KR20050028255A

KR20050028255A - 마커-프리 형질전환식물체 생산을 위한 신규 방법

Info

Publication number: KR20050028255A
Application number: KR1020030064926A
Authority: KR
Inventors: 이선교; 유제근; 장석소; 정남준; 조성환; 이인희; 박선희; 김인식
Original assignee: (주)넥스젠
Priority date: 2003-09-18
Filing date: 2003-09-18
Publication date: 2005-03-22

Abstract

본 발명은 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 마커-프리(marker-free) 고추, 배추, 무, 참외, 오이, 수박, 유채, 담배, 벼 등의 식물 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 마커-프리 식물 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 식물 형질전환체의 제조방법은 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 작업 시간 감축, 배지 사용양 감소, 아그로박테리움 과성장 방지 등의 장점이 있다.

Description

마커-프리 형질전환식물체 생산을 위한 신규 방법{A Novel Method for Production of Marker-free Transgenic Plants}

본 발명은 식물 형질전환 시 T-DNA 전달을 극대화시키는 방법과 형질전환율을 증가시키는 방법과 마커-프리 형질전환체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)를 주사기나 진공펌프를 이용해 주입하여 마커-프리 T-DNA 전달을 극대화시켜 식물 형질전환율을 증가시키는 방법 및 이로부터 제조되는 마커-프리 식물 형질전환체에 관한 것이다. 기존에는 형질전환율이 극히 낮은 상황에서 수많은 신초 중에 형질전환체를 선발하기 위하여 반드시 항생제 저항성 유전자나 제초제 저항성 유전자 등의 선발마커를 사용하였다. 그러나 본 발명에 의한 형질전환 효율의 획기적인적인 증가로 배지 중에 형질전환체 선발을 위한 항생제 또는 제초제를 제거해도 식물 형질전환체를 쉽게 얻을 수 있으므로 마커-프리 식물발현용벡터를 사용하여 목적하는 유전자만을 식물 내로 도입하여 손쉽게 안전한 마커-프리 식물 형질전환체를 생산할 수 있는 기술에 관한 내용이다.

안정 형질전환 (stable transformation)은 숙주식물 지놈으로 목적유전자 (target gene)를 삽입 (integration)시키는 것을 의미한다. 형질전환식물체를 제작하기 위한 두 가지 대표적인 기술이 다음과 같이 있다. 아그로박테리움을 이용하여 담배 또는 콩 등의 쌍자엽식물에 유전자를 도입하는 방법 (Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985)과 밀 또는 옥수수 같은 단자엽식물에 유전자를 biolistic delivery하는 방법 (Christou, Curr Opin Biotech 4:135-141, 1993)이 있다. 아그로박테리움은 제한된 숙주범위를 갖고 있고 단자엽식물을 효과적으로 감염시키지 않으므로 주로 쌍자엽식물의 형질전환을 위하여 광범위하게 사용되고 있다. 그러나 벼는 아그로박테리움으로 형질전환시킬 수 있으며 (Chan et al., Plant Mol Biol 22:491-506, 1993; Hiei et al., Plant J 6:271-282, 1994; Hiei et al., Plant Mol Biol 35:205-218, 1997) 다른 단자엽식물들을 형질전환시킬 수 있는 방법들도 개발되어 있다.

식물을 형질전환시키기 위하여 대상 유전자를 E. coli와 아그로박테리움 사이에서 작업이 가능한 바이너리 벡터에 도입해야 한다. 목적유전자를 포함하는 바이너리 벡터로 형질전환된 아그로박테리움은 스스로 대상유전자를 숙주세포 지놈으로 운반한다. 그 후에 대상유전자가 안정하게 숙주의 지놈에 도입된 세포를 선발한다. 이러한 아그로박테리움을 이용한 식물 형질전환의 가장 큰 단점은 균주별 숙주식물 특이성을 가지고 있어 어떤 식물 종에서는 형질전환율이 매우 낮은 것이 커다란 문제점으로 보고되고 있다. 이들 식물종에서 형질전환율을 증가하기 위하여 T-DNA 전달을 증가시키기 위하여 여러 방법이 개발되어 왔다(Finer and Fine, Applied Microbiology, 30:406-410, 2000). 그 방법들 중의 하나인 일시적 발현 (transient expression)에 있어서 유전자를 식물세포로 전달하는데 세 가지 대표적인 시스템이 있다. 내이키드 (naked) DNA를 입자에 코팅하여 DNA 입자총 (DNA particle bombardment) 방법으로 DNA를 식물 내에 도입하는 방법, 변형된 변형된 식물 바이러스 벡터들을 이용하는 방법, 진공 침투 (vacuum infiltration)에 의하여 식물 조직으로 발현벡터를 소지하고 있는 아그로박테리아 (agrobacteria)를 도입하는 아그로인필트래이션법 (agroinfiltration) 방법 등이 있다.

입자총의 경우에는 일반적으로 소수의 세포들에만 유전자가 도입되며 전사을 위하여 DNA가 세포의 핵 내에 도달해야만 기능을 하게 된다 (Christou, Trends Plant Sci 1:423-431, 1996). 이 방법은 안정 형질전환 (stable transformation)에 앞서서 재조합 단백질의 안정성 검사에 사용할 수 있지만 극소수 부위에서만 발현하는 단점이 있다. 다음은 바이러스 벡터를 이용한 방법이 있다. 그러나 바이러스 벡터를 사용할 경우에는 사용할 수 있는 DNA 길이가 2kb이하로 제한되어 있다. 다시 말하면 바이러스 벡터에 도입할 유전자의 크기가 커서는 사용하기가 어렵다는 단점이 있다. 그리고 아그로인필트래이션법은 입자총보다 많은 세포들이 targeting되는데 대상유전자를 포함하는 T-DNA가 몇 가지 세균 단백질들의 도움으로 능동적으로 핵 내에 도입된다 (Kapila et al., Plant Sci 122:101-108, 1996). 이 방법 또한 도입된 T-DNA가 숙주세포의 지놈 DNA로 삽입되어 지속적으로 유지되는 것이 아니고 핵 내에 존재하여 대상유전자의 일시적 발현을 나타낸다. 그러나 T-DNA의 도입을 증가시킴으로써 지놈 DNA 내로 끼어 들어갈 수 있는 가능성을 높일 수 있다.

본 개발에서는 이러한 문제점을 개선하기 위하여 새롭게 변형된 아그로인필트래이션법을 이용하여 T-DNA 전달을 극대화하고 이를 통하여 외래 유전자가 식물의 지놈 DNA에 삽입될 수 있는 기회를 증가시켜 식물 형질전환율을 획기적으로 증가시켰으며 이 방법으로 손쉽게 마커-프리 형질전환체를 생산하는 방법을 개발하였다 .

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시된다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 요지가 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 상술한 업계의 오랜 요구를 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 형질전환에 적합한 식물의 재배상태, 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)의 주입 방법, 기내 공동배양을 생략하여 관련 비용 절감 및 재분화 배지의 조성 등을 새롭게 구축하고, 이에 따르는 경우에는 아그박테리움 튜머페이션스에 의한 식물 형질전환체의 제조가 보다 단시간, 저비용, 고효율로 발생하는 것을 확인하고, 또한 형질전환 하고자하는 조직 전체에 양압 또는 음압 등의 물리적인 방법에 의하여 아그로박테리움을 대부분 모든 식물조직에 주입함으로써 선발마커로 이용되어온 항생제나 제초제 저항성 유전자를 사용을 피할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 그리고 형질전환체 선발을 목적으로 벡터에 추가되었던 항생제 저항성이나 제초제 저항성 유전자를 제거하고 형질전환을 실시함으로써 목적하는 유전자만을 식물체 내로 전달함으로서 선발마커 유전자로부터 발생할 수 있는 잠재적인 위험요소를 제거하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 아그로박테리움 튜머페이션스를 물리적 주입방법에 의한 식물 형질전환율의 증가 및 이를 사용하여 마커-프리 식물 형질전환체를 확보하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 식물 형질전환체의 제조방법에 의해 제조된 식물 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명은 (ⅰ) 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 잎 및 전체에 높은 효율로 T-DNA를 세포내로 전달하는 단계: (a) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (c) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; (ⅱ) 항생제 등의 선발마커를 제거한 벡터를 사용함으로써 기존의 거부감을 주었던 선발마커 없이 실시하는 형질전환법; 그리고, (ⅲ) 상기 감염된 식물 조직을 6.0-1.0 ㎎/ℓ의 시토키닌 및 0.2 ㎎/ℓ의 옥신계 성장 조절제를 포함하는 배지에서 재분화시키는 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 (ⅰ) 식물체 직접 아그로박테리움을 주입할 수 있도록 버퍼용액에 현탁하는 방법; (a) 아그로박테리움 현탁액에 아세토시린곤과 생장조절제 시토키닌을 첨가하여 식물 활성을 높이고 재분화율을 높이는 방법: (b) 아그로박테리움을 키울 때 pH를 5.6으로 맞춰 아그로박테리움의 형질전환 능력을 증가시키는 방법; (ⅱ) 항생제 등의 선발마커를 제거한 벡터를 사용함으로써 기존의 거부감을 주었던 선발마커 없이 실시하는 형질전환법; 그리고, (ⅲ) 상기 감염된 식물 조직을 6.0-1.0 ㎎/ℓ의 시토키닌 및 0.1-0 ㎎/ℓ의 옥신계 성장 조절제를 포함하는 배지에서 재분화시키는 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

이와 같은 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:

Ⅰ. 형질전환 재료의 준비

식물의 형질전환 재료로서 이용될 수 있는 것은 성체나 유묘의 잎, 줄기 및 엽병 등이다. 이러한 재료는 식물의 다양한 부분에서 얻을 수 있으며, 각각의 식물의 재분화가 가장 잘 이루어지는 시기와 부위가 중요하다. 종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. 형질전환 재료로 이용하기 위하여 온실에서 식물을 재배할 때는 병 발생이 적고 건강한 상태를 유지하는 것이 중요하다.

본 발명의 바람직하게 실시한 고추, 배추, 무, 참외, 오이, 수박, 유채, 담배, 벼 Nicotiana benthamiana와 Nicotiana tabacum cv, xanthi 예에 있어서, 종자의 발아 시 이용되는 토양은 피트모스 (peat moss)와 펄라이트 (perlite)를 균등하게 섞은 토양 혹은 일정 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 재료 등을 이용할 수 있고 이는 식물이 정상적으로 자랄 수 있는 모든 종류의 토양을 포함한다. 본 발명의 발아 배지에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

종자 발아의 조건에 있어서는 파종 후 씨앗을 덮는 복토에 있어 두껍지 않게 하는 것이 중요하다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 복토의 두께는 0.5cm 이내가 바람직하며 광 16시간 암 8시간 배양이 적절하다. 한편, 발아 단계에서의 배양 온도는 26℃±1℃가 바람직하다. 형질전환에 사용하기 위해서는 3주에서 10주 자란 식물이 적당하며 7주 이전의 식물이 재분화능이 높다.

Ⅱ. 주입을 위한 아그로박테리움 튜머페이션스 준비

본 발명에서 실시한 형질전환은 Ti 플라스미드가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시한다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)). 보다 바람직하게는 바이너리 (binary) 벡터 시스템을 이용하는 것이다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986)). 상기한 바이너리 벡터는 예컨대, pBin19, pRD400 등이 있다.

본 발명에 이용되는 바이너리 벡터는 기본적으로 (a) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (c) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열을 포함한다. 또한, 바람직하게는 상기 벡터에는 선택 표지로서 항생제 (예: 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자를 제거하였다. 한편, 상기 벡터는 추가적으로 리포터 물질(예: 루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제 등)을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 바이너리 벡터 내에 이용될 수 있는 프로모터는 예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 1' 프로모터, 2' 프로모터 또는 노팔린 합성효소 (nos) 프로모터 등을 포함한다. 한편, 상기 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열은 얻고자 하는 바람직한 형질에 따라 결정된다.

상기한 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움은 항생제를 포함하지 않은 LB 고체배지에서 자란 신선한 균을 3ml의 YEP 액체 배지에 진탕배양을 실시한다. 충분히 자란 배양액을 500ul 취하여 15ml YEP 액체 배지에서 18-20시간 키운다. 이때 균의 농도는 OD₆₀₀에서 1.5정도로 자란 것이 바람직하다. 그리고 특히 중요한 것은 마지막 배양액의 pH가 5.6으로 아그로박테리움의 vir 유전자가 활성화되도록 만들어야 한다. 상기한 정도로 균이 자랐을 때 이를 3000rmp, 15분간 상온에서 원심분리하여 균을 모은다. 상층액의 배지를 제거한 후 10mM의 MgCl2에 현탁한다. 이때 균의 농도는 OD₆₀₀에서 1이 가장 적절하다. 바람직하게는 아세토시린곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다. 최종적으로 6-벤진아미노퓨린을 최종농도 0.2ppm되게 넣어준다. 이는 본 개발의 핵심 중 하나로 주입된 식물체의 활성을 높여주고 재분화 능력을 향상하는데 중요한 역할을 한다. 이를 3시간에서 8시간 상온에서 반응하면 식물에 주입할 준비가 완료된다. 이는 원심분리로 인한 떨어진 균의 활성을 다시 찾아주는데 중요한 역할을 한다.

Ⅲ. 식물체에 균 주입

상기한 바에 따라 준비된 균을 발아 적절히 자란 고추, 배추, 무, 참외, 오이, 수박, 유채, 담배, 벼 N. benthamiana 혹은 N. tabacum cv xanthi에 주입할 수 있다. 식물 내로 아그로박테리움의 주입은 크게 두 가지로 이루어질 수 있다. 첫째는 주사기를 이용하여 주입하는 방식이다. 이는 다시 두 가지로 나눌 수 있는데 첫째는 잎 뒷면에 직접 주사기를 대고 아그로박테리움을 주입하여 식물체내로 주입하는 방식이고 둘째는 바늘로 넣고자하는 부위에 작은 상처를 낸 후 그 부위에 주사기를 대로 아그로박테리움을 주입하는 방식이다.

또 다른 주입방식은 진공펌프를 이용한 식물체 전체에 아그로박테리움 현탁액을 주입하는 방식이다. 압력은 400mm Hg에서 5분간 실시한다. 식물의 잎에 아그로박테리움 현탁액이 삽입되는 것을 관찰할 수 있다. 주입 후 식물체가 정상상태로 돌아오도록 밀폐형 용기에 6-12시간 배양 후 온실이나 키울 때의 배양조건에서 정상적으로 3일간 키운다.

종래에는 자엽을 아그로박테리움의 배양액과 공동배양하여 식물 조직을 감염시켰으나(Choi P.S. et al., Plant Cell Rep., 13(6):344-348(1994)), 이는 공동배양 시간이 48 시간 이상 소요되고, 자엽을 아그로박테리움의 배양액과 장시간 공동배양하는 동안 식물조직의 괴사가 발생하는 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명을 따르는 경우에는 이러한 문제점이 완전히 해결되며 식물이 건강한 상태가 되어 재분화 능력이 향상된다.

Ⅳ. 재분화 및 선발

상기 아그로박테리움에 의해 사용한 식물의 형질전환된 식물 조직 재분화는 엄격하게 조절된 성분과 성분양를 포함하는 재분화 배지에서 실시되어야 한다.

본 발명에 따르면, 재분화 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 재분화 배지에는 식물 성장 조절제가 포함된다. 식물 생장조절제 중 함유되는 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린, 키네틴, 제아틴, 이소펜틸아데노신 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 6-벤질아미노퓨린이 이용된다. 한편, 옥신계 성장 조절제 (예: 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산, (2,4-디클로로페녹시) 아세트산)는 본 발명의 재분화 배지에는 1-나프탈렌아세트산이 사용된다.

재분화 배지에 포함되는 시토키닌의 양은 바람직하게는 6.0-1.0 ㎎/ℓ이다. 상기 옥신계 성장 조절제의 함량은 바람직하게는 0.1 ㎎/ℓ이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 형질전환된 조직을 선별할 수 있도록 항생제 (예: 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등)를 추가적으로 포함하지 않았으므로 PCR(Polymorphic Chain reaction)을 통하여 목적 유전자가 식물 내로 전달되었는지 확인한다.

재분화 배지에서의 배양 온도는 25℃±2℃가 가장 바람직하고, 광배양:암배양의 비율은 16시간:8시간이 가장 바람직하다. 배양 기간은 사용할 식물에 따라 가변적이나, 바람직하게는 약 3주-6주이다.

상기한 조건에 따라 재분화 배지에서 형질전환된 식물 조직을 배양하면 소량의 캘러스 상태를 거쳐 재분화되어 신초가 형성된다.

Ⅴ. 발근

재분화된 조직은 본 발명의 발근 배지에서 발근시켜 형질전환체를 얻는다. 본 발명의 발근 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 발근 배지에는 식물 성장 조절제로서 시토키닌은 거의 이용되지 않고, 옥신이 주로 이용된다. 상기 옥신계 성장 조절제로서는 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산, (2,4-디클로로페녹시) 아세트산 등이 이용될 수 있고, 가장 바람직하게는 인돌아세트산이다. 본 발명의 발근 배지에는 형질전환체를 선택하기 위한 항생제를 첨가하지 않는다.

Ⅵ. 형질전환체의 확인

본 발명에 의해 제조된 식물 형질전환체는 당업계에 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예컨대, 형질전환 식물의 조직으로부터 분리한 DNA 시료를 이용하여 PCR을 실시함으로써 형질전환에 의해 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자를 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 (ⅰ) 형질전환에 사용되는 아그로박테리움을 피트모스 와 펄라이트를 함유한 10mM Mgcl2에 현탁하여 식물 조직의 활성을 증가시키고 재분화율을 증가시키는 방법; (ⅱ) 기내뿐만 아니라 온실에서 자란 식물체에 주사기 혹은 진공펌프를 이용하여 아그로박테리움 현탁액을 식물체에 주입하고 배양하는 방식: (ⅲ) 상기 감염된 식물 조직을 6-벤질아미노퓨린, 키네틴, 제아틴 및 이소펜틸아데노신 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 시토키닌 2.0-1.0 ㎎/ℓ; MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지; 에너지원인 당; 그리고 비타민을 포함하는 재분화 배지에서 재분화시키는 단계; 그리고, (ⅳ) 상기 재분화 단계에서 형성된 신초를 1-나프탈렌아세트산, 인돌아세트산 및 (2,4-디클로로페녹시) 아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 옥신계 성장 조절제 1-나프탈렌아세트산 0.1㎎/ℓ; MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지; 에너지원인 당; 그리고 비타민을 포함하는 발근배지에서 발근시키는 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기한 본 발명의 방법에 의해 제조된 식물 형질전환체를 제공한다.

상술한 본 발명의 식물 형질전환체의 제조방법은 하기하는 실시예에서 확인할 수 있듯이, 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 작업 시간이 크게 단축되고 공동배양을 기내에서 하지 않음으로써 배지사용이나 용기사용 절감의 장점이 있으며 식물 형질전환체 제조의 재현성이 매우 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 식물 조직의 준비

실시예 1-1: Nicotiana tabacum cv.xanthi 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. Nicotiana tabacum cv.xanthi 재분화 및 형질전환 재료로서 본엽을 사용하였다. 본 발명의 Nicotiana tabacum cv, xanthi 예에 있어서, 종자의 발아 시 이용되는 토양은 피트모스 와 펄라이트를 균등하게 섞은 토양에 퇴비를 섞어 키운 후 주사 주입 시 사용하였다. 혹은 일정 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배한 경우 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 현상을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아 배지에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

종자 발아의 조건에 있어서는 파종 후 씨앗을 덮는 복토에 있어 두껍지 않게 하는 것이 중요하다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 복토의 두께는 0.5cm 이내이고 광 16시간 암 8시간에서 배양하였다. 한편, 발아 단계에서의 배양 온도는 26℃±1℃이다. 형질전환에 사용하기 위해서는 3- 4주 성장한 식물을 사용하였다.

본 발명에서 주사기를 이용하여 주입할 경우 이용될 수 있는 조직은 모든 조직이 이용될 수 있으나, 가장 바람직하게는 정단부로부터 3-4번째 옆을 이용하는 것이다. 형질전환 재료로 이용하기 위하여 온실에서 식물을 재배할 때는 병 발생이 적고 건강한 상태를 유지하는 것이 중요하다.

실시예 1-2: Nicotiana benthamiana 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하고 10시간정도의 침수에 의한 수분의 공급은 발아를 촉진하였다. Nicotiana benthamiana 재분화 및 형질전환 재료로서 본엽을 사용하였다. 본 발명의 Nicotiana benthamiana 예에 있어서, 종자의 발아 시 이용되는 토양은 피트모스 와 펄라이트를 균등하게 섞은 토양에 퇴비를 섞어 키운 후 주사 주입 시 사용하였다. 혹은 일정 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배한 경우 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 현상을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아상에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

종자 발아의 조건에 있어서는 파종 후 씨앗을 덮는 복토에 있어 얇게하거나 하지않는 것이 중요하다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 복토의 두께는 0.2cm 이내이고 광 16시간 암 8시간에서 배양하였다. 한편, 발아 단계에서의 배양 온도는 26℃±1℃이다. 형질전환에 사용하기 위해서는 4- 5주 성장한 식물을 사용하였다.

실시예 1-3: 유채 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. Brassica camperstris ssp. napos cv.westar 재분화 및 형질전환 재료로서 떡잎을 사용하였다. 본 발명의 Brassica camperstris ssp. napos cv.westar 예에 있어서, 종자의 발아 시 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배하여 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 오염원을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아상에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 광 16시간 암 8시간에서 배양하였다. 한편, 발아 단계에서의 배양 온도는 26℃±1℃이다. 형질전환에 사용하기 위해서는 6-7일 성장한 식물을 사용하였다.

본 발명에서 진공펌프를 이용하여 주입할 경우 모든 조직이 이용될 수 있으나, 가장 바람직하게는 떡잎을 이용하는 것이다. 형질전환 재료로 이용하기 위하여 식물을 재배할 때는 병 발생이 없고 건강한 상태를 유지하는 것이 재분화에 중요하다.

실시예 1-4: 참외 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. Cucumis melo var. makuwa cv. enchun 재분화 및 형질전환 재료로서 떡잎을 사용하였다. 본 발명의 Cucumis melo var. makuwa cv. enchun 예에 있어서, 종자의 발아 시 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배하여 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 오염원을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아상에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 광 16시간 암 8시간에서 배양하였다. 한편, 발아 단계에서의 배양 온도는 26℃±1℃이다. 형질전환에 사용하기 위해서는 4-5일 성장한 식물을 사용하였다.

실시예 1-5: 오이 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. Cucumis sativus cv. Headong의 재분화 및 형질전환 재료로서 떡잎을 사용하였다. 본 발명의 Cucumis sativus cv. Headong 예에 있어서, 종자의 발아 시 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배하여 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 오염원을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아상에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 암조건하에서 발아 후 광 16시간 암 8시간에서 배양하였다. 한편, 발아 단계에서의 배양 온도는 26℃±1℃이다. 형질전환에 사용하기 위해서는 4-5일 성장한 식물을 사용하였다.

실시예 1-6: 배추 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. Brassica campestris L. ssp. perkinesis cv. seoul의 재분화 및 형질전환 재료로서 떡잎 및 하배축을 사용하였다. 본 발명의 Brassica campestris L. ssp. perkinesis cv. seoul 예에 있어서, 종자의 발아 시 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배하여 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 오염원을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아상에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

본 발명에서 진공펌프를 이용하여 주입할 경우 떡잎과 하배축 모두 이용될 수 있으나, 가장 바람직하게는 떡잎을 이용하는 것이다. 형질전환 재료로 이용하기 위하여 식물을 재배할 때는 병 발생이 없고 건강한 상태를 유지하는 것이 재분화에 중요하다.

실시예 1-7: 무 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. Raphanus sativus L. cv. Jinju의 분화 및 형질전환 재료로서 떡잎 및 하배축을 사용하였다. 본 발명의 Raphanus sativus L. cv. Jinju 예에 있어서, 종자의 발아 시 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배하여 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 오염원을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아상에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 광 16시간 암 8시간에서 재배하였다. 한편, 발아 단계에서의 배양 온도는 26℃±1℃이다. 형질전환에 사용하기 위해서는 4-5일 성장한 식물을 사용하였다.

실시예 1-8: 고추 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. Capsicum annuum L. cv. kumtop의 분화 및 형질전환 재료로서 떡잎 및 하배축을 사용하였다. 본 발명의 Capsicum annuum L. cv.kumtop 예에 있어서, 종자의 발아 시 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배하여 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 오염원을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아상에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

실시예 1-9: 수박 준비

종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다. Citrullus vulgaris cv. teaguk의 분화 및 형질전환 재료로서 떡잎 및 하배축을 사용하였다. 본 발명의 Citrullus vulgaris cv. teaguk 예에 있어서, 종자의 발아 시 지지물 즉 부직포에 영양액을 첨가한 후 재배하여 진공펌프로 주입 시 사용하였다. 이는 진공 주입 시 거꾸로 놓았을 때 흙이나 불순물이 아그로박테리움 현탁액에 혼입되는 오염원을 방지할 수 있다. 본 발명의 발아상에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

실시예 2. 주입을 위한 아그로박테리움 튜머페이션스 준비

본 발명에서 실시한 형질전환은 Ti 플라스미드가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시한다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)). 보다 바람직하게는 바이너리 (binary) 벡터 시스템을 이용하는 것이다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986)). 상기한 바이너리 벡터는 예컨대, pBin19, pRD400 등에서 항생제 선발마커를 제거한 것이 있다.

본 발명에 이용되는 바이너리 벡터는 기본적으로 (a) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (c) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열을 포함한다. 또한, 상기 벡터에는 선택 표지로서 항생제 (예: 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자를 포함하지 않는다. 한편, 상기 벡터는 추가적으로 리포터 물질(예: 루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제 등)을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 바이너리 벡터내에 이용될 수 있는 프로모터는 예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 1' 프로모터, 2' 프로모터 또는 노팔린 합성효소 (nos) 프로모터 등을 포함한다. 한편, 상기 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열은 얻고자 하는 바람직한 형질에 따라 결정된다. 예컨대, 제초제 (글라이포세이트, 설포닐우레아 등) 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자 (예: Bt 유전자), 악조건 (가뭄, 기온, 염도) 저항성 유전자, 품질향상을 위한 유전자 (예; 당도 증가, 과숙 지연 등), 의료용 단백질 생산 관련 유전자(EGF, 각종 질병의 항원 또는 항체, 인슐린 등), 기능성 화장품 생산 관련 유전자 (알부민, 항균성 펩타이드 등) 등이 있다.

상기한 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움은 적정 항생제를 포함하고 있는 LB 고체배지에서 자란 신선한 균을 3ml의 YEP 액체 배지에 진탕배양을 실시한다. 충분히 자란 배양액을 500ul 취하여 15ml YEP 액체 배지에서 18-20시간 키운다. 이때 균의 농도는 OD600에서 1.5정도로 자란 것이 바람직하다. 그리고 특히 중요한 것은 마지막 배양액의 pH가 5.6으로 아그로박테리움의 vir 유전자가 활성화되도록 만들어야 한다. 상기한 정도로 균이 자랐을 때 이를 3000rmp, 15분간 상온에서 원심분리하여 균을 모은다. 상층액의 배지를 제거한 후 10mM의 Mgcl2에 현탁한다. 이때 균의 농도에 따른 T-DNA의 전달을 GUS를 통하여 알아본 결과 OD₆₀₀에서 1이상의 경우에 유사한 결과를 보였다. 바람직하게는 아세토시리곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다. 최종적으로 BA를 최종농도 0.2ppm되게 넣어준 결과 재분화율의 증가를 확인할 수 있었다. 이는 본 개발의 핵심중 하나로 주입된 식물체의 활성을 높여주고 재분화능력을 향상하는데 중요한 역할을 한다. 현탁된 아그로박테리움을 3시간에서 8시간 상온에서 반응하면 식물에 주입할 준비가 완료된다. 이는 원심분리로 인한 떨어진 균의 활성을 다시 찾아주는데 중요한 역할을 한다.

실시예 3. T-DNA 전달을 높이기 위한 주사기를 이용하여 식물체에 아그로박테리움 주입

상기한 실시예 2에 따라 준비된 균을 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비된 Nicotiana tabacum cv. xanthi와 Nicotiana benthamiana 식물체에 주입하였다[참조 도 1]. 이러한 방법은 두 종류로 나눌 수 있는데 첫째는 잎 뒷면에 직접 주사기를 대고 아그로박테리움 현탁액을 주입하여 식물체내로 주입하는 방식이고 둘째는 바늘로 넣고자하는 부위에 작은 상처를 낸 후 그 부위에 주사기를 대로 아그로박테리움 현탁액을 주입하는 방식이다. 이와같이 형질전환에 이용될 조직전체에 물리적인 방법에 의하여 전체 세포에 아그로박테리움을 전달함으로써 모든 세포에 T-DNA가 전달되는 가능성을 높이고 이로부터 재분화되는 식물체가 형질전환체일 가능성을 증가시킨다. 또한 식물체의 잎이 온전하게 붙어있으므로 충분한 영양 공급과 정상적인 대사작용을 하게되어 건강한 상태를 유지하게 되어 재분화율을 증가시킨다. 뿐만 아니라 기존의 형질전환에서 사용된 배지 위에서의 공동배양 단계를 제거함으로써 배지 및 배양용기를 절감할 수 있는 장점이 있다. 또한 배지 교환에 소비되었던 시간도 필요 없게 되었다. 종래에는 메스로 여러 곳을 상처 입힌 자엽을 아그로박테리움의 배양액과 공동배양하여 식물 조직을 감염시켰으나(Choi P.S. et al., Plant Cell Rep., 13(6):344-348(1994)), 이는 공동배양 시간이 48 시간 이상 소요되고, 여러 곳을 상처 입힌 자엽을 아그로박테리움의 배양액과 장시간 공동배양하는 동안 식물조직의 괴사나 아그로박테리움이 과성장하는 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명을 따르는 경우에는 건강한 식물체 내에서 높은 고밀도로 T-DNA가 전달되면서 잎이 공기 중에 존재하므로 아그로박테리움의 과성장하는 문제점이 완전히 해결된다. 그리고 식물의 상태가 건강한 상태가 되어 재분화 능력이 향상된다.

실시예 4. T-DNA 전달을 높이기 위한 진공펌프를 이용하여 식물체 전체에 아그로박테리움 주입

상기한 바에 따라 준비된 균을 발아 후 실시예 2와 같이 준비된 고추, 배추, 무, 참외, 오이, 수박, 유채, 벼, N. benthamiana 혹은 N. tabacum cv xanthi에 진공펌프를 이용하여 식물 전체에 아그로박테리움 현탁액을 주입할 수 있다[참조 도 2]. 압력은 400mm Hg에서 5분간 실시했다. 식물의 잎에 아그로박테리움 현탁액이 삽입되는 것을 관찰할 수 있다. 아그로박테리움 현탁액을 주입했을 당시는 식물에 주입된 아그로박테리움의 무게로 인하여 아래로 쳐지는 현상이 발생한다. 이 때는 식물체가 꺽이지 않도록 주의하고 증산작용을 통하여 식물체가 정상상태로 돌아오도록 광이 약한 곳에서 6-12시간동안 배양 후 온실이나 키울 때의 배양조건에서 정상적으로 3일간 키운다.

종래에는 자엽을 아그로박테리움의 배양액과 공동배양하여 식물 조직을 감염시켰으나(Choi P.S. et al., Plant Cell Rep., 13(6):344-348(1994)), 이는 공동배양 시간이 48 시간 이상 소요되고, 여러 곳을 상처 입힌 자엽을 아그로박테리움의 배양액과 장시간 공동배양하는 동안 식물조직의 괴사가 발생하는 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명을 따르는 경우에는 이러한 문제점이 완전히 해결된다. 그리고 식물의 상태가 건강한 상태가 되어 재분화 능력이 향상된다.

실시예 5. 형질전환

실시예 5-1. Nicotiana tabacum cv. xanthi 형질전환

Nicotiana tabacum cv. xanthi 잎에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 주사기 혹은 진공 품프를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.5% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 형질전환된 잔티를 유도하기 위하여 재분환 배지 (MSB5, 3% sucrose, 5 g/L MES, 1 mg/L BA, 0.01 mg/L NAA, 6.5 g/L agar power, pH 5.8)으로 옮긴 후 2주 동안 25℃, 16h 명/ 8h 암 조건에서 배양하였다. 3주 이후 성장한 신초의 뿌리를 유도하기 위하여 MSB5, 3% sucrose, 5 g/L MES, 6.5 g/L agar, pH 5.8 인 배지로 옮긴 후 뿌리를 유도하였다.

도 4에서 LB 및 RB는 각각 T-DNA의 좌측 및 우측 보더 (border), MCS는 다중 클로닝 위치, Tnos 및 Pnos는 각각 nos 유전자의 종결 서열 및 프로모터 서열, GUS 유전자를 보고 유전자(reporter gene)로 이용하였다.

배양 기간은 가변적이나, 배양 후 2주가 경과하면 신초가 발생되기 시작한다. 발생된 신초가 1cm 정도 자라면 rooting 배지로 옮겨준다. 재분화는 모든 잎절편에서 신초 발생이 이루어 졌다.

실시예 5-2: Nicotiana Benthamiana 형질전환

Nicotiana Benthamiana 잎에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 주사기를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.5% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 형질전환된 benthamian를 유도하기 위하여 재분환 배지 (MSB5, 3% sucrose, 5 g/L MES, 2 mg/L BA, 0.01 mg/L NAA, 6.5 g/L agar power, pH 5.8)으로 옮긴 후 2주 동안 25℃, 16h 명/ 8h 암 조건에서 배양하였다. 4주 이후 성장한 신초의 뿌리를 유도하기 위하여 MSB5, 3% sucrose, 5 g/L MES, 6.5 g/L agar, pH 5.8 인 배지로 옮긴 후 뿌리를 유도하였다.

재분화 배지에서의 배양 온도는 25℃±1℃가 가장 바람직하고, 광배양:암배양의 비율은 16시간:8시간이 가장 바람직하다. 배양 기간은 가변적이나, 배양 후 2주가 경과하면 신초가 발생되기 시작한다. 발생된 신초가 1cm 정도 자라면 rooting 배지로 옮겨준다. 재분화는 모든 잎절편에서 신초 발생이 이루어 졌다.

실시예 5-3: 유채 형질전환

유채 유묘에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 진공펌프를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.5% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 형질전환된 유채를 유도하기 위하여 재분환 배지 (MSB5, 3% sucrose, 5 g/L MES, 2 mg/L BA, 0.01 mg/L NAA, 6.5 g/L agar power, pH 5.8)으로 옮긴 후 2주 동안 25℃, 16h 명/ 8h 암 조건에서 배양하였다. 2주 이후 성장한 신초의 뿌리를 유도하기 위하여 MSB5, 3% sucrose, 5 g/L MES, 0.1 mg/L NAA, 6.5 g/L agar, pH 5.8 인 배지로 옮긴 후 뿌리를 유도하였다.

재분화 배지에서의 배양 온도는 25℃±1℃가 가장 바람직하고, 광배양:암배양의 비율은 16시간:8시간이 가장 바람직하다. 배양 기간은 가변적이나, 배양 후 3주가 경과하면 신초가 발생되기 시작한다. 발생된 신초가 1cm 정도 자라면 rooting 배지로 옮겨준다. 재분화는 배지와 접한 면 모두에서 신초 발생이 이루어 졌다.

실시예 5-4: 참외 형질전환

참외 유묘에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 진공펌프를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.5% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 자엽을 배분화 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 6.0 mg/L 키네틴, 1.5 mg/L IAA, 1.0 mg/L CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.6% 아가, pH5.6, 500 mg/L 카르베니실린)에 치상하고, 26±1℃ 온도와 4,000 Lux 조도에서 16시간 광조건에서 3주 동안 광배양 하여 신초의 발생을 유도하였다. 신장된 신초를 발근 배지(MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 0.1 mg/L NAA (α-Naphtalene Acetic Acid), 1.0 mg/LCuSO₄ㆍ5H₂O, 0.6% 아가, pH5.6)에 이식하여 2주일 동안 배양하고, 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하였다.

실시예 5-5: 오이 형질전환

오이 유묘에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 진공펌프를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.25% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 엽을 MS-B5, MES 0.5g/L, 3% sucrose, 0.4%Phytagel을 기본으로 하는 선발 배지(BAP 2 mg/L, NAA 0.01 mg/L, 500 mg/L 카르베니실린) 4주 동안 26±1℃ 및 8,000 Lux, 16시간/8시간 (광/암)의 조건에서 배양하였다. 이어, 재분화된 신초를 일정량의 NAA 0.01 mg/L, 아가 0.4%를 포함하는 발근 배지에 옮겨 26±1℃ 및 8,000 Lux, 16시간/8시간 (광/암)의 조건으로 배양하여 발근한 개체를 형질전환체로 확인하고자 PCR 이용하여 분석하였다.

실시예 5-6: 배추 형질전환

배추 유묘에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 진공펌프를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.25% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 자엽을 MSB5, MES 0.5g/L, 3% sucrose, 0.6%Phytoagar을 기본으로 하는 재분화 배지(BAP 3 mg/L, NAA 1.0 mg/L, AgNO₃ 1.0 mg/L, 500 mg/L카르베니실린) 4주 동안 26±1℃ 및 8,000 Lux, 16시간/8시간 (광/암)의 조건에서 배양하였다. 이어, 재분화된 신초를 일정량의 NAA 0.01 mg/L, 아가 0.6%를 포함하는 발근 배지에 옮겨 26±1℃ 및 8,000 Lux, 16시간/8시간 (광/암)의 조건으로 배양하여 발근한 개체를 형질전환체로 확인하고자 PCR 이용하여 분석하였다.

실시예 5-7: 무 형질전환

무 유묘에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 진공펌프를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.5% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 자엽을 배분화 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 5.0 mg/L BAP, 1.0 mg/L NAA, 1.0 mg/L AgNO₃, 0.6% 아가, pH5.6, 500 mg/L 카르베니실린)에 치상하고, 26±1℃ 온도와 4,000 Lux 조도에서 16시간 광조건에서 3주 동안 광배양 하여 신초의 발생을 유도하였다. 신장된 신초를 발근 배지(MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 0.6% 아가, 500 mg/L 카르베니실린, pH5.6)에 이식하여 2주일 동안 배양하고, 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하였다.

실시예 5-8: 고추 형질전환

고추 유묘에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 진공펌프를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.5% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 자엽을 배분화 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 1.0 mg/L Zeatin, 0.5 mg/L IAA, 1.0 mg/L AgNO₃, 0.6% 아가, pH5.6, 250 mg/L 카르베니실린)에 치상하고, 26±1℃ 온도와 4,000 Lux 조도에서 16시간 광조건에서 3주 동안 광배양 하여 신초의 발생을 유도하였다. 신장된 신초를 발근 배지(MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 0.6% 아가,250 mg/L 카르베니실린, pH5.6)에 이식하여 2주일 동안 배양하고, 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하였다.

실시예 5-8: 수박 형질전환

수박 유묘에 실시예 2에서 기술한 바와 같이 바이너리 벡터 pRD400mf(참조: 도 4)에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens GV3101(Mp90); Plant-cell-rep., 15(11) : 799-803 (1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)과 0.2㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린과 함께 실시예 3과 같이 진공펌프를 이용하여 주입하였다. 주입 후 3일이 경과한 후 0.5% 하이퍼클로라이드로 10분간 표면 살균 후 3회 수세하여 재분화 배지에 치상하였다. 자엽은 배지(MSB5, BAP 2 mg/L, 3.0% Sucrose, 0.5 g/L MES, 0.4% phytagel, pH 5.6, 카베니실린 500 mg/L)에 치상 후 7일간 25℃±1℃에서 4주간 배양하여 신초를 선발하였다. 신장된 신초를 발근 배지(MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 0.6% 아가, 500 mg/L 카르베니실린, pH5.6)에 이식하여 2주일 동안 배양하고, 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하였다.

실시예 5: 형질전환체의 확인

발근배지에서 발근된 형질전환 추정체를 선발하여 PCR 분석으로 형질전환체를 다음과 같이 확인하였다: 우선, 상기 실시예 4에서 선별된 형질전환체로부터 PCR 분석을 할 DNA를 다음과 같이 수득하였다. PCR 분석을 위한 식물체 지놈 DNA의 분리는 Edwards 방법 (Nucleic Acids Research, 19:1349(1991))에 의하여 추출하였다.

PCR 분석에서 사용된 프라이머는 아그로박테리움 튜머페이션스에 있는 벡터의 nptⅡ 유전자 (네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 Ⅱ를 인코딩)에 대한 것으로서, 전방향 프라이머는 5'-GAT GGA GTG CAC GCA GGT-3'이고, 역방향 프라이머는 5'-TCA GAA GAA CTC GTC AAG-3'이다. PCR 반응은 총반응액 25 ㎕당 10x 반응 완충액(베링거만하임사, 2.5 mM Mg²⁺함유, pH7.5) 2.5 ㎕, dNTP's 혼합물(10 mM) 2.0 ㎕, 주형 DNA 1 ㎕ 및 Taq 중합효소(5 U/㎕) 0.25 ㎕를 혼합하여 사용하였다. 반응은 94℃에서 1분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72'C에서 10분간 연장반응을 하였고, 반응 산물은 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다 (참조: 도 6). 도 4에서 M 레인은 1 kb 레더, 1 레인-5 레인은 본 발명의 식물 형질전환체의 DNA 그리고 6 레인은 야생형 식물의 DNA 시료에 대한 것이다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 실시예 4에서 선별된 형질전환체의 지놈 DNA를 이용한 PCR에서 약 0.8 kb의 GUS 유전자 단편이 증폭되었음을 알 수 있다. 따라서, 실시예 4에서 선별된 형질전환체는 본 발명의 형질전환법에 의해 형질전환되어, 그 지놈 DNA 상에 외래 유전자를 갖게 되었음을 확인할 수 있다.

본 발명은 아그로박테리움 튜머페이션스에 성장조절제를 첨가하여 물리적으로 식물체의 잎이나 전체에 주입하는 방식을 통하여 형질전환율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 전체세포에 아그로박테리움을 전달함으로써 형질전환된 세포에서 재분화될 가능성을 증가시킴으로써 항생제 선발마커를 사용하지 않고 목적하는 유전자만을 식물체에 전달할 수 있는 방법을 개발하였다. 또한 아그로박테리움 튜머페이션스을 물리적 주입에 의한 식물 형질전환체의 제조방법에 의해 제조된 식물 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 식물 형질전환체의 제조방법은 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 작업 시간 감축, 배지 사용양 감소, 아그로박테리움 과성장 방지 등의 장점이 있다.

도 1은 주사기를 이용하여 아그로박테리움을 주입한 후 주입부위에 목적하는 유전자가 전이되었는지를 알아보기 위한 GUS 분석 사진;

도 2는 각종 식물 잎의 대부분 세포에서 외래유전자 GUS가 발현되고 있는 사진;

도 3은 각종 식물들이 재분화배지에서 신초가 생성되는 사진;

도 4는 본 발명에 이용된 바이너리 마커-프리 벡터 pRD400mf의 유전자 지도;

도 5는 본 발명의 각종 형질전환체들의 기내 정식된 양상 및 발근된 양상을 나타내는 사진; 및

도 6은 본 발명의 각종 형질전환체를 확인하는 PCR 결과를 나타내는 겔 사진.

Claims

다음의 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법:

(ⅰ) 형질전환에 사용되는 아그로박테리움을 BA와 아세토실린곤을 함유한 10mM Mgcl2에 현탁하여 식물 조직의 활성을 증가시키고 재분화율을 증가시키는 방법; (ⅱ) 기내뿐만 아니라 온실에서 자란 식물체에 주사기 혹은 진공펌프를 이용하여 아그로박테리움 현탁액을 식물체에 주입하고 배양하는 방식: (a) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; (c) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; (ⅲ) 항생제 등의 선발마커를 제거한 벡터를 사용함으로써 기존의 거부감을 주었던 선발마커 없이 실시하는 형질전환법; (ⅳ) 상기 감염된 식물 조직을 6-벤질아미노퓨린, 키네틴, 제아틴 및 이소펜틸아데노신 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 시토키닌 2.0-1.0 ㎎/ℓ; MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지; 에너지원인 당; 그리고 비타민을 포함하는 재분화 배지에서 재분화시키는 단계; 그리고, (ⅴ) 상기 재분화 단계에서 형성된 신초를 1-나프탈렌아세트산, 인돌아세트산 및 (2,4-디클로로페녹시) 아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 옥신계 성장 조절제 1-나프탈렌아세트산 0.1㎎/ℓ; MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지; 에너지원인 당; 그리고 비타민을 포함하는 발근배지에서 발근시키는 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법.
다음의 단계를 포함하는 식물 형질전환체의 제조방법:

(ⅰ) 식물의 어린 유묘나 성체의 일부 혹은 식물체 전체에 아그로박테리움을 물리적인 힘을 가하여 주입하여 상처부위뿐만 아니라 잎 혹은 식물체 전체에 아그로박테리움을 주입하여 형질전환율을 증가시키는 방법

(ⅱ) 상기 발아에 의해 형성된 자엽의 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 식물 조직을 감염시키는 단계: (a) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; (c) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; 및 (d) 항생제 선발하지 않음; 그리고,

(ⅲ) 상기 감염된 식물 조직을 2.0-1.0 ㎎/ℓ의 시토키닌 및 0.2-0 ㎎/ℓ의 옥신계 성장 조절제를 포함하는 배지에서 재분화시키는 단계.
음압 또는 양압을 이용하여 물리적으로 형질전환에 사용되는 모든 조직에 아그로박테리움을 주입함과 동시에 항생제 선발마커를 포함하지 않은 형질전환 벡터를 이용함으로써, 식물체에 항생제 저항성 유전자나 제초제 저항성 유전자 등 위험의 잠재력을 가진 유전자를 전달하지 않고 목적하는 유전자만을 가진 형질전환체를 확보하는 방법
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린, 키네틴, 제아틴 및 이소펜틸아데노신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 식물 형질전환체의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 옥신계 성장 조절제는 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산 및 (2,4-디클로로페녹시) 아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 식물 형질전환체의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 시토키닌의 함량은 2.0-1.0 ㎎/ℓ이고, 상기 옥신계 성장 조절제의 함량은 0.1 ㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 식물 형질전환체의 제조방법.
제 5 항에 있어서, 상기 시토키닌의 함량은 2.0 ㎎/ℓ이고, 상기 옥신계 성장 조절제의 함량은 0.1 ㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 식물 형질전환체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 형질전환을 위한 아그로박테리움 현탁과정에서 사이토키닌계 성장조절제를 사용하여 식물에 주입하는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환체의 제조방법.
제 1항과 제 7항에 있어서, 아그로박테리움을 10mM Mgcl2에 현탁하고 아세토시린곤과 사이토닌계 호르몬을 첨부하여 아그로박테리움 현탁액을 제조하는 방법.
제 1항 및 7항에 있어서, 식물체내로 아그로박테리움 전달하는 방식을 주사기나 진공펌프 등의 양압 또는 음압 등의 물리적인 힘을 이용하여 식물체내 조직 전체로 주입하는 방법.
제 1 항에서 아그로박테리움을 키우는 과정에서 pH 5.6로 맞춰 아그로박테리움의 vir 유전자의 활성을 유도하고 T-DNA 전달 능력을 향상시키는 방법
아그로박테리움에 식물체의 감염이 식물체의 상처부위뿐만 아니라 잎 혹은 식물체 전체의 세포들에 모두 감염시킴으로써 형질전환율을 증가시키는 방법
상기 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 제조된 식물 형질전환체.
상기 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 제조된 고추, 배추, 무, 참외, 오이, 수박, 유채, 담배, 벼 등의 식물 형질전환체.