CN101693891B - 荠菜CBF途径关键基因CbCBF的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种荠菜CBF途径关键基因CbCBF的启动子CBFP及其应用。该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中CbCBF基因及其启动子包含序列表SEQ ID NO：1所示序列中的2283位碱基的核酸序列，该核酸序列编码一个受低温诱导的、能调控冷诱导基因的转录因子。启动子区域包含两个串联排列的ABRE顺式作用元件，能特异地对低温和ABA起应答反应，和三个MYCRE顺式作用元件CANNTG，能与上游调控因子ICE(inducer of CBF expression)基因结合。利用该基因启动子构建的诱导性表达载体可以在植物受到低温胁迫时强烈地诱导目标基因的表达。本发明还提供上述启动子在培育抗寒植物中的应用，实现农作物品种的改良。

Description

荠菜CBF途径关键基因CbCBF的启动子及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、植物基因工程技术领域。具体涉及植物逆境诱导启动子的克隆及其应用。通过鉴定、克隆一个荠菜受低温诱导的、能调控冷诱导基因的转录因子基因的启动子，将其应用于植物逆境基因特别是用于植物抗寒基因的遗传转化，达到提高植物抗寒性的目的。

背景技术

植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进化的遗传基因型控制，又受个体发育中的生理生态因素制约。温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布及生长和产量，对植物生长发育起着决定性作用(Viswanathan C，Zhu JK.Molecular genetic analysis of cold-regulated gene transcription.Philos Trans R Soc Lond B BiolSci.2002，357(1423)：877-886.)。随着转基因技术的日益成熟，人们已从植物中分离了大批抗寒相关基因(蔺忠龙，李维薇，白现广，吕广磊，程在全.植物抗冻基因最新研究进展，北方园艺，2009(1)：119-123)用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相关基因进行转基因抗寒植物培育时均发现在获得优良低温抗性植株的同时，普遍出现不同程度的生长延滞(retardation)现象。主要是利用抗寒相关基因进行的转基因植物都是在组成性启动子CaMv(cauliflowermosaic virus)35S驱动下产生的。这种基因的组成性表达对植物的生长造成了一定的影响。为了克服转基因植物出现的生长延滞现象，人们开始利用冷诱导特异性启动子代替组成性启动子。冷诱导基因RD29A(来源于拟南芥COR78基因)启动子驱动的转基因植株的研究表明，转基因植株的生长延滞比CaMV35S启动子驱动的转基因植株所表现出来要轻微得多(Kasuga M，Miura S，Shinozaki K.A combination of the Arabidopsis DREB1A gene an dstress-inducible RD29A promoter improved drought and low-temperature stress tolerance intobacco by gene transfer.Plant Cell Ph siol，2004，45：346-350)。利用特异性的诱导型启动子避免外源基因在宿主植物中非特异性的持续、高效表达已经得到广泛共识，但是真正能应用于生产实际的特异性启动子不多，而冷诱导型特异启动子更少。目前特异启动子的克隆及其结构功能的研究是转基因植物研究中的一个热点，也是一个生发点。这一领域的研究成果将极大推动转基因植物基础研究的进展，加速转基因植物的产业化。

荠菜(Capsella bursa-pastoris)是一种1年或2年野生的草本植物，平铺地面，喜阴，在南方是随处可见的一种可食用的蔬菜，属于十字花科、荠菜属Capsella Medik，在低温条件下能够正常生长发育并结实。以前的研究证实荠菜中存有CBF抗逆应答机制，荠菜中的CBF基因(GenBank登录号：AY391121)的全长cDNA序列1034bp，包括一个双向的核定位序列(NLS)结构域，一个推定的60个氨基酸基元的AP2结构域和一个ALA-Rich结构域。冷适应分析表明荠菜中的CBF基因的表达受冷诱导调节(Wang X，Liu S，Liu X，Chen Z，Liu X，Pang Y，Sun X，Tang K.Molecular Cloning and Characterization of a CBF Genefrom Capsella bursa-pastoris.DNA sequence.2004，15(3)：180-187)。本发明所涉及的荠菜CBF途径关键基因CbCBF基因的启动子是从荠菜叶片的总DNA中克隆到的。目前尚未发现利用荠菜CBF途径关键基因CbCBF基因启动子用于培育耐寒植物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是克隆、鉴定一个低温强烈诱导表达的植物内源启动子，并利用该启动子构建抗寒相关基因表达载体，通过遗传转化方法达到提高植物的抗寒性，最终获得抗(耐)寒能力明显增强的优良植物品种。

本发明首先分离得到低温强烈诱导表达的启动子，所提供的低温强烈诱导表达的启动子来源于荠菜。该启动子控制的荠菜内源基因为编码受低温诱导的、能调控冷诱导基因的转录因子CBF(CRT/DRE binding factor)家族的一个成员，被命名为CbCBF，故该启动子记为CbCBFP(CbCBF Promoter)。CbCBFP启动子是具有序列表SEQ ID NO：1中的碱基第1-1623位的序列。CbCBFP启动子控制的CbCBF基因是具有序列表SEQ ID NO.1中碱基第1624-2283位的编码序列或含有与其编码的蛋白质同源性至少在80％以上具有相同功能的序列。

本发明所提供的CbCBFP启动子区域含有两个ABRE顺式作用元件，三个MYCB顺式作用元件(附图1)，前者能特异性地对低温和ABA起应答反应，后者是上游调控因子ICE(inducer of CBF expression)基因的冷调控元件ICE盒，是ICE基因的结合位点。

本发明利用CbCBFP启动子构建了诱导性表达载体，该表达载体可以在植物受到低温胁迫时强烈地诱导报告基因GUS的表达。

利用本发明所提供的CBFP启动子构建的植物表达载体转化模式植物烟草，检测转基因烟草的抗寒的生理指标，显示植株耐寒性能有了显著提高。

本发明进一步详细描述如下：

一种分离出的荠菜DNA分子，它的核苷酸序列如序列SEQ ID NO.1所示，其中荠菜CbCBF基因及其启动子CbCBFP包含序列表SEQ ID NO.1所示序列中的2283位碱基的核酸序列，该核酸序列编码一个受低温诱导的、能调控冷诱导基因的转录因子。

所述荠菜启动子CbCBFP区包含两个串联排列的ABRE顺式作用元件ACGTGGC和CACGTG，和三个MYCRE顺式作用元件CANNTG。

所述的启动子CbCBFP全部或部分序列构建的植物表达载体。

所述的启动子CbCBFP全部或部分序列构建的植物表达载体，通过遗传转化培育抗寒植物的方法。

所述的启动子CbCBFP全部或部分序列构建的植物表达载体，通过遗传转化培育抗寒植物材料。所述的抗寒植物材料是指植株、种子或无性细胞系。

按照以上的技术方案，很显然，人们可以利用本发明所提供的CbCBFP启动子构建抗寒相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗寒性。受体植物主要包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物，当然也包括其他一些重要的经济作物，例如棉花、油菜或番茄作物上的应用。

序列表SEQ ID NO.1，为本发明克隆的包含启动子序列CbCBFP的荠菜冷诱导转录因子CbCBF基因序列全长和引物的序列。

序列表SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.4，为本发明用于克隆荠菜CbCBF基因启动子CbCBFP序列的引物序列。

序列表SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6，为本发明用于克隆荠菜CbCBF基因序列的引物序列。

附图说明

图1显示的是CbCBF基因启动子区顺式作用元件。斜体标注序列为开放阅读框(ORF)；两个ABRE元件用和三个MYCRE顺式作用元件加文本框表示；灰色背景显示的是基本启动子元件序列。双下划线为扩增CbCBF基因所用的引物序列；单下划线序列为扩增CbCBF基因启动子所用的引物序列。

图2显示的CbCBF基因的诱导表达。结果表明只有在低温诱导条件下(4℃ for 8h)，CbCBF基因才出现表达条带。

具体实施方式

下面结合具体的试验数据和实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1荠菜CBFP启动子的分离和鉴定

1.荠菜幼苗的培养

荠菜种子来源于上海市种子公司，荠菜种子经过消毒处理后，播种于含有MS₀培养基的培养罐内，置于25℃下培养4周，其中光照周期为16h光照，8h黑暗。

2.启动子序列的克隆

采用Genome walking技术扩增荠菜CbCBF基因的启动子序列。实验操作按照UniversalGenomeWalker^TM Kit(CLONTECH)的使用手册进行。荠菜的Genome walking库建好后，根据CBF基因(GenBank Accession No.：AY391121)的cDNA序列的开放阅读框(ORF)设计2条引物：5′-TCCGACGAACTCCTC TGTAAAC TGG-3′(记为SEQ ID NO.2)和5′-CGGGTCTCACGAAACTTCTTCCTAC-3′(记为SEQ ID NO.3)，与试剂盒中的2个接头引物配合，进行两轮PCR反应，同时电泳检测两轮PCR扩增产物。挑选第二轮中的特异条带进行克隆、测序。根据测序结果，进一步设计1条引物(5′-AAGGCTGTTACTCACTCATTGTC-3′)(记为SEQ ID NO.4)，与试剂盒中的接头引物2配合，进行第3轮PCR反应，电泳检测并克隆、测序。

测序显示克隆到的CbCBF基因的启动子序列全长1623bp(记为SEQ ID NO.1)。荠菜CbCBF基因编码框的第一个起始密码子在(1624-1626bp)处，第一个起始密码子ATG前的1623个碱基为CbCBF基因的5’侧翼序列，命名为CBFP。

实施例2荠菜CBF途径关键基因CbCBF基因的诱导表达

通过半定量RT-PCR验证Cbcbf mRNA的表达受低温诱导。以野生型荠菜为材料，依次按照三种不同的低温诱导条件处理材料：28℃ 4d；4℃ 8h；28℃ 4d。依次提取三个不同阶段的三种荠菜叶片总RNA，电泳检测并测定所抽提RNA的OD₂₆₀值。使用One Step PCR Kit(Takara)进行半定量RT-PCR。RT-PCR反应条件为50℃ 30min，随之94℃ 1min，60℃ 1min和72℃ 2min进行30个循环。未诱导的RNA被抽提用于ubiquitin基因(约250nt)的扩增(AY189972)，用作对照便于更好的比较分析。

结果表明只有在低温诱导条件下(4℃ for 8h)，CbCBF基因才出现表达条带(图2)。这说明CbCBF基因的转录是受低温条件触发的，并且当解除诱导条件时，其转录不能维持很长的时间。该结果证明CbCBF基因的确与冷适应过程相关。

实施例3荠菜CBFP启动子低温诱导活性分析

在该实施例中，将克隆得的荠菜CBFP启动子序列连至pCAMBA1301载体上(由澳大利亚CAMBIA[the Center of the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture，Australia]提供)，构建一个驱动GUS基因的植物表达载体。瞬时表达实验表明，在单子叶和双子叶植物中，荠菜CBFP启动子均在低温诱导下能增强GUS基因的表达。因此，荠菜CBFP启动子在作物抗寒基因工程中具有较好的应用前景。

瞬时表达载体的构建

在本实施方案中，构建成瞬时表达载体pCAMBA1301-CBFP-GUS

切除商品化的植物表达载体pCAMBA1301自带的CaMV35S启动子，连入荠菜CBFP启动子，调控GUS基因的表达。用商品化的植物表达载体pCAMBA1301，作为荠菜CBFP的启动子在单子叶和双子叶植物中瞬时表达实验的对照。

基因枪法转化玉米胚性愈伤组织和烟草幼叶

以1300psi系统压力和28时汞柱真空度，在Bio-Rad公司DuPont PDS1000/He型基因枪上，分别转化玉米胚性愈伤组织和烟草幼叶，每枪1μg质粒DNA。玉米胚性愈伤组织在N6培养基上诱导培养，烟草幼叶在1/2MS培养基上培养。用荠菜CBFP启动子启动的诱导型表达载体pCAMBA1301-CBFP-GUS转化，以组成型表达载体pCAMBA1301为对照，各转化玉米胚性愈伤组织150块和烟草幼叶90片。

低温逆境处理和GUS组织化学染色

转化后将1/2玉米愈伤组织转移至N₆培养基上，27℃黑暗培养；1/2烟草幼叶转移至1/2MS培养基上，24℃条件下，每天16h光照培养，作为正常生长条件的对照。同时将另外1/2玉米愈伤组织或烟草幼叶在原培养基上于4℃低温培养。

处理3d以后，用GUS反应液(0.1mol/L NaH2PO4缓冲液，pH 7.0；10mmol/L EDTA，pH 7.0；5mmol/L 铁氰化钾；5mmol/L 亚铁氰化钾；1.0mmol/L X-gluc；0.1％Triton X-100)浸泡上述各处理的玉米愈伤组织或烟草幼叶，抽真空(200Mbar，重复2次，每次30s)，37℃温育16h，用蒸馏水清洗。玉米愈伤组织无色素干扰，直接在显微镜下观察拍照。烟草幼叶有色素干扰，用固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)固定1h，25％-95％乙醇逐级脱色脱水，蒸馏水清洗，然后观察拍照。

GUS基因的表达产物，可将反应液中的X-Gluc水解成蓝色物质，使组织呈现蓝色，蓝色的深浅及斑点数量，能在一定程度上反应GUS基因的表达水平。在低温和对照条件下，用组成型表达载体pCAMBA1304转化的玉米愈伤组织和烟草幼叶，正常显现蓝色斑点。用冷诱导表达质粒pCAMBA1304-CBFP-GUS转化的玉米愈伤组织和烟草叶片，在正常培养条件下检测不到蓝色斑点，无法鉴别阳性克隆，但在高盐和低温条件下，玉米愈伤组织和烟草幼叶均显现蓝色斑点，斑点的面积和着色强度均高于用组成型表达载体转化的对应处理。由此说明，荠菜CBFP启动子在单子叶和双子叶植物中，均可受低温诱导，启动结构基因的表达。

实施例4利用荠菜CBFP启动子控制CBF基因转化烟草提高抗寒性

植物表达载体的构建

构建植物表达载体：pCAMBA2301-CBFP-CbCBF。

在本实施方案中，CbCBF基因被置于CBFP启动子之后，再连至pCAMBA2301，构建一个植物表达载体，用于植物的转化。

农杆菌介导法对烟草的转化

1.农杆菌的培养  挑取单菌落，在2ml农杆菌液体培养基中，28℃培养过夜；取1mL以上培养物，加入50mL农杆菌液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0；8000rpm离心10min，收集菌体，用MS₀重悬，使OD₆₀₀＝1.0。

2.共培养  取烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.8cm×0.8cm左右的叶盘，放在MS₁培养基上，防止叶盘脱水；将叶盘放入农杆菌培养液中，190rpm，28℃摇床上浸染10min；用药勺捞出叶盘，放在灭菌的吸水纸上，吸干叶盘上的多余菌液；将吸干的叶盘平放在加盖一层滤纸的MS₁培养基上，25℃左右，于暗处共培养约2d。

3.诱导丛生芽  共培养后，按以下步骤将叶盘表面的农杆菌洗掉，其间不时摇动，使叶盘充分接触下列溶液：无菌水，15min；无菌水+羧苄青霉素(500mg/L)，15min；MS₀+羧苄青霉素(500mg/L)，20min。用药勺捞出叶盘，放在吸水纸上，吸干多余水分；将叶盘放在MS₂培养基上，叶盘边缘轻压入培养基中；25℃左右，16h光照培养。

4.诱导生根  在MS₂培养基上诱导约4周后，将叶缘长出的幼芽从基部与叶盘切开，将幼芽插入MS₃培养基中诱导生根，25℃左右，16h光照培养。

转基因烟草微量DNA提取及PCR检测筛选

1.取少量转基因植株叶片，剪碎，置研钵中，加入1mL提取缓冲液(100mmol/L Tris·ClpH 8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，研磨成浆。

2.吸入1.5mL EP管中，剧烈摇动混匀。

3.60℃水浴保温30-60min，不时颠倒混匀。

4.室温下10000rpm离心5min。

5.小心吸取上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈震动。

6.室温下10000rpm离心5min。

7.小心将上清吸入新的离心管中。

8.加入1倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。8000rpm离心5min，弃掉上清；75％酒精洗一次，晾干沉淀。

9.加入5μL RNaseA(10μg/μL)，37℃ 10min，除去RNA。

10.加50-100μL水融解，-20℃贮存。

11.以提取出的DNA为模板，用表达载体自带HYG基因引物及CbCBF基因特异性引物分别进行PCR反应，鉴定目的基因在转基因烟草基因组中的表达状况。

转基因烟草的DNA提取及Southern blot检测

烟草叶片DNA的提取  取烟草叶片100mg，加入500μl提取缓冲液[1倍体积的DNA提取缓冲液[(63.77g/L山梨糖醇，12.1g/L Tris-HCl pH8.2，1.861g/L EDTA-Na₂盐)；1倍体积的核酸裂解缓冲液(200ml 1M Tris-HCl pH 7.5，200ml 0.25M EDTA，400ml 5M NaCl，20gCTAB，200ml MQ Water)；0.4倍体积的5％SDS；使用前加入亚硫酸氢纳(终浓度为0.02M)]，65℃水浴放置30min后，加750μl氯仿∶异丙醇(24∶1)，离心(12000rpm)5min，移取上清液到一新离心管中，加入同体积的冷异戊醇，摇动，直到DNA沉淀出现。离心(12000rpm)10min，弃去上清液。用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于适量的TE中。

应用分光光度法定量分析DNA或RNA，具体操作步骤如下：用TE或蒸馏水对待测样品做适量的稀释。用TE或蒸馏水作为空白，在波长为260nm，280nm及310nm处调节紫外分光光度仪读数至零，加入样品溶液于三处波长处读取OD值，记录OD值，并通过计算确定DNA或RNA的浓度和纯度。

探针的制备  我们设计了用于克隆荠菜的CBF的核苷酸序列的引物(5′-ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT-3′和5′-CTACTTGGTGGCATCCTTAG-3′)(分别记为SEQ ID NO.5和记为SEQ ID NO.6)，获得扩增片段长度为660bp(CbCBF基因)作为杂交探针的模板，采用PCR法对探针实行地高辛-dUTP(digoxigenin(DIG)-dUTP)(PCR DIGProbe Synthesis Kit，Roche)标记。于冰水上在2个标号的500μL Eppendorf管中分别加入：CbCBF的胶回收产物0.1μL，10×PCR buffer(with MgCl₂)5μL，10×PCR Dig Mix 5μL，10×dNTP stock solution 5μL，10μmol/L引物11μL，10μmol/L引物21μL，Enzyme mix，Expand High Fidelity 0.75μL(2.6单位)，ddH₂O 32.15μL，总体积50μL。混匀后转到已预热到94℃的PCR仪上进行扩增，扩增程序为：94℃，2min→(94℃，30sec→60℃，30sec→72℃，40sec)×30cycles→72℃，10min。每管取5μL PCR产物经琼脂糖/溴乙锭/1×TAE凝胶电泳和紫外检测后，判断探针是否标记上及浓度。

酶切  选取探针序列中不具有识别位点的限制性内切酶EcoRI和HindIII分别对荠菜基因组DNA进行酶切，在2只500μL Eppendorf管中分别加入以下成分：

成分               EcoRI组               HindIII组

10×buffer         15μL NEBuffer 2      15μL NEBuffer 2

DNA                40μL(30μg)          40μL(30μg)

酶(10units/μL)    EcoRI 12μL           HindIII 12μL

去离子H₂O          83μL                 83μL

总体积             150μL                150μL

轻轻混匀后于37℃温育24h以上，酶切3h后轻轻混匀一次，酶切24h后每管取5μL于0.5％琼脂糖/溴乙锭/1×TAE凝胶电泳，直至确认酶切已基本彻底后转入下一步。

Southern凝胶电泳  向每管酶切产物中加入355μL ddH₂O和500μL酚∶氯仿∶异戊醇，颠倒混匀10min；

1.12000rpm离心10min；

2.吸上清，加入1000μL-20℃预冷的无水乙醇，混匀；

3.12000rpm离心10min；

4.弃上清，稍干燥后用30μL TE(pH 8.0)溶解沉淀；

5.配制0.8％琼脂糖/1×TAE凝胶；

6.凝胶冷后向每管DNA酶切产物中加入5μL6×上样buffer，上样；

7.常温下于1.0v·cm^-1电泳12小时左右至溴酚兰迁移至凝胶的五分之三距离。

Southern凝胶转膜和固定

1.电泳完毕后取出凝胶，切去多余的胶体，切下左上角作为标记，没于变性液中振荡变性45min；

2.弃去变性液，用ddH₂O稍事清洗后于中和液中振荡中和2×15min。

3.架好毛细管转膜的平台，倒入500mL 20×SSC于铝盒中，铺好双层3MM滤纸桥并润湿；

4.将凝胶孔口一面向下置于平台上，赶去气泡；

5.切一张与凝胶一样大小的Hybond-N⁺尼龙膜，润湿后铺于凝胶上，赶去气泡；

6.用Parafilm围住凝胶的四边，以防短路；

7.切取与尼龙膜一样大小的两层3MM滤纸铺于尼龙膜上，赶去气泡；

8.压上一叠与尼龙膜相同面积的吸水纸，顶上均匀压一500g左右的法码盒，转膜24h以上；

9.转膜完成后，取下凝胶用溴乙锭染色10min，并进行紫外检测，检查转膜效率；

10.同时用6×SSC漂洗尼龙膜2×5min；

11.将尼龙膜置于吸水纸上于室温晾干30min；

12.用3MM滤纸裹住尼龙膜于80℃固定2h；

13.将尼龙膜包裹于锡泊纸中，室温保存备用。

探针与尼龙膜的Southern杂交和检测

1.将尼龙膜取出浸入2×SSC中5min，DNA面向上铺于杂交管中；

2.加入20mL DIG Easy Hyb(Roche)，于Shake‘n’Stack杂交炉(Hybaid)中于42℃转动预杂交30min；

3.倒出预杂交液，加入12mL新鲜的DIG Easy Hyb，继续于42℃转动预杂交；

4.将适当数量的检测已标好的探针液于沸水浴中水浴变性5min，冰水中急冷3min；

5.将探针迅速加入到热的DIG Easy Hyb中，42℃转动杂交16h；

6.杂交时间到后取出尼龙膜，温室下于2×SSC、0.1％SDS洗2×5min；

7.68℃下于0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤尼龙膜2×15min；

8.室温下于100mL Washing Buffer(Roche)中振荡漂洗膜2min；

9.室温下将膜于100mL Blocking Solution中振荡阻断1h；

10.室温下将膜于20mL AP Solution(DIG Luminescent Detection Kit，Roche)中振荡平衡30min；

11.室温下于100mL Washing Buffer中振荡漂洗尼龙膜2×15min；

12.室温下将尼龙膜与20mL Detection Buffer(DIG Luminescent Detection Kit，Roche)平衡3min；

13.将膜于杂交袋中，DNA一面向上并均匀铺上1mL CSPD(DIG LuminescentDetection Kit，Roche)，封闭均匀，于37℃预热10min；

14.于暗室中压上一张Fuji X光片，37℃保温10min左右；

15.显影、停影和定影。定影完成后用大量自来水冲洗胶片，晾干后按编号对应在胶片上标出编号和三个标记点的位置，剪下每张膜对应的胶片。

转基因烟草的总RNA提取及Nouthern blot检测

转基因烟草的总RNA提取

探针的制备  采用southern blot设计的两对引物，以荠菜总RNA为模板，分别克隆荠菜CBF的cDNA序列(5′-ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT-3′和5′-CTACTTGGTGGCATCCTTAG-3′)(见记为SEQ ID NO.5和记为SEQ ID NO.6)，获得扩增片段长度分别为660bp(CbCBF基因)作为杂交探针的模板，配制琼脂糖甲醛变性凝胶于一支180℃干烤2h的三角瓶中加入：DEPC处理过的水37.5mL；10×MOPS 7.5mL；RNase-free的低熔点琼脂糖0.55g；总体积45mL。于微波炉中化胶，冷至60℃时加入10mL甲醛，混匀后待冷至45℃左右倒胶，插上3mm梳子，凝胶冷后备用。

RNA变性样品的制备和电泳  取30株转基因烟草植株的叶片和4℃诱导的转基因烟草植株的总RNA。事先采用乙醇沉淀法将RNA样品浓缩至3μg/μL以上，并计算出每个样品所需RNA的μL数，准备相应数量的RNase-free的500μL Eppendorf管，编号后分别加入：总RNA 30μg；甲醛7μL；去离子甲酰胺20μL；10×MOPS 2μL；DEPC处理过的水补足至40μL混匀后于65℃变性10min，冰上急冷，加入微量溴乙锭和6μL RNase-free的上样buffer，立即上样，在1×MOPS缓冲液中于1v/cm电泳，待溴酚兰迁移至凝胶的一半距离时转膜。

Northern凝胶转膜、固定和杂交检测电泳完毕后取出凝胶，切去多余的胶体，切下左上角作为标记；凝胶用DEPC处理过的水稍事清洗；采用DEPC处理过的20×SSC转膜；在RNase-free的环境下预杂交、杂交(均在50℃)和洗片。杂交过程均同Southern杂交和检测。

转基因烟草的耐寒性试验

将生根两周的转基因苗与同时期栽培生长状况类似的野生型烟草苗置于4℃光照培养，冷适应3d，之后置于-15℃处理暗1-2h，记录存活苗数量。实验设置三组重复，通过t-检验评价转基因组与野生型对照组差异的统计学意义。

通过低温处理检测烟草苗存活率可见，-15℃处理1h后，Cbcbf转基因植株存活率显著高于野生型对照；2h后Cbcbf存活率降低，依然明显高于野生型植株。三组重复实验数据根据t-检验证明P＜0.05，符合统计学意义。提示荠菜基因Cbcbf的启动子及其编码蛋白在植物耐寒性和抗冻性提高方面有重要作用。

荠菜抗寒基因启动子核苷酸序列表

SEQ ID NO.1

<110>复旦大学

<120>荠菜CbCBF基因的编码序列

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2283

<212>DNA

<213>荠菜(Capsella bursa-pastoris)

<400>1

CGACGGCCCG GGCTGGTCTG AAGACAAGAG GATTGTAAGA GTCTAAGAGA AATGTGGTGG    60

TCGTTGAACT TGAAGGGAAG AAGAGAAGAG GATCGTAAGA GAAAGGTGGT GGTTGAAGGA   120

AAGAAGAGAA AAGAGGAGAA AGAAACTCCT CCGCTTGAGG AGGAGCCAAG GAGGTGTGAA   180

AGGTGGTGGT TGAAGGAAAT AAGAGAAGAT AGGAGAAAGA AACTCCCCCG AATGAGAAAG   240

AGGAGGAGCT CACCACCATC ACTATATAGA AGAGATAAAG CGAGAGAGAG AAAAACTAGT    300

CTAGAGTGAG AGAGGGGGTT GAGAATTGTG ATCAACTTAA TGCAAAATGT GCTTTTATTG    360

CATGCTTACT ACATTCTCCT TTTGTCACAT ACGCAAACAC TTTTCTATTT TGTCTCCTAA    420

ATCCAACGCA CCCCACATTT TGTCAATGCA CTATGTAGTG AATACTAAAG AAAATTGACT    480

AATTTATAAA TGCAGGTAAA TTTTATGTTT CAAATCGTAT GACGATTCGA TACAAATTTG    540

CTATTTTATT TAGTTTTAAT ATACTTACAT TCTGACGGAT TTAATAAACA TATCAAACCC    600

TAAATATAAC TTTCATAGTT TTCACTAGAC CTTCTAAAAA TTTATCATAG AATATTACAA    660

AATTCGTATT GTATATATAT CATTTATAAC AACAACAATG TGAAACTATT TTCCCCCAAA    720

AAGAAATAGG AGATCACTCA ATTTTTATTT TCTTAGAGAC GTCATTACTT TAGTTACCTA    780

TAGATATTAT GATATGGAGT TAACCATTTA ACTAGGGCTT TAAAAAATTT ATACCATTTC    840

AGCTTTAATG TAGATTACCA ATTATGGTCT AGAACCACAT TTCATAACTT TTTACACTTC    900

TTGAATAAAT TTTAAAAGAT CATTATAATC ATTTAAATTG CACACAAATA TCTGGCTACC    960

ATCCTCGCTA TTCATATTCT AGAAGGATTT GCAGTGTACA AAATGCCAAG GTAAAAAAAA   1020

AAGAGCATCT AAAAATATCT TAATATTATG TCGATTGGAT GGGTGACAAT TAACGACAAA   1080

TTCTAAATTC AGGAATATAA TAATGAAAAT GAATATAACG GTTGTGGCCT ACATACACTT   1140

GACTACTTTA GTATAGTAGA GAATACATAA CAGCCACACA TTCACACGAT GAGAGGTTAT   1200

TTTATTTATT AATAATAAAA ACGACTCATA AAGGTGTAAT AACGAGTGAA GAGTCCAAAA   1260

AGTCTTCTCA AGAGGGGTCG AAGGCCACAT GTCAGACAAT GAGTGAGTAA CAGCCTTAAC   1320

AACTCGTTTC TTTAAAACCA AACCGTAGAA TTGCTTAGCT GTGTTTTTGT TCACGTGGCG   1380

TCCTCAGAGA CACTATCTTC GTGTTCTCTA TGCTTGTAAA ATATCTCAGG GCCAATATAA   1440

AAGATCAAGC TCTCACTCCA ACTTTTCTTC TAACTACAAA CTTAAACAAG AATCCACCTG   1500

AAAAGAAAAT AGAGAGAGAG AAATATATAT ATATTAACAA CTAAAGAGAT TTCTTCTTTT   1560

AGTTACTCTC TACTTTTATC CAGTTTTTTT TCTTCTTTAT CTCGAACAGA GTATTCTCAA   1620

ACA ATG AAC TCA TCT TTC TCT GCT TTC TCT GAA ATG TTT GGT TCC GAG     1668

Met Asn Ser Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Glu

 1               5                   10                  15

TAC GAG TCT CCG GTT TCT TCA GGC GGC GGA GAT TAT TGT CCG ACG CTG     1716

Tyr Glu Ser Pro Val Ser Ser Gly Gly Gly Asp Tyr Cys Pro Thr Leu

                20                  25                  30

GCG ACG AGC TGT CCC AAG AAA CCA GCG GGT AGG AAG AAG TTT CGT GAG     1764

Ala Thr Ser Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu

             35                  40                  45

ACC CGT CAC CCA GTT TAC AGA GGA GTT CGT CGG AGA AAC TCC GGT AAG    1812

Thr Arg His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys

        50                   55                 60

TGG GTT TGT GAG GTT AGA GAG CCA AAC AAG AAA TCT AGG ATT TGG CTC    1860

Trp Val Cys Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu

    65                  70                   75

GGA ACT TTC CCT ACG GCC GAG ATG GCT GCT CGT GCT CAC GAC GTC GCC    1908

Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala

 80                  85                  90                  95

GCT ATA GCC CTC CGT GGC AGG TCA GCC TGT CTC AAT TTC GCT GAC TCT    1956

Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser

                100                 105                 110

GCT TGG CGG CTA CGG ATC CCC GAG TCA ACA GGC GCC AAG GAA ATC CAG    2004

Ala Trp Arg Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Gly Ala Lys Glu Ile Gln

            115                 120                 125

AAG GCG GCG GCT GAA GCT GCG CTG GCC TTT CAG GAT GAG ATG ATG ATG    2052

Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe Gln Asp Glu Met Met Met

        130                 135                 140

AGC GAT ACC ACG ACG ACG GAT CAT GGC TTT GAC ATG GAG GAA ACG TTT    2100

Ser Asp Thr Thr Thr Thr Asp His Gly Phe Asp Met Glu Glu Thr Phe

    145                 150                 155

GTG GAA GCA ATT GTG ACG GCG GAA CAG AGC GCT TCG TTA TAT ATA GAC    2148

Val Glu Ala Ile Val Thr Ala Glu Gln Ser Ala Ser Leu Tyr Ile Asp

160                 165                 170                 175

GAA GAG GAC ATG TTC GGT ATG CCG AGT TTG ATG GCT AGT ATG GCC GAA    2196

Glu Glu Asp Met Phe Gly Met Pro Ser Leu Met Ala Ser Met Ala Glu

                180                 185                 190

GGT ATG CTT TTG CCT CTG CCG TCC GTA CAA TGG AAC CAC AAC TAT GAC    2244

Gly Met Leu Leu Pro Leu Pro Ser Val Gln Trp Asn His Asn Tyr Asp

            195                 200                 205

ATC GAC GGC GAT GAT GAC GTC TCG CTA TGG AGT TAT TAA          2283

Ile Asp Gly Asp Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr

        210                 215

SEQ ID NO.2

<211>25

<212>DNA

<213>荠菜(Capsella bursa-pastoris)

TCCGACGAACTCCTCTGTAAACTGG

SEQ ID NO.3

<211>25

<212>DNA

<213>荠菜(Capsella bursa-pastoris)

CGGGTCTCACGAAACTTCTTCCTAC

SEQ ID NO.4

<211>23

<212>DNA

<213>荠菜(Capsella bursa-pastoris)

AAGGCTGTTACTCACTCATTGTC

SEQ ID NO.5

<211>20

<212>DNA

<213>荠菜(Capsella bursa-pastoris)

ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT

SEQ ID NO.6

<211>20

<212>DNA

<213>荠菜(Capsella bursa-pastoris)

CTACTTGGTGGCATCCTTAG

Claims (2)

1.一种分离的具有低温诱导表达特性的荠菜启动子，其特征在于该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中碱基第1-1623位的序列所示，记为CbCBFP。

2.如权利要求1所述的荠菜启动子CbCBFP在培育抗寒作物中的应用。

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