KR101317891B1

KR101317891B1 - 발아초기 종자 이용 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR101317891B1
Application number: KR1020110114678A
Authority: KR
Inventors: 조용구; 이혜정; 이 압둘라 사일리라; 윤웅한; 박성한
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2013-10-11
Also published as: WO2013066007A1; KR20130049578A

Abstract

본 발명은 형질전환 벼 식물체의 제조 방법에 있어서, (a) 종피가 제거된 벼 성숙 종자를 액체 배지에 18~30시간 동안 침종시키는 단계; (b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양 배지에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계; (c) 상기 공동배양한 식물세포를 캘러스 유도 배지에서 5~10일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 벼 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

Description

발아초기 종자 이용 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 {High-efficiency and rapid method for producing transgenic rice plant using germinating rice seeds and the plant thereof}

본 발명은 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 형질전환 벼 식물체의 제조 방법에 있어서, (a) 종피가 제거된 벼 성숙 종자를 액체 배지에 18~30시간 동안 침종시키는 단계; (b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양 배지에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계; (c) 상기 공동배양한 식물세포를 캘러스 유도 배지에서 5~10일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 벼 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

벼는 세계적으로도 중요한 농산물로서 세계 총생산량의 약 92%는 아시아 여러 나라에서 생산되며, 대부분 아시아 사람들이 소비하고 있다. 그러나, 최근에는 밀가루와 육류 섭취가 많아 비만과 성인병 환자가 많은 미국과 유럽에서도 쌀을 소비하는 인구가 급격히 많아지고 있다. 또한 최근 벼의 염기서열 분석이 완료됨에 따라 유전자의 기능 연구나 단자엽 식물에서 유전자의 작용을 규명하기 위한 모델식물로 이용되는 등 그 중요성이 점차 증가되고 있다.

기존에 사용된 전통 육종 방식은 시간이 오래 걸리고 효율이 낮은 단점을 갖고 있기 때문에 최근 유전공학적 분자 육종 방법을 적용하여 새로운 형질을 가지는 신품종을 개발하려는 노력이 증가되고 있다. 형질전환을 통한 분자 육종 방법은 목표하는 유전자를 직접 식물체 내로 도입이 가능하다는 점과 원하는 다양한 유용 유전자를 식물체에 이식할 수 있는 장점을 가지고 있다. 목표 유전자를 식물체 내로 형질전환하는 방법은 미세입자 투사 방법과 아그로박테리움법이 가장 일반적으로 사용되고 있는 방법이다. 미세입자 투사 방법은 미세입자에 코팅된 DNA를 유전자 총을 이용하여 식물 세포에 직접 전이하는 방법으로 식물 세포에 삽입되는 방법으로 도입 유전자의 복제수가 많고 도입 유전자의 재배열 현상 및 유전자 침묵 (gene silencing)이 일어나는 등의 문제점을 가지고 있다 (Makarevitch I. et al. (2003) Plant Mol Biol. 52:421-432). 이러한 문제점으로 인해 효율적인 식물 형질전환 방법으로 아그로박테리움을 이용하는 방법이 주로 사용되고 있다.

아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법은 식물 병원균인 아그로박테리움이 지니고 있는 Ti 플라스미드의 T-DNA 영역이 식물세포로 전이되는 성질을 이용하여 형질전환하는 것으로 아그로박테리움을 식물세포에 접촉시키는 접종, 아그로박테리움과 식물세포를 함께 배양하여 T-DNA 전이가 이루어지게 하는 공동배양, 선발마커가 포함된 배지에서 형질전환 세포를 선발하는 과정과 선발된 세포를 증식하고 재분화 식물체를 유도하는 과정 등을 포함한다. 그러나 아그로박테리움을 이용해서 형질전환을 하는 경우 형질전환체를 얻기 위해 소요되는 시간이 매우 길며, 기간이 길어질수록 배양에 따른 변이체가 발생할 가능성이 있기 때문에, 아그로박테리움을 이용해 형질전환할 때 짧은 시간에 성공시키는 것이 필요하다.

한편, 한국특허공개 제2010-0034090호에는 억새 성숙종자로부터 배발생 캘러스 유도 및 식물체 재분화 방법이 기재되어 있고, 한국특허등록 제2011-0026054호에는 약배양과 여교잡 기술을 이용한 우량 벼 형질전환체의 단기생산법이 기재되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 24시간 동안 침종시켜 분화되기 시작한 벼 종자에 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스를 접종하여 7일간 공동배양한 뒤 7일간 캘러스를 유도하는 단계를 가짐으로써, 기존의 캘러스 유도 기간을 대략 4~5주 가진 후 아그로박테리움과 5일간 공동배양하여 형질전환시키는 방법보다 2개월 이상의 기간을 단축시킬 수 있고, 또한 체세포 변이체 발생율을 최소화하는 장점을 갖는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은

형질전환 벼 식물체의 제조 방법에 있어서,

(a) 종피가 제거된 벼 성숙 종자를 액체 배지에 18~30시간 동안 침종시키는 단계;

(b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양 배지에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계;

(c) 상기 공동배양한 식물세포를 캘러스 유도 배지에서 5~10일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

(b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스를 공동배양 배지에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계;

(c) 상기 공동배양한 식물세포를 캘러스 유도 배지에서 5~10일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

(d) 상기 유도된 캘러스를 항생제가 첨가된 선발 배지에서 선발하는 단계; 및

(e) 상기 선발된 벼 세포를 재분화 배지에서 재분화시키는 단계를 포함하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 벼 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명은 캘러스를 얻기 위해 소요되는 시간을 단축 시키는데 매우 효과적이며, 배양에 따른 변이체의 발생률을 최소화할 수 있어 아그로박테리움을 이용한 고효율의 형질전환 벼 식물체를 제조하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 형질전환에 이용된 벡터를 나타낸다.
도 2는 아그로박테리움 내로의 형질전환 여부를 확인하기 위한 콜로니 PCR 결과를 나타낸다.
도 3은 30℃, 암조건에서 N6 배지에 침종 24시간 후 모습을 나타낸다.
도 4는 고품벼 종자를 N6D 액체배지에서 침종한 후 아그로박테리움을 접종하기 전 모습을 나타낸다. 숫자는 2,4-D 농도 (㎎/ℓ)를 나타낸다.
도 5는 목표유전자를 아그로박테리움을 이용하여 접종한 후 2N6-AS 배지에 치상한 모습을 나타낸다 (좌: 고품벼, 우: 일품벼).
도 6은 목표유전자를 아그로박테리움을 이용해 고품벼 발아종자에 접종한 후 2,4-D 농도에 따른 캘러스의 형성을 비교한 결과이다 (0, 1, 2, 3, 4 - 2,4-D 농도 (㎎/ℓ))
도 7은 목표유전자를 아그로박테리움을 이용하여 형질전환한 후 선발배지에서 캘러스를 증식시킨 후 SF 배지에서 재분화를 유도한 결과를 나타낸다 (위: green spot 형성, 아래: 재분화체 형성).
도 8은 SF 배지에서 재분화가 유도된 식물체를 RF 배지에서 뿌리를 유도 (A, B) 한 후 온실에 순화시키는 과정 (C)을 나타낸다.
도 9는 PCR을 이용하여 목표 유전자의 형질전환 여부를 확인한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

형질전환 벼 식물체의 제조 방법에 있어서,

(b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양 배지에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계;

본 발명은 24시간 동안 침종시켜 분화되기 시작한 벼 종자에 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스를 접종하여 7일간 공동배양한 뒤 7일간 캘러스를 유도하는 단계를 가짐으로써, 기존의 캘러스 유도 기간을 대략 4~5주 가진 후 아그로박테리움과 5일간 공동배양하여 형질전환시키는 방법보다 1~2개월의 기간을 단축시킬 수 있고, 또한 체세포 변이체 발생율을 최소화하는 장점을 갖는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법에서, 상기 (a) 단계의 침종은 바람직하게는 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 28~32℃ 암조건에서 18~30시간 동안 수행하는 것이고, 가장 바람직하게는 3 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 30℃ 암조건에서 24시간 동안 수행하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 배지의 조성은 하기 표 2에 기재되어 있으며, 본 발명의 N6D 및 2N6-AS 배지는 당업계에 캘러스 증식 배지로 사용되는 N6 배지를 기본으로 하여 제조하였으며, 2,4-D 및 L-프롤린이 첨가된 N6 배지는 N6D 배지이고, 글루코스, 아세토시린곤, DTT 및 AgNO₃가 첨가된 N6 배지는 2N6-AS 배지이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법에서, 상기 (b) 단계의 공동배양은 바람직하게는 1~10 g/ℓ 젤라이트, 0.7~1.3 mM DTT (dithiothreitol), 2.5~3.5 ㎎/ℓ AgNO₃, 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D 및 5~25 ㎎/ℓ 아세토시린곤이 포함된 N6 배지에 치상하여 23~27℃에서 5~10일 동안 수행하는 것이고, 가장 바람직하게는 5 g/ℓ 젤라이트, 1 mM DTT (dithiothreitol), 3 ㎎/ℓ AgNO₃, 3 ㎎/ℓ 2,4-D 및 15 ㎎/ℓ 아세토시린곤이 포함된 N6 배지에 치상하여 25℃에서 7일 동안 수행하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법에서, 상기 (c) 단계의 캘러스의 유도는 바람직하게는 300~500 ㎎/ℓ 카베니실린 및 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 포함된 N6 배지에서 30~34℃에서 5~10일 동안 수행하는 것이고, 가장 바람직하게는 400 ㎎/ℓ 카베니실린 및 3 ㎎/ℓ 2,4-D가 포함된 N6 배지에서 32℃에서 7일 동안 수행하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 벼 식물체의 제조 방법에서, 상기 (b)의 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은

본 발명의 일 구현 예에 따른 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법에서, (a) 단계의 침종은 바람직하게는 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 28~32℃ 암조건에서 18~30시간 동안 수행하는 것이고, 가장 바람직하게는 3 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 30℃ 암조건에서 24시간 동안 수행하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법에서, 상기 (d) 단계의 선발은 바람직하게는 40~60 ㎎/ℓ 하이그로마이신, 350~450 ㎎/ℓ 카베니실린 및 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에서 30~34℃에서 10~18일 동안 배양하는 것이고, 가장 바람직하게는 50 ㎎/ℓ 하이그로마이신, 400 ㎎/ℓ카베니실린 및 3 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에서 32℃에서 14일 동안 배양하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 본 발명의 일 구현예에 따른 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법은 바람직하게는

(a) 종피가 제거된 벼 성숙 종자를 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 28~32℃ 암조건에서 18~30시간 동안 침종시키는 단계;

(b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스를 1~10 g/ℓ 젤라이트, 0.7~1.3 mM DTT, 2.5~3.5 ㎎/ℓ AgNO₃, 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D 및 5~25 ㎎/ℓ 아세토시린곤이 포함된 N6 배지에 치상하여 23~27℃에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계;

(c) 상기 공동배양한 식물세포를 300~500 ㎎/ℓ 카베니실린 및 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 포함된 N6 배지에서 30~34℃에서 5~10일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

(d) 상기 유도된 캘러스를 40~60 ㎎/ℓ 하이그로마이신, 350~450 ㎎/ℓ 카베니실린 및 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에서 30~34℃에서 10~18일 동안 배양하여 선발하는 단계; 및

(e) 상기 선발된 벼 세포를 재분화 배지에서 재분화시키는 단계를 포함할 수 있으며,

가장 바람직하게는

(a) 종피가 제거된 벼 성숙 종자를 3 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 30℃ 암조건에서 2일 동안 침종시키는 단계;

(b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스를 5 g/ℓ 젤라이트, 1 mM DTT, 3 ㎎/ℓ AgNO₃, 3 ㎎/ℓ 2,4-D 및 15 ㎎/ℓ 아세토시린곤이 포함된 N6 배지에 치상하여 25℃에서 7일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계;

(c) 상기 공동배양한 식물세포를 400 ㎎/ℓ 카베니실린 및 3 ㎎/ℓ 2,4-D가 포함된 N6 배지에서 32℃에서 7일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

(d) 상기 유도된 캘러스를 50 ㎎/ℓ 하이그로마이신, 400 ㎎/ℓ 카베니실린 및 3 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에서 32℃에서 14일 동안 배양하여 선발하는 단계; 및

(e) 상기 선발된 벼 세포를 재분화 배지에서 재분화시키는 단계를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. CIPK15 발현 운반체의 제작 및 이를 포함하는 형질전환 아그로박테리움

단기형질전환 방법을 확립하기에 앞서 목표 유전자인 CIPK15 발현 운반체를 제작하였고, 이를 아그로박테리움에 도입하였다. 운반체 제작은 pCAMBIA1300 벡터를 모벡터로 사용하여 유전자를 도입하였다. 목표유전자의 발현을 위해서 CaMV 35S 프로모터가 사용되었다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 하이그로마이신 저항성 유전자를 이용하였다. 실험에 사용된 운반체의 모식도는 도 1과 같다. 아그로박테리움내로의 형질전환 여부는 콜로니 PCR을 이용하여 확인하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 중합, 72℃에서 2분 동안 신장반응을 30회 반복 후 72℃에서 10분간 신장 반응하도록 하였다. 증폭된 산물은 1% 아가로스 젤로 확인하였다. 도 2는 실험에 사용된 형질전환용 운반체를 아그로박테리움에 형질전환하고 콜로니 PCR을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. 선발된 8개의 콜로니가 모두 사용한 프라이머의 기대 크기인 1,332 bp 위치에서 밴드를 나타내어 목표유전자가 아그로박테리움에 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었다. 형질전환이 확인된 아그로박테리움 콜로니를 증식시켜 형질전환에 이용하였다.

실시예 2. 벼 종자의 멸균 및 침종

단기 형질전환법 확립을 위해 공시품종으로는 고품벼와 일품벼를 사용하였다. 완숙종자의 종피를 제거한 다음 70% 에탄올에 1분간 세척한 후 멸균수로 1회 세척한다. 그 후 50% 락스 용액으로 상온에서 10분씩 2회 소독한 후 멸균수로 10회 이상 세척하여 멸균 처리하였다. 멸균된 종자는 2,4-D가 다양한 농도 (0, 1, 2, 3, 4 ㎎/ℓ)로 포함된 N6D 액체 배지에 담가 30℃ 암조건에서 24시간 침종하였다 (도 3). 24시간 후에 페트리 디쉬에 여과지를 깔고 종자를 약간 건조한다 (도 4).

실시예 3. 형질전환된 아그로박테리움의 준비

초저온냉장고에서 글리세롤 스탁으로 저장되어 있는 재조합 플라스미드가 형질전환된 아그로박테리움을 꺼내 하이그로마이신, 스트렙토마이신이 포함된 AB-KS 액체배지에 2일간 증식한 후 동일한 고체배지에 스트리킹하여 28℃ 암조건에서 2일간 배양하였다. 배양이 끝난 아그로박테리움을 멸균된 루프를 이용하여 긁어내어 15ml AAM 배지가 담긴 50ml 튜브에 옮겨 담았다. 그 후 아그로박테리움이 잘 현탁될 때까지 볼텍싱하였고, 최종 접종 농도는 OD₆₅₀nm에서 0.3이 되도록 하였다.

실시예 4. 침종시킨 종자와 아그로박테리움의 공동배양

침종 24시간이 지난 후 배 부분이 부풀어 오르며 분화가 되기 시작한 종자를 15ml의 아그로박테리움 현탁액이 담겨있는 튜브에 담가 약 20분간 접종한 다음 멸균한 필터페이퍼 위에 종자를 올려놓아 여분의 아그로박테리움을 제거하였다. 여분의 아그로박테리움을 제거한 후에 1mM DTT (dithiothreitol), 3㎎/ℓ AgNO₃ (silver nitrate), 5 g/ℓ 젤라이트가 포함된 멸균된 2N6-AS 배지 위에 접종한 종자를 치상한 다음 25℃ 암조건에서 7일간 공동 배양하였다 (도 5). 7일간의 공동배양 후 호르몬에 따른 캘러스 형성율을 살펴본 결과 표 1과 같았다. 아그로박테리움을 접종하지 않은 무처리구에 비해 캘러스 형성율이 낮았으나, 2,4-D를 3㎎/ℓ 처리한 처리구의 경우 무 처리구와 비교했을 때 캘러스 형성율이 거의 비슷한 결과를 보였다. 또한 호르몬 처리 농도에 따라 캘러스 형성율도 다르게 나타났다 (도 6). 이 결과를 종합해 볼 때 종자를 소독하여 캘러스 형성 액체 배지에 1일간 침종 한 후 접종하는 방법의 형질전환법을 이용할 때는 2,4-D 농도가 3 ㎎/ℓ인 것이 효율적인 것으로 판단되며 이와 같은 조건에서는 균을 접종하지 않았을 때와 동일한 정도의 캘러스 형성이 가능하다.

실시예 5. 형질전환된 식물세포의 캘러스 유도 및 식물체의 재분화

2N6-AS 배지에서 7일간 공동 배양한 종자를 아그로박테리움을 제거하기 위해 500 ㎎/ℓ 카베니실린이 포함된 멸균수로 10회 이상 세척한 다음 멸균된 필터페이퍼로 간단히 수분을 제거한 뒤 캘러스 증식을 위해 400 ㎎/ℓ 카베니실린이 포함된 N6D 배지에 옮겨 32℃ 지속 광조건으로 1주 동안 배양하였다. 접종 이후의 실험은 2,4-D 농도를 고려하지 않고 수행하였다. 1주 후 유전자가 삽입된 캘러스 선발을 위해 50 ㎎/ℓ 하이그로마이신과 400 ㎎/ℓ 카베니실린이 포함된 N6D 배지에 옮겨 32℃ 지속 광조건으로 2주 동안 배양하였다. 배반으로부터 왕성하게 증식하는 캘러스를 SF (shooting formation) 배지로 옮겨 식물체의 재분화를 유도하였다 (도 7). 약 3주의 배양기간 후 지상부가 재분화된 식물체를 RF (rooting formation) 배지로 옮겨 뿌리 발생을 유도하였으며 순화된 벼 형질전환 식물체를 온실에서 포트에 이식하여 재배하였다. 고품벼는 형질전환 캘러스 115개 중 총 27개의 형질전환 식물체를 얻어 23.5%의 높은 형질전환 효율을 보였다 (도 8).

실시예 6. 형질전환 식물체의 확인

형질전환이 성공적으로 이루어졌는지를 확인하기 위해 PCR 방법을 이용하였다. 유전자가 형질전환된 벼 T0 식물체의 어린잎에서 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 주형으로 하여 목표유전자를 증폭하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 보다 정확한 PCR을 위해 정방향 프라이머를 CaMV 35S 프로모터의 3' 말단에서 디자인하였고, 역방향 프라이머는 목적 유전자에서 디자인하였다. PCR 반응을 위해서 벼 게놈 DNA는 100ng을 이용하였고, PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 중합, 72℃에서 2분 동안 신장반응을 30회 반복 후 72℃에서 10분간 신장 반응하도록 하였다. 증폭된 산물은 1% 아가로스 젤로 확인하였다. 목표 유전자를 고품벼 캘러스에 접종하고 단기형질전환 방법을 이용하여 유도된 형질전환 T0 식물체 35개 중 8개를 무작위로 선발하여 PCR한 결과 모두 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었다 (도 9).

Claims

형질전환 벼 식물체의 제조 방법에 있어서,
(a) 종피가 제거된 벼 성숙 종자를 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 28~32℃ 암조건에서 18~30시간 동안 침종시키는 단계;
(b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양 배지에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계; 및
(c) 상기 공동배양한 식물세포를 캘러스 유도 배지에서 5~10일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 공동배양은 1~10 g/ℓ 젤라이트, 0.7~1.3 mM DTT (dithiothreitol), 2.5~3.5 ㎎/ℓ AgNO₃, 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D 및 5~25 ㎎/ℓ 아세토시린곤이 포함된 N6 배지에 치상하여 23~27℃에서 5~10일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 캘러스의 유도는 300~500 ㎎/ℓ 카베니실린 및 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 포함된 N6 배지에서 30~34℃에서 5~10일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
(a) 종피가 제거된 벼 성숙 종자를 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 28~32℃ 암조건에서 18~30시간 동안 침종시키는 단계;
(b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스를 공동배양 배지에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 공동배양한 식물세포를 캘러스 유도 배지에서 5~10일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
(d) 상기 유도된 캘러스를 항생제가 첨가된 선발 배지에서 선발하는 단계; 및
(e) 상기 선발된 벼 세포를 재분화 배지에서 재분화시키는 단계를 포함하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
삭제
제5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 공동배양은 1~10 g/ℓ 젤라이트, 0.7~1.3 mM DTT, 2.5~3.5 ㎎/ℓ AgNO₃, 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D 및 5~25 ㎎/ℓ 아세토시린곤이 포함된 N6 배지에 치상하여 23~27℃에서 5~10일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 (c) 단계의 캘러스의 유도는 300~500 ㎎/ℓ 카베니실린 및 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 포함된 N6 배지에서 30~34℃에서 5~10일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 (d) 단계의 선발은 40~60 ㎎/ℓ 하이그로마이신, 350~450 ㎎/ℓ 카베니실린 및 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에서 30~34℃에서 10~18일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
(a) 종피가 제거된 벼 성숙 종자를 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 액체 배지에 담가 28~32℃ 암조건에서 18~30시간 동안 침종시키는 단계;
(b) 상기 침종시킨 종자와 외래 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스를 1~10 g/ℓ 젤라이트, 0.7~1.3 mM DTT, 2.5~3.5 ㎎/ℓ AgNO₃, 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D 및 5~25 ㎎/ℓ 아세토시린곤이 포함된 N6 배지에 치상하여 23~27℃에서 5~10일 동안 공동배양하여 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 공동배양한 식물세포를 300~500 ㎎/ℓ 카베니실린 및 2.5~3.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 포함된 N6 배지에서 30~34℃에서 5~10일 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
(d) 상기 유도된 캘러스를 항생제가 첨가된 선발 배지에서 선발하는 단계; 및
(e) 상기 선발된 벼 세포를 재분화 배지에서 재분화시키는 단계를 포함하는 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 형질전환 벼 식물체.
제11항에 따른 식물체의 종자.