KR20040086918A - 아그로박테리움을 통한 고려인삼 형질전환 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고려인삼의 배발생 캘러스를 아그로박테리움과 공동배양하는 방법을 이용한 식물형질전환 기술로 유용형질이 도입된 형질전환 인삼 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 구성은 인삼의 배발생 캘러스를 아그로박테리움과 공조배양 한 후 항생제가 포함된 선발배지에서 유전자가 도입된 배발생 세포만을 선발하는 단계와, 상기 선발된 세포만을 증식하는 단계와, 상기 선발되어 증식된 세포에서 형질전환 식물체를 생산하는 단계와, 형질전환체를 확인하는 단계와, 형질전환 인삼 식물체를 토양에 순화하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 식물형질전환 기술에 의한 유용형질이 도입된 형질전환 고려인삼 식물체의 생산에 관한 것이다.

따라서 본 발명에서 제시된 방법에 따르면 인삼의 배발생 캘러스에서 효울적으로 식물체를 재분화시킬 수 있으며, 전통적인 육종방법으로 획득하기 어려운 유용한 유전형질을 가지는 인삼 형질전환체의 생산이 가능해짐으로써 고려인삼의 상품성 및 경쟁력을 높일 수 있는 고품질 인삼을 제공할 수 있다.

Description

아그로박테리움을 통한 고려인삼 형질전환 방법{The method for genetic transformation of Panax ginseng via Agrobacterium-mediated transformation}

본 발명은 아그로박테리움 투머파시언스 (Agrobacterium tumefaciens)를 매개로 한 식물형질전환 기술을 이용하여 고려인삼을 형질전환하는 방법 및 형질전환 식물체에 관한 것으로, 구체적으로는 제초제에 저항성을 가지는 phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) 유전자를 식물에 도입하는 아그로박테리움을 인삼의 배발생 세포에 감염시켜 형질전환된 체세포배를 유도한 다음 이로부터 인삼식물체를 재분화 시켜 제초제 저항성 식물체를 생산하는 방법 및 제초제 저항성 식물체의 생산에 관한 것이다.

인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer)은 대한민국을 대표하는 대표적인 상품으로써, 이미 전세계적으로 고려인삼의 효능과 중요성은 잘 알려져 있다. 그러나 인삼을 재배하여 수확하기까지 4년-6년이라는 긴 재배기간이 필요하며, 재배 시 요구되는 특수한 해가림 시설 및 한번 재배된 토양에서 다시 재배 시 정상적으로 생육되지 않아 항상 새로운 경작지를 찾아 관리해야한다는 점과 같은 재배상 문제점과 뿌리의 표면이 적색으로 변하는 적변현상과 곰팡이의 감염에 의해 뿌리가 썩게 되는 근부병 등에 의해 품질 저하가 심각하다는 점과 같은 생리적인 문제점 등이 고려인삼의 세계화에 장애가 되고 있다.

따라서 이러한 인삼의 문제점을 극복하기 위해서는 새로운 인삼품종의 육종이 필요하다. 그러나 전통적인 육종방법으로는 약 50년 이상의 긴 육종 기간이 필요하며, 육종의 재료로 사용될 다양한 형질의 야생종 즉 산삼의 고갈은 전통적인 방법의 육종을 더욱 어렵게 하고 있다. 따라서 외부 유용유전자를 식물에 도입하여 새로운 품종을 개발하는 식물형질전환 기술이 인삼의 육종방법으로 많은 장점을 가지고 있다.

현재 식물형질전환 기술은 식물 병원성균인 아그로박테리움과 식물조직 절편을 공동배양하여 아그로박테리움 내에 있는 일부 유전자 (T-DNA)가 식물 세포내로 전이되어 식물의 염색체내에 삽입되는 현상을 이용하는 방법으로 도입하고자하는 유용유전자와 형질전환된 세포를 선발할 수 있는 항생제 저항성 유전자를 T-DNA 사이에 삽입한 유전자 운반체를 제작하여 사용하고 있다. 본 발명에 사용된 유전자 운반체에는 제초제 Basta에 저항성을 가지는 유전자와 항생제 선발 유전자로 항생제 kanamycin에 저항성을 가지는 NPT II 유전자로 구성된 유전자 운반체를 사용하였다 (Strauch et al, Physiol Plant 63; 65-74, 1988).

제초제 저항성 식물체를 만드는데 가장 유력한 방법으로는 제초제를 분해하거나 무독화시키는 효소를 생합성하는 유전자를 작물에 도입하는 것이다. 따라서 많은 제초제에 이러한 전략을 이용하려는 연구가 진행되고 있으며, 이러한 효소들은 주로 미생물에서 발견되고 있다. Bar 유전자 (Thompson et al., EMBO J 6; 2519-2523, 1987)와 PAT 유전자 (Strauch et al., Physiol Plant 63; 65-74, 1988)는 각각Streptomyces hygroscopicus와 S.viridochromogenes에서 클로닝된 것으로 Thompson 등(1987)은Streptomyces hygroscopicus가 자체 독성물질인 tripeptide bialaphos를 2차 대사산물로 생성하는데, 이 물질에 내성을 가지며 생존하는 이유는 acetyl CoA를 이용하여 bialaphos의 자유 아미노기를 acetyl화하여 제초활성이없는 산물로 만드는 phosphinothricin acetyl transferase (PAT)의 작용임을 발견하였다. 따라서 이러한 PAT 유전자를 클로닝하여 제초제에 저항성을 가지는 형질전환 식물체 개발에 많은 연구가 진행되어 왔으며, 사용된 유전자는 주로bargene이라고 명명된Streptomyces hygroscopicus에서 클로닝된 유전자를 사용하였다 (Rathore et al., Plant Mol. Biol. 21; 871-884, 1993; Thompson et al., EMBO J 6; 2519-2523, 1987; De Block et al., Plant Physiol 91; 694-701, 1989).Bar유전자는 CaMV 35S promotor와 함께 재조합 되었으며 이 식물형질전환용 운반체는 담배에 도입하여 제초제 저항성 형질전환체를 얻었다 (De Block et al., EMBO J 6; 2513-2518, 1987).

식물형질전환을 위한 필수적인 조건은 식물체의 조직 일부에서 정상적인 식물체로 재분화시키는 기술이다. 특히 고빈도의 식물체 재분화 조건일 때 형질전환이 보다 용이하므로 이러한 재분화 체계의 확립은 매우 중요하다. 따라서 인삼의 형질전환에 앞서 인삼의 재분화 체계가 확립되어야 하는데, 인삼의 조직배양에 대한 보고는 본 발명자들이 이전에 출원한 특허 공개 번호 특1998-020958에서는 인삼자엽으로부터 유래한 단일배 배양을 통한 기내 유식물체를 생산하는 방법을 보고하였으며, 특허 공개 번호 특2000-0066625에서는 인삼의 배발생세포의 현탁배양을 실시하여 체세포배와 유식물체의 대량 생산방법에 대한 기술이 보고되었다.

한편, 인삼의 형질전환 연구는 주로 아그로박테리움 리조지네스를 이용한 모상근 유도에 편중되어 있는데, 특허 공개 번호 특1993-0000004에서는 인삼모상근의 유도 및 다량증식방법에 관한 기술이, 본 발명자들에 의한 특허 공개 번호특1998-078464에서는 인삼모상근으로부터 인삼 유식물체를 생산하는 방법에 대한 기술이 특허화되어 있다. 또한 세계적으로도 모상근을 유도하여 사포닌을 생산하려는 시도들을 하고 있다 (Yoshikawa and Furuya 1987, Plant Cell Rep.; Inomata 1993 Plant Cell Rep.; Bulgakow et al., 1999 Phytochemistry). 또한, 아그로박테리움 튜머파시언스를 이용한 표지유전자인 거스유전자가 도입된 형질전환 인삼에 대한 연구도 보고되었다 (Lee et al., 1995 Plant Cell Rep.; Choi et al., 2001 Plant Cell Rep). 한편 최근에는 미국삼의 형질전환에 대한 연구 또한 보고되고 있다 (Chen and Punja 2002 Plant Cell Rep). 그러나 현재까지 유용유전자를 이용한 고려인삼의 형질전환에 대한 연구는 거의 이루어지고 있지 않으며, 특히 제초제 저항성유전자를 이용한 형질전환 연구는 보고되고 있지 않은 실정이다.

본 발명의 목적은 아그로박테리움을 이용한 고려인삼의 형질전환 방법과 형질전환 식물체를 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 고려인삼식물체의 배발생 캘러스를 아그로박테리움과 공동배양하여 형질전환 식물체를 생산하는 방법을 제공한다. 실 예로써 형질전환체의 손쉬운 확인을 위한 거스 유전자와 제초제에 저항성인 PAT 유전자를 이용하여 제초제 저항성 인삼 식물체를 생산하였으며, 형질전환된 식물체는 제초제에 저항성을 가졌다.

본 발명은 고려인삼의 배발생 캘러스를 이용하여 외래유용유전자가 도입된 고려인삼 형질전환체계를 확립하는 방법에 관계된다.

본 발명은 고려인삼 식물체에 제초제 저항성 유전자가 도입함으로써 새로운 신품종의 육성에 관계된다.

본 발명은 외래유용유전자가 삽입된 형질전환 식물체가 토양에 이식되어 순화되는 방법에도 관계된다.

도 1은 인삼 배발생캘러스에서 유도되는 체세포배의 모습

도 2는 본 연구에서 사용된 식물 발현용 운반체 pRD 320의 사진

도 3은 항생제가 첨가된 선발배지에서 인삼 배발생 캘러스에서 유도되는 항생제 저항성 체세포배의 발생

도 4는 형질전환된 인삼 유식물체에서의 GUS 유전자의 안정된 발현을 확인하는 사진

도 5는 형질전환 인삼 유식물체의 기내 증식 사진.

도 6은 인삼 식물체에서 유전자의 도입을 확인하는 PCR 분석사진.

도 7은 형질전환 인삼 식물체의 게놈내에 유전자가 안정되게 삽입되었음을 확인하는 게놈 서던 분석 (genomic southern analysis)한 사진.

도 8은 형질전환 인삼 식물체의 토양순화, 토양에 이식되어 순화 5개월 된 사진.

도 9는 형질전환 인삼 식물체의 제초제 저항성을 검정하기 위해 200 ppm의 제초제 바스타 (BASTA)를 처리한 후 4주가 지난 형질전환체와 형질전환 되지 않은 인삼 식물체의 사진이다.

이하 본 발명의 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1] 배발생 캘러스 유도

인삼의 접합자배를 무균적으로 적출한 뒤 성숙된 자엽을 절단하여 설탕 3%, 2,4-D 1 mg/l 및 한천 1%가 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 배지에서 치상하여 배양하였다. 약 4주 후에 자엽절편으로부터 배발생 캘러스가 유도되었으며, 유도된 배발생 캘러스는 동일 배지에서 4주에 한번씩 계대하며 증식시켰다. 또한, 증식되는 배발생 캘러스에서는 체세포배가 형성되었다 (도1).

[실시예 2] 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 및 선발

형질전환에 이용된 도입유전자는 유전자의 도입을 쉽게 눈으로 확인 할 수 있는 마커 유전자인 거스유전자와 항생제 선발마커인 NPT II 유전자 및 제초제 저항성 유전자인 PAT gene으로 구성되어 있는 식물발현용 운반체인 pRD 320을 binary vector로 가지는A. tumefaciensGV 3101을 이용하였다 (도 2).

아그로박테리움 균주는 YEP배지 (5 g/l yeast extract, 5 g/l bacto-peptone, and 5 g/l sucrose; pH 7.2)에 접종하여 1-2일 동안 120rpm으로 배양한 후 사용하였으며, 배양된 아그로박테리움은 3,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 제거한 후 새로운 무라시쿠 스쿠트 액체배지를 이용하여 재현탁하여 인삼의 배발생 세포에 접종하였다. 아그로박테리아에 접종된 배발생 세포는 필터페이퍼에서 박테리아 잔액을 제거하고 1 mg/l 2,4-D와 3% 설탕이 첨가된 MS 한천배지로 옮겨 암상태에서 3일간 공동배양하였다. 이후 300 mg/l cefotaxime이 첨가된 배지에 일주일간 배양하며 선발하지 않으면서 균만을 제거하는 단계를 거친다. 이후 25 mg/l kanamycin과 300 mg/l cefataxime을 첨가한 배지에서 2주마다 계대배양하며 형질전환되었다고 추정되는 세포들을 선발하였다 (도 3). 선발된 세포들은 호르몬을 첨가하지 않은 MS배지에 항생제 25 mg/L kanamycin과 300 mg/L cefataxime이 첨가된 배지로 옮겨 2주간격으로 5차례 계대배양하면서 성숙한 배로 발달시킨 다음 고농도의 항생제 즉 50 mg/L kanamycin을 첨가하여 선발하였으며, 발아를 위해 5 mg/L의 지베렐린을 첨가한 배지에서 발아를 유도한 후 정상적인 식물체로 재생시켰다 (도 5).

[실시예 3] 거스반응을 이용한 형질전환체 분석

선발배지에서 임으로 선택된 기내 소식물체들을 이용하여 유전자의 도입 및 발현을 눈으로 쉽게 확인 할 수 있는 거스반응을 실시하였다. 거스반응은 Jefferson 등 (1987)의 방법에 따라 실시하였는데, 임으로 선발된 식물체 잎조직을 2mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- glucuronide을 포함하는 50mM의 sodium phosphate buffer에 침지한 후 24시간동안 37℃에서 배양하였으며, 이후 99% 에탄올에서 식물색소 등을 제거하였다. 반응 결과 선발된 개체에서 GUS 양성반응을 보였는데, 균과 접종되지 않은 정상적인 소식물체에서는 아무런 변화가 없었으나 형질전환된 소식물체에서는강한 청색의 반응이 일어나 유전자가 성공적으로 도입되어 발현됨을 증명하였다 (도 4).

[실시예 4] PCR을 이용한 형질전환체 분석

형질전환체에 도입된 유전자의 확인은 먼저 PCR을 이용하여 실시하였으며, 거스반응이 양성으로 확인된 식물체들을 이용하여 게놈 DNA을 분리하고 각각NPT II, PAT유전자의 도입을 확인 할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킨 후 PCR 산물을 전기영동하여 유전자의 삽입을 확인하였다 (도 6). 유전자의 확인을 위해 사용된 프라이머는 각각 NPT; 5'-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3'과 5'-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3', PAT; 5'-AGG ACA GAG CCA CAA ACA CC-3'과 5'-ATG CTT GTA TCC AGC TGC G-3' 이었으며, PCR 산물은 각각 700bp, 350bp이다. PCR 반응은 Applied Biosystems PCR 기기를 사용하였으며, 반응조건은 95℃에서 3분 반응 후 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간 반응을 36회 반복하였으며, 최종 72℃에서 15분간 신장반응하였다.

[실시예 5] 서던 블롯을 이용한 형질전환체 분석

PCR 반응에 의해 유전자의 도입이 확인된 식물체에서는 제초제 저항성 유전자 (PAT)를 특이 탐침(probe)으로 한 게놈 서던 블롯을 실시하여 인삼 식물체의 게놈에 목적유전자가 안전하게 도입된 것을 확인하였다 (도 7). 거스양성반응을 보인 식물체들에서 게놈 DNA를 분리하여 제한효소 EcoR I 으로 절단하였으며, 0.8% 아가로스겔 상에서 크기별로 분리한 후 Hybond-N+ 나일론 멤브레인으로 옮겨, Roche사의 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II에서 제시된 방법으로 특이탐침을 제조하고 하이브리다이제이션 및 검출과정 등을 수행하였다.

[실시예 6] 형질전환체의 대량증식 및 토양순화

기내배양된 고려인삼식물체의 성공적인 토양순화 및 토양으로 이식된 후 6개월 이상 생존하였다는 결과는 아직까지 보고되고 있지 않다. 따라서 형질전환된 인삼식물체의 성공적인 토양순화를 위해서 먼저 형질전환된 인삼식물체를 대량증식하였는데, 대량증식은 형질전환된 배의 자엽을 절단하여 1 mg/L의 2,4-D과 5% 설탕을 첨가한 MS 고체배지에 치상하여 2달간 배양하였을 때 수많은 배발생 캘러스가 생성되었으며, 이를 모두 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 식물체로 재생시켰다. 이렇게 증식된 형질전환 식물체들은 토양에 이식하였는데, 사용된 토양은 모래와 펄라이트 토양으로 환기를 위해 필터를 부착한 플라스틱 용기에 토양을 담았으며, 각각 멸균과 비멸균 처리하였다. 토양에 이식한 후 약 3개월이 경과해였을 때 멸균하지 않은 토양에서는 토양의 종류에 상관없이 곰팡이의 감염에 의해 많은 식물체들이 고사하였으며, 5개월이 지나서는 모두 고사하였다. 이러한 곰팡이의 감염을 억제하기 위해 토양을 멸균하였을 때에는 3개월이 지났을 때 모래는 42%, 펄라이트에서는 67%의 식물체가 생존하였으며, 5개월이 경과하여서도 펄라이트에서는 약 36%의 식물체가 생존하였다 (도 8, 표 1). 그러나 멸균된 모래에서는 5개월이 지나면서 이식된 식물체가 모두 생존하지 못하였다. 이렇게 5개월간 순화된 형질전환체를 멸균된토양에 이식하여 온실로 옮겼을 때 약 89%가 생존 하였다.

형질전환 고려인삼의 토양순화에 미치는 토양형태와 조건

토양형태	토양에 이식된식물체 수	식물체 생존율 (%)
		1달	3달	5달
비살균토양모래펄라이트살균토양모래펄라이트	127111163225	89±1288±1091±787±5	9±2.714±0.942±5.367±4.7	00036±2.3

[실시예 7] 제초제 처리

제초제 저항성 유전자가 도입된 인삼 형질전환체의 제초제 Basta 저항성 여부를 확인하고자 토양에 순화된 인삼 형질전환체와 형질전환되지 않은 식물체에 각각 200 mg/L Basta를 식물체가 흠뻑 젖도록 분무한 후 4주간 관찰한 결과 형질전환 되지 않은 식물체는 모두 2주만에 고사하는 반면에 형질전환 식물체는 모두 제초제에 영향받지 않으며 강력한 저항성을 나타내며 정상적인 생육을 보였다 (도 9).

본 발명의 효과는 유용유전자를 아그로박테리움을 이용하여 고려인삼 식물체에 도입시키는 유용한 방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 고려인삼 배발생 캘러스를 아그로박테리움과 공동배양하여 효과적으로 형질전환체를 선발할 수 있는 조건과 형질전환체의 대량증식방법을 제공하였으며, 고려인삼의 토양순화에 대한 유효한 방법을 제공함에 따라 지금까지 개발되어 있지 않은 유용유전자를 이용한고려인삼의 형질전환방법과 성공적인 토양순화 방법의 개발이라는 효과가 있다.

Claims (6)

1. 고려인삼의 배발생 캘러스를 2.4-D가 첨가된 MS 고체배지에서 배양하여 체세포배를 유도하는 방법
2. 제 1항에 있어서, 배발생 캘러스를 아그로박테리움과 공동배양하여 외래 유전자를 도입하여 형질전환 고려인삼 식물체의 제조방법
3. 제 1항에 있어서, 가나마이신을 이용하여 형질전환된 체세포배를 유도하고 이를 선발하며, 계대배양으로 형질전환체를 얻는 방법.
4. 상기 제 3항의 형질전환 방법에 의해 고려인삼 형질전환 시 아그로박테리움 투미파시엔스를 이용하여 고려인삼의 배발생 캘러스를 이용하여 형질전환 하는 것을 특징으로 하며, MS배지에 3% 설탕과 생장조절제인 2.4-D를 처리하는 단계, 아그로박테리움과 공동배양하는 단계, 항생제를 이용 아그로박테리움만을 제거하는 단계, 가나마이신을 이용 형질전환된 체세포배를 선발하기 위한 선발단계, 선발된 체세포배에서 완전한 식물체로 재분화 하는 단계를 일련의 과정으로 하는 형질전환 고려인삼을 제조하는 방법.
5. 상기 제 4항에 의해 제조된 고려인삼 유식물체를 인공토양인 펄라이트를 필터를 부착한 플라스틱 포트에 담아 멸균한 후 이식하여 약 5개월간 생육시킨 후 멸균된 토양으로 이식하여 온실에서 건실한 식물체로 생장시켜 형질전환 식물체를 제조하는 방법.
6. 제 4항의 식물형질전환 방법에 따라 제조된 형질전환 고려인삼 1종 (제초제 저항성 고려인삼)