CN102174517B - 荠菜冷诱导COR15a基因启动子及其在植物的抗寒性改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种荠菜抗寒功能基因CbCOR15a的启动子CbCOR15aP及其在植物的抗寒性改良中的应用。该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其中CbCOR15a基因及其启动子包含序列表SEQIDNO:1所示序列中的1706位碱基的核酸序列，该核苷酸序列编码一个受低温诱导表达的、能促进细胞产生抗冷力的基因。在4℃诱导条件下，该启动子除了在叶片中表达量上调外，还在根中表达量上调。利用该基因启动子片段构建的诱导性表达载体可以在植物受到低温胁迫时启动目标基因的表达。本发明还提供上述启动子在培育抗寒植物中的应用，以改良农作物品种的抗寒性能。

Description

荠菜冷诱导COR15a基因启动子及其在植物的抗寒性改良中的应用

技术领域

本发明属于分子生物、植物基因工程技术领域，具体涉及植物逆境诱导启动子的克隆及其应用。

背景技术

植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进化的遗传基因型控制，又受个体发育中的生理生态因素制约。温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布及生长和产量，对植物生长发育起着决定性作用（Viswanathan C, Zhu JK. Molecular genetic analysis of cold-regulated gene transcription. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2002, 357(1423):877-886）。随着转基因技术的日益成熟，人们已从植物中分离了大批抗寒相关基因（蔺忠龙,李维薇,白现广,吕广磊,程在全. 植物抗冻基因最新研究进展, 北方园艺, 2009(1):ll9- 123）用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相关基因进行转基因抗寒植物培育时均发现在获得优良低温抗性植株的同时，普遍出现不同程度的生长延滞（retardation）现象。主要是利用抗寒相关基因进行的转基因植物都是在组成性启动子CaMV（cauliflower mosaic virus）35S驱动下产生的。这种基因的组成性表达对植物的生长造成了一定的影响。为了克服转基因植物出现的生长延滞现象，人们开始利用冷诱导特异性启动子代替组成性启动子。冷诱导基因RD29A（来源于拟南芥COR78基因）启动子驱动的转基因植株的研究表明，转基因植株的生长延滞比CaMV35S启动子驱动的转基因植株所表现出来要轻微得多（Kasuga M, Miura S, Shinozaki K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene an d stress-inducible RD29A promoter improved drought and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Ph siol, 2004, 45:346-350）。利用特异性的诱导型启动子避免外源基因在宿主植物中非特异性的持续、高效表达已经得到广泛共识，但是真正能应用于生产实际的特异性启动子不多，而冷诱导型特异启动子更少。目前特异启动子的克隆及其结构功能的研究是转基因植物研究中的一个热点，也是一个生发点。这一领域的研究成果将极大推动转基因植物基础研究的进展，加速转基因植物的产业化。

荠菜（Capsella bursa-pastoris）是一种1或2年野生的草本植物，平铺地面，喜阴，在南方是处处可见的一种可食用的蔬菜，属于十字花科、荠菜属Capsella Medik，在低温条件下能够正常生长发育并结实。早期的研究表明，在拟南芥中COR基因在低温诱导表达下被启动，能够促进细胞产生抗冷力，在植物的抗冷作用中起作用，其中COR15a基因的功能研究最深入，在其抗旱作用中起30%。构建的一种表达 COR15a多肽的转基因型，耐冻性比野生型的植株有显著提高（Artus NN, Uemura M, Steponkus PL, Gilmour SJ, Lin C, Thomashow MF. Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:13404-13409）。本发明所涉及的荠菜冷调节基因CbCOR15a基因的启动子是从荠菜叶片的DNA中克隆到的。目前尚未发现荠菜CbCOR15a基因启动子序列和利用荠菜冷调节基因CbCOR15a基因启动子用于培育耐寒植物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是克隆、鉴定一个低温强烈诱导表达的植物内源启动子，并利用该启动子构建抗寒相关基因表达载体，通过遗传转化方法达到提高植物的抗寒性，最终获得抗（耐）寒能力明显增强的优良植物品种。

本发明通过以下技术方案实现：

首先是分离低温强烈诱导表达的启动子，所提供的低温强烈诱导表达的启动子来源于荠菜。该启动子控制的荠菜内源基因为编码受低温诱导表达的、能促进细胞产生抗冷力的基因，属于冷调节COR（cold regulated）基因，被命名为CbCOR15a，故该启动子命名为CbCOR15aP（CbCOR15a Promoter）。CbCOR15aP是具有序列表SEQ ID NO: 1中的碱基第1-1026位的序列。CbCOR15aP控制的CbCOR15a基因是具有序列表SEQ ID NO: 1中碱基第1027-1706位的编码序列或含有与其编码的蛋白质同源性至少在80%以上具有相同功能的序列。

本发明所提供的CbCOR15aP区域含有两个ABRE顺式作用元件，能特异地对低温和ABA起应答反应，两个CRT/DRE（C-repeat dehydration-responsive element）顺式作用元件，能够特异性的和一种受低温诱导的调控冷诱导基因的反式转录激活因子CBF结合，两个TGA-element（auxin-responsive element），可以和生长素反应因子（ARF）相结合，以及一个CGTCA-motif（MeJA-responsiveness），能够被甲基茉莉酸所诱导。申请人利用CbCOR15aP构建的诱导性表达载体可以在植物受到低温胁迫时强烈地诱导报告基因GUS在叶中和根中的表达。

利用本发明所提供的CbCOR15aP构建成植物表达载体转化模式植物烟草，检测转基因烟草的抗寒的生理指标，显示植株耐寒性能有了显著提高。

本发明详细技术方案如下：

一种分离出的荠菜DNA分子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，其中荠菜CbCOR15a启动子及其基因包含序列表SEQ ID NO: 1所示序列中的1-1026和1027-1706位碱基的核苷酸序列，1027-1706位碱基的核苷酸序列编码一个受低温诱导的、能促进细胞产生抗冷性的冷调节基因。

所述的一种分离的DNA分子，其特征在于启动子区（SEQ ID NO: 1序列中1-1026位）包含有两个ABRE顺式作用元件AAGAAA和ACACGTGG，两个CRT/DRE元件TGGCCGAC，两个TGA顺式作用元件AACGAC，以及一个MeJA顺式反应元件CGTCA。

所述的CbCOR15aP全部或部分序列构建的植物表达载体。

所述的CbCOR15aP全部或部分序列构建的植物表达载体，通过遗传转化培育抗寒植物的方法。

所述的CbCOR15aP全部或部分序列构建的植物表达载体，通过遗传转化培育抗寒植物材料。所述的抗寒植物材料是指植株、种子或无性细胞系。

按照以上的技术方案，很显然，申请人或申请人以外的其他人可以利用本发明所提供的CbCOR15aP构建抗寒相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗寒性。受体植物主要包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物，当然也包括其他一些重要的经济作物，例如棉花、油菜或番茄作物上的应用。

序列表SEQ ID NO：1，公开了本发明克隆的包含启动子序列的荠菜冷调节基因CbCOR15a全长基因序列。

序列表SEQ ID NO：2-3，公开了本发明用于克隆荠菜CbCOR15a启动子序列的引物序列。

附图说明

图1显示的是CbCOR15a基因启动子区的顺式作用元件。其中，起始密码子ATG用方框表示；两个ABRE元件、两个CRT/DRE顺式作用元件、两个TGA反应元件和一个MeJA反应元件均用下划线表示。

图2 显示的是冷驯化和冷诱导下荠菜CbCOR15a基因在根茎叶中的表达特性。

图3显示的是用CbCOR15aP的引物、GUS引物和潮霉素引物三对引物检测转基因烟草苗。

图4显示的是GUS基因的表达和组织化学染色图。其中，（a）为GUS基因的表达量检测图；（b）为GUS基因的组织化学染色图。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 荠菜COR15aP的分离和鉴定

1．荠菜幼苗的培养

荠菜种子来源于上海市种子公司，荠菜种子经过消毒处理后，播种于含有MS₀培养基的培养罐内，置于25℃下培养4周，其中光照周期为16h光照，8h黑暗。

2．启动子序列的克隆

采用Genome walking技术扩增荠菜CbCOR15a基因的启动子序列。实验操作按照Universal GenomeWalker^TM Kit（CLONTECH）的使用手册进行。荠菜的Genome walking库建好后，根据COR15a基因的cDNA序列的开放阅读框（ORF）设计2条引物：CbCOR15aF1：5'-AGCCAACGCCTCCTTTGTCTTATCC-3'（记为SEQ ID NO. 2）和CbCOR15aF2：5'-ATCAC CTTTAGCGGCGTAGACCAAC-3'（记为SEQ ID NO. 3），与试剂盒中的2个接头引物配合，进行两轮PCR反应，同时电泳检测两轮PCR扩增产物。挑选第二轮中的特异条带进行克隆、测序。

测序显示克隆到的CbCOR15a基因的启动子序列全长1026bp记为SEQ ID NO. 1。荠菜CbCOR15a基因编码框的第一个起始密码子在（1027-1706bp）处，第一个起始密码子ATG前的1026个碱基为CbCOR15a基因的5’侧翼序列，命名为CbCOR15aP。

实施例2 荠菜COR15a基因的冷诱导和冷驯化处理下的表达特性

1.荠菜的种植和处理

取适量新鲜荠菜种子，无菌处理后置于预先配置好MS培养基（MS粉 4.41g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8.5g/L）的无菌培养罐中，26℃光照培养。冷驯化处理选取种子萌发后4w的幼苗，按温度梯度26℃ (4d), 12℃ (4d), 4℃ (4d), 0℃ (2h), -4℃ (2h)处理荠菜幼苗，冷诱导处理选取种子萌发后4周的幼苗，在4℃条件下，按时间0h, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h梯度处理荠菜幼苗，分别取叶片、茎段和根提取总RNA。

2. RNA抽提

RNA提取按照Plant RNA Mini Kit操作程序进行。

3. RT-PCR扩增

使用One Step RNA PCR Kit (AMV)进行。各管使用Total RNA模板为 1μg，RT-PCR操作按试剂盒操作程序进行。50℃ 30min，94℃ 2min反转录后，样品经30次循环（94℃ 30s，57℃ 30s，72℃- 30s），内参经18次循环（94℃ 30s，57℃ 30s，72℃- 30s），得到PCR产物。1%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

冷驯化结果表明，荠菜根、茎、叶中CbCOR15a基因的表达在不同程度低温处理下均有一定冷应答，同时具有组织特异性。Cbcor15a 26℃时在根、茎和叶中表达有些差别，在根中表达量较低，但随着温度降低，表达趋势趋于一致，12℃表达有少量增加，4℃进一步增加，0℃和-4℃增加较为明显。Cbcor15b在叶、根和茎中也有相同的表达模式，26℃、12℃和4℃均无表达，0℃开始有少量表达，-4℃增加较为明显（附图2上）。

冷诱导结果表明，荠菜根、茎、叶中CbCOR15a基因的表达在4℃低温处理下均有不同程度的冷应答，同时也具有组织特异性。CbCOR15a在叶中0h和1h微量表达，3h，6h和24h明显增加；根中0h，1h，3h和6h微量表达，24h明显增加；茎中0h和1h微量表达，3h，6h和24h增加明显（附图2下）。

实施例3 荠菜COR15aP启动子低温诱导活性分析

在该实施例中，将克隆到的荠菜COR15aP序列加上酶切位点BglⅡ和PstⅠ,连至pCAMBA1301载体上（由澳大利亚 CAMBIA [the Center of the Application of Molecular Biology to International Agriculture，Australia]惠赠），构建一个驱动GUS基因的植物表达载体。转化烟草实验表明，荠菜COR15aP在低温诱导下能增强GUS基因的表达。因此，荠菜COR15aP在作物抗寒基因工程中具有较好的应用前景。

表达载体的构建

在本实施方案中，构建表达载体pCAMBA1301-COR15aP-GUS

切除商品化的植物表达载体pCAMBA1301自带的CaMV35S启动子，连入荠菜COR15aP，调控GUS基因的表达。用商品化的植物表达载体pCAMBA1301，作为荠菜COR15aP在双子叶植物烟草中表达实验的对照。

农杆菌介导法对烟草的转化

1. 农杆菌的培养  挑取单菌落，在2ml农杆菌液体培养基中，28°C培养过夜；取1mL以上培养物，加入50mL农杆菌液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀=0.6-1.0；8000rpm离心10min，收集菌体，用MS₀重悬，使OD₆₀₀=1.0。

2. 共培养  取烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.8cm× 0.8cm左右的叶盘，放在MS₁培养基上，防止叶盘脱水；将叶盘放入农杆菌培养液中，190rpm，28℃摇床上浸染10min；用药勺捞出叶盘，放在灭菌的吸水纸上，吸干叶盘上的多余菌液；将吸干的叶盘平放在加盖一层滤纸的MS₁培养基上，25℃左右，于暗处共培养约2d。

3. 诱导丛生芽  共培养后，按以下步骤将叶盘表面的农杆菌洗掉，其间不时摇动，使叶盘充分接触下列溶液：无菌水，15min；无菌水+羧苄青霉素（500mg/L），15min；MS₀ +羧苄青霉素（500mg/L），20min。用药勺捞出叶盘，放在吸水纸上，吸干多余水分；将叶盘放在MS₂培养基上，叶盘边缘轻压入培养基中；25℃左右，16h光照培养。

4. 诱导生根  在MS₂培养基上诱导约4周后，将叶缘长出的幼芽从基部与叶盘切开，将幼芽插入MS₃培养基中诱导生根，25℃左右，16h光照培养。

5. 诱导生根后约3-4周，挑选生长茁壮根系发达的植株，首先将培养基罐子打开适应外界环境5-7天，然后将幼苗温柔取出，在水中轻柔洗净培养基残余（不要伤害根系）后栽入普通土质中培养（腐殖质土+珍珠岩+沸石）。标好编号待检测。25°C左右，16h光照培养。

转基因烟草微量DNA提取及PCR检测筛选

1. 取少量转基因植株叶片，剪碎, 置研钵中，加入1mL提取缓冲液（100 mmol/L Tris·Cl pH 8.0，20mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，1.5% SDS），研磨成浆。

2. 吸入1.5mL EP管中，剧烈摇动混匀。

3. 60℃水浴保温30-60min，不时颠倒混匀。 

4.  室温下10000rpm离心5min。

5. 小心吸取上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈震动。

6. 室温下10000rpm离心5min。

7. 小心将上清吸入新的离心管中。

8. 加入1倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。8000rpm离心5min，弃掉上清；75%酒精洗一次，晾干沉淀。

9. 加入5μL RNaseA（10μg/μL），37℃ 10min，除去RNA。

10. 加50-100μL水融解，-20℃贮存。

11. 以提取出的DNA为模板，用表达载体自带HYG基因引物、CbCOR15a基因启动子特异性引物和GUS基因的引物分别进行PCR扩增，鉴定目的基因在转基因烟草基因组中的整合状况，结果显示59号株系，在三种引物扩增下均能PCR出特异的条带，说明59号株系是转基因阳性植株（见附图3）。

转基因烟草RNA提取及RT-PCR检测

常温下以及4°C冷处理烟草59号株系苗，取叶片和根，提取总的RNA，经DNase I消化基因组DNA，以烟草中GAPDH基因（GenBank Accession No.：AJ133422）为内参，对转基因烟草苗59号株系在4℃处理后GUS的表达量进行RT-PCR检测，结果显示在4℃处理下，烟草叶片和根中GUS基因的表达量明显高于26℃条件下的GUS基因的表达量（附图4a所示）。

低温逆境处理和GUS组织化学染色

常温下以及4°C冷处理烟草59号株系苗，取叶片和根，用GUS反应液（0.0577 mol/L NaH₂PO4缓冲液，0.0423 mol/L Na₂HPO₄，pH 7.0；3g/L EDTA，pH 7.0；1g/L 铁氰化钾；0.75g/L X-gluc；0.1% NP40）浸泡上述各处理烟草幼叶和根，抽真空（200 Mbar，15min），37℃温育过夜，用75%乙醇脱色脱水，蒸馏水清洗，然后观察拍照。

GUS 基因的表达产物，可将反应液中的X-Gluc水解成蓝色物质，使组织呈现蓝色，蓝色的深浅及斑点数量，能在一定程度上反应GUS 基因的表达水平。在低温和对照条件下，用组成型表达载体pCAMBA1301转化的烟草幼叶，正常显现蓝色斑点。用冷诱导表达质粒pCAMBA1301-COR15aP-GUS转化的烟草叶片，在正常培养条件下蓝色斑点少，但在低温条件下，烟草幼叶显现蓝色斑点，斑点的面积和着色强度均高于用组成型表达载体转化的对应处理。由此说明，荠菜COR15aP在烟草中，可受低温诱导，启动结构基因的表达（见附图4b）。

<110>  复旦大学

<120>  荠菜冷诱导COR15a基因启动子及其在植物的抗寒性改良中的应用

<130>  001

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1706

<212>  DNA

<213>  荠菜（Capsella bursa-pastoris）

<400>  1

gtgaacatgg ggagagtgta agcacgcacc acaatctacc gttgctcaca cgtaagtgat     60

 

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<213>  荠菜（Capsella bursa-pastoris）

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<213>  荠菜（Capsella bursa-pastoris）

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Claims (4)

1.一种分离的具有低温诱导表达特性的荠菜冷调节蛋白基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中碱基第1-1026位的序列所示。

2.如权利要求1所述的荠菜冷调节蛋白基因的启动子，其特征在于启动子区包含一个ABRE顺式作用元件CACGTG，一个CRT/DRE元件TGGCCGAC，一个TGA顺式作用元件AACGAC，一个TCA顺式作用元件GAGAGGAATA，一个GARE顺式作用元件TGTGTTG, 两个MeJA顺式作用元件TGACG和CGTCA。

3.由权利要求1所述的荠菜冷调节蛋白基因的启动子构建的植物表达载体。

4.如权利要求1所述的荠菜冷调节蛋白基因的启动子在烟草的抗寒性改良中的应用。

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