CN116590333B - 一种番木瓜遗传转化体系的建立方法 - Google Patents
一种番木瓜遗传转化体系的建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116590333B CN116590333B CN202310683654.8A CN202310683654A CN116590333B CN 116590333 B CN116590333 B CN 116590333B CN 202310683654 A CN202310683654 A CN 202310683654A CN 116590333 B CN116590333 B CN 116590333B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- papaya
- ecs
- genetic transformation
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000219173 Carica Species 0.000 title claims abstract description 85
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 title claims abstract description 84
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 36
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 27
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 39
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 37
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 claims description 26
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 claims description 25
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 claims description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 21
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 18
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 18
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 18
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 16
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 11
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims description 9
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 6
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 5
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 4
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims description 3
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 31
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 25
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 206010017472 Fumbling Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 33
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 241000723990 Papaya ringspot virus Species 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 241000205663 Papaya leaf distortion mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 101150083464 CP gene Proteins 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 240000008790 Musa x paradisiaca Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000012883 rooting culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/002—Culture media for tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明所述番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，以番木瓜胚性细胞悬浮系(ECS)为遗传转化受体，利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法进行遗传转化，并通过对抗生素浓度筛选、侵染时间、继代培养、抗性胚的诱导与萌发以及植株再生整个过程进行了摸索，最后获得抗性再生植株，成功建立了以番木瓜ECS为转化受体的农杆菌介导的高效遗传转化体系。该体系为番木瓜基因功能研究和分子育种提供了新的途径，也为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状分子改良提供新的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，更具体涉及一种以番木瓜ECS为遗传转化受体基于农杆菌介导的高效遗传转化体系的建立方法。
背景技术
番木瓜(Carica papaya L.)起源于墨西哥南部和哥斯达黎加地区，目前在世界各地的热带和亚热带地区都有种植。番木瓜是我国岭南特色水果，具有很高的营养和药用价值，有“百益果王”之称。然而，受限于番木瓜环斑花叶病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)、番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV)、炭疽病等病害，严重制约了番木瓜产业的可持续发展，培育抗病品种是产业发展的关键。由于番木瓜栽培品种抗病资源匮乏、遗传基础狭窄、传统杂交育种难以培育出综合性状优异的抗病新品种，因此，分子育种是培育抗病番木瓜新品种的最有效途径，而建立番木瓜高效遗传转化体系是实现这一途径的重要前提。
番木瓜是最早进行转基因的作物之一，主要集中在抗PRSV转基因的研究。目前，番木瓜转基因研究采用的转基因方法包括基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道技术。在番木瓜转基因研究方面，最早实现的是基因枪法，Fitch等首先利用基因枪法，以番木瓜愈伤组织为转化受体进行遗传转化，获得了抗PRSV毒株HA的转基因番木瓜品系“55-1”，之后不断回交，获得了转基因品种“SunUp”。2017年贾瑞宗等也利用该方法获得了针对海南PRSV毒株的转基因抗病番木瓜。但是，通过该方法获得转基因胚的时间大概需要4个月，而且基因枪转化效率低，且轰击会造成细胞核内DNA双链断裂，在DNA双链修复过程中目的基因及其载体片段会随机插入，这个过程极有可能导致染色体重组等非目标改变，花粉管通道法目前还没有明确的定论。
1993年，Fitch等首先建立了以番木瓜胚性愈伤组织为遗传转化受体的农杆菌共培养转化体系，并通过体胚发生途径获得了2株抗PRSV毒株的HA5-1株系CP基因的转基因番木瓜，之后又通过组培快繁育成2个抗病品系。但由于受体材料的限制，筛选过程中材料损失很大，在方法上迫切的需要优化。我国研究人员也利用农杆菌介导法获得了抗病品种“华农一号”。相较基因枪法，农杆菌转化系统具有拷贝数低，变异少等优点。然而，受体材料是实现番木瓜高效遗传转化的重要因素。前人曾较多地报道利用番木瓜胚性愈伤组织为受体进行遗传转化，进而诱导体细胞胚发生并获得再生植株的途径，存在基因型依赖、体胚发育不同步、胚根生根质量差、体胚发生率和植株再生率低等问题，成为限制番木瓜转基因技术广泛应用的瓶颈。
综上所述，虽然在番木瓜转基因的研究中应用这些方法都可获得转基因植株，但需要进一步改进和完善转化体系，以提高转化效率和增强实用性，而当前的番木瓜遗传转化技术仍需进一步改进和完善，以提高转化效率和增强实用性。
胚性细胞悬浮系(embryogenic cell suspensions，ECS)被认为是理想的遗传转化受体材料。以ECS为受体、利用农杆菌介导等方法在柑橘和香蕉等作物中均获得了转基因植株。番木瓜胚性细胞悬浮系被认为是最理想的转基因受体，但由于悬浮系制备困难，且周期较长，目前还未见相关报导。本领域期待依托于成熟的番木瓜均质ECS和高效再生技术体系，建立一种以番木瓜ECS为遗传转化受体、农杆菌介导的高效遗传转化体系，为番木瓜基因功能研究和分子育种提供技术支撑。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，所述方法以番木瓜ECS为遗传转化受体并基于农杆菌进行介导，可高效实现番木瓜的遗传转化。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，包括如下步骤：
(1)取番木瓜ECS进行增殖培养，得到ECS转化受体，备用；
(2)取含有目的基因的重组质粒转入农杆菌并进行增殖培养，得到农杆菌浸染液；
(3)将所述ECS转化受体与所述农杆菌浸染液进行混合共培养；
(4)收集步骤(3)获得的培养物进行筛选培养，筛选得到生长良好的抗性番木瓜ECS；
(5)将所述抗性番木瓜ECS继续进行再生培养，即得。
具体的，所述步骤(1)中，所述增殖培养步骤的培养基包括：1/2MS培养基+1.5-2.5mg·L-1 2,4-D+350-450mg·L-1谷氨酰胺+50-70g·L-1蔗糖，pH5.5-6.0；
优选的，所述增殖培养步骤的培养基包括：1/2MS培养基+2.0mg·L-12,4-D+400mg·L-1谷氨酰胺+60g·L-1蔗糖，pH5.8。
具体的，所述步骤(2)中，所述含有目的基因的重组质粒为pCAMBIA1301；
所述增殖培养步骤的培养基为含有30-80mg·L-1优选50mg·L-1卡那霉素的YEB液体培养基。
具体的，所述步骤(3)中，所述混合共培养步骤的培养基包括：1/2MS培养基+1.5-2.5mg·L-1 2,4-D+350-450mg·L-1谷氨酰胺+50-70g·L-1蔗糖，pH5.5-6.0；
优选的，所述混合共培养步骤的培养基包括：1/2MS培养基+2.0mg·L-12,4-D+400mg·L-1谷氨酰胺+60g·L-1蔗糖，pH5.8。
具体的，所述步骤(4)中，所述筛选培养步骤的培养基包括：1/2MS培养基+1.5-2.5mg·L-1 2,4-D+350-450mg·L-1谷氨酰胺+50-70g·L-1蔗糖+
80-120μmol·L-1乙酰丁香酮+150-300mg·L-1头孢霉素+3-7mg·L-1潮霉素，pH5.5-6.0；
优选的，所述筛选培养步骤的培养基包括：1/2MS培养基+2.0mg·L-12,4-D+400mg·L-1谷氨酰胺+60g·L-1蔗糖+100μmol·L-1乙酰丁香酮
+200mg·L-1头孢霉素+5mg·L-1潮霉素，pH5.8。
具体的，所述步骤(5)中，所述再生培养步骤包括体胚诱导培养、体胚成熟培养、体胚萌发培养以及生根培养的步骤。
具体的，所述体胚诱导培养和体胚成熟培养步骤的培养基包括：1/2MS盐+MS维生素+40-60mg·L-1肌醇+350-450mg·L-1谷氨酰胺+20-40g·L-1蔗糖+150-300mg·L-1头孢霉素，pH5.5-6.0；
优选的，所述体胚诱导培养和体胚成熟培养步骤的培养基包括：1/2MS盐+MS维生素+50mg·L-1肌醇+400mg·L-1谷氨酰胺+30g·L-1蔗糖
+200mg·L-1头孢霉素，pH5.8。
具体的，所述体胚萌发培养步骤的培养基包括：MS+0.3-0.5mg·L-16-BA+0.01-0.03mg·L-1NAA+20-40g·L-1蔗糖+5-8g L-1琼脂粉
+150-300mg·L-1头孢霉素，pH5.5-6.0；
优选的，所述体胚萌发培养步骤的培养基包括：MS+0.4mg·L-1
6-BA+0.02mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g L-1琼脂粉+200mg·L-1头孢霉素，pH5.8。
具体的，所述生根培养步骤的培养基包括：1/2MS+0.05-0.15mg·L-16-BA+1-3mg·L-1IBA+20-40mg·L-1蔗糖+5-8g·L-1琼脂粉，pH5.5-6.0；
优选的，所述生根培养步骤的培养基包括：1/2MS+0.1mg·L-1
6-BA+2mg·L-1IBA+30mg·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH5.8。
本发明还公开了由所述方法建立的番木瓜高效遗传转化体系。
本发明所述番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，以番木瓜胚性细胞悬浮系(ECS)为遗传转化受体，利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法进行遗传转化，并通过对抗生素浓度筛选、侵染时间、继代培养、抗性胚的诱导与萌发以及植株再生整个过程进行了摸索，最后获得抗性再生植株，成功建立了以番木瓜ECS为转化受体的农杆菌介导的高效遗传转化体系，经农杆菌侵染后的ECS继代3次后，几乎全部为转化细胞。该体系为番木瓜基因功能研究和分子育种提供了新的途径，也为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状分子改良提供新的技术支撑。
本发明所述番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，通过设置不同浓度的头孢霉素和潮霉素处理，观察ECS细胞状态，筛选、确定头孢霉素和潮霉素最适处理浓度分别为200mg·L-1和5mg·L-1。农杆菌和ECS共培养侵染3d后进行清洗，再转到含有头孢霉素和潮霉素的液体筛选培养基上进行继代培养，继代周期为14d。经GUS染色验证表明，继代3次后的ECS几乎全部为转化细胞。将以上ECS转移到液体胚诱导培养基中进行培养，2个月后可获得大量球形体细胞胚，且GUS组织染色为蓝色；将球形体细胞胚转到半固体成熟培养基上培养，2个月后可获得子叶期体细胞胚；子叶期体细胞胚在萌发培养基上光培养30d后，可获得再生芽。任意选取再生芽进行GUS染色，均可染成蓝色；抗性再生芽经促根培养可成功获得再生植株。利用PCR检测抗性再生植株，可以确定GUS基因已经整合到番木瓜基因组中。
本发明所述番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，从受体材料选择、农杆菌共培养方式、侵染时间、筛选培养基选择等方面进行了探索和优化，成功建立了番木瓜胚性细胞悬浮系的高效遗传转化和再生体系。在该技术体系中，经农杆菌侵染后的ECS继代筛选3次后，几乎全部为转化细胞，这些转化细胞经体胚诱导、成熟、萌发和生根过程可成功再生植株，抗性体胚得胚率为43.65％，抗性体胚萌发率为73.26％，植株再生率为80.55％，大大提高了番木瓜遗传转化效率，为番木瓜基因功能研究和分子育种提供了新的途径。
本发明所述番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，基于前期制备的番木瓜胚性悬浮系为受体材料，进行遗传转化，发现在继代3次以后，转化细胞几乎为100％，具有很高的转化效率。同时，本发明所述方法基于建立的胚性细胞悬浮系的高效植株再生技术体系，该体系可以提高细胞胚再生、发育的同步性以及植株再生率，解决了传统报道方法转化效率低、同时再生难的问题。
本发明所述番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，采用液体培养方式进行农杆菌与ECS共培养，在保证悬浮细胞和工程菌充分接触的同时，降低培养时的转速以减缓农杆菌的生长速度，防止其过度生长。在继代筛选时，我们同样使用了液体培养方式，经3次继代筛选后，可使转化细胞高效地快速繁殖，并淘汰非转化细胞，操作简便，同时能得到大量转化胚性悬浮细胞，为后续体胚诱导、萌发、植株再生和转基因材料的获得提供了充足的材料基础。有效解决了传统农杆菌侵染共培养的方法主要采用半固体培养法而容易污染且容易导致受体严重褐化甚至损失的缺陷。
本发明所述番木瓜高效遗传转化体系的建立方法，利用潮霉素等抗生素在一定程度上会影响植物正常生长发育，应用本方法经过3代及3代以上的筛选培养后，几乎所有的ECS都已经是转化的材料，所以在后续胚诱导、体胚萌发和生根时可适当降低或不添加抗生素，可显著提高获得转基因材料的几率。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为头孢霉素和潮霉素浓度的筛选结果；其中，A为不同浓度头孢霉素处理下ECS的生长情况；B为不同浓度潮霉素处理下ECS的生长情况；
图2为液体筛选各代ECS的GUS表达情况；其中，A为未转化ECS的GUS染色情况；B为液体筛选第一代ECS的GUS染色情况；C为液体筛选第二代ECS的GUS染色情况；D为液体筛选第三代ECS的GUS染色情况；
图3为抗性胚的诱导和成熟情况；其中，A-B为在液体培养基中进行体细胞胚的诱导情况；C为抗性体细胞胚GUS染色情况；D-E为抗性体细胞胚诱导成熟形成子叶期体细胞胚；
图4为植株再生结果；其中，A为绿色子叶的形成；B为再生芽；C为未转化芽的GUS染色；D为转化芽的GUS染色；E为抗性再生植株；
图5为抗性再生植株的PCR鉴定结果；其中，第1泳道为以未转化番木瓜植株DNA为模板进行的PCR扩增、电泳结果；第2-11泳道分别为以具有GUS活性的10株番木瓜转基因植株DNA为模板进行的PCR扩增、电泳结果，M：D2000。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明。
本发明如下实施例中，所利用的遗传转化受体为番木瓜“紫晖”品种的ECS，由广东省农业科学院果树研究所利用未成熟合子胚为外植体，经胚性愈伤组织诱导、增殖、筛选和液体振荡培养等过程建立获得。供试菌株为根癌农杆菌菌株EHA105，供试载体为pCAMBIA1301：含有β-葡萄糖甘酸酶基因(β-glucuronidase，GUS)和潮霉素磷酸转移酶基因(Hygromycin B phosphotransferase，HPT)。本研究所用培养基组成详见下表1。
表1番木瓜胚性细胞悬浮系及遗传转化所用培养基
实施例1头孢霉素和潮霉素最适浓度的筛选
本实施例中，在液体筛选培养基中添加头孢霉素主要是为了抑制共培养之后根癌农杆菌的生长，同时为了确保头孢霉素不会对ECS的生长造成影响。
为了明确液体增殖培养基中可抑制根癌农杆菌生长的头孢霉素(Cef)浓度和筛选阳性植株的潮霉素浓度，本实施例在ML培养基中分别添加了不同浓度的头孢霉素(0、100、200、300、400mg L-1)和潮霉素(0、3、5、7、10mg L-1)，在黑暗条件下，于(27±1)℃、110r·min-1振荡培养，观察ECS增殖生长情况，并利用显微镜观察细胞状态，确定合适的筛选浓度。
在ML培养基中分别添加0、100、200、300、400mg·L-1头孢霉素进行暗培养，观察其对ECS增殖生长状态和细胞形态的影响，培养2周后，结果如图1中A所示。可见，头孢霉素浓度为0、100、200mg·L-1时，胚性悬浮细胞为圆形或椭圆形，生长正常；当头孢霉素浓度达到300mg·L-1时，悬浮细胞颜色变深，开始褐化，通过光学显微镜观察，部分细胞伸长变型，ECS增殖生长受到影响；而当浓度达到400mg·L-1时，出现较多的游离长月型异常细胞，ECS增殖生长受到明显影响。以有效抑制农杆菌生长且不影响番木瓜ECS生长为原则，确定200mg·L-1头孢霉素为最适浓度。
在ML培养基中分别添加0、3、5、7、10mg·L-1潮霉素，观察其对ECS增殖生长状态和细胞形态的影响，培养2周后，结果如图1中B所示。可见，当潮霉素浓度为5mg·L-1时，ECS出现轻微褐化，但细胞形态正常，增殖量正常；当浓度达到7mg·L-1和10mg·L-1时，ECS颜色变白，生长状态差，增殖量小，显微镜下可看到大量弯月形和长条形异常细胞，生长受到严重影响。以不改变细胞形态且可筛选抗性悬浮细胞为目标，确定5mg·L-1潮霉素为最适浓度。
实施例2工程菌的制备
利用购买的重组质粒pCAMBIA1301，按照常规方式获得含有目的基因的根癌农杆菌，并在YEB(含有50mg·L-1卡那霉素)的固体培养基上划线，于27±1℃条件下培养，然后挑取单菌落继续在含有50mg·L-1卡那霉素的YEB液体培养基中，于150r·min-1振荡培养至对数期(OD600＝0.8-1.0)，将菌液离心弃去上清后，重悬于含有100μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的液体共培养培养基中，制备工程菌，备用。
实施例3侵染与液体共培养
取在ML液体培养中继代培养10d的ECS，经离心去上清后，加入经实施例2中获得的工程菌液，在(27±1)℃、黑暗条件下静置1-2h，然后在(27±1)℃、黑暗、50r·min-1振荡条件下共培养2d，将培养物离心、去除上清后，清洗3次，转移至含有100μmol·L-1AS、200mg L-1头孢霉素和5mg L-1潮霉素的液体筛选培养基LSM中，继续黑暗培养，每14d继代一次。
本实施例中，将工程菌侵染2d后的ECS用ML培养基清洗干净，转移到液体筛选培养基LSM中进行继代培养。在继代的同时，吸取部分ECS进行GUS染色，与未转化的ECS对照(见图2中A)相比，在筛选培养第1代的ECS中可见少许被染上蓝色的转化细胞团(见图2中B)；继续进行第2代筛选培养，转化细胞在筛选压力下不断增殖，未转化的细胞会发生褐化死亡，能染上蓝色的细胞团比例明显增多(见图2中C)；在第3代ECS中，ECS几乎全部可染上蓝色，即几乎全部为转化细胞(见图2中D)。由此可见，经过3代或3代以上的筛选培养，可以获得生长良好的抗性番木瓜ECS。
实施例4抗性筛选和植株再生
按实施例3中记载方法，连续继代3次以上。每次继代培养时取0.1mL细胞密实体积的ECS进行GUS染色实验。取液体筛选培养3代的ECS，静置后去上清，将培养物转移至液体体胚诱导培养基MSI中诱导体细胞胚，每14d更新一次培养基，黑暗条件下培养2个月统计体细胞胚发生数量。将获得的球形体细胞胚转移到半固体MSI上成熟培养2个月，直至获得成熟的子叶期体胚。将子叶期抗性体胚转移至体胚萌发培养基MG上进行萌发培养，1个月后统计体细胞胚萌发率。培养条件为：(27±1)℃、12h/12h光周期、54μmol·m-2·s-1光照强度。然后，将萌发的分化芽转移至生根培养基MR，促进茎部和根系发育，培养1个月后获得完整的转化植株，统计植株再生率。同时以未侵染的ECS为对照，进行体胚诱导、成熟和萌发培养，直到获得再生植株。
本实施例中，将继代3次的ECS先转到液体体胚诱导和成熟培养基MSI上，2个月后可见大量白色圆球形体细胞胚(见图3中A-B)。对抗性球形胚进行GUS染色鉴定表明，诱导形成的抗性球形胚几乎全部都可以染上蓝色，即全部为转化体细胞胚(见图3中C)。经统计，筛选继代3次的番木瓜ECS具有很强的体细胞胚发生能力，平均抗性体细胞胚获得率为23.2×103个/mL PCV，抗性体胚得胚率为43.65％，与对照ECS的平均体细胞胚获得率相近。将球形体细胞胚转移到半固体MSI上培养2个月，可逐步发育为成熟的子叶期体细胞胚(见图3中D-E)。
继续挑选子叶期体细胞胚接种于体细胞胚萌发培养基MG上进行光培养，3d后可见体细胞胚开始萌发，10d后可见到萌发的绿色子叶(见图4中A)，同时体细胞胚根段开始出现愈伤化。培养30d后，体细胞胚已具备完整的下胚轴、子叶和芽(见图4中B)。经统计，经遗传转化的子叶期体细胞胚萌发率为73.26％，低于对照(97.58％)。以未转化芽作对照，任意切取再生抗性芽进行GUS染色鉴定，均可被染成蓝色(见图4中C-D)。再生芽于生根培养基MR上培养10d后开始生根，1个月后可获得发育良好的小植株，植株再生率为80.55％，与对照(81.36％)相近(见图4中E)。
实施例5 GUS基因的检测及阳性植株的鉴定
GUS基因的检测
通过GUS组织染色，主要检测对象：共培养后继代筛选的第一代、第二代和第三代的ECS细胞团、由共培养筛选3个继代周期后的ECS诱导获得的成熟体细胞胚及其再生芽、以及相应的对照材料。
阳性植株的分子鉴定
利用CTAB法提取番木瓜叶片DNA，并以此为模板，利用如下GUS基因特异性引物：
LP：5'-TTACGGCAAAGTGTGGGTCA-3'；
RP：5'-TCGGTGATGATAATCGGCTG-3'；
进行PCR扩增检测，扩增长度为1233bp，PCR反应条件为：94℃2min；98℃10s、58℃30s、68℃1min，33个循环，68℃延伸5min。PCR产物利用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后利用凝胶成像系统拍照保存，结果见附图5，其中，第1泳道为以未转化番木瓜植株DNA为模板进行的PCR扩增、电泳结果；第2-11泳道分别为以具有GUS活性的10株番木瓜转基因植株DNA为模板进行的PCR扩增、电泳结果，M：D2000。
本实施例中，为了确定GUS基因在番木瓜基因组中的整合情况，我们对获得的具有GUS活性的10株(2-11号泳道)番木瓜转基因植株进行了PCR检测。电泳结果表明，与未转化的番木瓜植株(1号泳道)相比，在获得的具有GUS活性的番木瓜转基因株系中均可增出目的条带(见图5)，进一步说明GUS基因转化成功，已经整合到番木瓜基因组中。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (6)
1.一种番木瓜遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取番木瓜ECS进行增殖培养，得到ECS转化受体，备用；
所述增殖培养步骤的培养基为：1/2MS培养基+1.5-2.5mg·L-1 2,4-D +350-450mg·L-1谷氨酰胺+ 50-70g·L-1蔗糖，pH5.5-6.0；
（2）取含有目的基因的重组质粒转入农杆菌并进行增殖培养，得到农杆菌浸染液；
（3）将所述ECS转化受体与所述农杆菌浸染液进行混合共培养；取在ML液体培养中继代培养10 d的ECS，经离心去上清后，加入步骤（2）所述的农杆菌浸染液，在（27±1）℃、黑暗条件下静置1-2 h，然后在（27±1）℃、黑暗、50r•min-1振荡条件下共培养2d；所述混合共培养步骤的培养基为：1/2MS培养基+1.5-2.5mg·L-1 2,4-D +350-450mg·L-1谷氨酰胺+ 50-70g·L-1蔗糖，pH5.5-6.0；
（4）收集步骤（3）获得的培养物进行筛选培养，筛选得到生长良好的抗性番木瓜ECS；所述筛选培养的方法为：将培养物离心、去除上清后，清洗3次，转移至含有100μmol•L-1AS、200mg L-1头孢霉素和5mg L-1潮霉素的液体筛选培养基LSM中，继续黑暗培养，每14d继代一次；
所述筛选培养步骤的培养基为：1/2MS培养基+1.5-2.5mg·L-1 2,4-D + 350-450mg·L-1谷氨酰胺+ 50-70g·L-1蔗糖+ 80-120μmol·L-1乙酰丁香酮+200mg·L-1头孢霉素+5mg·L-1潮霉素，pH5.5-6.0；
（5）将所述抗性番木瓜ECS继续进行再生培养，即得。
2.根据权利要求1所述番木瓜遗传转化体系的建立方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述含有目的基因的重组质粒为pCAMBIA1301；
所述增殖培养步骤的培养基为含有30-80mg·L-1卡那霉素的YEB液体培养基。
3.根据权利要求1或2所述番木瓜遗传转化体系的建立方法，其特征在于，所述步骤（5）中，所述再生培养步骤包括体胚诱导培养、体胚成熟培养、体胚萌发培养以及生根培养的步骤。
4.根据权利要求3所述番木瓜遗传转化体系的建立方法，其特征在于，所述体胚诱导培养和体胚成熟培养步骤的培养基为：1/2MS盐+MS维生素+40-60mg·L-1肌醇+350-450mg·L-1谷氨酰胺 + 20-40g·L-1蔗糖+150-300mg·L-1头孢霉素，pH5.5-6.0。
5.根据权利要求3所述番木瓜遗传转化体系的建立方法，其特征在于，所述体胚萌发培养步骤的培养基为：MS+ 0.3-0.5mg·L-1 6-BA+0.01-0.03mg·L-1 NAA+20-40g·L-1蔗糖+5-8g L-1琼脂粉+150-300mg·L-1头孢霉素，pH5.5-6.0。
6.根据权利要求3所述番木瓜遗传转化体系的建立方法，其特征在于，所述生根培养步骤的培养基为：1/2MS+0.05-0.15mg·L-1 6-BA+1-3mg·L-1 IBA +20-40mg·L-1蔗糖+5-8g·L-1琼脂粉，pH5.5-6.0。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310683654.8A CN116590333B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种番木瓜遗传转化体系的建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310683654.8A CN116590333B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种番木瓜遗传转化体系的建立方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116590333A CN116590333A (zh) | 2023-08-15 |
| CN116590333B true CN116590333B (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=87589931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310683654.8A Active CN116590333B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种番木瓜遗传转化体系的建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116590333B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040086918A (ko) * | 2003-04-03 | 2004-10-13 | 최용의 | 아그로박테리움을 통한 고려인삼 형질전환 방법 |
| WO2005121347A2 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-22 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Recombinant constructs for use in reducing gene expression |
| CN1900291A (zh) * | 2006-07-24 | 2007-01-24 | 华中农业大学 | 一种农杆菌介导的培育悬铃木转基因植株的方法 |
| CN101096673A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-01-02 | 中山大学 | 利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法 |
| CN101654684A (zh) * | 2009-09-07 | 2010-02-24 | 广东省农业科学院果树研究所 | 利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法 |
| CN111454983A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-07-28 | 福建农林大学 | 一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法 |
| CN111500620A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-08-07 | 福建农林大学 | 一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法 |
| CN111771724A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-16 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种基于单细胞起源的番木瓜高效植株再生方法 |
| CN116162649A (zh) * | 2023-04-06 | 2023-05-26 | 南京农业大学 | 一种农杆菌介导的荆芥遗传转化方法及其应用 |
-
2023
- 2023-06-09 CN CN202310683654.8A patent/CN116590333B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040086918A (ko) * | 2003-04-03 | 2004-10-13 | 최용의 | 아그로박테리움을 통한 고려인삼 형질전환 방법 |
| WO2005121347A2 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-22 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Recombinant constructs for use in reducing gene expression |
| CN1900291A (zh) * | 2006-07-24 | 2007-01-24 | 华中农业大学 | 一种农杆菌介导的培育悬铃木转基因植株的方法 |
| CN101096673A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-01-02 | 中山大学 | 利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法 |
| CN101654684A (zh) * | 2009-09-07 | 2010-02-24 | 广东省农业科学院果树研究所 | 利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法 |
| CN111454983A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-07-28 | 福建农林大学 | 一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法 |
| CN111500620A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-08-07 | 福建农林大学 | 一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法 |
| CN111771724A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-16 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种基于单细胞起源的番木瓜高效植株再生方法 |
| CN116162649A (zh) * | 2023-04-06 | 2023-05-26 | 南京农业大学 | 一种农杆菌介导的荆芥遗传转化方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 番木瓜均质胚性细胞悬浮系的建立和高效植株再生;魏岳荣等;果树学报;第40卷(第2期);摘要、3.3部分 * |
| 番木瓜成熟种子的体细胞胚简易诱导和植株再生;魏岳荣;陈彩霞;杨敏;黄炳雄;杨护;;分子植物育种(第12期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116590333A (zh) | 2023-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Damm et al. | Regeneration of fertile plants from protoplasts of different Arabidopsis thaliana genotypes | |
| Harini et al. | Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of chilli (Capsicum annuum L.) | |
| JPH10117776A (ja) | インディカイネの形質転換方法 | |
| US5792927A (en) | Genetically transformed rose plants and methods for their production | |
| De Benedetti et al. | Agrobacterium-mediated transformation with rol genes of Lilium longiflorum Thunb. | |
| CN114303954A (zh) | 墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法 | |
| Nakano et al. | Protoplast culture and plant regeneration of several species in the genus Dianthus | |
| US5589613A (en) | Carnation plants and methods for their transformation and propagation | |
| US20060212973A1 (en) | Agrobacterium-mediated transformation of turfgrass | |
| WO1992000371A1 (en) | Rose plants and methods for their production and genetic transformation | |
| AU782198C (en) | High-efficiency agrobacterium-mediated transformation of cotton using petiole explants | |
| US6133035A (en) | Method of genetically transforming banana plants | |
| CN115896160B (zh) | 一种利用发根农杆菌高效快速获得苹果稳定转基因植株的方法 | |
| CN116590333B (zh) | 一种番木瓜遗传转化体系的建立方法 | |
| CN105441479B (zh) | 版纳甜龙竹转基因体系的建立方法 | |
| CN110195077B (zh) | 一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法 | |
| CN112931227B (zh) | 一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法 | |
| CN113755521B (zh) | 一种由农杆菌介导的草莓‘甜查理’遗传转化体系的构建方法 | |
| JP4228044B2 (ja) | シバ属植物の再分化植物体及び形質転換植物体 | |
| US20010007157A1 (en) | Genetically transformed rose plants and methods for their production | |
| Soniya et al. | In vitro organogenesis and genetic transformation in popular Cucumis sativus L. through Agrobacterium tumefaciens | |
| US4659668A (en) | Controlled regeneration of corn plants and breeding strategies therewith | |
| Ziv | Micropropagation of Cucumis spp. | |
| CN114410678B (zh) | 一种建立农杆菌介导中国水仙高效遗传转化体系的方法 | |
| Jia et al. | Two Agrobacterium-mediated transformation protocols of white Clover (Trifolium repens) through the callus system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |