CN111500620A - 一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法，将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，后，再在优化培养基M13上诱导外植体长愈伤，即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。该转化方法与传统番木瓜转化相比，直接使用预培养的下胚轴作为外植体，避免了愈伤诱导后扩繁的4‑5个月时间，显著缩短转化周期。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法。
背景技术
番木瓜是一种主要的热带水果，也是鲜果市场上的主要供应水果。番木瓜同时也被加工成饮料、果酱、干果和甜点，其青果、叶片和花也可以作为蔬菜(Watson,1997)。目前番木瓜的育种主要采用传统育种，由于制约着番木瓜的生产的主要为番木瓜环斑型花叶病毒病，我们用常规杂交方法难以赋予番木瓜栽培品种以野生番木瓜中的抗性特性，提高番木瓜产量，改良番木瓜品质仍是当前重要任务。我们通过转基因技术可以定向的改变植物的抗性，产量，品质等方面。但是由于现有的转基因方法中番木瓜诱导愈伤组织的周期很长，并且体系不是特别稳定，严重制约着番木瓜育种产业的发展。因此建立一种简单高效的番木瓜转基因方法，对番木瓜分子育种及基因功能研究具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，再移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，将苗的下胚轴经伤口膨大处理即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。
作为进一步改进的，所述消毒为在无菌环境中，将番木瓜种子先后经过体积浓度为70～80％的酒精、体积浓度为3～4％的NaClO溶液和质量浓度为0.05～0.15％氯化汞消毒，用无菌水清洗数次，这种消毒方式显著抑制了木瓜内生菌的繁殖。
作为进一步改进的，所述浸泡为将番木瓜种子浸泡在体积浓度为18～22％的NaClO溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床3.5～4.5h；然后将番木瓜种子从NaClO溶液中取出，用无菌水清洗数次，浸泡在浓度为0.5～1.5mol/L的KNO3溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床20～26h，番木瓜种子经过KNO3的处理，显著提高了种子的萌发率。
作为进一步改进的，所述抗生素为浓度为450～550mg/L的羧苄青霉素。
作为进一步改进的，所述萌发长芽为将番木瓜种子从KNO3溶液中取出，用无菌水清洗数次，放入含有抗生素的无菌水中，置于28～32℃，110～130rpm摇床，每天更换含有抗生素的无菌水，直至番木瓜种子出芽，这种方法保证了种子萌发过程中不被污染。
作为进一步改进的，所述伤口膨大处理为当待黑暗生长的苗高度达8～10cm，顶端的两片子叶张开时，取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上培养5～7天，伤口膨大处理对于转化的成功，转化后诱导愈伤的形成非常关键。
作为进一步改进的，所述K4培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L。
作为进一步改进的，所述M13培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L，脯氨酸对于显著缩短愈伤生长周期具有重要作用。
本发明还提供一种应用上述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的农杆菌介导的转化方法，包括以下步骤：
S1：在无菌环境中，用含有目的基因的农杆菌的侵染液侵染所述番木瓜下胚轴农杆菌转化受体，吹干；
S2：将侵染过的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体转移至k4培养基上加无菌滤纸共培22～26小时，吹干，置于k4+T培养基上培养32天后，转移至M13+T培养基中共抑菌培养2～3个月，诱导外植体长愈伤随后出芽，每月更换新的M13+T培养基，直至不再出芽为止；
S3：将步骤S2中长出的芽挑出，转接至MBNT培养基上置于光照下恢复培养20～30天，接下来置于MBNTH培养基上光照下培养3个月，筛选存活下来的绿芽；
S4：将步骤S3中筛选的绿芽转接至MBNT培养基中继续培养，每月更换一次新培养基，待绿芽长成2～2.5cm高的幼苗时，将幼苗从基部切掉，放入Rooting培养基中，培养3～5周进行生根；
S5：将步骤S4中生根的幼苗进行PCR和Southern鉴定；
S6：将步骤S4得到的阳性幼苗转移至蛭石+1/2MS培养基中，液体的1/2MS培养基浸湿蛭石即可，培养7天，观察有细根和根毛长出时，放入培养土中，于培养箱里光照培养，待苗生长的健壮，即可转移至大棚。
作为进一步改进的，所述k4培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L；k4+T培养基为所述k4培养基中加入特美汀200mg/L；所述M13+T的培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L，特美汀100mg/L；所述MBNTH培养基为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后加6BA 0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，特美汀100mg/L，潮霉素50mg/L；所述MBNT培养基即MBNTH培养基不加潮霉素其他不变的培养基；所述Rooting培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 5.5～6.0，高压灭菌后加IBA 0.2mg/L。
作为进一步改进的，所述侵染液含有农杆菌的OD600值为0.05～0.08。本发明的有益效果是：
本发明直接利用番木瓜下胚轴作为外植体直接转化后再诱导愈伤分化出芽，长出的芽经过抗性筛选最终筛选到转基因植株。这种方式避免了愈伤组织的四到五个月的扩繁时间，显著缩短了转化周期。
本发明所提供的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法及番木瓜农杆菌介导的转化方法，外植体的获得操作简单易行，愈伤组织诱导所需培养基简单高效，目的基因转化周期短，效率高，这个方法的应用为研究番木瓜基因功能、发掘有益基因并应用于育种具有非常重要的价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例的番木瓜种子萌发长芽的图。
图2是本发明实施例的切好后放置于K4培养基上的番木瓜下胚轴的图。
图3是本发明实施例的转到M13+T培养基上的番木瓜下胚轴的图。
图4是本发明实施例的农杆菌侵染后在MBNTH培养基上挑出的抗性绿芽的图。
图5是本发明实施例的筛选出的抗性绿芽长大成苗的图。
图6是本发明实施例的目的基因35s-CpYh-1以35s-CpYh-1F/R为引物的扩增图。其中，1,2泳道为引物35s-CpYh-1F/R扩增片段。
图7是本发明实施例的重组载体以HYG-F/R和35s-CpYh-1F/R为引物的扩增图。其中，1,2泳道为载体序列HYG-F/R扩增结果，3,4泳道为35s-CpYh-1F/R扩增结果。
图8是本发明实施例的幼苗的PCR鉴定结果图。
图9是本发明实施例的幼苗的Southern鉴定结果图。其中，1-8泳道为1-8转基因株系，9为质粒对照。
图10是本发明实施例的幼苗的qPCR检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种番木瓜农杆菌转化受体的制备方法
包括以下步骤：
(1)种子消毒：取木瓜种子150～200颗于灭过菌的组培瓶中，①、体积浓度为75％的酒精消毒1min，无菌水清洗3～5遍，②、入体积浓度为3.5％的NaClO溶液消毒20min，无菌水清洗3～5遍，③、转入质量浓度为0.1％的升汞消毒10min，无菌水清洗3～5遍后，④、将种子用无菌镊子放到灭过菌的锥形瓶中，加入100ml体积浓度为20％的NaClO溶液，放入28℃，180rpm摇床4h；此过程均在超净工作台操作。
(2)1M KNO3处理：取步骤(1)处理得到的种子，从20％NaClO溶液中取出，用无菌水清洗3～5遍，换成1mol/L的KNO3溶液，置于28℃，180rpm摇床24h。
(3)萌发换水：取步骤(2)处理得到的种子，从1mol/L的KNO3溶液中取出，用无菌水清洗3～5遍，换成含羧苄的无菌水，同时换新的灭过菌的锥形瓶，将漂浮的种子挑出丢弃，置于30℃，120rpm摇床，每天换无菌水，直至种子。出芽如图1所示，刚发芽的种子，可见白色下胚轴，种子萌发率达100％。
(4)转移至水琼脂：待步骤(3)处理得到的种子芽长约0.5cm时，将其转移至水琼脂培养基上，将芽竖直轻轻插入水琼脂中，每瓶可放10颗左右出芽种子，直至出苗。
(5)切下胚轴，进行伤口膨大处理：待步骤(4)处理得到的芽长成苗，高度为8～10cm，顶端的两片子叶张开时，可取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上预培养5～7天，即得转化体，可以进行农杆菌侵染转化，一个月后转接。
在本发明中，所述番木瓜优选采用中白番木瓜品种。
在步骤(3)中所述含羧苄(cb)的无菌水为100ml水中加入50μl cb母液，终浓度为500mg/L。
在步骤(4)中所述水琼脂培养基是按照9g/L的琼脂配置的，并高压灭菌后使用。
在步骤(5)中所切的下胚轴以两片子叶正好抬头刚及组培瓶瓶口为佳，切记不可过长太老，否则难以膨化。
在步骤(5)中所述K4培养基为：1/2MS即2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L(母液浓度1mg/ml)，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 6.1左右，高压灭菌后加激动素(KT)0.5mg/L。
实施例2
目的基因载体构建
含有35s-CpYh-1目的基因的重组载体是按照包括如下步骤的方法构建的：以SunUp品种番木瓜的cDNA为模板，采用引物35s-CpYh-1F和35s-CpYh-1R进行PCR扩增，将扩增产物735bp的片段(如图6所示)以同源重组的方式插入到质粒pMC202(购自ABRC官网)载体的M13通用引物之间，得到重组载体pMC202-35s-CpYh-1，重组载体用引物HYG-F/R和引物35s-CpYh-1F/R扩增确定载体构建成功(如图7所示)。
目的基因35s-CpYh-1的核苷酸序列如SEQ IDNO.01所示：
ATGGAGTTTGAGGATCAAGATGAGCAAGATGAAGAGATGGGAATGGGAACTGGTTGTGGGTCACTCCGTAACTCGACCGGGGTCAAACTGGGCGGTCCGAAGGCTGTGGGGACGGGGACAGGGACGGATCATCGGCAGAACAGGAAACCGAGGTATAGAGAGTGTCTGAAGAACCACGCGGTGGGAATTGGTGGCCAGGCCGTGGATGGGTGCGGCGAGTTCATGCCGGCGGGGATGGAGGGCTCGCTTGATGCTTTGAAATGCGCTGCTTGTAACTGTCATCGTAATTTCCACCGTAAGGAGACGGAACCGCCGTCATCTTCGGCGGGTGAGTTCTACCACCCGCATCCCCATCAGGTGATGCCGCAGTTCGCAGCCTATTATCGGGGATCGTCGGGGTTTTTGCAGGTGGCGGGGGATGGACAGCATCAGAGGCCGCTGCCGCTGCGGTCGACGTCCAGTAGGCAGAGCAGGGAGAGGGAGTTTGACCAAGAGGACATGTCGAACCCGATGAGCGGCGCCGGCGGAAGTGGGTCGAGCAGGAAGAGGTTCAGGACCAAGTTCACGCAGGAGCAGAAGGAGAGGATGCTGGGGCTGGCGGAGAGGATGGGATGGAGGATCCAGAAGCACGACGAGGAAGTGGTGCAGCAGTTTTGCGACGAGACTGGACTGAAGCGACATGTTCTCAAGGTGTGGATGCATAATAACAAGCAAACCCTGGGTATGAAACCCTAG。
该目的基因35s-CpYh-1属于转录因子ZF-HD(Zinc-finger homeodomain)，该转录因子在植物生长发育中扮演着重要角色。根据对该基因在番木瓜不同性别花上的分析，发现该基因存在于性别特异区域，在调控植物生长发育中扮演着重要的角色，此外它还与植物应对胁迫有关。ZF-HD家族可分为ZHD和MIF两个亚族。而ZF-HD最初是在水稻中被鉴定出来的，是一类新型的锌指结构同源域蛋白，能够间接的调控编码C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因。
引物35s-CpYh-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.02所示：GACCTCGACTCTAGAACTAGTATGGAGTTTGAGGATCAAGATGAGCA AG。
引物35s-CpYh-1R的核苷酸序列如SEQ IDNO.03所示：TTTACTCATTTTTTCTACCGGTACCGGGTTTCATACCCAGGGTTTGC。
引物HYG-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.04所示：CCACGGCCTCCAGAAGAAGATG。
引物HYG-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.05所示：CGAAGAATCTCGTGCTTTCAGC。
构建成功后转化到农杆菌中，使用液体LB溶液进行摇菌。其中卡那霉素的终浓度为50mg/L、利福平的终浓度为100mg/L。将菌液于50mL离心管中18℃3500rpm条件下离心10min，加入1/2MS重悬液(液体MS培养基，配方：1/2MS即2.215g/L，蔗糖30g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后放至常温)重悬，使其最终OD600值在0.5-0.8左右即可进行侵染。
实施例3
一种应用上述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的农杆菌介导的转化方法
包括以下步骤：
1.侵染：将用1/2MS液体培养基悬浮的含有目的基因的农杆菌侵染液OD值调整为0.5～0.8，再稀释10倍，即为制得的侵染液。可用侵染液将上述制备方法得到的番木瓜下胚轴段浸泡8分钟左右，倒掉上清液，用滤纸吸干，吹至下胚轴段表面无水状即可，不可吹太久。(预培养五天后细胞分裂比较严重，所以侵染直接在无菌培养皿中做)。
2.共培养：将步骤(1)侵染过的下胚轴置于k4培养基上加无菌滤纸共培24小时，并将共培好的下胚轴于超净台内吹干。共培过程中若发现长菌的，需及时丢弃。
3.抑菌：将步骤(2)吹干的下胚轴置于k4+T培养基(k4培养基加入特美汀200mg/L)上，约一个月更换新的M13+T(1/2MS即2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L(母液浓度1mg/ml)，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 6.1左右，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L，特美汀100mg/L)培养基，共抑菌培养，每个月都需要转接，诱导外植体长愈伤随后出芽，直至不再出芽为止。
4.筛选：2～3个月后，下胚轴段长出的芽挑出，转接至MBNT培养基上(6BA和NAA为0.2mg/L，特美汀100mg/L)置于光照下20～30天恢复培养，接下来置于MBNTH培养基上(6BA和NAA为0.2mg/L，特美汀100mg/L和Hygr25mg/L)置于光照下筛选。每月更换一次新的MBNTH培养基。筛选三个月后进行再生培养。
5.再生：将步骤(4)中筛选存活下来的绿芽转接至MBNT培养基中。每一个月左右更换一次新培养基，待绿芽长大成大一些植株时，再转移至含MBNTH培养基的培养瓶中再次筛选，筛选时间视情况而定，并且根据幼苗生长情况进行培养基的更换。待长到2cm高，叶子和生长点都比较正常时，进行生根。
6.生根：将步骤(5)得到的幼苗从基部切掉，不保留块状的组织部分，放入含生根培养基Rooting(IBA为0.2mg/L)的培养瓶中，约3～5周会有根长出。
7.将生根得到的幼苗进行PCR和Southern鉴定。
PCR使用引物为：正向引物SEQ IDNO.06所示：GCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACT，反向引物为SEQ IDNO.07所示：TTCTACCACCCGCATCCCCATCA。PCR结果如图所述，结果显示，13株植株中有11株为阳性苗，阳性率达84.6％。Southern鉴定结果如图9所述，结果显示1-8株系都能检测到阳性条带，说明我们得到的转基因植株都是单拷贝插入。
通过qPCR检测了转基因株系2号和9号株系的表达水平，显示植株中CpYh-1超表达，并且植株中生长素合成相关基因YUC与生长素信号通路基因IAA表达都发生变化，这表明该基因可能参与调控生长素信号通路。
8.炼苗：待步骤(7)得到的阳性幼苗根长得比较多时，转移至蛭石+液体的1/2MS培养基中，液体培养基不要太多，只浸湿蛭石即可。培养7天。观察有细根和根毛长出时，放入培养土中，于培养箱里光照培养，培养箱里的湿度非常重要。待苗生长的健壮，即可转移至大棚。
步骤4所述MBNTH培养基为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后加6BA 0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，特美汀100mg/L，潮霉素50mg/L；
步骤4所述MBNT培养基即MBNTH培养基不加潮霉素其他不变的培养基；
步骤6所述Rooting培养基为：1/2MS即2.215g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后加IBA 0.2mg/L。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法
<130> 2020
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 735
<212> DNA
<213> Carica papaya
<400> 1
atggagtttg aggatcaaga tgagcaagat gaagagatgg gaatgggaac tggttgtggg 60
tcactccgta actcgaccgg ggtcaaactg ggcggtccga aggctgtggg gacggggaca 120
gggacggatc atcggcagaa caggaaaccg aggtatagag agtgtctgaa gaaccacgcg 180
gtgggaattg gtggccaggc cgtggatggg tgcggcgagt tcatgccggc ggggatggag 240
ggctcgcttg atgctttgaa atgcgctgct tgtaactgtc atcgtaattt ccaccgtaag 300
gagacggaac cgccgtcatc ttcggcgggt gagttctacc acccgcatcc ccatcaggtg 360
atgccgcagt tcgcagccta ttatcgggga tcgtcggggt ttttgcaggt ggcgggggat 420
ggacagcatc agaggccgct gccgctgcgg tcgacgtcca gtaggcagag cagggagagg 480
gagtttgacc aagaggacat gtcgaacccg atgagcggcg ccggcggaag tgggtcgagc 540
aggaagaggt tcaggaccaa gttcacgcag gagcagaagg agaggatgct ggggctggcg 600
gagaggatgg gatggaggat ccagaagcac gacgaggaag tggtgcagca gttttgcgac 660
gagactggac tgaagcgaca tgttctcaag gtgtggatgc ataataacaa gcaaaccctg 720
ggtatgaaac cctag 735
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gacctcgact ctagaactag tatggagttt gaggatcaag atgagcaag 49
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tttactcatt ttttctaccg gtaccgggtt tcatacccag ggtttgc 47
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccacggcctc cagaagaaga tg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
cgaagaatct cgtgctttca gc 22
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gcaagtggat tgatgtgata tctccact 28
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ttctaccacc cgcatcccca tca 23
Claims (10)
1.一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，再移植到琼脂培养基中在黑暗的条件下培养至长苗，将苗的下胚轴经伤口膨大处理，即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。
2.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述消毒为在无菌环境中，将番木瓜种子先后经过体积浓度为70～80％的酒精、体积浓度为3～4％的NaClO溶液和质量浓度为0.05～0.15％氯化汞消毒，用无菌水清洗数次。
3.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述浸泡为将番木瓜种子浸泡在体积浓度为18～22％的NaClO溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床3.5～4.5h；然后将番木瓜种子从NaClO溶液中取出，用无菌水清洗数次，浸泡在浓度为0.5～1.5mol/L的KNO3溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床20～26h。
4.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述抗生素为浓度为450～550mg/L的羧苄青霉素。
5.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述萌发长芽为将番木瓜种子从KNO3溶液中取出，用无菌水清洗数次，放入含有抗生素的无菌水中，置于28～32℃，110～130rpm摇床，每天更换含有抗生素的无菌水，直至番木瓜种子出芽。
6.根据权利要求1所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述伤口膨大处理为当待长出的苗的高度达8～10cm，顶端的两片子叶张开时，取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上培养5～7天。
7.根据权利要求6所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述K4培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L。
8.一种应用权利要求1至7所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的农杆菌介导的转化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：在无菌环境中，用含有目的基因的农杆菌的侵染液侵染所述番木瓜下胚轴农杆菌转化受体，吹干；
S2：将侵染过的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体转移至k4培养基上加无菌滤纸共培22～26小时，吹干，置于k4+T培养基上培养28～32天后，转移至M13+T培养基中共抑菌培养2～3个月，诱导外植体长愈伤随后出芽，每月更换新的M13+T培养基，直至不再出芽为止；
S3：将步骤S2中长出的芽挑出，转接至MBNT培养基上置于光照下恢复培养20～30天，接下来置于MBNTH培养基上光照下培养3个月，筛选存活下来的绿芽；
S4：将步骤S3中筛选的绿芽转接至MBNT培养基中继续培养，每月更换一次新培养基，待绿芽长成2～2.5cm高的幼苗时，将幼苗从基部切掉，放入Rooting培养基中，培养3～5周进行生根；
S5：将步骤S4中生根的幼苗进行PCR和Southern鉴定；
S6：将步骤S4得到的阳性幼苗转移至蛭石+1/2MS培养基中，液体的1/2MS培养基浸湿蛭石即可，培养7天，观察有细根和根毛长出时，放入培养土中，于培养箱里光照培养，待苗生长的健壮，即可转移至大棚。
9.根据权利要求8所述的农杆菌介导的转化方法，其特征在于：所述k4培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L；k4+T培养基为所述k4培养基中加入特美汀200mg/L；所述M13+T的培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L，特美汀100mg/L；所述MBNTH培养基为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后加6-BA 0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，特美汀100mg/L，潮霉素50mg/L；所述MBNT培养基即MBNTH培养基不加潮霉素其他不变的培养基；所述Rooting培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 5.5～6.0，高压灭菌后加IBA0.2mg/L。
10.根据权利要求8所述的农杆菌介导的转化方法，其特征在于：所述侵染液含有农杆菌的OD600值为0.05～0.08。
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| CN116590333A (zh) * | 2023-06-09 | 2023-08-15 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种番木瓜高效遗传转化体系的建立方法 |
| CN116590333B (zh) * | 2023-06-09 | 2024-04-30 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种番木瓜遗传转化体系的建立方法 |
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