JPH03198781A - トランスジェニック植物のプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明（１６）般的には植物遺伝子操作に関し、さらに
詳しくは４［物内でのキメラ遺伝子の構成的かつ均一な
発現を達成するための新規なプロモーターに調子る．本
発明は１た、このプロモーター全含有するトランスジェ
ニック植物および植物細胞に閑Ｔる。

４１［物遺六子工学の主たる目的の一つは、改良された
％住ｆｔ有する植物を得ることにある。これらの特性の
種類および数ｔ−挙げれはきシがないが、七〇二、三を
示せば、ウィルス抵抗性、昆虫抵抗性、除草剤抵抗性、
安定性の増大ｌたは栄養的価値の改良がある。遺伝子工
学の最近の進歩によ九この分野の研究者は、選ばれた植
物で所望の性質を得るために植ｖＤｉａ胞中に異種遺伝
子全導入することができるようになった。これは、形質
転換植物とは異なるソースからの有利な遺伝子を、その
植物のグノム内に導入することが可能になったからであ
る。この新しい遺伝子をついで植物側胸中で発現させて
新しい特性を表現させることができる。

新たに挿入された遺伝子がコードする蛋白質を植物細胞
内で発現させるためには、適痛なａｌ！ｌ１ｒＪシグナ
ルが、遺伝子に対して適当な位置に存在しなければなら
な鱒．これらの調節シグナルには、プロモーター領域、
５′非翻訳リーダー配列および３′ボリ７デニル酸配列
を包含する．プロモーターは、細胞機構にＲＮＡの産生
を指示するＤＮ人配列である。

プロモーター領域は、遺伝子の職人産生およびその結果
としての遺伝子による蛋白質産生の速度に影響する。６
′ボリ７デニル酸シグナルは非翻訳領域でめって、植物
細胞内におｉてＲＮＡの３′末端にポリアデニル酸ヌク
レオチドの性力ｎｔ起こさせて、以後のＲＮＡの翻訳に
よる蛋白質の産生のためにＲＮＡを癲胞質円で安定化す
る。

ある種のプロモーターが他に比べて高速度でＲＮＡ合成
を指示できることは以前に明らかにざれて＾る。これら
は強力なプロモーターと呼ばれている。１た、ある種の
プロモーターは、特定の盤のＭ胞および組織内でのみ高
レベルでのＲＮＡ産生全指示できるととも知られている
。多くのｌたは丁ぺてのｊ７ｉｉｌｉｌｌｌＩＭ域でＲ
ＮＡＱ産生を指示するプロモーターは構成プロモーター
と呼ばれる。

これ１での４ｔｔｆ死から、カリフラワーモデイクウイ
ルスの６５８プロモーター（　ＣａＭＶ　、Ｓ　５　Ｓ
　）が４１ｔＩｉｌＩ！Ｉで知られている最も強力な構
成プロモーターでめることがわかっている（　（Ｍｅｌ
工ら，１９８５；Ｊｅｎｓｅｎら，　　１　９　８　６
　；　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，１９８７；Ｋａ７ら＃　
　１　９　８　７　；　Ｓａｎｄｅｒｓら，　　１９８
７ン。これは、トランスジェニック植物の葉、茎、根お
よび花の抽出物から、測定可能なレベルのレポーター遺
伝子蛋白質ｌたはｍＲ１）Ａを実証することによって明
らかにされた。その結果、ｃａＭｖ３５ｓプロモーター
は、４１ｉ［物遺伝子工学の分野の科学者によって広く
用いられてきた。

ＣａＭ’７　３　５　３プロモーターは、ｉａ胞抽出液
についてのアッセイでは強力な構成プロモーターである
ことが明らかにされたが、＃ｌ胞および組織レベルで検
出ざれるレポーター遺伝子産物の詳細な組織学的分析で
は、この遺伝子産物の発現にかなり高度な変動性のある
ことが認められた．この組織学的分析によｊ）　ＣａＭ
Ｖ　５　５　Ｂプロモーターが促進する遺伝子の発現に
は未知の予期せぬ変動性のあることが明らかにざれた。

この発現のレベルおよび部位の変動には主として２つの
原因が考えられる。第一に、この変動性はＣａＭＶ　５
　５　Ｓプロモーターの固有な性質でおる。第二に、Ｃ
＃　３　５　Ｂ駆動ＤＮＡ配列が形ＪＸ＠換植動植グラ
ム中に組込１れる位置によって変動が生じる。遺伝子を
Ｓ物細胞中に導入する場合、后しいＤＲＮＡは、植物Ｄ
ＮＡ中のランダムな場所に取）込ｌれる．この−ｌｊ！
所筐たは挿入位置の変動が、プロモーターの活性レベル
および各形質祇換体からの責白産庄の変動全招来する。

したがって、多数の各トランスジェニック植物につめて
、植物の大部分もしくはすべての組織で最高レベルの遺
伝子産物を生成する植物を見出すための検定が必要にな
る。強力な、構成ＣａＭＶ　３５　Ｓプロモーターの場
合でさえも、挿入位置変動の影響を受けやすく、その使
用には１適当なレベルの遺伝子発現全示す形）Ｘ転換植
物を見出すために、比較的多数の形質転換植物をスクリ
ーニングすることが必要でるる。すなわち、植物遺伝子
工学においては、高レベルのキメラ遺伝子産物を発現し
、しかもそのプロモーターの固胃の性ｉ’ｉたはトラン
スジェニック植物ＤＮＡにおける挿入位置の影響が原因
となって組織レベルの発現が広Ｓ囲に変動することが少
ないプロモーターの要求があることは明らかである。

カリフラワーモザイクウィルスが属する二本鎖ＤＮＡつ
１イルスのグループであるカリモウイルスの他のウィル
スには、このようなプロモーターのソースとしての可能
性が考えられた。ＣａＭＶとは遠縁にわたる２種のカリ
モウイルスについて従来記載がある。ゴマノハグサモデ
ィクウィルス（所）がＲｉｃｈｉｎＳら（１９８７）に
よシ、互たカーネーション腐食環（ｅｔｃｈｅｄ　ｒｉ
ｎｇ　）タイルｘ（ｃｚｙ）がＨｕｌｌらにより報告さ
れた。これら２種のウィルスそれぞれのＤＮＡ配列およ
び予想される遺伝子機構はＣａＭＶにかなシ類似し、彪
ＣｈｉｎａらはＣ−３５８プロモーターの’ｆＰＭＶお
よびＣＥＲＶ類縁体の配置を推察した。しかじながら、
これらの推定されたプロモーター領域にはＤＮＡ配列の
保存にはとんとなかった。ｌた、これらのプロモーター
配列の正確な位１ｔをａ［ｌＥ明するための４４認梱Ａ
転写分析は行われていないし、ｌしてやＦＭ％ｒからの
プロモーターが植物中でのキメラ遺伝子の、高いしかも
よ）均一なレベルの発現金与えることは全く示されてい
なめ。

したがって、本発明の第一の目的は、従来既知の植物プ
ロモーターの場合よシも高いしかもよシ均一なレベルで
の遺伝子座Ｕ１ｋＪの発現を促進できる、トランスジェ
ニック植物用のプロモーター全提供することにある。

本発明の他の目的は、従来から知られていて使用されて
きた植物プロモーターの場合に比べて、挿入位置の影響
全党けにくい、トランスジェニック植物用のプロモータ
ー全提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、植物の多くの組織およびａ
胞とくに花芽における遺伝子Ｍ物の発現を、従来既知の
植物プロモーターの場合よｐも高レベルで促進できる、
トランスジェニック植物用のプロモーターを提供するこ
とにめる。

本発明のさらに他の目的は、ゴマノハモデイクウイルス
の全長転写体から侍らルる、植物中キメラ遺伝子の発現
用プロモーターを提供することにある。

本発明のさらに他の別の目的は、以下の記述および％ｆ
Ｆ請求の範囲を姫付の図面を参照しながら読めば、さら
に明瞭になるものと考える。

図面の簡単な説明 第１図Ｕ、ゴマノハグサモザイクウイルスからの全長転
写プロモーター’ｔ：ｚ５／’）−ダー配列および少量
の６′隣接ＤＮＡ　′ｆ！：、含めて含有するＤＮＡ配
列をボす。

第２図はＩ）ＭＯＮ　７２１の物理的地図を示す。

第３因はｐＭＯ！Ｊ　ｌ　５７３の物理的地図を示す。

第４図はＩ）ＭＯＮ　９７７の物理的地図を示す。

８５図は１）ＭＯＮ　９８１の物理的地図を示す。

８６図はｐＭＯＮ　９９４の物理的地図を示す。

１ｇ７図はｐＭＯＮ　９９４の衾造に用いられる工程を
示す。

第８図はｐＭＯＮ　９９６の物理的地図を示す。

第２図はｐＭＯＮ　９９６の！ｌ！！！造に用いられる
工程を示す。

ｃ　ｉ　ｅ　ｎｓ株ｐＴｉＴ　５７グンスミドのＴ−Ｄ
ＮＡ領域の制限酵素地図を示す。

＠ＩＨａ）および（ロ）図は、増強ＣａＭＶｅ　３５　
Ｓ　７’ロモーター（〜およびＦＭ７全７全長伝写グロ
ター（ロ）によって促進されるβ−グルクロニダーゼ遺
伝子で形幕転換されたタバコ花芽における（ＩＳ活性の
存在を示す力２−写真である。

第１２図は、ＦＭＶ全長伝写グＣＩ％−ター（ｐＭＯＮ
９９６）’！たはＣａＭｖｅ　３５　Ｓプロモーター（
ｐＭＯＮ８９９ンの制御下に変異体ＥＰＳＰＳを含有す
るトランスジェニック植物の、クリホセート適用後の生
殖評点を示す。

発明の要約 ゴマノハグサモザイクウイルスからの全長転写プロモー
ター（Ｆ唐つは、とく（／ｃ花芽かうなる細胞中で、植
物細胞内に挿入ざｎたキメラ遺伝子の強力かつ均一なプ
ロモーターとして機能することが発見された。得られた
トランスジェニック植物は挿入された遺伝子によってコ
ードされる責白質を、同じ遺伝子が増強されたＣａＭＶ
６５８プロモーターで促進された場合に比べて、より高
く均一なレベルで、形質転換された植物のすべての組織
およびａ胞において発現する。このプロモーターのＤＮ
Ａ　配列は、ＦＭＶゲノムのヌクレオチド６３６８と６
９３０の間に位置する。５′非翻訳リーダー配列がプロ
モーターと連結されることが好ｌしい。

このリーダー配列はＦＭＶ　ｌ’ツム自体に由来するも
のでも、ｌｆｃＰＭ′ｖ以外の他のソースに由来するも
のであってもよい。

本発明は他のＮ様として、植物細胞全形質転換する方法
におけるＦ、ＭＶプロモーターの使用、Ｐ■７’ｏモー
ターを包含するカセットベクター　Ｉプロモーター配列
を口片するキメラ遺伝子、ならびにキメラ遺伝子中にＭ
プロモーターが導入されたトランスジェニックＭ物、植
物ｍｌ胞および種子を包含する。

針筒しい態様の詳細な説明 ゴマノハグサモザイクウイルスは、二本ｉ　ＤＮＡウィ
ルスのグループ、カリモウイルスの一員である。このグ
ループに属する他のメンバーには、カリフラワーモデイ
クウイルス（ＣａＭｖ）およびカーネーション腐食環ウ
ィルス（Ｃ慇Ｖ）が含ｌれる。

ＣａＭＶおよび七のプロモーター配列は文献でよく知ら
れている（　Ｇａｒｄｎｅｒら＋　　１９８　ｉ　ｚ　
Ｈｏｈｎら。

１９８２　；　ＧｕｉｌｌｅｙらＰ　　１９８２　）　
、　　ＦＭＩＩ’　ＤＮＡの全ヌクレオチド配列はＲｌ
ｃｈｉｎｓら（１９８７，）によって解明され、報告さ
れて＾る。ＲｌｃｈｉｎｓらはＦＭＶゲノムＶｃ２個の
遺伝子開領域、すなわち読み取り枠（ｏＭ）ＶＩと■の
間の大遺伝子間領域およびＯＲＦ’　Ｖと■の間の小遺
伝子８領域全報告している。Ｒｌｃｈｉｎｓらは、Ｃａ
ＭＶ　５５　Ｓプロモーターに類似のプロモーター配列
、Ｃａ、ＭＶの主要ｍＲＮＡ　ｋ写プはモーターがＦＭ
Ｖ　Ｉ’ツムの大遺伝子間領域に配置されていると述べ
ているが、転写開始の正確な位置ならびにプロモーター
配列全証明するための確認ＲＮＡ転写分析は行っていな
い。

本発明の一つの特徴には、ゴマノハグサモザイクウイル
スから全長転写のためのプロモーターの単離およびこの
プロモーターの配列次定か包含される。プロモーターは
、ＦＭｌｖグロモーター配列自体Ｉたはプロモーターに
関して異種のソースに由来する５リーダー配列金含むこ
とが好ましい。

本発明の新規なプロモーターは、ＦＭＶ　ＤＮＡの完全
な全長クローンの小ＤＮＡフラグメントから単離された
。プラスミド、ｐ］ｌＩ′ＭｖＳＣ６はｘｅｎｔｕｃｋ
ｙ大学のＲ，、Ｔ、　５ｈｅｐｈｅｒａ博士から恵与さ
れた。ＦＭＶＤＮＡのヌクレオチド配列およびＦＭＶゲ
ノムの構成は、Ｒ１Ｃｈ　ｉ　ｎｓら（１９８７）によ
って示されている。コノグラスミドは、５ｈｅｐｈｅｒ
ａら（１９８７）の記載したナス科宿主での成長に馴化
されるように、ＰＭＶからの完全なりＮＡ　ｋ含んでい
る。ナス科宿主での成長へのＦＭＶ　ＤＮＡの馴化の結
果、ＦＭＶＤＮＡ　ｉヌクレオチドレベルで多数の突然
変異を受けているものと考えられる。以下の説明および
実施例においては〜このような馴化様からのＦＭＶＤＮ
Ａが用いられている。本発明の教示および実施例はｌた
、「野生型」ｌたは非馴化ＦＭＳ　ＤＮＡから単離され
たプロモーター領域にも適用され、類似の利益２よび結
果が得られるものでめることを理解丁べさである。もと
のウィルスは５ｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａＣａｌｉｆｏｒ
ｎｉａから単離された。ＢＩＭｖＤＮＡはｐＵＣ１５（
Ｖｉｅｉｒａ、　；ｒ、　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ−
、１９８２）の咄−のＳａｃ　１部位にクローン化して
ｐＦＭｖ８０３　ｔ”得た。

不明細書に添付した図面に示ｆ　ＦＭＶ’関連ヌクレオ
チド配列は、Ｒｌｃｈｉｎｓらの用いた番号付けに従う
。

ＦＭＮＩ’プロモーター配列は、ＰＭＶ　ＤＮＡ　ｔ−
ヌクレオチド６６６７と６３６８の間およびヌクレオチ
ド６９４８と６９４９の間を含めて数個所の部位で切断
するＳｓｐ　（でｐＦＭｖｓａ　５　ｆｔ消化すること
によつて単離した。これにょρ、ＦＭｖの全長転写プロ
モーターに相当するプロモーター配列と１８ヌクレオチ
ドの５′非翻訳リーダー配列を含有する５８１塩基対（
ｂｐ）ヌクレオチドフラグメントが遊離される。この７
ラグメントおよび少量の隣Ｈｒｎｑｈのヌクレオチド配
列を第１図に示す。

このフラグメントは０．８％アガロースゲル上電気泳動
で分離したのちＮＡ−４５ｍ法を用いて猜製し、Ｓｔｕ
　ｌで予め切断したグラスミドｐＭＯＮ７２１中に挿入
した。ｐＭＯＮ　７２１の物理的地図を第２図に示す。

第２図に示すよりに、グラスミドｐＭＯＮ　７２１は、
一方の側全Ｈｉｎｄ　ｉｌ１部位、他方の情をＢｇｌ　
１［８位に隣接したマルチリンカ−内にＳｔｕ　Ｉ　８
位を含有する。Ｓｓｐ　ｌ　７ラグメントをｐＭＯＮ　
７２１甲のＳｔｕ　１部位に挿入して、得られた形質転
換ｐＭＯＮ　７２１プラスミドについて、適正な方向性
でＦＭＶ全長ＲＮＡ転写プロモーターを有すると思われ
る形質転換体の確認のためのスクリーニング全実施した
。ｐＭＯＮ　１５７３と同定されたグラスミドについて
、プロモーターの５ｆｘたは上流配列がＨｌｎｄ　ｍ部
位に隣接し、非翻訳リーダー配列はＥｇｌ　１部位で終
わるように適指な方向性でＥＦＭＶプロモーターフラグ
メント全含有することを確認した。第６図Ｂ　ｌ）ＭＯ
Ｎ　１５７３の物理的地図を示す。

ＦＭＶ大ＲＮＡ　（全長）転写プロモーター配列を適正
な方向性で含むグラスミドが単離されたならば、このプ
ロモーターを含むカセットベクターを調製した。カセッ
トベクターは植物ｌたは植物細胞の形ＪＸ転換に必要な
すべての要素を通常包含するクローニングベクターであ
る。典型的な植物クローニングベクターは、選択と計数
が可能なマーカー遺伝子、Ｔ−ＤＮＡ境界、クローニン
グ部位、トンンスコンジュｒ−ト、広い宿主域複製およ
び動員機能の確ｇを容易にする適当な細菌遺伝子、なら
びに所望の他の要素から構ｇされる。本発明の耐大ＲＮ
Ａ　ｋ写プロモーターを適当な植物形質転換ベクター中
に含有するカセットベクターはｐＭＯＮ９７７プラスミ
ドを出発原料として調製された。

ｐＭＯＮ　９７７の物理的地図ｆｉｃ第４図に例示する
。

第４図に示すように、ｌ）ＭＯＮ　９７７は以下の成分
、すなわち大腸菌およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中
でプラスミドの選択マーカーとして機能する細菌のスベ
クチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性遺伝子（Ｓ
ｐａ　／　Ｓｔｒ　）をコードするトランスボゾンＴｎ
　７から単離された０、９３　ｋｂフラグメント（Ｂ’
ｉｌｉｎｇ、　Ｍ、Ｅ、ら、１９８５）；形’Ｘ６換植
物＃Ｉ胞の選択全可能にするキメラカナマイシン抵抗性
遺伝子ＣＰ　−６５８／　Ｋａｎ　／　ＮＯ８３’　）
　ｆ　＝ｒ−ドするＤＮＡの１．６１　ｋｂ上セグメン
ト　Ｂｅａｋ、　１．ら。

１９８２）；ｎｋ２グラスミドからの複製起源を含有す
る０、７５　ｋｂ　０ｒｉＶ　ＤＮＡ配列（５ｔａｌｋ
ｅｒ、　Ｄ、Ｍ。

ら、１９７９）；大ＭＩ！菌内維持のための複製起源と
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｍ胞への接合形ｆＸ転換
のためのｂｏｍ部位を提供するｐＢＲ３２２（ｏｒｉ　
−５２２ンの３．ｉ　ｋｂ上セグメント　５ｕｔｌｉｆ
ｆｅ、Ｊ−、１９７９）　ｐツバリンｆｉ　Ｔ−ＤＮＡ
右匈境界（Ｂ’ｒａｌｅｙら、１９８５）ｆ　４　ツｐ
ＴｉＴ　３７からの０．３６　ｋｂ上セグメント　Ｐｖ
ｕ　ｌ〜Ｂｃｌ　（フラグメント）；ならびに０．６６
　ｋｂｂ強３５８プロモーターＰ−ｅ　３５　Ｓ（Ｋａ
ｙら、１９’８７）、数個のユニーク制限部位およびダ
イズリブロースニリン酸カルボキシンーゼの小すブユニ
ツ）Ｅ９遺伝子の３′非翻訳領域（Ｂ　９　３’）　０
．７　ｋｂからなる１、１５　ｋｂ発発現カセット金子
る（　Ｃｏｒｕｇｚｉ、　Ｇ、ら、１９８４およびＭｏ
ｒｅｌｌｉ、　Ｇら、１９８５）。グラスミドｐＭＯＮ
９７７　ｋＨｉｎｄ　ｍおよびＢｇｌ　ｉで切断し、Ｃ
ａＭＶｐ−ｅ　３５　Ｓ増強３５８プロモーターを除去
した。

ＦＭＶ全長伝写グロモーターを含む６０５　ｂｐ　７ラ
グメント＠　ＩＩＭＯＮ　１５７３からＨｌｎｃＬ　ｌ
ｌ［およびＢｇ工■で切り出し、ＰＭＯＮ９７７にクロ
ーン化して、ｐＭＯＮ９８１’に割裂した。したがって
、グラスミドｐＭＯＮ　９８１は、発現カセットとして
、？■全長伝写グロモーターとＥ　９−３’遺伝子（Ｆ
Ｍｖ−Ｅ９３’）を含有する。ｐＭＯＮ９８１にはざら
に、ＦＩＭｖグＣＩ％−ｐ−トＥ９−３’遺伝子の間に
Ｘｂａ　ｌ。

Ｂｇｌ　ｌおよびＳｍａ　Ｉの制限エンドヌクレアーゼ
部位全包含する。ｐＭＯＮ　９８１の物理的地図全第５
図に示す。

単１１１ＦＭＶ配列が所望のプロモーター領域を含むこ
とを調べるため、ｌた単離ＦＭＶグロモーターの有効性
と有用性全確証するために、レポーター遺伝千金植物カ
セットベクターｐＭＯＮ　９８　ｉ　中に挿入した。選
択ざ九たレポーター遺伝子は、大腸菌β−グルクロニダ
ーゼ（ＧＵｓ　）コード配列およびＡｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ　Ｊｉ２ＰＳＰシンターゼ遺伝子でＣの酵素にグリ
ホセート除草剤耐性を付与する１個のグリシンの７ラニ
ンへの置換を含む遺伝子であった。

大ｉ菌β−グルクロニダーゼコード配列は、グラスミド
Ｘ）ＭＯＮ　９８１のＦＭＳ　−Ｊｌｉ　９　５’カセ
ツトにおける唯一のＢｇｌ　ＩＩｔ＠１位へ挿入した。

ＧＵＳ　ｉｔ伝子はＰＭＯＮ　６５７から１８８５　ｂ
ｐ　Ｂｇｌ　Ｍ　〜ＢａｍＨ１フラグメント上に切少出
した。得られたプラスミドはｐＭＯＮ　９９４と命名さ
れ、ＦＭｖプロモーターの制御下にａｕＳｉｔ仏子を含
有する。グラスミドｐＭＯＮ　９９４は第６図に示し、
ｌたｐＭＯＮ　９９４の翔発全例示するフローチャート
′ｔ″第７図に示す。

ｇｐｓｐシンターゼ（５−エノールビルビルーシキミ酸
−６−リン酸シンターゼ；　ＥＣ：２５．１．１９）は
植物のシキミ酸経路に関与する酵素である。シキミ酸経
路は、植物に必須の芳香族アミノ酸合成の前駆体を提供
する。とくにＢＰＳＰシンターぜは、ホスホエノールピ
ルビン酸およびシキミＲ−５−リン酸の５−エノールビ
ルビル−シキミ酸−３−リン酸への変換を触媒する。Ｎ
−ホスホノメチルグリシンを含有する除草剤はＩＰＳＰ
シンターゼを阻害し、したがって植物のシキミ酸経路を
組沓する。「グリホセート」の語は通常、その醒性電た
は隘イオン屋でのＮ−ホスホノメチルグリシン除草剤を
指して用いられる。グリホセート含有除草剤に対する耐
性が増大した新規なＩＰＳＰシンターぜ酵素が発見され
ている。とくに、成熟野生盤ｇｐｓｐシンターゼアミノ
酸配列中の位ｆ８０と１２０の間に存在する高度に保存
された領域の配列ニーＬ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−に
グリシンのアラニンへの単一のＲ換金有するＥＰＳＰシ
ンターゼ酵素は、グリホセートに対する耐性の増大全示
し、−緒に―渡された係属中の特肝出顧、’　Ｇｌｙｐ
ｈｏｓａｔｅ　−Ｔｏｌ−ｅｒａｎｔ　５−　Ｂｎｏｌ
ｐｙｒｕｖｙｌ　−３−Ｐｈｏｓｐｈｏｓｋｉｍａｔｅ
Ｓｙｎｔｈａｓ　ｅ　　　米国％吐出［５Ｎ９３１，４
９２号に記載されている。この教示は参考として本明細
書に導入する。グリホセート耐性を示すように植物を形
質転換する方法は、−緒に譲渡された米国特吐出顔５Ｎ
８７９，８１４号（１９８６年７月７日出Ｒ）　、　　
”　Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｐｌ
ａｎｔｓ”に述べられている。この開示は参考としてと
くに本明細書ＶＣ尋人する。グリホセート耐性ｇｐｓｐ
シンターゼ植物遺伝子は、ＥＰＳＰシンターゼボリベグ
チド（Ｉたはそれに対する活性部分りの植物細胞内部の
葉緑体への輸送全可能にする葉緑体トシンジットベグチ
ド（ＣＴＰ）ｉｆむポリペグテド全コードする。ＨＰＳ
Ｐシンターゼ遺伝子は核内でｍＲＮＡに転写さｉＬ、　
ｍＲＮＡは細胞質内で前駆体ポリペプチド（ＣＴＰ／成
熟ＢＰＳＰシンターゼ）に翻訳される。前駆体ポリペプ
チドは葉緑体内へ輸送される。

突然変異Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　
ａ　成子配列から得られる１個のグリシンの７ラニンへ
の突然後！Ｓを含有するｇｐｓｐシンターゼ遺伝子も、
グラスミドｐＭＯＮ　９８１のｖｕｖ−ＪＩＣ９５’カ
セ７トベクターに挿入り、’ｃ。グ５スミドｐＭＯＮ　
９８ｉ　’ｆ　Ｘｂｔｌ　■およびＳｍａｌで切断した
。　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＢＰＥ３Ｐシンターゼ遺
伝子はグラスミドｐＭＯＮ　８９７上に位置する。グラ
スミドＰＭＯＮ　８９７は、ｐＭＯＮ　６００中のＡｒ
ａｂｊ４ｏｐｓｉｓ　ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（ＡＥ
ＰＳＰＳ）をＣ１ａ　ＩおよびＪＤｃｏＲＩで切断して
切ｐ出丁ことにより得られる。このフラグメントは、Ｅ
ｃｏＲＩ。

ａｌａｌおよびＸｂａ　Ｉに対する部位を含むマルチリ
ンカ−を包含するｐＭＯＮ　８５５中ＶＣ挿入される。

グラスミドＩ）ＭＯＮ　８５５　ｆｃ　Ｃ１ａ　１およ
びＫｃｏＲＩで切断し、Ｉ）ＭＯＮ６［＋［］から単虐
すれるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｘｐｓｐシンターゼフン
グメントを挿入する。得られたグラスミドはＩＩＩＭＯ
Ｎ　８９７で必る。ついでグラスミド＄ＯＮ　８９７　
ｆ　ＥａｏＲＩで切断し、末端金りレノウボリメ（２２
）ゼを用いて満たし、ついでＸｂａ　ｉで＋Ａ断し、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＢＰＳＰシンターゼ遺伝子に３
８８１ｂｐフラグメントとして切シ出した。次にＡｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＩＤＰＳＰシンターゼ遺伝子ｔ、Ｘ
ｂａ　ＩとＳｍａ　Ｉで消化したｐＭＯＮ　９８１にク
ローニングしてｐＭＯＮ　９９６　ｋ創製した。ｐＭＯ
Ｎ９９乙の物理的地図を第８図に、ｐＭＯＮ９９６の構
築を例示するフローチャートｔ−第９図に示す。

所望のレポーター遺伝子を含有するＰＭＶ　−Ｂ　９３
′カセントベクターが製造でさたならば、このベクター
は、植物互たは植物細胞中へのＡｇｒｏｂａｃｔｅ−ｒ
ｉｕｍ仲介形仲介形質転心に、ついで適当なＡｇｒｏ−
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ株中に挿入できる。使用できるＡｇ
ｒｏｂ−ａＣｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株
は無力化Ｔｉプラスミドを含有することが好ｌしい。２
種のとくに有用な株は、無力化Ｔ′１グラスミドｐＴ工
Ｃ５Ｂ誘導体、ｌｐＭＰ　９０　ＲＫ　ｆもつ（Ｋｏｎ
ｃｚ６ｃ　５ｃｈｅ１１．１９８６）Ａｇ　ｒＱ　ｂａ
　Ｃｔｅｒ　ｉ　ｕｌｌｌ　ｆ　ｕ］ＩＩｅｆａ　Ｑ　
ｌ　ｅｎｓ株２０８、および無力化ｐＴｉＴ　５７−　
ＣＯツバリン型グラスミド′企もつＡＣＯＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株である。

無力化ｐＭＰ　９　Ｑ　ＲＫグラスミドをもつＡ、　ｔ
ｕｍｅ−ｆａｃｉ８ｎ８株２０８はＴ−ＤＮＡＭＷホル
モン處伝子をもたず、したがってクラウンゴール病を起
こすことはできない。この株に４ｍ？７形ｌＡ伝換に使
用する一合には、ベクターグンスミドは、ヘルパーグン
スミドｐＲＸ、　２０１３を用いた三親域会系により（
Ｄｉｔｔａら、　　１９８０　）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ内に導入される。ベクターは無力化ｐＭＰ　９
　［Ｉ　ＲＫ　　Ｔｉプラスミドによってコードされる
ｖｉｒ　機能にょ少植物細胞に伝達さする。形質転換体
の分析にょシ、ベクターはｐＴｉＴ　５７右端境界配列
で開裂し、全ベクター配列が宿王植物染色本中に挿入さ
れることが示佼される。ｐＭＰ　９　（Ｊ　ＲＫ　　Ｔ
ｉグッスミト°は多分、殖物粗胞に伝達さルず、純ｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に残るものと思われる。

６７ノラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵巣地図全示す
。この株は無力化ｐＴｉＴ　５７−　ＣＯツバリン型グ
ンスミドをもつ。Ｍ１０図中ＩＩ＋線を付した部分ｅよ
、Ｔ−ＤＮＡの組換えおよびＲ換のためのホモロジーの
提供に用いられたＴｉプラスミドＤＮＡのセグメントを
示す。Ｔ−ＤＮＡ−＝グメントは、上述のベクターと相
同のＯｒ工Ｖおよび１）ＢＲ５２２セグメントに炭合し
たＴｎ　６０１　Ｍ菌カナマイシン抵抗住遺伝子（Ｋｎ
Ｒ）セグメントによって置換された。無力化ｐＴｉＴ　
３７−　ＣＯと植物カセットベクターの間の組換えは、
カセットベクタープンスミドの全ＤＮＡを含むハイブリ
ッドＴ−ＤＮＡ中に生じる相同のｐＢＲ３２２ｏｒＩＶ
領域を介して起こる。Ａｇｒｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍを
植ｖＥａ胞と培養すると、左端）よび右端境界の間のハ
イブリッドＴ−ＤＮＡセグメントが細胞に伝達され、ゲ
ノムＤＮＡ中に挿入きれる。

ベクターが無力化Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株中に導
入さすると、ついで所望の植物全形質転換できる。所望
のｉ＊について司能な任意の既知の形ＪＸ転換方法が利
用でさる。こ九らの方法には、ｎｏｒｓｃｈら（１９８
４）によって報告されＰｒｙら（１９８６）によってＢ
ｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　Ｋ適用されたり一７デイ
スク法が包含される。Ｉた、エレクトロポレーションま
たは倣小弾丸形質転換のような技術を用いる形ＪＪｔ転
換で異種ＤＮＡ配列とカンプリングしたＴＰＭＴＩプロ
モーター配列を包含するＤＮＡ　７ングメントｌたはベ
クターの使用も本発明の範囲内に含ｌれると埋屏丁べさ
である。

本発明の実施に適当な植物には、これらに限定δルるも
のではないが、ダイズ、綿、アルファルファ、西洋アブ
ラナ、アマ、トマト、テンサイ、ヒマワリ、馬鈴薯、ト
ーモロコシ、小麦、米およびレタスが包含される。

ＷＭＶプｔ１２％−ターの有効性は、増強ＣａＭｖ３５
　Ｓプロモーターとの比ＩＲ研究によって決定した。ひ
とつの研究では、ＦＭｖからの５′非翻訳リーダー配列
を含むＦＭＶプロモーターを含有するμ０Ｎ９９４をβ
−グルクロニダーゼレポーター遺伝子に融合し、エント
ウからのＥ９−３’−ＩＬ細訳’ａＲ域’ｃ　Ｈｏｒｓ
ｃｈら（１９８４）のリーフディスク法によりタバコに
導入し、トランスジェニック植物１：得た。

タバ：ｙ　（Ｎ１ｃｏｔｉａｎｉ　ｔａｂａｃｕｍ　ｖ
ａｒ、　ｓａｍｓｕｎ　）Ｑ直径約６　ｍ　（１／４イ
ンチ）のリーフｆイスクを表面滅菌したタバコの葉から
採取した。これらをＭ８１０４寒天培地上で２日間培養
して、創傷表面の部分細胞壁形成を促進した。つ＾でと
九らを、予めＬｕ　ｒｉ　ａ培地中２８℃で一投生育さ
せたｐＭＯＮ９９４およびｐＭＰ　９　Ｑ　ＨＨの両者
を含むＡ、　ｔｕｍｓ−ｆｑｃｉｅｎＳ　ｌ１ｍ胞の培
養液中に浸漬し、穂やかに振盪した。細胞金細藺懸濁液
から取り出し、液を吸い取って乾かし、Ｈｏｒｓｃｈ　
（１９８０）によって記載されたようにタバコ細胞のナ
ースカルチャー上に置いた濾紙の上に上側を下にしてイ
ンキュベートした。２〜３日後、ディスクを５００ｔ４
／ｘｔｌのカルベニシリン含有ＭＳ培ｉｋ含み、ナース
カルスｔ＠ｌないベトリ皿に移した。

対照組織は、ヘルパープラスミドｐＡｉＰ　９　Ｑ　Ｈ
ｐ。

と、ＮＯ８／ＮＰＴ　Ｍ／ＮＯＳカナマイシン抵抗性遺
云子およびｐＭＯＮ　９９４と同一のＮＯＳ選択町餌マ
ーカーをもつがＦＭＶ　／β−グルクロニダーゼ遺伝子
はもたないＴ−ＤＮＡ　１ｉｌｉｊ域を含有する別の形
質転換ベクターｐＭＯＮ　５０５とを包含するＡ、　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｓｎｓ　ａ胞を用いて創製した。

ＭＳ培地に移して１ｕ日以内に、対照および形質転換グ
レート両者のすべてのディスクの縁に盛んに生育するカ
ルス組織が認められた。

形）Ｘ転換タバコ植物は、上述の形質転換リーフディス
クから、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５）の記載した操作に
よる再分化によって生成させた。得らｔした形質転換植
物は、β−グルクロニダーゼ遺伝子に融合した丁プロモ
ーターを含む：９Ｍ０Ｎ　９９４ベクターを含有した。

上述したのと同じ操作を用いて、β−グルクロニダーゼ
レポーター遺伝子に融合した増強ＣａＭｖ３５　Ｓ　（
ＣａＭＶｅ　６５　Ｓ　またはＰ−ｅ　３５　Ｓ　）お
よびエントウからのＥｉ　９−３’非翻訳ポリアデニル
酸領域を含む形質転換タバコ植ｖｌＪを得た。

第二の研究では、アミノ酸１０１に１個のグリシンがア
ラニンに置換され、ｙ都グロモーター１７’ｃ　Ｂ　Ｃ
ａＭＶｅ　６５　Ｓプロモーターのいずれかで促進され
るＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　］１ｆＰＳＰシンターゼ遺
伝子ｅ＃ｂつ形１（ｉｉｌｊ換アブラナ植物（Ｅｒａｓ
ｓｉｃａ　ｎａｐｕ１３　）　’ｆｃ得た。ＰＭＶグロ
モーターによって指示されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　
ＫＰＳＰシンターゼ遺伝子をもつｐＭＯＮ９９６グラス
ミドがＦｒｙら（１９８６）の方法によって７プンナに
導入された。抽たい＠前ｌたは抽だい過程おるが花成前
の植物から４個の末端節間を除去し、表面を７０°Ｖ／
Ｖエタノールで１分間、２％ｗ／ｖ次亜塩素酸ナトリウ
ムで２０分間滅菌し、ついで滅菌蒸留水中で６回洗浄し
た。茎セグメントを５朋のディスクに切断しく　８ｔｒ
ｉｎｇａｍ。

１９７７）、基部末端の方向に注意して滅菌１５Ｘ　１
００ｍベトリ版板中置いた。ディスクは、上述のｐＭＯ
Ｎ　９９６含有ＡＣＯＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｓｎｓ株
の一夜培養液２〜４ｄｋベトリ板内のディスク上に注い
で５分間接種し、つ＾でベトリ板に滅菌濾紙製置いて吸
い取って乾燥δぜ、板をひつく少返して過剰の細菌を吸
収させた。茎ディスクｔ１基部側を下にして、１／Ｉ１
）Ｘ標準ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％スクロース、０．
８％アガール、−５，７、ｉダ／７３　　ＢＡおよび１
，４　ｔａｇ　ＴＸＤ　フィーダー細胞官有培地上のフ
ィーダーグレートに置いた（　Ｈｏｒｓｃｈら、１９８
５）。

２〜６日の共培養ＭＩＭＩ後、茎ディスクを、標準ＭＳ
塩、１ｍｙ／ｌ　　ＢＡ％　５０ＣＪＩＩｌ／ｌ＃にペ
ニシリン、０．３Ｍアルギニン２よび選択用１００９／
ノカナマイシンとともに同じ培地全１宮む深＾ベトリ皿
プレート（２５Ｘ１０ｍ）あた９５個ずつ移した。６週
後に、茎外植体を同じ培地金含む新鮮なプレートに移し
た。外植体の栽培は、２６℃で連続冷白色光下に育成呈
で実施した０次の１〜３週の間に発生した苗条を茎外植
体から切シ取りて、ｕｏｏｔｏｎｅ■中に浸漬し、閉鎖
ＧＡＦ容器中水飽和ＭｅｔｒＯＭｉｘ　３５０を含む２
翅インチのポットに入れ、２１℃の恒温、光周期１６時
間とした室内に１０日間装いた。茎外植体から切断して
１だ無菌の間に直ちに、苗条のカナマイシン抵抗性の存
在につ＾て検定した。

茎セグメントディスク全ｐＭＯＮ　ａ　９９　を有ＡＣ
ＯＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｓｎ
ｓ株で接種して〜Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｍＰ８Ｐシ
ンターゼ遺伝子に一合した増強（ａＭＷｅ　３５　Ｓプ
ロモーターを含む形′Ｘ松換アブ２す植物も、上述した
のと同じ操作を用＾て得た。

例　　１ Ｅ’ＭＶ全長グ全長グロー−ター増強ＣａＭ’ＴＩｅ　
５５　Ｓプロモーターのいずれかで促進されるＧ（Ｉｓ
遺伝子全含有する形質転換Ｓ物を、組織染色操作を用い
て検定し、形質転換細胞中のＧＵＳ活性を測定した。

ＦＭＶ　／　ＧＵ’Ｓ　／　Ｂ　９およびＣａＭＶｅ　
３５　Ｓ　／　Ｇ［ＪＳ　／ＩＯ９構築体を含有するタ
バコ植物の組織学的検定には、形質転換植物の若い花芽
（１０ａｕ＊）切片についてのＧ［ｒ１３活性測定試験
を実施した。形質転換植物の花芽切片は、！ｉｉ物組織
組織ミソリの刃によってフリーハンドで厚さ０．５１未
満に切断することによって調装した。ついで組織を過剰
のＸ−ｇＬｕｃ浴叙中に、切片が完全に援われるよりに
置いた。

切片全真空に必ててｘ−ｇｌｕｃ　ｕ液の浸透金助ける
こともできる。２５１１！７の０．２ＭＮａＰＯ４Ｍ　
ｍ　Ｉ％ｌＥ　ｒ７．０．２４．Ｏｕｖｏ　ｄＨ２０，
０，２５ｄｃｖ　Ｏ，Ｉ　ＭＫ３［：Ｆｅ（ＯＮ）６］
、０．２５　ｄの［１−Ｉ　Ｍ　Ｋ４ＣＦｅＣＣＮ）ａ
〕およヒ０−５　”　ノＩ　Ｍ　ｇＤＴＡ％　ｉ”　７
−　Ｏｋ　ｍ　合シテ５０−のＸ−ｇｌｕｃｇｉｉ詞装
した。この浴液にＲｅｓｅａｒｃｈＯｒｇａｎｉｃｓ　
（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ　）から入手したＸ
−ｇｌｕｅ　（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−グルクロニド〕５０ηを加え、浴解する鷹で攪
拌した。ついで好ｌしくは、溶液全ａ遍により滅菌した
。　Ｘ−ｇｌｕｃ浴液中の花芽切片をついで３７℃に２
〜４時間放置した。浴液の蒸発を防止するように注意し
た。インキュベーション終了後、切片全リン酸緩衝ｇＩ
たは蒸留水で洗浄−切片を直ちに実体顕微鏡筒たけ複合
顕微鏡で検査した０色累からの干渉があれば、組織をＦ
ＡＡ溶液（８５＋ｔ６！５０％エタノール、５尼氷酢酸
および１［１ａｕホルマリン〕中で２４時間固定する。

フェノール類との問題は、染色の直前、染色浴液に、二
亜硫酸ナトリウムを２０　ｍＭ　１で礒カｌすることに
よって緩和できる。第１１図には、ＦＭＶ含有Ｇ１）Ｓ
構築体およびＣａＪＭＶｅ　３５　Ｓ含有構築体それぞ
れの組織学的染色検定の結果を示す。

ＧＵＳ活性の存在に対する陽性反応は、検定植物切片の
組織中への背合の出現によって示される。

第１１図には、増強ＣａＭ’ｉｅ　３５　Ｓプロモータ
ー（転）およびＬＩＭＶ全長グロモーター（切によって
促進されるβ−グルクロニタ゛−ゼ遺伝子で形ＪＸ転換
されたタバコ花芽の染色切片のカン−写真を示す、第１
１に）図は、ＣａＭＶ６３５　Ｂ促進Ｇ１）Ｓ遺伝子に
ついての典裂的な染色像を示し、単一のトランスジェニ
ック槓物内で一部の組織は染色され、その他のｉ織は染
色されている。Ｇ［ＪＳ遺伝子が発現した組織での発現
レベルは普通とみられる。第１１　（ｂ）図は、ＦＭＶ
７’ロモーター促進ＧＵＥ遺伝子で形質転換された植物
の組織での、はるかに高いＧ（ＪＳ発現およびＭ城、細
胞を通じてのよシ均一なパターンの発現を示している。

これは切片全体を通じての優位な背色の層色によって示
される。

発現の分布および得られた高度な発現を示すトランスジ
ェニック植物の数は、最高に増強されたＣａＭＶグロモ
ーター含有形質転換ｍ物に比較して、ＦＭＶプロモータ
ーは発現のＭ域分布および均一性の点で優れていること
を示して＾る。ＦＭＶ　／　ＧＵｓ會有形）ＪＬ転侠植
物の２０％以上がピわめて強力なＧＵＳ発現を示し、盈
た染色はｍ物量、組織間で均一であった。このＦＭＶ　
’ゴせ植物に２ける染色は常に、最高に増強され／ＣＣ
ａＭＶ　／　ＧＵＳ植物に認められる染色と同程度でめ
る。

例　　２ ＦＭＶプロモーターｌたはＣａＭＶｅ　３５　Ｓプロモ
ーターのいｒれかによって促進される、ヌクレオチド１
０１の１個のグリシノのアラニンへの突然変異を含むＡ
ｒａｂｉｄｏｐＳｉｓ　ＥＰＳＰシンターゼを含有する
トランスジェニック植物を作成し、グリホセートに対す
る抵抗性全分析した。ＦＭＶプロモーターで指示される
（上述の）　ＡｒａｂｉｃＬｏｐｓｉｓ　ＦｉＰＳＰシ
ンターゼ２を転子含有トランスジェニック植物はｐＭ○
Ｎ９９６金含有したが、増強ＣａＭＶｅ　３５　Ｓプロ
モーター含有トランスジェニック植物はｐＭＯＮ　８９
９を含有した。これらのトンンスジェニ７り植物全栽培
し、ＲＯ＃ｉ物からの種子を収穫し、脱殺し、乾燥した
のち、クリホセート噴赫試賊のために栽培した。糧子金
Ｍｅｔｒｏ　３５０と３種類の徐放性肥料の４インチ平
方ポットに播いた。試験には各Ｒｏ植物からの２０１１
ｉ！ｉｌの実生全目標とすることが望ましい。発芽率は
通常高いが過剰に播種して２０個の実生が確実に得られ
るようにした。Ｎ２１ｉＩ後７〜１０日目に最も活気の
ある直立した実生を２０個選んで間引いた。展性対照（
非形質転換。

’　ｆｅｓｔｅｒ″ｍ）は品質を保持し、結果を展示す
るために同時に栽培した。植物は温室環境に維持し、生
育させた。１６時間光周期と、昼間２１℃。

夜間１５℃の温度全維持した。分析結果２０−１９−１
８の水浴性Ｐｅｔｅｒｓ　Ｐａｔｅ　Ｌｉｔｅ　ＪＰ！
科を１週に１同筒たは必要に応じて施用した。

各ＲＯ子係から２ｍの種物には噴霧を行わず、グリホセ
ート耐性を比較し、測定する対照とした。

残りのＭ物が６〜８葉の段階に逼したとき、通常は播種
２０〜２８日後に、グリホセートを０．２８繕／ｈａに
相当する割合で適用した。低谷童金用いる低率法を採用
した。０．２８暗／　ｈａのグホセートを１Ｕ英ガロン
とするのがフィールド試験の標準である。実験室試験用
の噴霧器はフィールド条件に相当する一定の割合で噴霧
が行われるよりに基準化した。

生殖評価の結果は第１２図に示す。これらの計算は非噴
寝対照に対する評点システムに基づくものである。生殖
評価は、噴霧後２８日目に実施ム主要分裂組織１ｆｃμ
花のグリホセートに対する反応を６段階の状急に基づい
て行う。

０−花芽の発生なし ２＝花芽を生１；るが開花前に枯死 ４−朽のない花、朽は花弁の上方に突き出さなけれは−
けない ６＝外観正常の朽をもつ花、ただし不毛８；一部不毛の
朽をもつ花 １ｕ−完全な生殖能力のめる花 第１２図には、Ｈ′ＭＶグロモーターを含有するトラン
スジェニックアブラナ系とＣａＭＶ６５５　Ｓプロモー
ターを歯打するトランスジェニック系の生殖評点全全体
で比較した。Ｎ１２図から明らかなよＱＶＣ，ＦＭＶプ
０％−ター（ｐＭＯＮ　９９６　）　ｋ含有する７個の
トランスジェニック系の３個の生殖評点はｃａｘｖｅ　
５　ｓ　ｓプロモーター（ｐＭＯＮ　８９９　）金含有
する系からのどの評点よ夕も良好である。

第１２図は過去に試験した１５０系中で最も高いグリホ
セート１ｌＩｉｔ性金示している。これからＦＭＶグロ
モーターが、植物の組織およびａ胞全通して、とくに花
芽におい−Ｃ１遺云子Ｍ物をよシ均一に発現させること
が明らかでめる。花芽における発現レベルの上昇は最高
のグリホセート耐性を達成するのにきわめて重要である
。

以上述べた態様および実施例は、本発明の実際をよりよ
く理解するだめのものである。これらの態様および実施
例は単に例示の目的のものであって、本発明の範ｖ５を
限定するものではないことを理解すべきでめる。

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ｎｔｅｒ、　　Ｊ、Ａ、、　　Ｂａｒｎａｓｏｎ、　Ａ
、Ｒ，。

Ｒｏｇｅｒｓ、Ｓ、Ｇ、Ｆｒａｌｅｙ、Ｒ，Ｔ、、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、４：１５４
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ｉｃｈｉｎｓ、Ｒ，、Ｄｕｆｆｕｓ、Ｊ、。

Ｈａｄｌｅｙ、　Ｍ、、　ｐｈ７ｔｏｐａｔｈｏｌＱｇ
７．　　Ｖｏｌ、　　７７、　Ｎｏ、　　１２：１６６
８−１６７３　　（１９８７，）Ｓｔａｌｋｅｒ、Ｄ、
Ｍ、、Ｋｏｌｔｅｒ、Ｒ，、Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、Ｄ、。

８ｕｔ工１ｆｆｅ、Ｊ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ＆ｒ
ｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。

４６二７７　（１ソ７ソノ Ｖｉｅｉｒａ、　；ｒ、　＆ＭｅＳｓｉｎｇ、　；ｒ、
、　Ｇｅｎｅ、　　１９：２５９ＣＩ９８２Ｌ

【図面の簡単な説明】

第１図は、ゴマノハグサモずイクウイルスからの全長転
写プロモーター’ｉ、５’！Ｊ−ダー配列および少倉の
３′瞬接ＤＮＡ　”ｉ含めて官有するＤＮＡ配夕０をボ
丁。 第２図〜弗６図は）歇次、ｐＭＯＮ　７２１　ｒ　　ｐ
ＭＯＮｌ　５７５、　　ｐＭＯＮ５１’　７７．　　μ
ＯＮ　９８１．　　ｐＭＯＮ第８図はｐＭＯＮ　９９６
の物理的地図を示す。 第９図はｐＭＯＮ　９９６の製造工程図でおる。 第１０図はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅ　　株ｐＴｉＴ　３７プラスミドのＴ−ＤＮＡ領
域の制限酵累地図である。 第１１ａ図および第１１ｂ図は、増強ＣａＭＶ６３５８
プロモーター（第１１ａ図）およびＢ′Ｍｖ全長り写プ
ロモーター（第１１ｂ図）によりて促進されるβ−グル
クロニダーゼ遺伝子で形１ｉＬｈ換されたタバコ花芽に
おけるＧＵＳ活性の存在を示す生物形感写真である。 第１２図は、ＦＭＶ全長転写グロモーターｌたはＣａＭ
Ｖｅ　３５　Ｓプロモーターの制御下に変異体ＫＰＳＰ
Ｓを含有するトランスジェニック植物のクリホセート適
用後における生殖評点を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ゴマノハグサモザイクウイルスからの全長転写プ
   ロモーター （２）第１図のヌクレオチド６３６８〜６９３０に示す
   ヌクレオチド配列を有する請求項（１）記載のプロモー
   ター （３）さらにゴマノハグサモザイクウイルスからの５′
   非翻訳リーダー配列からなる請求項（１）記載のプロモ
   ーター （４）さらにプロモーターに関して異種の起源からの５
   ′非翻訳リーダー配列からなる請求項（１）記載のプロ
   モーター （５）第１図に示すヌクレオチド配列を有する請求項（
   ３）記載のプロモーター （６）キメラ遺伝子を発現するように植物細胞を形質転
   換する方法において、ゴマノハグサモザイクウイルスか
   らの全長プロモーターをキメラ遺伝子に含有させる改良 （７）プロモーターは５′非翻訳リーダー配列を包含す
   る請求項（６）記載の方法 （８）５′非翻訳リーダー配列はゴマノハグサモザイク
   ウイルスのものである請求項（７）記載の方法 （９）５′非翻訳リーダー配列はプロモーターに関して
   異種起源のものである請求項（７）記載の方法 （１０）ゴマノハグサモザイクウイルスの全長転写プロ
   モーター；プロモーターに関して異種の構造ＤＮＡ配列
   ；および植物細胞中で機能してＲＮＡの３′末端にポリ
   アデニレートヌクレオチドの付加を起こすポリアデニル
   酸シグナルをコードする３′非翻訳領域からなる植物細
   胞中で機能するキメラ遺伝子 （１１）プロモーターはさらに５′非翻訳リーダー配列
   からなる請求項（１０）記載のキメラ遺伝子 （１２）５′非翻訳リーダー配列はゴマノハグサモザイ
   クウイルスのものである請求項（１１）記載のキメラ遺
   伝子 （１３）５′非翻訳リーダー配列はプロモーターに関し
   て異種起源のものである請求項（１１）記載のキメラ遺
   伝子 （１４）構造ＤＮＡ配列は、葉緑体トランジットペプチ
   ドが植物細胞の葉緑体内へのその輸送を可能にする葉緑
   体トランジットペプチド／５−エノールピルビルシキミ
   酸−３−リン酸シンターゼ融合ポリペプチドをコードし
   ＲＮＡを産生させるコード配列からなる請求項（１０）
   記載のキメラ遺伝子 （１５）ゴマノハグサモザイクウイルスの全長転写プロ
   モーター；プロモーターに関して異種の構造ＤＮＡ配列
   ；および植物細胞中で機能してＲＮＡの３′末端にポリ
   アデニレートヌクレオチドの付加を起こすポリアデニル
   酸シグナルをコードする３′非翻訳領域からなるキメラ
   遺伝子を含有する形質転換された植物細胞 （１６）プロモーターはさらに５′非翻訳リーダー配列
   を包含する請求項（１５）記載の植物細胞 （１７）５′非翻訳リーダー配列はゴマノハグサモザイ
   クウイルスからのものである請求項（１６）記載の形質
   転換された植物細胞 （１８）５′非翻訳リーダー配列はプロモーターに関し
   て異種起源のものである請求項（１６）記載の形質転換
   された植物細胞 （１９）構造ＤＮＡ配列はさらに、葉緑体トランジツト
   ペプチドが植物細胞の葉緑体内へのその輸送を可能にす
   る葉緑体トランジツトペプチド／５−エノールピルビル
   シキミ酸−３−リン酸シンターゼ融合ポリペプチドをコ
   ードしＲＮＡを産生させるコード配列からなる請求項（
   １５）記載の形質転換された植物細胞 （２０）コード配列はグリホセート耐性５−エノールピ
   ルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）
   をコードする請求項（１９）記載の形質転換された植物
   細胞 （２１）葉緑体トランジツトペプチドは植物ＥＰＳＰＳ
   遺伝子のものである請求項（１９）記載の形質転換され
   た植物細胞 （２２）コード配列はグリホセート耐性５−エノールピ
   ルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ （ＥＰＳＰＳ）をコードする請求項（１４）記載のキメ
   ラ遺伝子 （２３）葉緑体トランジットペプチドは植物ＥＰＳＰＳ
   遺伝子のものである請求項（１４）記載のキメラ遺伝子 （２４）キメラ遺伝子を感受性植物細胞に挿入できるＡ
   ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの
   無力化植物腫瘍誘発プラスミドからなる植物形質転換ベ
   クターにおいて、キメラ遺伝子はゴマノハグサモザイク
   ウィルスの全長転写プロモーターおよびプロモーターに
   関して異種の構造ＤＮＡ配列からなるベクター （２５）プロモーターはさらに５′非翻訳リーダー配列
   からなる請求項（２４）記載の植物形質転換ベクター （２６）５′非翻訳リーダー配列はゴマノハグサモザイ
   クウイルスのものである請求項（２５）記載の植物形質
   転換ベクター （２７）５′非翻訳リーダー配列はプロモーターに関し
   て異種起源のものである請求項（２５）記載の植物形質
   転換ベクター （２８）請求項（１５）記載の植物細胞からなるトラン
   スジエニツク植物 （２９）請求項（１６）記載の植物細胞からなる請求項
   （２８）記載のトランスジエニック植物 （３０）請求項（１７）記載の植物細胞からなる請求項
   （２９）記載のトランスジエニック植物 （３１）請求項（１８）記載の植物細胞からなる請求項
   （２９）記載のトランスジエニック植物 （３２）請求項（１９）記載の植物細胞からなる請求項
   （２８）記載のトランスジエニツク植物 （３３）請求項（２０）記載の植物細胞からなる請求項
   （３２）記載のトランスジエニツク植物 （３４）請求項（２１）記載の植物細胞からなる請求項
   （３２）記載のトランスジエニツク植物 （３５）請求項（２８）記載の植物の種子 （３６）請求項（２９）記載の植物からの請求項（３５
   ）記載の種子 （３７）請求項（３０）記載の植物からの請求項（３６
   ）記載の種子 （３８）請求項（３１）記載の植物からの請求項（３６
   ）記載の種子 （３９）請求項（３２）記載の植物からの請求項（３５
   ）記載の種（４０）請求項（３３）記載の植物からの請
   求項（３９）記載の種子 （４１）請求項（３４）記載の植物からの請求項（３９
   ）記載の種子