择压PPt 5mg/L、Cb 500mg/L和6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的分化培养基中，25℃光下培养，每两周换一次培养基，至分化出愈伤组织，直至长出芽；

(5)将长至1cm以上的芽转入含PPt 5mg/L、Cb 500mg/L的生根培养基上诱导生根；

实施例5  对草坪草的遗传转化：

基因枪法：

转化过程包括种子或幼穗(包括草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草、)诱导愈伤组织、基因枪轰击、抗性愈伤筛选、苗的分化、植株鉴定。

种子诱导愈伤的步骤：成熟种子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培养基上，让其萌动3天，露出小芽时，将胚纵切后转接于诱导愈伤组织培养基上，形成愈伤(约30天左右)后，每次挑选色泽鲜、增殖快、质地硬的愈伤组织继代培养，继代愈伤可供基因枪转化；

幼穗诱导愈伤的步骤：取长约0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超净台内剥出幼穗，接种于诱导诱导培养基上，形成愈伤后，每20天继代培养一次，供基因枪转化；基因枪的转化及苗的分化：质粒：提取的质粒浓度调整为1μg/μL。子弹配制：30mg金粉或钨粉加1mL 100％乙醇旋涡洗涤15分钟，无菌水洗3次，加500μL 50％甘油备用。取上述钨或金粉悬液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl2，加20μL 0.1M亚精胺，旋涡，冰上静置15分钟，离心数秒，70％乙醇142μL洗一次，离心数秒，100％ 140μL乙醇洗一次，离心数秒，加50μL 100％乙醇，供5枪用。

供试基因枪：PDS-1000/He(美国伯乐公司)基因枪可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25InHg，6cm射击距离，每皿射击一枪。枪击前的愈伤组织在含0.4M甘露醇的继代培养基上培养4～8小时，枪击16小时后移入正常继代培养基。枪击后的愈伤组织一周后转至含除草剂2-5mg/L的继代筛选2～4轮，每轮20天。筛选后得到的抗性愈伤组织转入含50g糖的培养基中，光照培养20天，然后转入去掉2，4-D的分化培养基中分化成苗。当小苗长到4-5片叶时，取少量叶片提取植物总DNA，进行PCR检测。小苗长至5～10cm大小时，移入蛭石∶松针土为1∶1的土中，塑料袋保温一周后，苗即成活。

实施例6：转基因植株Southern杂交和Northern杂交检测：

为了检测目的基因是否已经整合到转化植物的基因组中并且正常表达，我们在PCR检测的基础上，又对转基因植物进行了Southern杂交和Northern杂交检测。

转基因植株基因组DNA的制备(SDS法)

(1)称取0.2g植物材料，液氮研磨，加入0.75ml提取缓冲液中，混匀；

(2)加40μl 20％SDS溶液使终浓度为1％，剧烈振荡，混匀，65℃保温15分钟；

(3)加160μl 5M KAc，剧烈振荡，混匀，冰浴20-30分钟；

(4)4℃20000g离心10分钟；

(5)取上清，加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃放置30-40分钟；

(6)15000g离心10-15分钟；

(7)沉淀干燥，溶解于100-200μl 50×TE缓冲液中，若不溶解，65℃加热助溶；

(8)加入RNase A 37℃保温15分钟；

(9)苯酚/氯仿，苯酚/氯仿/异戊醇，各抽提一次；

(10)取上清，加入1/10体积3M NaAc，2体积无水乙醇；

(11)12000g离心10分钟；

(12)70％乙醇洗涤；

(13)干燥，溶于TE缓冲液中，65℃加热10分钟助溶。

转基因植株基因组RNA的制备(TRIzol法)

(1)每50-100mg组织中加入1mL TRIZOL，组织体积≤10％总体积；

(2)匀浆液混匀后，于15-30℃放置5分钟，于12000g离心10分钟去渣；

(3)每1mL TRIZOL加入0.2mL氯仿，振荡15秒，于15-30℃放置2-3分钟；

(4)2-8℃，≤12000g离心15分钟，分三层，上层无色水相约占总体积60％；

(5)移出水相，每1mL初始TRIZOL加0.5mL异丙醇，于15-30℃放置10分钟；

(6)2-8℃，≤12000g离心10分钟，得胶状RNA沉淀；

(7)用75％乙醇≥1mL，振荡，于2-8℃≤7500g离心5分钟；

(8)干燥，但不要过分干燥，否则难溶(部分溶解的RNA A_260/280≤1.6)，加无菌水溶解，上下吹打，55-60℃保温助溶。

Southern杂交(参见分子克隆)

选择基因内部没有，而只在载体单侧的存在的酶切位点BamHI，酶切不同的转基因植株基因组DNA，采用不对称PCR法标记探针。根据Boehringer Mannheim公司的PCR DIG探针合成试剂盒进行如下操作：

在50μl反应体系中加入5μl 10×PCR buffer，5μl 10×PCR DIG mix，50pmol上游引物，5pmol下游引物，0.75μl酶混合物，100pg模板DNA，同时用未标记DIG的dNTP作对照反应。反应条件根据不同的模板稍有变动。反应结束后电泳检测标记效率，标记后的探针应比没有标记的产物分子量大，-20℃冻存备用。

Northern杂交(参见分子克隆)

实施例7：转基因植株耐旱生理功能的检测；

选取在相同条件下生长的苗龄大小一致的转基因烟草叶片和转空载体的烟草叶片，于空气中干燥脱水(2h～24h)，在渐进的水分胁迫条件下，转基因烟草叶片均表现出了较之对照明显增强的耐脱水能力(图9)。

同行又对栽种在温室土壤中的转基因烟草进行了整株耐旱性检测，中度失水条件下(土壤含水量8％)对照烟草明显萎蔫，而转基因烟草只表现出轻度萎蔫(图10)。

对移栽在温室的苗龄约两个半月的转基因烟草及对照烟草在水分胁迫下的生理指标进行了测定。植物光合强度的测定采用CI-301便携式光合系统测定仪。

土壤水分含量在12％左右时(中度水分胁迫)，转基因烟草与对照植株的光合强度都有降低，但对照植株降低更为明显，而当土壤含水量在8％以下(重度水分胁迫)时所有植株的光合强度和呼吸强度明显下降，但转基因植株的光合速率仍略高于对照植株(图11)。

转基因烟草和对照烟草在重度水分胁迫之后，立即进行了复水，每隔半小时分别测定其光合速率，结果发现，转基因烟草复水过程的光合速率明显高于对照，在2小时左右光合速率基本恢复正常，完全复水，而对照株烟草大约4小时完全复水(图12)。

在模拟干旱条件下，对T1代转基因烟草种子在15％PEG处理的滤纸上进行了萌发实验。(图13)。

专利菌种说明：

此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli(DH5α))，保藏代号为AdZFP1，保藏编号为CGMCC NO.1286，保藏日期为2005年1月5日。

总之，本发明克隆了一个新的编码区为1335bp的干旱相关转录因子基因AdZFP1，并且利用此基因构建了植物表达载体，通过农杆菌介导和基因枪法遗传转化获得了耐旱转基因植物。PCR检测和Southern检测证明该基因整合到转基因植株基因组中，Northern检测证明该基因能在植物中高效表达，脱水处理实验和生理指标的测定均证明转基因株系比对照显著提高了耐旱性能，转基因植株T1代种子在模拟干旱条件下的萌发实验更加证明了转AdZFP1基因植株耐旱性能的提高。

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<110>林忠平

<120>沙蒿AdZFP1转录因子基因及其在培育耐旱植物中的应用

<160>2

<210>1

<211>1723

<212>DNA

<213>沙蒿(Artemisia desertorum Spreng)

<220>

<221>5’UTP

<222>(1)...(70)

<220>

<221>CDS

<222>(71)...(1408)

<220>

<221>3’UTP

<222>(1409)...(1723)

<400>1

acaaccatct tcacaagtgg cttgtttccg acggaccaac cgccgtcgct aacaatcgtc 60

actaaagaaa atg gga cag aat ctt agc tgt gga gta aaa gat gac aat ggt tta ttt 118

           Met Gly Gln Asn Leu Ser Cys Gly Val Lys Asp Asp Asn Gly Leu Phe

            1               5                  10                   15

aca gca ata caa tat ggt gat ata gaa gtg gtg aaa cat gtt atg gaa aat gat gca aat 178

Thr Ala Ile Gln Tyr Gly Asp Ile Glu Val Val Lys His Val Met Glu Asn Asp Ala Asn

            20                   25                 30                  35

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Phe Val Val Lys Lys Lys Thr Val Tyr Asp Arg His Ser Ala Leu His Ile Ala Ala Ala

            40                   45                  50                 55

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Asn Gly Gln Ile Glu Ile Val Asn Leu Leu Leu Asp Lys Ser Ser Val Asn Pro Asp Ala

            60                  65                  70                  75

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Leu Asn Arg Arg Lys Gln Thr Pro Leu Met Leu Ala Ala Met His Gly Lys Ile Ala Cys

            80                  85                   90                 95

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Val Glu Lys Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Ile Leu Met Phe Asp Ser Leu Asn Gly Arg

            100                 105                 110                 115

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Thr Cys Leu His Tyr Ala Ala Tyr Tyr Gly His Ser Asp Cys Leu Glu Thr Ile Leu Ser

            120                 125                 130                 135

tct gct aga act tcc cac gtt gcg gct tct tgg ggc ttt tcg cgg ttt gtg aat ata aga 538

Ser Ala Arg Thr Ser His Val Ala Ala Ser Trp Gly Phe Ser Arg Phe Val Asn Ile Arg

            140                 145                 150                 155

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Asp Gly Lys Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Gln Arg Arg Pro Glu Cys Val

            160                 165                 170                 175

cat ata ctt ctt gat agt gga gcc ctt gtt tgt gcc tca acc ggt gga tat ggt ctt cct 658

His Ile Leu Leu Asp Ser Gly Ala Leu Val Cys Ala Ser Thr Gly Gly Tyr Gly Leu Pro

            180                 185                 190                 195

ggc agc acg cca ctt cat ttg gct gca aga ggg ggt tca atg gat tgc gtt cgc gaa tta 718

Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Gly Gly Ser Met Asp Cys Val Arg Glu Leu

            200                 205                 210                 215

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Leu Ala Trp Gly Ala Asp Arg Leu His Arg Asp Ala Ser Gly Arg Ile Pro Tyr Ala Val

            220                 225                 230                 235

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Ala Leu Lys His Asn Tyr Gly Val Cys Ala Ala Leu Leu Asn Pro Ser Ser Ala Glu Pro

            240                 245                 250                 255

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Leu Val Trp Pro Ser Pro Leu Lys Phe Ile Ser Glu Leu Asn Gln Asp Ala Lys Ala Leu

            260                 265                 270                 275

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Leu Glu Gln Ala Leu Met Glu Ile Asn Arg Glu Arg Glu Arg Ser Ile Leu Lys Gly Thr

            280                 285                 290                 295

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Gly Tyr Ser Val Ser Ser Pro Ser His Ser Asp Ala Thr Gly Met Asp Asp Asn Ile Ser

            300                 305                 310                 315

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Glu Ala Ser Asp Ser Gln Leu Cys Cys Ile Cys Phe Asp Gln Leu Cys Ala Ile Glu Val

            320                 325                 330                 335

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Gln Asp Cys Gly His Gln Met Cys Ala Gln Cys Thr Leu Ala Leu Cys Cys His Asp Lys

            340                 345                 350                 355

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Pro Asn Pro Thr Thr Ser Ala Leu Ala Ala Pro Ile Cys Pro Phe Cys Arg Ser Asn Ile

            360                 365                 370                 375

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Glu Arg Leu Ala Val Ile Lys Val Lys Ala Ser Thr Val Asp Gln Gly Leu Asp Val Phe

            380                 385                 390                 395

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Ser Ser Pro Lys Gln Arg Lys Ser Arg Arg Ser Ile Asn Leu Ser Glu Gly Ser Ser Ser

            400                 405                 410                 415

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            420                 425                 430                 435

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            440                445

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<210>2

<211>445

<212>PRT

<213>沙蒿(Artemisia desertorum Spreng)

<400>2

Met Gly Gln Asn Leu Ser Cys Gly Val Lys Asp Asp Asn Gly Leu Phe Thr Ala Ile Gln

1                5                  10                  15                  20

Tyr Gly Asp Ile Glu Val Val Lys His Val Met Glu Asn Asp Ala Asn Phe Val Val Lys

21              25                  30                  35                  40

Lys Lys Thr Val Tyr Asp Arg His Ser Ala Leu His Ile Ala Ala Ala Asn Gly Gln Ile

41              45                  50                  55                  60

Glu Ile Val Asn Leu Leu Leu Asp Lys Ser Ser Val Asn Pro Asp Ala Leu Asn Arg Arg

61              65                  70                  75                  80

Lys Gln Thr Pro Leu Met Leu Ala Ala Met His Gly Lys Ile Ala Cys Val Glu Lys Leu

81              85                  90                  95                  100

Ile Glu Ala Gly Ala Asn Ile Leu Met Phe Asp Ser Leu Asn Gly Arg Thr Cys Leu His

101             105                 110                 115                 120

Tyr Ala Ala Tyr Tyr Gly His Ser Asp Cys Leu Glu Thr Ile Leu Ser Ser Ala Arg Thr

121             125                 130                 135                 140

Ser His Val Ala Ala Ser Trp Gly Phe Ser Arg Phe Val Asn Ile Arg Asp Gly Lys Gly

141             145                 150                 155                 160

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161             165                 170                 175                 180

Asp Ser Gly Ala Leu Val Cys Ala Ser Thr Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Gly Ser Thr Pro

181             185                 190                 195                 200

Leu His Leu Ala Ala Arg Gly Gly Ser Met Asp Cys Val Arg Glu Leu Leu Ala Trp Gly

201             205                 210                 215                 220

Ala Asp Arg Leu His Arg Asp Ala Ser Gly Arg Ile Pro Tyr Ala Val Ala Leu Lys His

221             225                 230                 235                 240

Asn Tyr Gly Val Cys Ala Ala Leu Leu Asn Pro Ser Ser Ala Glu Pro Leu Val Trp Pro

241             245                 250                 255                 260

Ser Pro Leu Lys Phe Ile Ser Glu Leu Asn Gln Asp Ala Lys Ala Leu Leu Glu Gln Ala

261             265                 270                 275                 280

Leu Met Glu Ile Asn Arg Glu Arg Glu Arg Ser Ile Leu Lys Gly Thr Gly Tyr Ser Val

281             285                 290                 295                 300

Ser Ser Pro Ser His Ser Asp Ala Thr Gly Met Asp Asp Asn Ile Ser Glu Ala Ser Asp

301             305                 310                 315                 320

Ser Gln Leu Cys Cys Ile Cys Phe Asp Gln Leu Cys Ala Ile Glu Val Gln Asp Cys Gly

321             325                 330                 335                 340

His Gln Met Cys Ala Gln Cys Thr Leu Ala Leu Cys Cys His Asp Lys Pro Asn Pro Thr

341             345                 350                 355                 360

Thr Ser Ala Leu Ala Ala Pro Ile Cys Pro Phe Cys Arg Ser Asn Ile Glu Arg Leu Ala

361             365                 370                 375                 380

Val Ile Lys Val Lys Ala Ser Thr Val Asp Gln Gly Leu Asp Val Phe Ser Ser Pro Lys

381             385                 390                 395                 400

Gln Arg Lys Ser Arg Arg Ser Ile Asn Leu Ser Glu Gly Ser Ser Ser Phe Arg Gly Leu

401             405                 410                 415                 420

Ser Gly Ala Ser Phe Gly Lys Met Val Gly Arg Gly Ser Gly Arg Val Ser Ala Asp Leu

421             425                 430                 435                 440

Glu Trp Asp Lys Pro

441             445

Claims (9)

1、从沙蒿中克隆的编码区为1335bp的干旱相关RING型锌指蛋白转录因子基因AdZFP1，该基因的特征在于：该基因编码一条由445个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质的324-372位氨基酸为RING型锌指蛋白结构域。

2、根据权利要求1所述的基因，该基因所编码的氨基酸序列与拟南芥中的RING型锌指蛋白转录因子基因所编码的氨基酸序列具有69％的同源性，拟南芥中该基因的GenBank登录号 gi|3927831|gb|AAC79588.1。

3、根据权利要求1所述的基因，该基因可用于构建成适合在双子叶植物中表达AdZFP1基因的植物表达载体p3300-AdZFP1和适合在单子叶植物中表达AdZFP1基因的植物表达载体pAHC-AdZFP1。

4、根据权利要求3所述的植物表达载体p3300-AdZFP1，该植物表达载体的特征在于：驱动AdZFP1基因的启动子为35S，终止子为Tnos，筛选标记为bar基因，启动子为35S，终止子为Tnos。

5、根据权利要求3所述的植物表达载体pAHC-AdZFP1，该植物表达载体的特征在于：驱动AdZFP1基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos，筛选标记为bar基因，启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos。

6、根据权利要求3所述的植物表达载体p3300-AdZFP1，该载体可通过农杆菌介导法导入植物细胞，生长出含有目的基因AdZFP1的转基因植株。

7、根据权利要求3所述的植物表达载体pAHC-AdZFP1，该载体可通过基因枪法导入植物细胞，生长出含有目的基因AdZFP1的转基因植株。

8、根据权利要求6所述的植物，所指的植物是指烟草、矮牵牛。

9、根据权利要求7所述的植物，所指的植物是早熟禾、高羊茅、黑麦草。

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