KR100974000B1

KR100974000B1 - 발아종자의 배축 분열조직을 이용한 콩의 형질전환방법

Info

Publication number: KR100974000B1
Application number: KR1020070128814A
Authority: KR
Inventors: 김율호; 이장용; 박향미; 신동범; 최만수; 채현실; 이인자
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2007-12-12
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2010-08-05
Also published as: KR20090061845A

Abstract

본 발명은 콩의 형질전환방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외래 목적 유전자 및 선발 마커 유전자를 포함하는 콩 형질전환용 발현벡터가 도입된 아그로박테리움을 배양하고 현탁액을 준비하는 단계; 상기 현탁액을 콩 발아 종자의 배축 절편에 접종시키고 공동 배양하는 단계; 상기 공동 배양된 배축 절편에서 형질전환된 신초를 유도 및 선발하는 단계; 상기 선발된 신초를 신장시키는 단계; 및 상기 신장시킨 신초에서 뿌리를 유도 및 순화하는 단계;로 이루어지는 콩의 형질전환방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 콩 품종 및 발아시간에 관계없이 형질전환 식물체의 제조를 가능하게 하여 형질전환이 어려운 국내 품종을 대상으로 형질전환 식물체를 생산할 수 있도록 한다. 또한, 형질전환 과정을 단순화함으로써 형질전환 과정이 간단하고 목표로 하는 형질전환 식물체를 빠른 기간 내에 생산할 수 있어 형질전환과정에서 소요되는 인력 및 비용을 절감할 수 있다.

콩, 아그로박테리움, 배축

Description

발아종자의 배축 분열조직을 이용한 콩의 형질전환방법{Transformation Method of Soybean using Meristematic Tissue of Germinating Seed}

본 발명은 발아종자의 배축(embryo axis) 조직을 사용하여 목적유전자를 효율적으로 콩에 형질전환시키는 방법에 관한 것으로서, 형질전환 전과정을 새로운 방법으로 개량함으로써 형질전환이 어려운 국내 품종을 대상으로 안정적으로 콩의 형질전환을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 콩 형질전환 방법을 이용하여 콩 품종 및 발아시간 등에 영향을 받지 않고 짧은 기간에 형질전환체를 개발하는 것이 가능하다.

콩은 단백질과 유지의 주요 공급원으로서 세계적으로 상업적 가치가 매우 높은 농작물이다. 콩의 산업적 가치를 높이기 위해 병, 해충저항성, 수량 및 품질 등의 주요 형질에 대한 개량이 지속적으로 이루어지고 있으며, 최근에는 형질전환기술을 이용한 분자 육종 방법을 적용하여 제초제 저항성, 해충저항성 및 아미노산 조성이 개량된 신품종 등이 활발히 개발되고 있다.

분자 육종 방법은 전통적인 교배 육종법에 비해 우수한 품종의 유전 형질을 그대로 유지하면서 목표로 하는 유용한 유전자를 직접 도입할 수 있다는 점과 다양 한 생물종으로부터 유용한 유전자를 확보하여 식물체에 이식할 수 있다는 장점이 있다. 형질전환기술을 이용한 분자 육종 방법을 성공적으로 콩에 적용하기 위해서는 재분화가 가능한 콩 조직을 분리하고 배양하는 방법, 분화가 일어나는 세포 내에 목적 유전자를 형질전환하는 방법 및 형질전환된 세포로부터 재분화 식물체를 유도하는 방법 등의 기반 기술이 요구된다.

재분화가 가능한 콩 조직으로는 하배축 부분이 처음으로 보고된 이후(Kimball & Bingham, Crop Sci. 13: 758-760, 1973) 자엽마디(Cheng 등, Plant Sci. Lett., 19:91-99, 1980), 줄기마디(Saka 등, Plant Sci. Lett., 19: 193-201, 1980), 상배축(Wright 등, Plant Cell Tissue Organ Cult. 8: 83-90, 1987), 초생엽(Wright 등, Plant Cell Rep., 6: 83-87, 1987), 자엽(Mante 등, In Vitro Cell, Dev. Biol. Plant 25: 385-388, 1989), 배축(McCabe 등, Bio/Technology 6:923-926, 1988) 등이 보고되었다.

현재 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법에 사용되는 기관발생(Organogenesis)을 통한 재분화 체계는 자엽마디와 배축 조직이 주로 이용되고 있다. 자엽마디를 이용한 콩 재분화 체계(자엽마디 이용법)는 아그로박테리움방법으로 최초의 형질전환 콩을 개발(Hinchee 등, Bio/Technology 6:915-922, 1988)하는데, 사용된 이후 형질전환 효율과 재현성을 높이기 위해 지속적으로 개량되어 왔다. 그러나 자엽마디 이용법은 형질전환 과정에서 고도의 숙련된 기술이 요구되어 세계적으로 방법이 확립된 일부 연구실에서만 사용되는 한계가 있다(Buhr 등, Plant J. 30: 155-163, 2002). 이러한 자엽마디 이용법의 기술적 제한으로 인해 최 근에는 배축을 이용한 재분화 체계(배축 이용법)가 형질전환에 활발히 적용되고 있다(Martinell 등, US Patent 6,384,301, 2002, Liu 등 Planta 219:1042-1049, 2004).

분화되는 콩 조직의 세포에 목적 유전자를 성공적으로 형질전환하는 방법은 지금까지 여러 가지가 보고되었으나, 최근에는 유전자총을 이용한 미세입자(microparticle) 투사방법과 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens)을 이용하는 방법 등이 가장 일반적으로 사용되고 있다.

미세입자 투사 방법은 유전자 총을 이용하여 미세입자에 코팅된 DNA를 배양된 체세포 배에 직접 전이하는 방법으로 기관발생을 통한 형질전환방법에 많이 발생하는 키메라 현상을 줄일 수 있다는 장점이 있어 형질전환 콩 개발에 많이 이용되어 왔다(Finer & McMullen, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 27: 175-182, 1991, Trick & Finer, Transgeic Res. 6: 329-336, 1997). 그러나 식물세포에 삽입되는 DNA 복제(copy) 수가 많다는 점, 삽입되는 양상의 복잡성 및 삽입 DNA가 절단된 형태로 전이되는 등의 문제점(De block M, Euphytica, 71: 1-14, 1993)으로 인해 최근에는 콩 형질전환방법으로 아그로박테리움을 이용하는 방법이 그 대안으로 제시되고 있다.

아그로박테리움을 이용한 형질전환방법은 식물 병원균인 아그로박테리움이 지니고 있는 Ti(tumor-inducing) 플라스미드 또는 Ri(Root-inducing) 플라스미드 상의 T-DNA 영역이 식물 세포에 전이되는 성질을 형질전환에 이용한 것으로, 콩 형질전환에는 자엽마디 이용 방법과 배축 이용 방법이 주로 사용되고 있다.

아그로박테리움을 이용한 콩 형질전환 방법은 지금까지 많은 연구를 통해 콩 형질전환에 활발히 적용되고 있으나 보편적으로 사용되기에는 아직까지 기술적 제한 요인이 남아 있다. 이러한 문제점으로 인해 기존의 콩 형질전환 방법을 국내 품종에 적용하여 형질전환체를 개발한 보고는 없는 실정이다. 따라서 국내 품종을 사용하여 안정적으로 형질전환 콩을 생산하기 위해서는 기술적으로 매우 쉽고 간단하며 신속하고 효율이 높은 형질전환 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자는 아그로박테리움 형질전환 방법의 하나인 배축 이용법을 대상으로 상기 목적의 효율적인 콩 형질전환 방법을 개발코자 형질전환 전 과정을 개선하는 방법을 연구하였으며 그 결과, 기존에 보고된 배축 이용법(Martinell 등, US Patent 6,384,301, 2002, Liu 등 Planta 219: 1042-1049, 2004)에서 필수조건으로 제시한 발아시간(Martinell 등 14시간, Liu 등 24시간 이내)의 한계를 25~120시간으로 늘임으로써 작업의 편의성과 효율을 최대한 높였으며, 아그로박테리움을 접종하기 전에 미리 분열조직을 배양하는 전 배양 과정과 공동배양이 끝난 다음 무선발배지에서 배양(Resting medium)하는 과정을 생략하여 형질전환 과정 및 소요시간을 단축하였다. 또한 형질전환체의 선발에 사용되는 선발마커(Martinell 등 EPSPS 유전자(제초제 글라이포세이트(glyphosate) 저항성) 및 NPTⅡ 유전자(카나마이신(kanamycin) 저항성), Liu 등 NPTⅡ 유전자 사용)로는 제초제 저항성인 bar 유전자를 사용함으로써 항생제 선발 마커의 문제점을 보완하고 기존 방법과도 차별화하였다. 또한 형질전환 각 단계별로 사용되는 배지의 조성을 국내 콩 품종에 맞게 조정함으로써 형질전환이 어려운 국내 품종을 대상으로 형질전환체를 개발하는 것이 가능함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 아그로박테리움을 이용한 콩 형질전환 방법의 하나인 배축 이용법을 대상으로 형질전환 전 과정을 개선함으로써 형질전환이 어려운 국내 콩 품종에 적합한 형질전환 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 외래 목적 유전자 및 선발 마커 유전자를 포함하는 콩 형질전환용 발현벡터가 도입된 아그로박테리움을 배양하고 현탁액을 준비하는 단계; 상기 현탁액을 콩 발아 종자의 배축 절편에 접종시키고 공동 배양하는 단계; 상기 공동 배양된 배축 절편에서 형질전환된 신초를 유도 및 선발하는 단계; 상기 선발된 신초를 신장시키는 단계; 및 상기 신장시킨 신초에서 뿌리를 유도 및 순화하는 단계;로 이루어지는 콩의 형질전환방법을 제공한다.

바람직하게, 상기 선발 마커 유전자는 bar 유전자인 콩의 형질전환방법을 제공한다.

또한 바람직하게, 상기 배축 절편은 정단부 및 측아 분열조직을 포함하며, 상기 배축 절편은 0.5~2㎝인 콩의 형질전환방법을 제공한다.

또한 바람직하게 상기 아그로박테리움을 상기 배축 절편에 접종하는 것은 콩 종자의 발아 후 120시간 이내에 이루어지는 콩의 형질전환방법을 제공한다.

바람직하게, 상기 아그로박테리움을 배양하는 배지 조성은 에이비(AB) 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 스펙티노마이신(spectinomycine) 50㎎/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10㎎/L 및 pH 7.0인 콩의 형질전환방법을 제공한다.

또한 바람직하게, 상기 아그로박테리움 현탁액 배지 조성은 1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 4.26g/L, Na₂·EDTA 1㎖/L, 수크로오스 30g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 200uM/L, 지에이쓰리(GA3) 0.25㎎/L, 비에이피(BAP) 5㎎/L 및 pH 5.2인 콩 형질전환방법을 제공한다.

또한 바람직하게, 상기 공동배양의 배지 조성은 1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 4.26g/L, Na₂·EDTA 1㎖/L, 수크로오스 30g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 200uM/L, 지에이쓰리(GA3) 0.25㎎/L, 비에이피(BAP) 5㎎/L, 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 1mM/L, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 1mM/L, 파이타-아가(phyta-agar) 5.5g/L 및 pH 5.2인 콩의 형질전환방법을 제공한다.

바람직하게, 상기 신초를 유도하는 위한 배지의 조성은 MS 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, Na₂·EDTA 10㎖/L, 황산 제1철(ferrous sulfate) 28㎎/L, 세포탁심(cefotaxime) 100㎎/L, 카베니실린(carbenicillin) 500㎎/L, 젤라이트(gelrite) 2.6g/L, 비에이피(BAP) 0.4㎎/L, 아이비에이(IBA) 100ug/L, L-포스피노트리신(L-phosphinotricine) 3~6㎎/L 및 pH 5.7인 콩의 형질전환방법을 제공한다.

또한 바람직하게, 상기 신초를 신장시키기 위한 배지의 조성은 MS 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, Na₂·EDTA 10㎖/L, 황산 제1철(ferrous sulfate) 28㎎/L, 세포탁심(cefotaxime) 100㎎/L, 카베니실린(carbenicillin) 500㎎/L, 젤라이트 2.6g/L, 지에이쓰리(GA3) 0.5㎎/L, 아이에이에이(IAA) 0.1㎎/L, Silver-nitrate 10㎎/L, 지아틴-리보사이드(Zeatin-riboside) 1㎎/L, 아스파라긴(Asparagine) 50㎎/L, 피로글루탐산(Pyroglutamic acid) 100㎎/L, L-포스피노트리신 3~6㎎/L 및 pH 5.7인 콩의 형질전환방법을 제공한다.

또한 바람직하게, 상기 뿌리를 유도하기 위한 배지의 조성은 1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, 수크로오스 20g/L, 아이비에이(IBA) 1㎎/L, 플랜트아가(plant agar) 8g/L, 활성탄 0.5g/L 및 pH 5.6인 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법을 제공한다.

상기 외래 목적 유전자는 식물, 동물 및 미생물 등 다른 종에서 유래한 유전자와 인공적으로 합성한 유전자 등 모든 유전자가 사용될 수 있다.

상기 목적 유전자가 도입된 콩 식물체를 효과적으로 선발하기 위한 선발인자로는 에이치피티(HPT; hygromycin phosphotransferase), 씨에이티(CAT; chloramphenicol acetyltransferase) 및 젠타마이신(gentamicin) 등의 항생제 내성 유전자; bar 유전자 등의 제초제 저항성 유전자; 및 지유에스(GUS; β-glucuronidase), 제에프피(GFP; green fluorescent protein) 및 엘유엑스(LUX; luciferase) 등의 표지유전자가 사용될 수 있다.

목적 유전자를 콩에서 발현시키기 위한 형질전환용 벡터는 식물세포에서 목적유전자의 RNA 염기서열을 생산하게 하는 프로모터(promoter), 목적으로 하는 유전자의 정보를 가지고 있는 구조 DNA 염기서열 및 식물세포에서 RNA 염기서열의 3’말단에 폴리아데닐화된 뉴클레오타이드(polyadenylated nucleotide)를 생산하는 기능을 하는 3’비전사(non-translated) DNA 염기서열 등으로 이루어진 구조를 적 어도 하나 이상 지니고 있다.

본 발명에서 상기 발현에 사용하는 프로모터는 식물세포에서 기능하는 모든 종류의 것이 이용될 수 있으며, 여기에는 목적유전자를 상시 또는 식물생육 기간 중 일정 시기에 발현되도록 하는 프로모터, 건조 등 스트레스 조건에서 발현되도록 하는 프로모터, 식물조직의 전신 및 특이 부분에만 발현하게 하는 프로모터 및 목적유전자의 발현을 높이기 위해 인핸서 서열(enhancer sequences)이 결합된 하이브리드(hybrid) 프로모터 등이 포함된다.

본 발명에서는 벼에서 분리한 상시발현 OsCc1 프로모터(Jang et al., Plant Physiol. 129: 1473-1481, 2002)와 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터를 주로 사용하였다. 본 발명에 사용된 재조합 플라스미드의 종류 및 제작방법은 실시예 1에서 더욱 상세히 설명한다.

목적 유전자를 식물세포 내에 하나 또는 그 이상 도입하기 위해 사용되는 아그로박테리움은 디스암(disarmed)된 Ti 또는 Ri 플라스미드를 가지는 것으로 옥토핀형(octopine-type) 계통인 엘비에이(LBA)4404나 숙신아모핀형(succinamopine-type) 계통인 이에이치에이(EHA)101 또는 이에이치에이(EHA)105 등 모든 아그로박테리움 계통이 본 발명에서 사용될 수 있다.

본 발명에서 형질전환을 위한 콩 목적조직으로는 발아종자의 정단부 및 측아 분열조직을 이용하였다. 발아종자에서 자엽을 제거하여 분리된 배축 조직의 경우 뿌리부분을 포함하고 있어 다른 목적조직인 잎이나 캘러스 등과는 달리 계속 신장하는 특성이 있다. 이러한 특성으로 인해 기존의 배축 이용법에서는 형질전환에 사 용되는 배축은 종자발아 후 24시간 이내의 것으로 엄격히 제한하였다.

그러나 본 발명에서는 배축 이용법의 주요 제한 요인인 발아시간의 한계를 극복하기 위해 분리된 배축 조직을 정단부에서 뿌리 방향으로 0.5~2㎝를 남기고 나머지 부분은 절단함으로써 발아시간이 길어짐에 따라 배축 조직이 신장되는 문제점을 해결하였다. 배축 조직의 절단 길이는 발아종자의 상태에 따라 달리하였으며 발아가 양호한 경우에는 짧게, 불량한 경우는 뿌리 끝부분만 절단하였다. 배축 조직을 절단하는 방법을 적용하여 목적조직의 신장을 억제함으로써 아그로박테리움과 콩 조직세포를 수 시간에서 수일 동안 함께 배양하여 T-DNA의 전이가 이루어지게 하는 공동배양 과정에서 목표 유전자의 세포내로의 전이가 최대한 이루어지게 하였다.

또한, 분리된 배축 조직을 아그로박테리움 현탁액에 접종하기 전에 미리 배양하는 전 배양을 생략하고 바로 접종함으로써 형질전환 과정에서의 노력, 비용 및 작업의 편의성을 높였다.

아그로박테리움 접종을 위한 최종 현탁액의 농도는 650㎚에서 흡광도가 2.0 이상이 되게 하였으며 본 실시의 예에서는 650㎚에서 흡광도 2.5～3.0의 고농도로 접종하였다.

공동배양 단계에 사용되는 배지로는 B5 기본배지 및 MS 기본배지 등의 식물배양용 배지가 모두 사용될 수 있으며, 식물 성장 호르몬, 비타민, 아미노산, 철 및 미량요소 등이 첨가될 수 있다. 또한, 공동배양 배지 위에 여과지를 1매 이상 덮는 처리가 포함될 수 있으며 겔 형성제(Gelling agent)로는 파이타-아가(phyta- agar) 또는 젤라이트(gelrite; phytagel) 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 공동배양배지로 1/2 B5 배지를 사용하였고, 첨가되는 파이타-아가(phyta-agar)의 양은 4.5～6g/L로 하였으며, 최적량은 5.5g/L로 완성된 배지 위에 여과지를 덮고 그 위에 아그로박테리움이 접종된 콩 조직을 두었다.

콩 목적조직 세포의 산화적 파괴를 최소화하는 방법으로 공동배양 배지 내에 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 및 디티오트레이톨(dithiothreitol) 등 항산화 화합물을 한 종 또는 그 이상 첨가하는 처리하는 과정이 포함될 수 있다. 상기 항산화 화합물의 함량은 배지 조성에 대하여 티오황산나트륨이 0.1～5mM 및 디티오트레이톨이 0.1～5mM 정도가 바람직하다.

공동배양 과정에서의 처리 온도는 23～28℃ 범위에서 3℃ 차이로 변온하였으며, 먼저 26～28℃ 온도에서 하루를 처리한 후 23～25℃의 온도로 변경하여 나머지 기간을 처리하였다. 공동배양기간은 아그로박테리움의 종류에 따라 조절하여 처리하는 것이 가능하며, 본 실시의 예에서는 7일 동안 처리하였다.

공동배양이 끝난 배축 조직에 남아 있는 아그로박테리움을 제거하기 위해 세포탁심과 카베니실린이 포함된 현탁액으로 세척하였다. 이 과정이 끝난 배축 조직은 선발마커가 들어 있지 않는 배지(resting medium)에서 일정기간 치상하는 과정을 생략하고 선발마커가 포함된 배지에 바로 치상함으로써 형질전환 신초의 유도 및 선발 기간을 단축하였다.

형질전환 신초를 유도하기 위한 선발마커로는 제초제인 포스피노트리신(phosphinotricine)을 사용하였다. 지금까지 배축 이용법에 사용된 선발마커로는 항생제인 카나마이신과 제초제인 글루포시네이트 등 2종이 보고되었으나 본 발명에서는 배축 이용법에 포스피노트리신을 처음으로 적용하여 기존 방법과 차별화하였다. 배지에 첨가되는 포스피노트리신의 함량은 3～6mg/L로 하였으며, 적정량은 6mg/L 이었다

또한, 형질전환된 신초의 유도를 위해서 식물 성장 호르몬인 비에이피(BAP)와 아이비에이(IBA)를 배지에 첨가하였으며, 함량은 비에이피 0.4mg/L, 아이비에이 100ug/L로 하였다.

상기 선발된 신초의 신장단계에서 치상배지에는 지에이쓰리(GA3; gibberellic acid) 0.1～5㎎/L, 아이에이에이(IAA; indole acetic acid) 0.1～1㎎/L, 질산은(silver-nitrate) 5~20㎎/L 및 지아틴-리보사이드(zeatin-riboside) 0.1~3㎎/L 등을 배지 조성에 포함하였다.

상기 신장된 신초의 뿌리 유도단계에서 효과적인 뿌리의 유도를 위해 신장된 신초를 아이비에이(IBA) 2mg/mL의 고농도 스탁 용액에 1분 이상 침지하였으며, 가장 바람직하게는 6분 침지하였다. 또한, 뿌리 유도 배지로는 1/2 B5배지를 사용하였으며, 활성탄 0.5g/L, 아이비에이(IBA) 1mg/L, 수크로오즈(sucrose) 20g/L 및 플랜트-아가(plant-agar) 8g/L 등을 배지 조성에 포함하였다.

따라서 본 발명은 효과적인 콩 형질전환 방법을 제공한다. 본 발명의 형질전환 방법은 콩 품종 및 발아시간에 관계없이 형질전환 식물체의 제조를 가능하게 하여 형질전환이 어려운 국내 품종을 대상으로 형질전환 식물체를 생산할 수 있도록 한다. 또한, 형질전환 과정을 단순화함으로써 형질전환 과정이 간단하고 목표로 하는 형질전환 식물체를 빠른 기간 내에 생산할 수 있어 형질전환과정에서 소요되는 인력 및 비용을 절감할 수 있다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 형질전환을 위한 운반체의 제작 및 아그로박테리움에의 도입

본 발명에 의한 방법으로 콩 형질전환을 하기 위해 GUS 발현 운반체를 포함 모두 3종의 운반체를 제작하였고, 이를 각각 아그로박테리움에 도입하였다.

인트론이 포함된 GUS 유전자는 pCAMBIA 3301 벡터에서 클로닝하여 사용하였으며, 분리된 유전자는 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pSB11 벡터(Komari et al., Plant J. 10: 165-174, 1996)에 도입하였다. 유전자의 도입이 확인된 형질전환용 운반체는 pMJC-GB-GUS로 명명하였으며 본 발명에 포함된 형질전환 방법의 형질전환 정도를 확인하는데 사용하였다.

주 벡터로는 pSB11 바이너리(binary) 벡터가 이용되었으며 GUS 유전자의 발현을 위해서 벼에서 분리한 상시발현 OsCc1 프로모터(Jang et al., Plant Physiol. 129: 1473-1481, 2002)가 사용되었다. 형질전환된 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 Bar(Bialaphos resistance) 유전자를 이용하였으며 양쪽 보더(border) 안쪽으로 MAR(Matrix attachment region)를 추가하여 유전자의 안정적인 발현을 유도하였다. 상기 재조합된 플라스미드 pMJC-GB-GUS의 주요 유전자 배열은 도 1에 나타내었다. 도 1에서 각 부호의 약어는 다음과 같다:

OsCc1(OsCc1 promoter), Intron-GUS(GUS coding region with intron insertion), 3'Pinll(Pin-Ⅱ terminator), 35S pro.(CaMV 35S promoter), 3'Nos(Nos terminator), Bar(bar coding region), MAR(Matrix attachment region).

본 발명에 의한 방법이 실제 콩 형질전환에서도 효율적으로 적용 가능한지를 알아보기 위해 콩 모자이크 바이러스 외피 단백질 생합성 유전자 SMV-CP(Soybean mosaic virus-coat protein gene)를 대상으로 재조합된 플라스미드를 제작하였으며 운반체의 제작은 GUS 발현 운반체에서와 동일한 방법으로 하였다.

제작된 형질전환용 바이너리 벡터 DNA 즉, pMJC-GB-GUS, pMJC-GB-SMV-CP 등은 3계 교잡법(triparental mating)에 의해 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였으며, 재조합된 플라스미드가 포함된 아그로박테리움의 선발을 위해서 2종의 항생제인 스펙티노마이신(spectinomycin)과 테트라사이클린(tetracycline)을 사용하였다. 아그로박테리움 내로의 형질전환 여부는 콜로니 PCR 방법으로 확인하였다.

PCR 반응은 1X f-Taq 완충액(Solgent, Daejeon, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Daejeon, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Daejeon, Korea) 및 각 프라이머 25pM를 첨가하고 멸균수로 최종 부피를 25μl로 맞춘 PCR 반응액에 각각의 운반체가 형질전환된 콜로니의 일부를 팁으로 찍어 첨가하였다. PCR 반응은 엠제이 리서치(MJ Research)사의 PCT-200 기기로 수행하였으 며, 조건으로는 94℃에서 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 55℃에서 30 초간 중합, 72℃에서 60초간 신장 반응을 30회 반복 후 72℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램하였다. 증폭된 산물은 EtBr이 첨가된 0.8% 한천 겔(agarose gel)에서 분리하고 UV 트랜실루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.

도 2는 본 발명에 사용된 형질전환용 운반체 pMJC-GB-SMV-CP를 3계 교잡방법으로 아그로박테리움에 형질전환하고 콜로니 PCR을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. 선발된 8개의 콜로니는 모두 사용한 프라이머의 기대 크기인 796bp 위치에서 밴드를 나타내어 SMV-CP 유전자가 아그로박테리움에 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었다. 도 2는 SMV-CP-1에서 SMV-CP-8까지의 형질전환 콜로니를 나타낸 것이다.

위의 방법으로 형질전환이 확인된 아그로박테리움 콜로니는 증식시킨 후 형질전환에 이용하였다.

[실시예 2] 형질전환을 위한 종자 발아 및 아그로박테리움 배양

목표 유전자를 콩 조직 세포 내로 형질전환하기 위해 콩 종자를 발아시키고 아그로박테리움을 배양하였다.

2-1. 종자 발아

공시품종으로는 국내품종인 익산 나물콩을 사용하였다. 먼저, 종자를 75% 에탄올에 1분간 침지한 다음 멸균수로 2회 세척하였다. 세척된 종자를 20% 락스 용액 으로 상온에서 12분 동안 다시 소독한 후 멸균수로 3회 세척하여 멸균 처리하였다. 멸균된 종자는 약 15-20개로 나누어 여과지가 깔린 배양접시(90× 20㎝ petridish)에 넣고 멸균수를 10-15ml 정도 부어 27℃에서 2일 이상 발아시킨 다음 형질전환에 사용하였다.

2-2. 아그로박테리움의 배양 및 현탁액 준비

초저온냉장고(-70℃)에서 글리세롤 스탁으로 저장되어 있는 2종의 재조합 플라스미드가 형질전환된 아그로박테리움을 꺼내 AB-ST배지(표 1 참조)에 조밀하게 도말하여 27℃ 암조건에서 5-7일간을 배양하였다. 배양이 끝난 아그로박테리움을 페트리 접시(petri dish) 당 CCM-L 배지 15-20㎖(표 1 참조)를 분주한 후 멸균된 루프를 이용하여 긁어내고 팰콘 튜브(falcon tube)로 옮겨 담았다. 그 다음 아그로박테리움이 잘 현탁 될 수 있도록 수초 동안 볼텍싱(vortaxing)하였으며, 최종 접종 농도는 650㎚에서 흡광도 2.5 이상이 되도록 하였다.

[표 1] 형질전환 단계별 배지 종류 및 조성

형질전환 단계	배 지	조 성
아그로박테리움 배양	AB-ST	AB 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 스펙티노마이신(spectinomycine) 50mg/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10mg/L, pH 7.0
아그로박테리움 현탁 및 접종	CCM-L	1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 4.26g/L, Na₂·EDTA 1ml/L, 수크로오스 30g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 200uM/L, 지에이쓰리(GA3) 0.25mg/L, 비에이피(BAP) 5mg/L, pH 5.2
공동배양	CCM	1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 4.26g/L, Na₂·EDTA 1ml/L, 수크로오스 30g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 200uM/L, 지에이쓰리(GA3) 0.25mg/L, 비에이피(BAP) 5mg/L, 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 1mM/L, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 1mM/L, 파이타-아가(phyta-agar) 5.5g/L, pH 5.2
신초 유도	SIMP6	MS 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, Na₂·EDTA 10ml/L, 황산 제1철(ferrous sulfate) 28mg/L, 세포탁심(cefotaxime) 100mg/L, 카베니실린(carbenicillin) 500mg/L, 젤라이트(gelrite) 2.6g/L, 비에이피(BAP) 0.4mg/L, 아이비에이(IBA) 100ug/L, L-포스피노트리신 (L-phosphinotricine) 6mg/L, pH 5.7
신초 신장	SEMP6	MS 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, Na₂·EDTA 10ml/L, 황산 제1철 28mg/L, 세포탁심(cefotaxime) 100mg/L, 카베니실린(carbenicillin) 500mg/L, 젤라이트 2.6g/L, GA3 0.5mg/L, IAA 0.1mg/L, 질산은(Silver-nitrate) 10mg/L, 지아틴-리보사이드(Zeatin-riboside) 1mg/L, 아스파라긴(Asparagine) 50mg/L, 피로글루탐산(Pyroglutamic acid) 100mg/L, L-포스피노트리신 6mg/L, pH 5.7
뿌리 유도	RM	1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, 수크로오스 20g/L, 아이비에이(IBA) 1mg/L, 플랜트아가(plant agar) 8g/L, 활성탄 0.5g/L, pH 5.6

[실시예 3] 배축 조직의 분리, 아그로박테리움 접종 및 공동배양

목표 유전자를 콩 목적조직의 세포내로 도입하기 위해 발아 종자에서 배축 조직을 분리하고, 분리된 배축 조직에 아그로박테리움을 접종하였다. 접종된 배축 조직은 아그로박테리움과 공동배양을 실시하였다.

3-1. 발아된 종자로부터 배축 조직의 분리 및 절단

2일 이상 발아시킨 콩 종자에서 먼저 자엽 한쪽을 떼어낸 다음 노출된 배축 으로부터 남아있는 다른 한쪽의 자엽을 완전히 분리하였다. 이때 초생엽을 포함한 분열조직이 상하지 않게 조심하였다. 분리된 배축에서 정단부 및 측아 분열조직을 포함한 0.5~2cm 정도의 배축 부분만 남기고 나머지 부분은 잘라내었다(도 3). 잘라낸 배축은 15㎖ 튜브에 모아 아그로박테리움 접종에 사용하였다.

3-2. 아그로박테리움 접종

분리된 배축이 담겨져 있는 15㎖ 튜브에 2㎖의 아그로박테리움 현탁액을 첨가하고 5-6시간 동안 25℃ 암조건에서 접종하였다.

3-3. 공동배양

목표 유전자의 배축 조직 세포 내로의 도입을 향상시키고 형질전환된 세포의 생존율을 높이기 위해 공동배양 배지 조성 및 조건을 변경하였다. 배지 조성은 기본배지(B5)의 함량을 1/2로 줄이고 아그로박테리움과의 공동배양 과정에서 발생되는 식물 세포의 산화적 파괴를 최소화하기 위하여 2종의 항산화 화합물 즉 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1mM을 첨가하였다. 아가는 파이타-아가(phyta-agar)를 사용하였으며 함량은 5.5g/L로 조정하였다(표 1 참조).

공동배양 조건으로는 먼저 접종된 배축은 공동배양 배지 위에 깔아 놓은 여과지(Watman #1) 위에다 두었으며 동시에 아그로박테리움 현탁액 1-2㎖를 추가로 공급하여 배축 조직 세포 내로의 목표유전자 도입을 극대화하였다. 공동배양기간은 7일로 조정하였으며 늘어난 배양기간으로 인한 아그로박테리움의 과도한 성장은 관 찰되지 않았다. 또한 공동배양기간 동안의 온도는 26.5℃(1일)에서 23.5℃(6일)로 변온 처리하였다.

[실시예 4] 형질전환 콩 식물체의 작성

접종된 배축 조직으로부터 목표 유전자가 도입된 신초를 유도하고 선발하였다. 분화가 유도된 신초는 재분화 배지에서 신장을 유도하였으며 신장된 신초는 잘라내어 발근 및 순화 처리하였다.

4-1. 형질전환된 신초의 유도 및 선발

공동배양 과정이 끝난 배축에서 아그로박테리움을 제거하기 위해 세포탁심(cefotaxime) 100㎎/L, 카베니실린(carbenicillin) 500㎎/L이 포함된 용액으로 약 3회 이상 세척하였으며, 세척이 끝난 배축은 멸균된 여과지가 들어 있는 페트리 접시로 옮겨 남아 있는 용액을 완전히 제거하였다. 이 과정을 마친 배축은 PPT(6㎎/L)가 포함된 신초 유도 배지(SIMP6)에 옮겨 16시간 명조건인 25℃ 배양실에서 2주 동안 형질전환된 조직으로부터 신초 발생을 유도하고 선발하였다(도 5 참조).

4-2. 형질전환된 신초의 신장 유도

유도된 신초는 지에이쓰리(GA3) 0.5㎎/L, 아이에이에이(IAA) 0.1㎎/L, Silver-nitrate 10㎎/L, 지아틴-리보사이드(Zeatin-riboside) 1㎎/L, 아스파라긴(Asparagine) 50㎎/L, 피로글루탐산(Pyroglutamic acid) 100㎎/L, L-포스피노트 리신 6㎎/L, 세포탁심(cefotaxime) 100㎎/L, 카베니실린(carbenicillin) 500㎎/L, 젤라이트 2.6g/L이 포함된 SEMP6 배지(표 1 참조)에 치상한 다음, 상기 조건에서 형질전환된 신초의 신장을 유도하였으며 2주 간격으로 계대하였다(도 5 참조).

4-3. 뿌리 유도 및 순화

신장된 신초는 잘라내어 아이비에이(IBA) 2mg/mL 용액에 6분 동안 침지하였다. 뿌리 유도 배지로는 1/2 B5배지를 기본배지로 사용하였으며, 활성탄 0.5g/L, 아이비에이(IBA) 1㎎/L, 수크로오스(sucrose) 20g/L 및 플랜트-아가(plant-agar) 8g/L 등을 추가하였다(표 1 참조). 뿌리가 유도된 식물체는 바로커 상토에 옮겨 순화시켰으며 순화된 식물체는 화분에 이식하고 온실에서 관리하였다(도 5 참조).

[실시예 5] 본 발명에 의한 방법에 따른 형질전환 효율 비교

본 발명에 의한 방법과 종래 방법간의 유전자 도입 효율을 알아보기 위해 GUS 운반체를 사용하여 형질전환정도를 비교하였다.

5-1. 배축 절단에 의한 GUS 발현 차이

본 발명의 배축 절단법과 종래 방법으로 아그로박테리움 pMJC-GB-GUS/ LBA4404를 각각 접종하고 공동배양을 한 다음 GUS의 발현 정도를 조사하였다. 종래 방법으로 처리된 배축 조직의 경우 하루 발아된 배축 분열조직에서만 GUS가 발현되었을 뿐 발아 2일째부터는 GUS의 발현이 현저히 떨어졌다. 그러나 본 발명의 배축 절단법을 사용하여 처리된 배축 분열조직의 경우 발아 1, 2, 3일 처리에서는 강한 GUS 발현이, 발아 4, 5일 처리에서도 어느 정도의 GUS의 발현이 유지되었다(도 4 참조). 이러한 결과는 배축 조직을 절단하는 방법이 공동배양 과정에서 배축 조직이 신장되는 것을 억제하여 공동배양 배지와의 접촉을 잘 유지하게 함으로써 목표 유전자의 세포내 도입을 증가시킬 수 있음을 보여준다.

5-2. 본 발명에 의한 방법과 종래 방법간 콩 형질전환율 비교

형질전환이 어려운 국내품종인 익산 나물콩을 공시품종으로 사용하여 본 발명에 의한 방법과 종래 방법(Liu 등 Planta 219: 1042-1049, 2004)으로 GUS 유전자를 형질전환하고 효율을 비교하였다. 콩 형질전환은 재현성의 확인을 위해 2회에 걸쳐 실시하였다.

[표 4] 본 발명에 의한 방법과 종래 방법간 콩 형질전환율 비교

유전자	품 종	회 차	처리별	형질전환에 사용된 배축의 수(개)	형질전환 식물체 수(개)	형질전환율 (%)
GUS	익산 나물콩	1 차	종래방법	140	0	0
		1 차	본 발명	135	2	1.48
		2 차	종래방법	150	0	0
		2 차	본 발명	145	3	2.07

상기 표 4에서 보는 바와 같이 GUS 유전자를 익산 나물콩에 종래의 방법으로 형질전환 하였을 때는 두 번의 처리 모두에서 콩 형질전환체를 얻지 못하였으나 본 발명에 의한 형질전환 방법에서는 모두 형질전환체를 얻는데 성공하였다. 형질전환 식물체 수는 1회 135개의 배축을 사용하여 2개체를, 2회에는 145개의 배축에서 3개체를 작성하였으며 형질전환율은 각각 1.48%, 2.07%인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명에 의한 방법이 배축 이용법의 여러 가지 기술적 제한요인들을 해결함으로써 형질전환이 어려운 콩 품종에 광범위하게 적용될 수 있음을 보여주고 있다.

[실시예 6] 본 발명에 의한 방법의 콩 형질전환에 적용

본 발명에 의한 방법을 실제 콩 형질전환에 적용하여 상기 GUS 유전자와 사용하였을 때와 같이 형질전환체 작성이 가능한가를 알아보기 위해 SMV-CP 유전자를 사용하여 형질전환하였다.

[표 5] 본 발명에 의한 콩 형질전환 결과

유전자	품 종	회 차	처리별	형질전환에 사용된 배축의 수(개)	형질전환 식물체 수(개)	형질전환율 (%)
SMV-CP	익산 나물콩	1 차	본 발명	120	2	1.67
SMV-CP	익산 나물콩	2 차	본 발명	115	1	0.86

상기 표 5에서 보는 바와 같이, SMV-CP 유전자의 형질전환에서는 1차 처리에서 120개의 배축을 사용하여 2개체의 형질전환체를, 2차에는 115개의 배축에서 1개체를 작성하였으며 형질전환율은 각각 1.67%와 0.86%인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 방법에 의한 방법이 유전자의 종류에 상관없이 실제 콩 형질전환에 잘 적용될 수 있음을 보여주고 있다.

[실시예 7] 형질전환 콩 식물체의 분자생물학적 분석 및 생물 검정

7-1. GUS 유전자의 발현 확인

본 발명에 의한 방법의 형질전환 각 단계별 목표유전자의 도입양상을 알아보기 위해 GUS 유전자를 사용하여 발현을 확인하였다.

형질전환 단계별로 무작위로 콩 조직을 선발하여 50mM X-Gluc 용액(50mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0, 0.2% 트리톤 X-100, 3mM 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), 3mM 페로시안화칼륨(potassium ferrocyanide) 및 20% 메탄올)에서 37℃ 조건으로 하룻밤 동안 처리한 후 70% 에탄올에 탈색시키는 방법으로 GUS의 발현을 확인하였다.

도 5와 도 6F는 그 결과를 보여주는 것으로 본 발명에 의한 방법으로 처리된 콩 배축 조직은 형질전환 단계별로 분화되고 있는 분열조직 및 재분화 조직에서 GUS의 발현이 강하게 확인되었다. 이러한 결과는 GUS 유전자가 목적 조직에 안정적으로 콩 게놈에 도입되어 발현되고 있음을 보여준다.

7-2. PCR을 이용한 형질전환 확인

본 발명에 사용된 GUS 및 SMV-CP 유전자가 형질전환된 콩 게놈에 성공적으로 삽입되었는지를 PCR 방법을 이용하여 확인하였다.

먼저 형질전환된 콩 T0 식물체의 어린잎에서 CTAB 방법(Rogers & Benich, 1994)으로 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 주형으로 하여 bar 유전자의 DNA 단편을 402bp 크기로 증폭하도록 디자인된 프라이머 세트 서열번호 1의 barFOR, 5'-AGACAAGCACGGTCAACTTC-3'(20 mer)와 서열번호 2의 barREV, 5'-AGAAACCCACGTCAT GCCAGTT-3'(22 mer)를 사용하여 PCR을 실시하였다.

PCR 반응을 위해서 콩 게놈 DNA는 50ng, 1X f-Taq 완충액(Solgent, Daejeon, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Daejeon, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Daejeon, Korea) 및 각 프라이머 25 pM를 첨가하고 멸균수로 최종 부피를 50μl로 맞추었다. PCR 반응은 MJ 리서치(MJ Research)사의 PCT-200 기기로 수행하였으며, PCR은 94℃에서 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 55℃에서 30 초간 중합, 72℃에서 60초간 신장 반응을 30회 반복 후 72℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램하였다. 증폭된 산물은 EtBr이 첨가된 0.8% 한천 겔에서 분리하고 UV 트랜실루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.

도 6C는 GUS 유전자가 도입된 T0 식물체 3개체와 SMV-CP 유전자가 도입된 2개체를 대상으로 PCR을 수행하여 얻은 결과를 보여주고 있다. 형질전환 식물체는 모두 PCR 산물의 기대 크기인 402bp 위치에서 하나의 밴드를 나타내어 목표 유전자가 콩 게놈에 안정적으로 형질전환된 것으로 증명되었다. 도 6C에서 비형질전환체는 대조군(WT)으로 나타내었다.

7-3. 형질전환 식물체에 도입된 유전자의 카피 수 확인

형질전환 식물체에 도입된 유전자의 카피 수를 확인하기 위해 대조군 식물체 와 SMV-CP 형질전환 식물체를 이용하여 다음과 같이 서던 블럿을 수행하였다.

대조군 식물체 및 형질전환 식물체의 콩 잎으로부터 게놈 DNA는 상기 실시 예 7-2에서와 같이 분리하였다. 10 ug의 게놈 DNA를 제한효소 BamHI으로 처리하였다. 그런 다음 0.8% 젤에서 밤새 전기영동한 후, 나일론 멤브레인에 이전(transfer)시켰다. 탐침(probe)으로는 DIG로 표지한 SMV-CP 유전자를 사용하였다. 그 결과, 도 6E에서 보듯이, 형질전환체(왼쪽 2개 레인)는 SMV-CP 유전자가 각각 1 카피와 2 카피 도입된 것을 알 수 있었다. 대조군 식물체는 오른쪽 2 레인에 나타내었다.

7-4. 형질전환 식물체에 도입된 bar 유전자의 발현 확인

상기 실시예 7-3에서 콩 게놈에 삽입된 유전자의 카피수가 확인된 SMV-CP 형질전환 식물체와 대조군 식물체를 이용하여 다음과 같이 bar 스트립 검정을 수행하였다.

대조군 식물체 및 형질전환 식물체의 콩 잎을 소량 채취하여 증류수로 마쇄하고 그 즙액에 bar 스트립 키트를 침지하는 방법으로 검정하였다. 그 결과, 도 6D에서 보듯이, 형질전환체(왼쪽 2개 레인)는 각각 2개의 밴드를 나타내어 bar 유전자가 제대로 발현되고 있음을 알 수 있었으나 오른쪽 2개 레인의 대조군 식물체는 각각 1개의 밴드만을 나타내어 비형질전환체임을 알 수 있었다.

[실시예 8] 형질전환 유전자의 유전 확인

8-1. 형질전환 T1 식물체의 제초제 저항성 생물검정

콩 형질전환에서 선발마커로 사용된 제초제 저항성 bar 유전자의 세대진전에 따른 유전 여부를 확인하기 위해 상기 실시예 7에서 언급한 GUS 및 SMV-CP 유전자 형질전환체(T0)의 후대인 T1 식물체를 대상으로 제초제 저항성 생물검정을 수행하였다. 생물검정은 발아된 T1 식물체에 0.2% 바스타 액제를 고르게 살포하고 1주일 후에 저항성을 평가하는 방법으로 실시하였다.

도 7A와 B는 생물검정의 결과를 나타낸 것으로 본 발명에서 획득한 GUS 유전자 형질전환 T1 식물체의 경우 발아된 64개체를 대상으로 바스타를 살포하였을 때 44개체는 제초제에 저항성을 보였으나 20개체는 서서히 갈변되고 결국에는 고사되어 제초제 저항성이 없는 것으로 나타났다(도 7A). SMV-CP 유전자의 경우에는 54개체를 평가하여 39개체는 제초제에 저항성을 보였으나 15개체는 제초제 저항성이 없는 것으로 조사되었다(도 7B). 이러한 결과는 본 발명에 의해 형질전환된 제초제 저항성 유전자가 분리세대인 T1 식물체에서 저항성과 감수성으로 정확히 분리하고 있어 후대에 안정적으로 유전되었음을 나타낸다.

8-2. 형질전환 식물체에 도입된 bar 유전자의 발현 확인

상기 실시예 8-1에서 제초제 저항성 생물검정에서 저항성으로 평가된 GUS 및 SMV-CP 형질전환 T1 식물체와 대조군 식물체를 대상으로 bar 유전자의 발현을 확인하기 위해 bar 스트립 검정을 수행하였다.

검정은 유전자별로 각각 무작위로 선발된 10개체의 형질전환 T1 식물체를 대상으로 실시하였다. 그 결과, 도 8A(GUS 유전자)와 8B(SMV-CP 유전자)에서 보듯이, 선발된 T1 식물체는 모두 2개의 밴드를 보여 bar 유전자가 안정적으로 발현되고 있는 것으로 확인되었다.

도 1은 본 발명의 재조합 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.(LB(left border), RB(Right border), OsCc1(Cytochrome c promoter), SMV-CP(Soybean mosaic virus coat protein gene), TPinll(Pin-Ⅱ terminator), P35S(CaMV 35S promoter), TNos(Nos terminator), bar(bar coding region), MAR(Matrix attachment region)).

도 2는 본 발명의 재조합 벡터 pMJC-GB-SMV-CP로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404에 대하여 형질전환 여부를 콜로니 PCR로 확인한 것이다.

도 3은 발아시간이 1일에서 5일까지 처리된 종자로부터 본 발명에 의한 방법과 종래의 방법으로 배축 조직을 분리하고 아그로박테리움을 접종하기 전의 모습을 보여주는 사진이다.

도 4는 발아시간이 1일에서 5일까지 처리된 종자로부터 본 발명에 의한 방법과 종래의 방법으로 분리된 배축 조직에 GUS 유전자를 형질전환하고 공동배양과정 후 GUS 유전자의 발현을 보여주는 사진이다.

도 5는 본 발명의 방법으로 GUS 유전자를 형질전환하고 콩 형질전환 단계별로 GUS 유전자의 발현을 나타낸 것이다(SIM : 형질전환된 신초 유도 및 선발 과정, SEM : 선발된 신초의 신장 과정).

도 6은 GUS 및 SMV-CP 유전자가 도입된 T0 식물체의 형질전환 및 발현여부를 PCR(C), bar 스트립(D), 서던블랏 분석(E), 및 GUS 발현(F)으로 확인한 것이다(D와 E : SMV-CP 유전자가 도입된 T0 식물체 2 개체).

도 7은 본 발명에 의한 방법으로 생산된 형질전환 콩 T1 식물체에 0.2%의 바 스타를 처리하고 제초제에 대한 저항성 반응을 나타낸 사진이다(A : GUS 유전자 도입 T1 식물체, B : SMV-CP 유전자 도입 T1 식물체).

도 8은 제초제에 저항성을 보이는 형질전환 T1 식물체에서 제초제 저항성 bar 유전자의 발현을 bar 스트립 키트로 확인한 사진이다(A : GUS 유전자 도입 T1 식물체, B : SMV-CP 유전자 도입 T1 식물체, WT : 비형질전환체, T1 : 선발된 제초제 저항성 T1세대 식물체 10개체).

<110> Korea <120> Soybean Transformation Method <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Glycine max <400> 1 agacaagcac ggtcaacttc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Glycine max <400> 2 agaaacccac gtcatgccag tt 22

Claims

외래 목적 유전자 및 선발 마커 유전자를 포함하는 콩 형질전환용 발현벡터가 도입된 아그로박테리움을 배양하고 현탁액을 준비하는 단계;

콩 발아 종자에서 자엽을 제거한 정단부 및 측아 분열조직을 포함하는 배축 절편에 상기 현탁액을 접종시키고 공동 배양하는 단계;

상기 공동 배양된 배축 절편에서 직접 형질전환된 신초를 유도 및 선발하는 단계;

상기 선발된 신초를 신장시키는 단계; 및

상기 신장시킨 신초에서 뿌리를 유도 및 순화하는 단계;로 이루어지는 콩의 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 선발 마커 유전자는 bar 유전자인 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 정단부 및 측아 분열조직을 포함하는 배축 절편은 0.5~2㎝인 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 아그로박테리움을 상기 배축 절편에 접종하는 것은 콩 종자의 발아 후 120시간 이내에 이루어지는 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 아그로박테리움을 배양하는 배지 조성은 AB 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 스펙티노마이신(spectinomycine) 50㎎/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10㎎/L 및 pH 7.0인 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 아그로박테리움 현탁액 배지 조성은 1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 4.26g/L, Na₂·EDTA 1㎖/L, 수크로오스 30g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 200uM/L, 지에이쓰리(GA3) 0.25㎎/L, 비에이피(BAP) 5㎎/L 및 pH 5.2인 것을 특징으로 하는 콩 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 공동배양의 배지 조성은 1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 4.26g/L, Na₂·EDTA 1㎖/L, 수크로오스 30g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 200uM/L, 지에이쓰리(GA3) 0.25㎎/L, 비에이피(BAP) 5㎎/L, 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 1mM/L, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 1mM/L, 파이타-아가(phyta-agar) 5.5g/L 및 pH 5.2인 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 신초를 유도하는 위한 배지의 조성은 MS 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, Na₂·EDTA 10㎖/L, 황산 제1철(ferrous sulfate) 28㎎/L, 세포탁심(cefotaxime) 100㎎/L, 카베니실린(carbenicillin) 500㎎/L, 젤라이트(gelrite) 2.6g/L, 비에이피(BAP) 0.4㎎/L, 아이비에이(IBA) 100ug/L, L-포스피노트리신(L-phosphinotricine) 3~6㎎/L 및 pH 5.7인 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 신초를 신장시키기 위한 배지의 조성은 MS 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, Na₂·EDTA 10㎖/L, 황산 제1철(ferrous sulfate) 28㎎/L, 세포탁심(cefotaxime) 100㎎/L, 카베니실린(carbenicillin) 500㎎/L, 젤라이트 2.6g/L, 지에이쓰리(GA3) 0.5㎎/L, 아이에이에이(IAA) 0.1㎎/L, Silver-nitrate 10㎎/L, 제아틴-리보사이드(Zeatin-riboside) 1㎎/L, 아스파라긴(Asparagine) 50㎎/L, 피로글루탐산(Pyroglutamic acid) 100㎎/L, L-포스피노트리신 3~6㎎/L 및 pH 5.7인 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법.
제1항에 있어서,

상기 뿌리를 유도하기 위한 배지의 조성은 1/2 B5 매크로 및 미세 염, B5 비타민, 엠이에스(MES) 0.63g/L, 수크로오스 20g/L, 아이비에이(IBA) 1㎎/L, 플랜트아가(plant agar) 8g/L, 활성탄 0.5g/L 및 pH 5.6인 것을 특징으로 하는 콩의 형질전환방법.