CN1291021C - 厚叶旋蒴苣苔BcBCP1基因在培育耐旱耐盐植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种旋蒴苣苔属的606bp的干旱相关的蓝铜蛋白类似基因(BcBCP1)及其应用，该基因编码201个氨基酸组成的多肽，在氨基末端具有质膜导向信号肽，中部具有Cu²⁺结合的结构域，羧基末端含有植物细胞壁伸展蛋白所特有的PPR结构，具典型的小分子量蓝铜蛋白结构特征。将该基因导入植物可明显提高植物的耐旱、耐盐性、耐高低温度胁迫。构建了适合于单子叶植物和双子叶植物的BcBCP1基因的植物表达载体，涉及的启动子包括CaMV 35S启动子、Ubiquitin启动子和诱导型启动子BcDh2，通过基因枪和农杆菌介导的方法对烟草、矮牵牛、草坪草和牧草进行遗传转化，并获得了耐旱、耐盐、耐高低温胁迫的转基因植物。

Description

厚叶旋蒴苣苔BcBCP1基因在培育耐旱耐盐植物中的应用

一、技术领域：

本发明涉及利用从厚叶旋蒴苣苔属植物中克隆到的一个编码区为606bp的干旱相关的蓝铜蛋白类似基因(BcBCP1)，该基因编码201个氨基酸组成的多肽，在氨基末端具有质膜导向信号肽，中部具有Cu²⁺结合的结构域，羧基末端含有植物细胞壁伸展蛋白所特有的PPR结构，具典型的小分子量蓝铜蛋白结构特征。通过转基因技术来提高植物抗旱性，研究其可能功能的方法。

二、背景技术：

干旱胁迫是影响植物生长发育的主要逆境因子之一，在许多地域是农业发展的一大障碍。干旱对农作物造成的损失在所有的非生物胁迫中居首位。因此，利用转基因手段来获得抗干旱的转基因植物，已经成为当今植物生物技术领域研究的热点之一。随着对植物抗旱基础分子生物学研究的不断深入和对抗性基因的不断发现和挖掘，迄今，已有数十种植物被转化并获得了不同程度的抗旱和/或耐盐的转基因植物。现已证实，在转基因植物中超量表达低分子量化合物如甘露醇(Tarczynski，1993)、甜菜碱(Rathinasabapathi，1994)、芒柄醇(Sheveleva，1997)等、可溶性糖如果聚糖(Ebskamp，1994)、海藻糖(Romero，1997)和晚期胚胎发生富含蛋白(Xu，1996)等，能够赋予转基因植物抗水分胁迫的能力。然而，植物的抗旱机制极其复杂，植物的抗旱性与多个性状有关，在不同植物之间存在着很大的差异。对于某一种作物到底转移哪些抗旱基因，对提高抗旱性更为有效对目前的植物抗旱基因工程研究提出的严峻问题。这就需要克隆出越来越多的抗旱基因，并对它们的功能进行深入细致的分析。

厚叶旋蒴苣苔(Boea crassifolia)是苦苣苔科旋蒴苣苔属植物，主要分布在中国西南部的具石灰岩地貌的地区，是一种极其耐旱的植物，它能在极端的条件下生存下来。本实验采用mRNA差异显示技术及RACE技术从厚叶旋蒴苣苔中克隆得到一个小分子量的蓝铜蛋白类似基因，该基因编码一条由201个氨基酸组成的多肽，在氨基末端具有一个信号肽，中部具有一个Cu²⁺结合的结构域，羧基末端含有一个植物细胞壁伸展蛋白所特有的PPR结构，具有典型的小分子量的蓝铜蛋白的结构特征。小分子量的蓝铜蛋白是铜蛋白(copper protein)大家族的一个很小的分枝。铜蛋白根据铜中心的类型分为六类：I型铜蛋白(蓝铜蛋白)，II型铜蛋白，III型铜蛋白，三核中心铜蛋白，CuA和CuB蛋白。其中I型铜蛋白是蓝色的，在600nm附近有吸收峰，顺磁性，可用EPR检测。I型铜蛋白(蓝铜蛋白)又分为小分子量的蓝铜蛋白(包括Auracyanin，Azurin，Phytocyanin，Plastocynin，Rusticynin)，蓝氧化酶(Blue oxidases)和亚硝酸还原酶(Nitritereductase)。I型铜蛋白可以与一个铜原子相结合，通常为两个组氨酸，一个甲硫氨酸和一个半胱氨酸与铜原子相互作用，形成铜中心，这种蛋白存在于高等植物，绿藻和蓝绿藻中，主要参与电子传递、光合作用和细菌的呼吸代谢。目前国内外有关高等植物蓝铜蛋白的资料尚少(Turner，2002)。依据来自蓝藻和黄瓜的研究(Nersissian，1996)来推测蓝铜蛋白在植物抗逆中的作用：可能铜离子结合中心在与电子传递相关的氧化还原反应中起重要作用，而这对抗逆过程中消除活性氧的毒害是十分重要的。此外蓝铜蛋白中一个类似伸展蛋白(extensin)的结构域，它可能在细胞结构保护方面起重要作用。

本实验不仅从厚叶旋蒴苣苔中分离得到一个新的受干旱诱导的蓝铜蛋白类似基因，而且将其构建成的植物表达载体，在转基因系统中研究了该基因在提高植物耐旱、耐盐、耐高温、耐低温性能中的重要功能。这对于揭示厚叶旋蒴苣苔的耐旱机理，丰富植物耐旱分子生物学理论，提高植物的抗旱、耐盐、耐高温、耐低温能力，具有重要的意义。

三、发明内容：

本发明的一个主要目的是为植物抗旱、抗盐育种提供有价值的蓝铜蛋白类似基因，通过该基因的过量表达，使植物的抗旱、抗盐、抗高温、低温胁迫性能得到大幅度的提高，最终获得抗(耐)旱、抗(耐)盐、抗(耐)高温、抗(耐)低温能力明显增强的优良植物品种。

技术方案：

1.从厚叶旋蒴苣苔中克隆到一个干旱相关的蓝铜蛋白类似基因

(1)采用mRNA差异显示技术分离蓝铜蛋白类似基因片段：

本实验即采用mRNA差异显示技术从厚叶旋蒴苣苔中分离蓝铜蛋白类似基因片段。

(2)采用RACE技术获得蓝铜蛋白类似基因全长cDNA

本实验采用5’RACE技术获得蓝铜蛋白类似基因5’端未知序列。序列拼接后在两端设计引物，再次RT-PCR获得全长cDNA序列。

2.构建蓝铜蛋白类似基因BcBCP1的植物表达载体：

我们首先选用了启动能力很强的、在双子叶植物中最常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，将得到的厚叶旋蒴苣苔蓝铜蛋白类似基因BcBCP1全长cDNA序列连于其后，构建成功双元表达载体，采用农杆菌介导法转化烟草、矮牵牛。载体构建示意图见图1。

同时我们又将BcBCP1基因置于在单子叶中高效表达的Ubi启动子驱动下，通过基因枪法导入广泛应用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颖、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草和冰草等植物中。载体示意图见图2。

另外，我们还将BcBCP1基因置于受干旱、低温、高温诱导的启动子BcDh2的驱动下，通过农杆菌介导法转化了烟草、矮牵牛。载体示意图见图3。

3.通过基因枪和农杆菌介导的方法对烟草、矮牵牛、草坪草和牧草进行了遗传转化，并获得了耐旱转基因烟草、矮牵牛、草坪草和牧草

将BcBCP1基因分别置于在双子叶植物中高效表达的35S启动子和单子叶植物中高效表达的Ubi启动子驱动下，通过基因枪和农杆菌介导的方法导入烟草、矮牵牛和广泛应用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草、剪股颖、结缕草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草中，使烟草、矮牵牛、草坪草和牧草的耐旱、耐盐、耐高、低温性能显著提高，对于解决城市绿化中草坪耗水量大与我国水资源形势严峻的矛盾，以及草坪草和牧草安全渡过冬季、夏季等带有极端温度的季节有重要意义。目前已获得转基因烟草、矮牵牛、草坪草和牧草，并已初步表现出增加耐缺水、耐盐、耐高、低温度胁迫能力，有助于解决草坪草耗水量大、养护困难的问题。因此这一转基因草坪草在节约城市绿化用水方面很有潜力。

这里应特别指出的是，本发明利用我们从厚叶旋蒴苣苔中分离所得到的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1，但这并不意味着利用从厚叶旋蒴苣苔这一种指定的植物中分离得到的基因，使用厚叶旋蒴苣苔所属的旋蒴苣苔属植物分离得到的蓝铜蛋白类似基因进行其他方面的应用均在本发明权利要求之内。

这里还应特别指出的是，本发明利用我们所得到的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1，构建植物表达载体，但这并不意味着此基因只有这一个应用阶值。使用本发明中的基因进行其他方面的应用均在本发明权利要求之内。

在本发明的一个实施方案中，我们选用烟草、矮牵牛、草坪草(早熟禾、高羊茅、黑麦草、剪股颖、结缕草、狗牙根)及牧草(苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草)作为转基因植物材料。但这并不意味着本发明所构建的转基因载体只能用于转化烟草、矮牵牛、草坪草(早熟禾、高羊茅、黑麦草、剪股颖、结缕草、狗牙根)及牧草(苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草)，还包括其它植物。使用含本发明中蓝铜蛋白类似基因BcBCP1的正义及反义表达载体转化其他植物材料，均在本发明的权利要求之内。因为本领域的技术人员可以利用本专利构建好的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1基因表达载体，利用本专利提供的植物遗传转化方法转化其它植物。

在本发明的一个实施方案中，BcBCP1基因被置于CaMV 35S启动子和Tnos终止子的调控之下，再连至CAMBIA公司的双元表达载体pCAMBIA3300，构成一个植物表达载体，用于双子叶植物的转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了pCAMBIA3300之外，还可以选用CAMBIA公司的其它表达载体或者本领域技术人员所熟悉的其它如pGPTV系列，pBI系列，pCB系列等的植物表达载体，有关pCAMBIA3300载体的详细信息可以在CAMBIA公司网站 www.cambia.org.au中得到详细说明。

在本发明的一个实施方案中，BcBCP1基因被置于Ubiquitin启动子和Tnos终止子的调控之下，再连至表达载体pAHC25，构成一个植物表达载体，用于单子叶植物的转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了pAHC25之外，还可以选用其它适合于单子叶植物的表达载体，或者本领域技术人员所熟悉的其它载体。有关pAHC25载体的详细信息可以在 www.defra.gov.uk网站中得到详细说明。

在本发明的一个实施方案中，BcBCP1基因被置于干旱、高温、低温诱导型启动子BcDh2和终止子Tnos的调控之下，再连至CAMBIA公司的双元表达载体pCAMBIA3300，构成一个植物表达载体，用于双子叶植物的转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的干旱、盐胁迫诱导型启动子除了BcDh2之外，还可以选用文献资料中所列的其他诱导型启动子，本领域技术人员可以通过参考有关文献获得详情。。

根据本发明的这一个实施方案，植物筛选所用的抗生素为除草剂，具体选用何种筛选要看选用植物表达载体所对应的标记基因。

根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株为LBA4404。

根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株除了LBA4404外，还应包括农杆菌的其它菌株，如EHA101。这些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白区，能够帮助转入的植物表达载体中的T-DNA转移到植物的基因组中。

在本发明的一个实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化烟草、矮牵牛、早熟禾、高羊茅、黑麦草、剪股颖、结缕草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草等。本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本领域技术人员可以通过参考有关文献获得详情。

本发明中用于将转化细胞再生成植株的方法不是关键，可以使用任何对靶植物合适的方法。本领域技术人员可以通过参考有关文献得到详情。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。

本发明的有益效果：

厚叶旋蒴苣苔的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1受干旱诱导表达强烈，同时也受高浓度盐、高温、低温、外源ABA的诱导表达，其编码蛋白在氨基末端具有一个信号肽，中部具有一个Cu²⁺结合的结构域，羧基末端含有一个植物细胞壁伸展蛋白所特有的PPR结构。这种蛋白的结构推测与植物光合作用的电子传递和植物在病虫害、干旱、盐害、高温、低温等逆境条件下的信号传递及植物体内活性氧的清除有关，从而提高植物的抗逆能力。我们构建了该基因的植物表达载体，并将此耐旱基因导入各类植物中，以提高植物的耐旱、耐盐、耐高低温度胁迫性能。将BcBCP1基因导入烟草、矮牵牛、草坪草和牧草后，能有效提高转基因植物的耐旱保水、耐盐、耐高温和耐低温胁迫能力。转基因株系在液体培养条件下，在PEG8000模拟干旱胁迫48小时后，与未转基因株系相比，叶片相对电导率下降9.6％。在正常条件下，转基因株系的叶片净光合速率提高38％-98％，10％的PEG6000模拟干旱胁迫处理5天后，叶片净光合速率提高47％-1.6倍，处理10天后，提高1.7-3.4倍。相对电导率和叶片净光合速率是衡量植物干旱条件下生理状态的重要指标。相对电导率越低，耐旱性能越强。而植株在干旱条件下保持光合速率越高，耐旱能力越强。在液体培养条件下，125mM NaCL处理20天后，转基因株系比未转基因株系叶片相对电导率下降21.6％，总叶绿素含量提高了19.7％。在37℃处理10天后，转基因株系在形态上比未转基因株系明显健壮。

四、附图简要说明：

图1是植物表达载体p3300-BCP1构建流程的示图。

图2是植物表达载体p3ubi BcBCP1的示图。

图3是植物表达载体pBcDh2-BCBCP1的示图。

图4是BcBCP1基因转化烟草的PCR检测。

图中扩增条带大小为0.6kb，电泳带从左到右编号依次为M，CK，0，1，2，3，4，5，6，7，8。M表示分子标记Marker，CK为阳性对照，0为阴性对照，1-6，8为不同转基因株系，7为转基因阴性植株。

图5是BcBCP1基因转化烟草的Southern检测。

图6是BcBCP1基因转化烟草的Northern检测。

谱带从左到右编号依次为1，2，3，4，5。4为阴性对照，1-3，5表示不同转基因株系。

图7是在干旱处理后BcBCP1基因转化的烟草和未转基因烟草的照片左边是转基因植株，右边是未转基因植株，时间是PEG6000处理后第10天。

图8是BcBCP1基因转化烟草在干旱处理下的叶片质膜透性柱形图

图中编号1是未转基因植株，2-4是转基因植株。

图9是BcBCP1基因转化烟草在干旱处理下的叶片净光合速率柱形图

图中0，5，10分别表示PEG6000处理前，处理后第5天，处理后第10天测定的叶片净光合速率。每一天的测定结果条形柱从左到右编号依次为1，2，3，4。1-3为转基因植株，4为未转基因植株。

图10是BcBCP1基因转化烟草在盐胁迫处理下的叶片质膜透性柱形图

图中条形柱编号从左到右编号依次为1，2，3，4。1为未转基因植株，2-4为转基因植株。

图11是BcBCP1基因转化烟草在盐胁迫处理下的叶片叶绿素含量柱形图

图中条形柱编号从左到右编号依次为1，2，3，4。1为未转基因植株，2-4为转基因植株。

图12是在37℃高温处理后BcBCP1基因转化的烟草和未转基因烟草的照片

图中左边为未转基因植株，右边为转基因植株。

五、具体实施方式：

实验所涉及的药品均购自Invitrogen，Promega公司，Takara公司，Sigma公司及上海生工公司。具体实验操作依据《分子克隆》及相关文献。

实施例1：蓝铜蛋白类似基因BcBCP1的获得：

1.蓝铜蛋白类似基因BcBCP1基因片段的获得

为获得厚叶旋蒴苣苔中干旱胁迫下差异表达的序列标签，我们采用了mRNA差异显示(mRNA different display)结合反向Northern(Reverse Northernblotting)的方法。分别抽取干旱诱导(失水约43％)及自然环境下生长未经干旱处理的厚叶旋蒴苣苔总RNA，根据fluroDD试剂盒说明书，选择3条锚定引物(AP1，AP6和AP10)和4条随机引物(APR7，APR9，APR18和APR20)组合进行mRNA差异显示分析，得到的cDNA片段在5.6％的变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。差异显示重复3次，选择在3次实验中都出现的26条片段做进一步分析。将挖取的片段放入30ulTE中，37℃保温1-2天，取2ul在50ul体系中进行以相同的引物进行第二次PCR扩增。

(1)厚叶旋蒴苣苔总RNA的获得

取0.1g～0.2g厚叶旋蒴苣苔叶片放入研钵中，加液氮迅速研磨成粉沫；将粉末转入盛有0.5ml ConcertTM Plant RNA Reagent的DEPC处理的1.5ml离心管中；室温静置5min，室温小于12000g离心2min；将上清液转入新离心管，加入100ul 5mol/L NaCl，混匀；在加入300氯仿，混匀，4℃小于12000g离心10min；将上清液转入新离心管，加0.5ml异丙醇，15-30℃放置10min；4℃小于12000g离心10min；去上相，加1ml 75％乙醇涡悬洗涤沉淀；室温小于12000g离心1min；自然干燥(不要干透)，枪头吹打溶于50-100ul RNase-freewater；

用RNase-free的DNase I处理总RNA，在PE UV/VIS spectrometer LambdaBio40上测定A230nm至280nm波长范围内的吸光值，并计算A260/A280和A260/A230比值以检测样品的纯度。据RNA(ug/mL)＝OD260×37ug/ml×稀释倍数，计算样品的RNA浓度。

(2)RT-PCR

将对照组和处理组总RNA分别稀释成0.1μg/μl，各取2μl，用不同的anchored primer进行逆转录。在0.2ml PCR管中加入(50μl体系)：1.95μLddH₂O，10×PCR buffer II  1.0μL，25mM MgCl₂ 1.5μL，250μM dNTPs2.0μL，5’APR(2μM)1.75μL，3’AP(5μM)0.7μL，逆转录产物1.0μL，AmpliTaq(5U/μL)，0.1μL。PCR扩增条件为：95℃预变性2min；4个循环：92℃15s；50℃ 30s；72℃ 2min；30个循环：92℃ 30s；60℃ 30s；72℃2min；72℃延伸7min。

(3)反向Northern杂交

为降低差异显示中高比例70-80％的假阳性，进行了两次反向Northern杂交。在克隆片段之前进行第一次反向Northern杂交，取6μL扩增的片段同时点在两张Hybond-N+(Amersham Pharmarcia，U.S.A)尼龙膜上，分别以干旱诱导和未诱导的苣苔总RNA为模板逆转录标记总cDNA探针。在预杂交液中，65℃进行2-3小时的预杂交，过夜进行杂交。阳性的cDNA片段被克隆到pGEM-T Easy载体(Promega，USA)上，每一条片段选择6个克隆，进行第二次反向Northern杂交。选择阳性cDNA片段进行测序。(杂交和显色方法参见分子克隆)。

2.蓝铜蛋白类似基因BcBCP1基因全长cDNA的获得

根据所获得的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1片段设计三条反向基因特异引物，参照5’RACE的操作说明进行操作。设计的三条反向基因特异引物序列如下：

GSP1：5’-CTTCAGCGAACAACATGCAT-3’

GSP2：5’-CTGTGG CTGCAGCTGGATAG-3’

GSP3：5’-GGATAGGGATGCGGAGTTGT-3’

5’RACE试剂盒提供的引物如下：

AAP：5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3

AUAP：5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3

将所获得目的片段回收，与pGEM-T easy载体连接后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行测序，并对序列进行分析，发现已得到了基因的起始序列。将5’RACE序列与差异显示所获得的序列拼接，获得拼接的基因序列，根据此序列在两端设计引物，再次RT-PCR扩增全长基因，并进行序列测定。扩增全长基因所用的引物：

BCP-cDNA-L：5’-AGGATCCATGGGGGGACTCAAGGTTTTTGCT-3’(含BamHI和NcoI酶切位点)

BCP-cDNA-R：：5’-AAACACTTCAGCGAACAACATGCA-3’

PCR反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 20秒，72℃ 6分钟，6个循环；94℃20秒，70℃ 6分钟，6个循环；94℃ 20，68℃ 6分钟，6个循环；94℃ 20秒，66℃ 6分钟，6个循环；94℃ 20秒，64℃ 6分钟，6个循环；94℃ 20，62℃ 6分钟，10个循环；66℃ 7分钟。

实施例2：植物表达载体的构建：

植物表达载体p3300-BCP1的结构见图1。

植物表达载体p3300-BCP1的构建：将pBI121以HindIII和EcoRI酶切，回收2.8kb的片段，将pCAMBIA3301以HindIII和EcoRI酶切，与上述回收的2.8kb片段连接，命名为p3301-121。同时，将p BI121以EcoRI和Sac I酶切，回收0.2kb的小片段，将pCAMBIA3300以EcoRI和Sac I酶切，与上述0.2kb的小片段连接，获得质粒命名为p3300-Tnos。将p3300-Tnos以HindIII和SacI酶切，回收0.2kb的小片段，将p3301-121以HindIII和SacI酶切0.2kb片段连接，获得质粒命名为p35S-3300-Tnos。将BcBCP1基因连接到pGEM-Teasy载体上，并命名为pT-BcBCP1。pT-BcBCP1以EcoRI酶切，回收0.6kb片段与载体pGEM-7Z以EcoRI酶切后连接，连接产物转化DH5α感受态后，挑取菌落分别以BCP-cDNA-L和BCP-cDNA-R为上下游引物进行PCR鉴定。阳性的菌落提取质粒，以BamHI酶切鉴定BcBCP1基因插入载体pGEM-7Z中的方向。因上游引物BCP-cDNA-L和载体pGEM-7Z中均含BamHI识别序列。BamHI酶切若能得到0.6kb片段的小片段，则为正向插入，该质粒命名为p3300-BcBCP1。将p3300-BcBCP1以Xba I和Sac I酶切，回收0.6kb片段与载体p35S-3300-Tnos以Xba I和Sac I酶切后连接，连接产物转化DH5α感受态后，挑取菌落分别以BCP-cDNA-L和BCP-cDNA-R为上下游引物进行PCR鉴定，阳性菌落以Xba I和Sac I酶切鉴定后得到p3300-BCP1。BcBCP1基因的启动子为35S，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，Bar基因的启动子亦为35S，终止子为35S polyA。

植物表达载体p3ubiBcBCP1的结构见图2。

植物表达载体p3ubi BcBCP1的构建：将BcBCP1基因置于Ubiquitin(泛素蛋白基因的5’端调控区，在单子叶植物中组成型表达)启动子的调控之下，构建了适合于单子叶的植物表达载体pAHC-BcBCP1。将该基因连接到pGEM-Teasy载体上，并命名为pT-BcBCP1。Not I酶切pT-BcBCP1，回收约0.6kb的小片段，连接到pGEM-5Z上，得到中间载体p5Z-BcBCP1。将p5Z-BcBCP1用EcoRV和Sac I酶切，回收小片段，同时将pAHC25用Sma I和Sac I酶切，回收大片段，连接小片段和大片段，转化DH5α并进行PCR和酶切鉴定后得到p3ubi BcBCP1。该表达载体由于没有LB(Left Border)、RB(Right Border)，因此不能通过农杆菌介导的方法转化植物，而采取基因枪的方法转化植物。BcBCP1基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，Bar基因的启动子亦为Ubiquitin，终止子为Tnos。

植物表达载体pBcDh2-BCBCP1的结构见图3。

植物表达载体pBcDh2-BCBCP1的构建：将BcBCP1基因置于BcDh2(厚叶旋蒴苣苔脱水素的5’端调控区，本实验克隆，受干旱、高盐、高温、低温诱导表达的诱导型启动子)启动子的调控之下，构建了诱导型植物表达载体pBcDh2-BcBCP1。将连接在pGEM-Teasy载体上的BcDh2启动子用EcoRI酶切，回收约1.0kb的小片段，与载体pGEM-7Z以EcoRI酶切后连接，连接产物转化DH5α感受态后，挑取菌落分别以pBcDh2-promoter-L和pBcDh2-promoter-R为上下游引物进行PCR鉴定。阳性的菌落提取质粒，以BamHI和BamHI+XbaI酶切鉴定BcBCP1基因插入载体pGEM-7Z中的方向。因上游引物pBcDh2-promoter-L和载体pGEM-7Z中均含BamHI识别序列。BamHI酶切不能得到小片段，而BamHI+XbaI酶切得到1.0kb片段的小片段，则为正向插入，该质粒命名为p7Z-pBcDh2。p7Z-pBcDh2以HindIII+XbaI酶切，回收1.0kb的片段，与p3300-BcBCP1以同样酶切回收的大片段连接，连接产物转化DH5α感受态后，挑取菌落经PCR鉴定，阳性菌落以HindIII+XbaI酶切鉴定后得到pBcDh2-BCBCP1。BcBCP1基因的启动子为BcDh2，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，Bar基因的启动子亦为35S，终止子为35S polyA。

实施例3：农杆菌的转化：

(1)农杆菌感受态的制备

1.挑取土壤农杆菌单菌落接种于5ml含适当抗生素的LB/YEB液体培养基中，28℃、250rpm振荡培养过夜；

2.按1∶100接种于40ml含适当抗生素的LB/YEB液体培养基中继续培养4-6h；

3. 4℃，5,000rpm离心10min，去上清；

4.用600μl冰预冷0.05M的CaCL₂溶液洗涤菌体；

5. 4℃，5,000rpm离心10min，去上清；

6.用200μl冰预冷的冰预冷0.05M的CaCL₂重悬菌体，于4℃保存。

(2)转化

1.在感受态农杆菌中加入约0.5-1.0μg质粒DNA，轻轻混匀，冰上放置5min；

2.置于液氮中3min；

3.37℃温育5min；

4.500μL LB/YEB液体培养基，28℃振荡培养5-6h；

5.5,000rpm离心3min，去大部分上清，剩200μl左右，悬浮菌体；

6.均匀涂布于含适当抗生素的LB/YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。

实施例4：烟草、矮牵牛的遗传转化及再生：

在本发明的这一实施方案中，转化烟草的方法为农杆菌介导的叶盘法。侵染农杆菌的制备

(1)挑取经鉴定呈阳性的农杆菌单菌落，接种到含适当抗生素的的10mL液体LB培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养30个小时至对数生长期。对烟草叶盘进行转化前4-6小时，取摇至对数生长期的农杆菌菌液按1∶100的比例接种到含适当抗生素的40mL液体LB培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养以使菌株活化，摇至对数生长期时备用。

(2)取无菌烟草叶片，去叶缘和叶片主脉，剩余部分切成0.5cm的小块。

(3)将摇至对数生长期农杆菌LBA4404菌液于4℃，5000rpm离心，沉淀用等体积无菌MS液体培养基重新悬浮。

(4)将切好的小块烟草叶片放入重新悬浮后的农杆菌中，浸泡15-30分钟，其间不断轻摇几次。

(5)取出材料，用无菌滤纸吸去多余菌液，将叶片正面朝下置于MS固体培养基中，并使叶片与MS固体培养基紧密接触。25℃暗培养两天；把材料转入含相应抗生素和500mg/L Cb的分化培养基中，25℃光下培养至分化出愈伤组织，直至长出芽；

(6)将长至3-5cm的芽转入生根培养基(相应抗生素，Cb500)上诱导生根。

实施例5对草坪草的遗传转化：

基因枪法：

转化过程包括种子或幼穗(包括草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草、)诱导愈伤组织、基因枪轰击、抗性愈伤筛选、苗的分化、植株鉴定。

种子诱导愈伤的步骤：成熟种子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培养基上，让其萌动3天，露出小芽时，将胚纵切后转接于诱导愈伤组织培养基上，形成愈伤(约30天左右)后，每次挑选色泽鲜、增殖快、质地硬的愈伤组织继代培养，继代愈伤可供基因枪转化；

幼穗诱导愈伤的步骤：取长约0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超净台内剥出幼穗，接种于诱导诱导培养基上，形成愈伤后，每20天继代培养一次，供基因枪转化；基因枪的转化及苗的分化：质粒：提取的质粒浓度调整为1μg/μL。子弹配制：30mg金粉或钨粉加1mL 100％乙醇旋涡洗涤15分钟，无菌水洗3次，加500μL 50％甘油备用。取上述钨或金粉悬液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl₂，加20μL 0.1M亚精胺，旋涡，冰上静置15分钟，离心数秒，70％乙醇142μL洗一次，离心数秒，100％140μL乙醇洗一次，离心数秒，加50μL 100％乙醇，供5枪用。

供试基因枪：PDS-1000/He(美国伯乐公司)基因枪可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25inHg，6cm射击距离，每皿射击一枪。枪击前的愈伤组织在含0.4M甘露醇的继代培养基上培养4～8小时，枪击16小时后移入正常继代培养基。枪击后的愈伤组织一周后转至含除草剂2-5mg/L的继代筛选2～4轮，每轮20天。筛选后得到的抗性愈伤组织转入含50g糖的培养基中，光照培养20天，然后转入去掉2，4-D的分化培养基中分化成苗。当小苗长到4-5片叶时，取少量叶片提取植物总DNA，进行PCR检测。小苗长至5～10cm大小时，移入蛭石：松针土为1∶1的土中，塑料袋保温一周后，苗即成活。

实施例6：转基因植株Southern杂交和Northern杂交检测：

得到抗生素筛选阳性的转基因烟草、矮牵牛、早熟禾、高羊茅、黑麦草、剪股颖、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草后，在生长初期，取转基因植株叶片并用SDS法提取植株的总DNA进行PCR鉴定，以合成的BcBCP1基因特异性引物：

BCP-cDNA-L：5’-AGGATCCATGGGGGGACTCAAGGTTTTTGCT-3’

BCP-cDNA-R：：5’-AAACACTTCAGCGAACAACATGCA-3’

进行PCR扩增，可以得到约0.6Kb的条带，说明BcBCP1基因已整合至转基因植株的基因组。(见图5：转基因烟草、矮牵牛、草坪草和牧草的PCR鉴定)

转基因植株基因组DNA的制备(SDS法)

1.称取0.2g植物材料，液氮研磨，加入0.75ml提取缓冲液中，混匀；

2.加40μl 20％SDS溶液使终浓度为1％，剧烈振荡，混匀，65℃保温15分钟；

3.加160μl 5M KAc，剧烈振荡，混匀，冰浴20-30分钟；

4.4℃20000g离心10分钟；

5.取上清，加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃放置30-40分钟；

6.15000g离心10-15分钟；

7.沉淀干燥，溶解于100-200μl 50×TE缓冲液中，若不溶解，65℃加热助溶；

8.加入RNase A 37℃保温15分钟；

9.苯酚/氯仿，苯酚/氯仿/异戊醇，各抽提一次；

10.取上清，加入1/10体积3M NaAc，2体积无水乙醇；

11.12000g离心10分钟；

12.70％乙醇洗涤；

13.干燥，溶于TE缓冲液中，65℃加热10分钟助溶。

转基因植株基因组RNA的制备(TRIzol法)

1.每50-100mg组织中加入1mL TRIZOL，组织体积≤10％总体积；

2.匀浆液混匀后，于15-30℃放置5分钟，于12000g离心10分钟去渣；

3.每1mL TRIZOL加入0.2mL氯仿，振荡15秒，于15-30℃放置2-3分钟；

4.2-8℃，≤12000g离心15分钟，分三层，上层无色水相约占总体积60％；

5.移出水相，每1mL初始TRIZOL加0.5mL异丙醇，于15-30℃放置10分钟；2-8℃，≤12000g离心10分钟，得胶状RNA沉淀；

6.用75％乙醇≥1mL，振荡，于2-8℃≤7500g离心5分钟；

7.干燥，但不要过分干燥，否则难溶(部分溶解的RNA A_260/280≤1.6)，加无菌水溶解，上下吹打，55-60℃保温助溶。

Southern杂交(参见分子克隆)

提取植物总DNA，取10μg用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化过夜，电泳检测是否酶切完全，以3V/cm恒压电泳4-6小时。

采用不对称PCR法标记探针。根据Boehringer Mannheim公司的PCR DIG探针合成试剂盒进行如下操作：50μL反应体系中加入5μl 10×PCR buffer，5μl 10×PCR DIG mix，50pmol上游引物，5pmol下游引物，0.75μl酶混合物，100pg模板DNA，同时用未标记DIG的dNTP作对照反应。反应条件根据不同的模板稍有变动。反应结束后电泳检测标记效率，标记后的探针应比没有标记的产物分子量大，-20℃冻存备用。

Northern杂交(参见分子克隆)

实施例7：转基因植株的模拟干旱处理及叶片质膜透性测定

转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得大量的无菌苗，在MS培养基上生根后，移至Hogland营养液中进行培养。植株成活后选取生长一致的苗(5-7叶期)，进行PEG8000模拟干旱处理。在Hogland营养液中每天加入5％的PEG8000，直至PEG8000的浓度达到15％。处理前和处理48小时后分别用打孔器从叶片中打取小圆片测定叶片质膜透性。

进行PEG6000的模拟干旱处理：以每天递增5％的速度在Hogland营养液中加入PEG6000，直至PEG6000的浓度达到10％。处理前、处理5天、10天后，对每个株系植株第3-5位展开叶，用便携式CO2气体分析仪(CI-301 CO2 gasanalyzer，USA)测定净光合速率，每处理重复3次。

实施例8：转基因植株的盐胁迫处理及叶片质膜透性、叶片叶绿素含量的测定

转基因植株获得无性繁殖的无菌苗后，移至Hogland营养液中培养成活后选取生长一致的苗(5-7叶期)，进行NaCL胁迫处理。在Hogland营养液中以每天递增25mM的速度加入NaCL，直至NaCL的浓度达到125mM。处理前及处理后每隔3天用打孔器从第3-5位叶片中打取小圆片测定叶片质膜透性。处理20天后从第3-5位叶避开叶脉打取小圆片5片，放入研钵中，加MgCO3少许，加80％的丙酮，匀浆，定容至10mL。3000rpm离心10min。取上清，测定470、646.8、663.2、750nm处的吸光值，计算叶绿素含量。

实施例9：转基因植株的高温胁迫处理

选取长势一致的各个转基因株系的无菌苗，放入培养箱中，使培养箱的温度缓慢上升至37℃，观察植株的表现，每个转基因株系选三个植株进行处理。处理10天后，未转基因植株和转基因植株表现出明显差异，未转基因植株生长点坏死，叶片失绿白化，而转基因植株基本上没有明显变化。

六、专利菌种说明：

此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址北京市中关村北一条街13号，邮编100080，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli DH5α)，保藏代号为BcBCP1，保藏编号为CGMCC 1380，保藏日期为2005年5月28日。

总之，本发明克隆了一个新的编码区为606bp，编码201个氨基酸的干旱相关蓝铜蛋白类似基因BcBCP1，并且利用此基因构建了植物表达载体，通过农杆菌介导和基因枪法遗传转化获得了耐旱、耐盐转基因植物。PCR检测和Southern检测证明该基因整合到转基因植株基因组中，Northern检测证明该基因能在植物中正常表达，模拟干旱、高盐、高温、低温胁迫处理实验和生理指标的测定均证明转基因株系比对照显著提高了耐旱、耐盐、耐高温、低温胁迫性能，转基因植株T1代种子在模拟干旱条件下的萌发实验更加证明了转BcBCP1基因植株耐旱性能的提高。

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                             序列表

<110>林忠平

<120>厚叶旋蒴苣苔BcBCP1基因在培育耐旱耐盐植物中的应用

<160>1

<210>1

<211>848

<212>DNA

<213>厚叶旋蒴苣苔(Boea crassifolia)

<220>

<221>5’UTP

<222>(1)…(50)

<220>

<221>CDS

<222>(51)…(656)

<220>

<221>3’UTP

<222>(657)…(848)

<400>1

acgagaaaag attgacaaac tatttttgga gagagaaaga aagctgaaa   50

atg ggg gga ctc aag gtt ttt gct tcg gtg ctg ttt ctt gta gcc gtt gct gta aag ggg 110

Met Gly Gly Leu Lys Val Phe Ala Ser Val Leu Phe Leu Val Ala Val Cys Val Ser Gly

1                5                  10                   5                  20

ctg gaa cag ctg gtt tca gcc gag acc cac cat cat gtt ggt gga gaa gaa ggt tgg aac 170

Leu Glu Gln Leu Val Ser Ala Glu Thr His His His Val Gly Gly Glu Glu Gly Trp Asn

                25                  30                  35                  40

tcc gct tcc aac atc tce tcg tgg ctg tcg ggt cgg gtt ttc agg gtt gga gac aag ttg 230

Ser Ala Ser Asn Ile Ser Ser Trp Leu Ser Gly Arg Val Phe Arg Val Gly Asp Lys Leu

                45                  50                  55                  60

agg gtt tag cgt ccc ggc aac agc gga ctc cat tgt gga gct tca gag cct gga gga gct 290

Gly Phe Ser Val Pro Ala Thr Ala Asp Ser Ile Val Glu Leu Gln Ser Leu Glu Glu Leu

                65                  70                  75                  80

agc aac atg tga tct gcg aaa ccc cat cag aat gta tgc tga tgg atc gaa cca cgt tac 350

Ala Thr Cys Asp Leu Arg Asn Pro Ile Arg Met Tyr Ala Asp Gly Ser Asn His Val Thr

                85                  90                  95                  100

cct gga taa aga ggg gac tag gta ttt cag cag cgg gaa cct gga aag ctg caa gaa cgg 410

Leu Asp Lys Glu Gly Thr Arg Tyr Phe Ser Ser G1y Asn Leu Glu Ser Cys Lys Asn Gly

                105                 110                 115                 120

gat gaa gct acc tgt gac cgt gca gaa tcg tca tga tga aga caa gcc tta ccg ccc tga 470

Met Lys Leu Pro Val Thr Val Gln Asn Arg His Asp Glu Asp Lys Pro Tyr Arg Pro Asp

                125                 130                 135                 140

tcc acc agt gga gcc tta ccc tca tca cca tga tga aga cga gcc tta ccg ccc tga tcc 530

Pro Pro Val Glu Pro Tyr Pro his His His Asp Glu Asp Glu Pro Tyr Arg Pro Asp Pro

                145                 150                 155                 160

Acc agt gga gcc tta ccc tca tcc ccc gcc tac aac tcc gca tcc cta tcc agc tgc agc 590

Pro Val Glu Pro Tyr Pro His Pro Pro Pro Thr Thr Pro His Pro Tyr Pro Ala Ala Ala

                165                 170                 175                 180

cac agc ttt gaa tgt gtt ttt gtc cgt ggt gtt tgc tgg gct gtt cct ttc gtg tat tgg 650

Thr Ala Leu Asn Val Phe Leu Ser Val Val Phe Ala Gly Leu Phe Leu Ser Cys Ile Gly

                185                 190                 195                 200

cat gta gatttgtttt tctaatatat tatatgcatg ttgttcgctg aagtgttttt agta             710

Met *

201

ctatcagtat ccatcccctg tgtctgataa agcaactctt gtcttgttct tctgtttc                 770

taatgtcatg tttggatgtt ggaagctctt cagatgcact actaaataaa atgctgcttg               830

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Claims (7)

1、从厚叶旋蒴苣苔中克隆的干旱相关的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1，该基因的特征在于它具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，该基因编码区为606bp，编码一条由201个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白氨基末端具有一个信号肽，中部具有一个Cu²⁺结合的结构域，羧基末端含有一个植物细胞壁伸展蛋白所特有的PPR结构，具有典型的小分子量的蓝铜蛋白的结构特征。

2、根据权利要求1所述的干旱相关的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1基因的应用，其特征在于将该基因用于构建植物表达载体，并通过植物转基因方法获得具有耐旱、耐高温效果的转基因植物，转基因寄主植物为烟草、矮牵牛、早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颖、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草和冰草中的一种。

3、一种植物表达载体，其特征在于它含有权利要求1所述的干旱相关的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1。

4、根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于该植物表达载体具有图1所述p3300-BCP1的质粒结构。

5、根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于该植物表达载体具有图2所述p3ubiBcBCP1的质粒结构。

6、根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于该植物表达载体具有图3所述pBcDh2-BCBCP1的质粒结构。

7、一种生产耐旱、耐高温植物的方法，其特征在于将权利要求1所述的干旱相关的蓝铜蛋白类似基因BcBCP1通过农杆菌介导法或基因枪法转入植物中，再通过PCR鉴定、Southern杂交检测和模拟干旱、高温条件下生理指标的测定筛选出耐旱、耐高温的转基因植物。

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