CN108040875A - 一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的筛选配置方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的筛选配置方法。筛选包括以下步骤：A.将作物成熟种子去壳并烘干处理；B.配置多种待筛选的脱分化培养基，并将前述步骤去壳已烘干的作物成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内；C.将已接入成熟种子的培养基密封，放入25‑32℃恒温培养室内进行愈伤组织诱导培养；D.10‑18天后将培养室内的培养基取出，统计培养基内的愈伤组织的诱导率和其大小。本发明针对农作物成熟种子胚的愈伤组织的诱导培养基的配置和培养条件进行了改进，在配置愈伤组织诱导培养基的时候，选择出针对不同水稻品种的最佳愈伤组织诱导培养基和培养环境。

Description

一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的筛选配置方法

技术领域

本发明涉及生物技术组织培养技术领域，特别涉及一种高效率从水稻成熟胚诱导愈伤组织的培养基的筛选配置方法。

背景技术

植物组织培养(plant tissue culture，PTC)的概念有广义和狭义之分，前者是指在无菌条件下利用人工培养基质对原生质体、悬浮细胞、植物器官和植物组织的培养，后者主要指对植物的组织(分生组织、表皮组织、薄壁组织等)及培养产生的愈伤组织进行培养。

20世纪30年代植物组织培养领域里出现了三个重要的发现：一是发现了生长素是一种天然的生长调节物质；二是认识了B族维生素对植物细胞生长的重要意义；三是由Gantheret和White所发展的基本方法。这三方面奠定了以后各种植物组织培养的技术基础。1937年植物组织培养有了突破性进展，美国科学家White首先建立了组培的综合培养基，其化学成分均为已知的化合物，还发现了B族维生素对离体根的生长具有重要意义，并认识到吲哚乙酸(，IAA)在植物生长中的控制作用。他和德国植物学家Gantherct等人成功地用烟草茎段形成层细胞和胡萝卜根的小块组织，人工诱导出愈伤组织，这是一个可喜的进展，但未诱导出芽和根。1939年，Gantherct连续培养胡萝卜根形成层获得成功。同年，white由烟草中间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜也建立了类似的连续生长的组织培养物。1933年我国学者李续侗和沈同研究银杏的胚培养，将银杏胚乳的提取物加入培养基，获得成功。这是利用天然提取物获得成功的首次报道。

20世纪40、50年代以后，植物组织培养的研究日趋繁荣。1904年J.Vanoverbeek试用椰子的液体乳于培养基中，使心形期曼陀罗杂种幼胚培养成功。到50年代初，Steward等在胡萝卜组织培养中也使用了这一物质，从而使椰子汁在组织培养的各个领域中都得到了广泛应用。

进入20世纪60年代后，植物组织培养即开始走向大规模的应用阶段，同时研究工作也更加深入和扎实。通过与常规育种、良种繁育和遗传工程技术相结合，在植物改良中发挥了重要的作用，并且在若干方面已经取得了可观的经济效益。1960年G.Morel采用兰属的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的。这是经过茎尖一原球茎一小植株的方式而再生的，成为植株再生的第四种方式。1960年，E.c.cocking采用纤维素酶和果胶酶等酶制剂分离番茄幼根，获大量健康的原生质体。1971年T.Takebe等首次报道由烟草原生质体通过细胞壁再生、细胞分裂等过程再生出了完整的植株，确证了原生质的全能性。1972年P.5.Carlson等完成了粉蓝烟草和长花烟草的原生质体融合，实现了体细胞杂交。1962年Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基成分，这就是目前非常流行的、卓有成效的MS培养基。

20世纪70年代初期开始，我国掀起了单倍体育种的高潮，据估计约有上千个机构和小组从事各种作物的花药花粉培养，在小麦、水稻、烟草、玉米、三叶橡胶等作物上取得了一批有意义的成果。进入80年代，除原有项目得以巩固和提高外，全国研究工作的内容明显倾向无性系的快速繁殖。现在，我国在原生质体培养、体细胞杂交、突变体筛选、去除病毒、次生代谢物发酵生产、人工包装超级种子等方面都有了进步。组织培养应用研究已涉及到观赏植物、果树、农作物、林木、药用植物、工业原料植物等方面，人们以组织培养技术为手段，对植物的快繁与脱毒、种质保存、次生物质生产、细胞工程和基因工程等生物技术育种以及遗传学和生物学基础理论进行了广泛的研究，在花药培养、茎尖与茎段培养、嫩叶培养、幼胚培养、胚乳培养、子房培养、悬浮细胞培养及原生质体培养上进展都十分迅速。

培养基是指植物组织培养的物质基础，也是组织培养能否成功的重要因素之一。多年来，为了植物组织培养的成功和高效，科研工作者付出了大量的劳动对培养基的成分进行改良和优化。

目前，已公开报道的基础培养基种类较多，常用的主要有四种：MS培养基(Murashige&Skoog 1962)，B5培养基(Gamborg et al.1968)，White培养基(White 1943，1963)和N6培养基(Chu et al.1975)。天然生长激素(Indole-3-acetic acid，IAA)的发现(Went 1928：Kogl et al.1934；Thimann 1935)和它对植物生长的促进作用，使其在植物培养基中得以应用(White 1943；Gautheret 1985；Vasil 2008)。此后，各种植物生长调节剂(Plant growth regulator)被相应发现或人工合成，目前已有各种生长素(如IAA、NAA、2，4-D)和细胞分裂素(6-BA、Zeatin、Kinetin等)类物质被广泛地应用于调节培养物的生长发育过程、分化方向和器官发生。

培养基的逐步改进：植物组织培养中应用的培养基不下几十种，这些培养基是在植物组织培养的发展中，根据人们的认识和培养的需要，而不断改进产生的。培养基的配方基本上是以P.feffer配方为基础，加以改进，并加入一些活性物质而发展的。

20世纪30年代末期了解了维生素对植物离体器官培养的重要性，以后又逐渐认识到一些活性物质对组织和细胞生长及分化的作用，使培养基中的添加物不断丰富。这同时也凭借于对细胞、原生质体、原生质体融合体，甚至细胞器的生长和分化机制的了解而逐步改进的。基本培养基包括无机盐类的大量元素及微量元素和有机物质，碳源大多用蔗糖，有机养料包括水解酪蛋白、氨基酸、酵母提取液、椰乳等，维生素对生长也有促进作用。White培养基在40年代用得多，现在还经常用。Ms培养基是为培养烟草细胞设计的，有较高的No3-、K+和NH4+浓度，目前应用较广。为进行试验研究，要控制条件因子，对培养基的要求较高，应采用较高纯度的药品和重蒸馏水：而在大量生产应用时，为降低成本则开始采用代用品，如自来水代替重蒸馏水，采用普通蔗搪代替分析纯蔗搪，采用马铃薯培养基等效果也很好。

植物组织培养包含两个部分，即为脱分化和再分化。高等植物几乎所有器官和组织，都可作为外植体，在外源激素和适当的培养条件下，脱分化形成愈伤组织，这个过程为脱分化。经过脱分化阶段之后，在有适当的外界条件(包括营养、激素、光照、温度、湿度灯)时，愈伤组织经过再分化得到完整的植株。其中脱分化阶段最为关键，能否得到大小适合，高质量的愈伤组织是整个组织培养的首要步骤也是最关键的步骤。而影响脱分化的关键影响因素即为愈伤组织诱导培养基。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法。本发明针对水稻成熟种子胚的愈伤组织的诱导培养基的配置和培养条件进行了改进，在配置愈伤组织诱导培养基的时候，优化选择了愈伤组织诱导培养基中的碳源、无机盐、生长调节剂及附加物的浓度和种类和光照条件，选择出针对不同水稻品种的最佳愈伤组织诱导培养基和培养环境。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的筛选方法，包括以下步骤：

A.将作物成熟种子去壳并烘干处理；

B.配置多种待筛选的脱分化培养基，并将前述步骤去壳已烘干的作物成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内；

C.将已接入成熟种子的培养基密封，放入25-32℃恒温培养室内进行愈伤组织诱导培养；

D.10-18天后将培养室内的培养基取出，统计培养基内的愈伤组织的诱导率和其大小。

所述步骤B可以进一步包括：

①配置两种愈伤组织脱分化诱导培养基；

②取烘干去壳的作物成熟种子，用75％乙醇进行消毒处理2次；

③清洗后将乙醇倒出，随后加入次浓度为20％，摇床震荡消毒30-40min(160rpm)；

④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗一次或多次；同时用75％的乙醇清洗超净台，之后接种。

所述子步骤③中，优选加入的次氯酸钠的浓度为20％，摇床震荡消毒30-40min(160rpm)。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，包括以下步骤：

①.配置N6培养液；

②配置愈伤组织诱导培养基：

吸取60ml-70ml的N6母液放入1L的烧杯内；

随后，加入3ml-5ml的B5溶液和7ml-10ml的B5有机液，再加入1-3g铁盐；

最后，加入20g-40g蔗糖溶液、3-5g脯氨酸、0.1-0.5g谷氨酰胺、0.3g-0.7g水解酪蛋白、20g-50g蔗糖、1mg-10mg 2，4-D(生长素)；

添加8-14g琼脂粉；

本培养基配置过程中不添加植物凝胶。

为解决上述技术问题，本发明又提供了一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，包括以下步骤：

①.配置N6培养液；

②配置愈伤组织诱导培养基：

吸取60ml-70ml的N6母液放入1L的烧杯内；

随后，加入3ml-5ml的B5溶液和7ml-10ml的B5有机液，再加入1-3g铁盐；

最后，加入20g-40g蔗糖溶液、3-5g脯氨酸、0.1-0.5g谷氨酰胺、0.3g-0.7g水解酪蛋白、20g-50g蔗糖、1mg-10mg 2，4-D(生长素)；

添加8-14g植物凝胶；

本培养基配置过程中不添加琼脂粉。

所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，优选进一步包括以下步骤：

③加入麦芽糖，终浓度为60-90g/L。

所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，优选进一步包括以下步骤：

③加入生长调节剂2，4-D或6-BA；终浓度为2，4-D 1.5-2.5mg/L或6-BA0.3-0.7mg/L。

所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，优选进一步包括以下步骤：本培养基配置过程中不添加聚乙二醇。

所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，优选进一步包括以下步骤：

③加入麦芽糖，终浓度为70-80g/L；加入生长调节剂2，4-D，终浓度为1.6-2.4mg/L。

所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，优选进一步包括以下步骤：

③加入麦芽糖，终浓度为65-85g/L；6-BA；终浓度为0.4-0.6mg/L。

本发明有益效果包括：针对不同水稻成熟种子胚的愈伤组织的诱导培养，选择出最佳愈伤组织诱导培养基和培养环境。

附图说明

图1为本发明实施例所述加入不同凝固剂的脱分化培养基长出的愈伤组织生长情况照片；

其中，图1A中的长势较差的愈伤组织诱导培养基；

图1B中的长势较好的愈伤组织诱导培养基；

图2为本发明实施例所述两种光照环境下诱导的愈伤组织的大小对比图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本发明实施例中的原料和实验试剂均通过商业途径购买。

本发明愈伤组织的培养基中的碳源、生长调节剂、附加物及培养基凝固剂对培养的效率有直接影响。

培养基是影响培养效率的重要因素，在培养中对水稻愈伤组织的启动及再分化起着至关重要的作用。本发明选择了粳稻品种-武育粳7号和日本晴两种水稻品种作为实验材料，所应用到的愈伤组织诱导培养基为N6培养基。

本发明针对诱导这两种水稻品种的N6培养基中的碳源、生长调节剂、附加物及培养基凝固剂进行探究，筛选出最优的培养基和培养条件。

在本发明的一实施例中，提供了一种高效诱导水稻成熟胚愈伤组织的培养基的配置新方法。

其实验操作步骤包括：

A.将武育粳7号水稻成熟种子去壳并烘干处理；

B.配置两种脱分化培养基，并将去壳已烘干的武育粳7号水稻成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内；

C.将接入的武育粳7号水稻成熟种子的培养基密封，放入28℃恒温培养室内进行愈伤组织诱导培养；

D.14天后将培养室内的培养基取出，统计培养基内的愈伤组织的诱导率和其大小。

上述步骤B的详细步骤包括如下：①配置两种愈伤组织脱分化诱导培养基；②取适当的烘干去壳的武育粳7号的稻米，然后用75％乙醇进行消毒处理2次；③清洗后将乙醇倒出，随后再加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床震荡消毒；④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗数次。同时用75％的无水乙醇清洗超净台，之后便可接种。

下面是本发明加入不同凝固剂的脱分化培养基内的所诱导的愈伤组织统计情况。

1.取适当的武育粳7号成熟干燥的种子，将其外壳用镊子小心剥掉，在剥壳的过程中注意小心别把种子的胚损伤。将所有的种子剥完壳之后，放入干净的不带盖的培养皿内，随后再放入35度恒温培养箱内进行烘干处理1-2天。

2.配置水稻愈伤组织诱导的培养基。其培养基配置方法如下：

①.配置N6培养液；②配置愈伤组织诱导培养基：吸取60ml-70ml的N6母液放入1L的烧杯内，随后加入少量的B5溶液和B5有机液，再加入少量铁盐，最后加入20g-40g蔗糖溶液、3-5g脯氨酸、0.1-0.5g谷氨酰胺、0.3g-0.7g水解酪蛋白、20g-50g蔗糖、1mg-10mg 2，4-DA组培养基添加8-14g琼脂粉，B组培养基添加8-14g植物凝胶。

3.将烘干的武育粳7号的稻米取出，装入小锥形瓶内，倒入75％乙醇清洗稻米表明杂质，清洗两遍，且清洗时间不超过5min。

4.清洗后将乙醇倒出，随后再加入20-30％浓度次氯酸钠浸泡40min，在室温条件下摇床震荡灭菌30-40min(160rpm)

5.浸泡完倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌过的蒸馏水清洗数次。超净工作台中无菌水清洗10-20次，将消毒后种子分两批分别接种至2种诱导培养基上，每个培养皿放30粒种子，置于28℃培养室至长出新鲜的愈伤组织。随后对愈伤组织进行观察并统计。

在本发明的另一实施例中，针对诱导这两种水稻品种的N6培养基中的碳源进行研究，筛选出最优的培养基和培养条件。

碳源在培养基中的作用主要有两方面，一是供给培养物能量；而是维持培养液中的渗透压。在进行水稻组织培养的过程中，一般将蔗糖、葡萄糖、麦芽糖作为碳源。因此在本发明中，针对不同水稻品种的诱导培养基添加不同类型和浓度的碳源。

具体实验步骤如下：

①配置N6培养基，设置三组试验A、B、C组，分别向三组实验中的培养基内加入不同浓度的碳源-麦芽糖，并设置浓度梯度，分别为60g/L，75g/L，90g/L，其余添加物均保持一致。配置完毕后在0.11Mpa、121℃高温高压灭菌内15min灭菌，备用；②接种：将武育粳7号和日本晴水稻种子烘干并剥掉颖壳，用75％乙醇消毒，2次；③清洗后将乙醇倒出，随后再加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床震荡消毒；④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗数次。同时用75％的无水乙醇清洗超净台，之后便可接种两种水稻种子。

统计指标和数据处理

愈伤组织产量：培养14d后，转移培养基内的愈伤组织至无菌的塑料管内，采用电子天平称其重量，用毫克(mg/皿)表示；

结果采用Microsoft Excel 2003进行分析，且有两次重复。

结果与分析

以武育粳7号和日本晴材料为供试材料，结果见表1。

表1麦芽糖浓度对武育粳7号和日本晴水稻愈伤组织诱导产量的影响

注：表中数据为均值±标准误(n＝2)，同行不同字母代表在0.05水平差异显著。

由表1中数据可以看出，麦芽糖浓度对所诱导的水稻愈伤组织产量有十分重要的影响。麦芽糖浓度为75g/L时的愈伤组织产量最低，最高的愈伤组织产量出现在60g/L麦芽糖浓度的培养基上。

在本发明的再一实施例中，对诱导这两种水稻品种的N6培养基中的生长调节剂进行探究，筛选出最优的培养基和培养条件。

在培养基的各种成分中，生长调节剂对水稻愈伤组织的启动、分裂、分化起着关键性的作用。水稻愈伤组织培养中常用的生长调节剂有两大类：一是细胞分裂素类，如6-BA、KT、玉米素等；二是生长素类，有2，4-D、NAA、IAA等。

通常对愈伤组织分化及胚状体形成起主要作用的是细胞分裂素类，而对愈伤组织的诱导及生长起决定性作用的是生长素类。故要诱导水稻愈伤组织的分化，其转移到的分化培养基中应含有较低浓度的生长素及较高浓度的细胞分裂素。2，4-D一般用于水稻愈伤组织的去分化，而愈伤组织分化的启动常用6-BA及KT。在不含有生长调节剂的培养基上，少数植物的花粉能产生愈伤组织或胚状体。籼稻要求的激素水平通常高于粳稻，而绿苗分化，则要求更低的生长素浓度。

水稻等禾本科植物的愈伤组织培养中，生长素2，4-D和6-BA是分裂启动及愈伤组织诱导的必要条件，但也存在例外，如玉米、燕麦等，其细胞的分裂不需要外源激素的刺激。激动素、6-苄基氨基嘌呤、吲哚乙酸等外源激素常用于水稻愈伤组织培养的诱导培养基和分化培养基中，其合理的激素种类及其配比是培养的重要影响因素。

具体实验步骤如下：

①配置N6培养基，设置三组试验A、B、C、D组，分别向四组实验中的培养基内加入不同浓度的生长调节剂2，4-D和6-BA，并设置浓度梯度，分别设置0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L和2.0mg/L 4个浓度，且3次重复，其余添加物均保持一致。配置完毕后在0.11Mpa、121℃高温高压灭菌内15min灭菌，备用；②接种：将武育粳7号和日本晴水稻种子烘干并剥掉颖壳，用75％乙醇消毒，2次；③清洗后将乙醇倒出，随后再加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床震荡消毒；④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗数次。同时用75％的无水乙醇清洗超净台，之后便可接种两种水稻种子。

统计指标和数据处理

愈伤组织产量：培养14d后，转移培养基内的愈伤组织至无菌的塑料管内，采用电子天平称其重量，用毫克(mg/皿)表示；

试验结果采用Microsoft Excel 2003进行分析，且有两次重复。

结果与分析

以武育粳7号和日本晴材料为供试材料，试验结果见表2

表2 2，4-D和6-BA的浓度配比组合对武育粳7号和日本晴水稻愈伤组织诱导产量的影响

注：表中数据为均值±标准误(n＝2)，同行不同字母代表在0.05水平差异显著。

由表2中数据可以看出，2，4-D和6-BA浓度配比对水稻愈伤组织的诱导产量十分重要的影响。当2，4-D浓度为2mg/L和6-BA浓度为0.5mg/L这个配比的时候，两种材料的愈伤组织产量最高。

在本发明的再一实施例中，针对诱导这两种水稻品种的N6培养基中的附加物进行探究，筛选出最优的培养基和培养条件。

在诱导培养基中添加不同浓度的PEG，比较不同浓度的PEG胁迫处理，对供试水稻材料小孢子培养愈伤组织诱导的影响。PEG浓度设计为0％、2％、5％、8％共4个浓度，均在标准配制的分化培养基上分化，2次重复，结果见表3。

表3PEG浓度对水稻愈伤组织诱导的影响

注：表中数据为均值±标准误(n＝2)，同列不同字母代表在0.01水平差异显著。

当PEG浓度为8％时，已无愈伤组织的形成。试验中观察到PEG浓度达到或高于8％时，小孢子在诱导培养基中刚培养一天就有小孢子失水萎缩，死亡，在培养3d时绝大部分小孢子已死亡，致使最后没有诱导出愈伤组织。从表3中可以看出，随着PEG浓度的升高，愈伤组织的诱导率下降，愈伤组织产量降低。当PEG浓度增加为5％时，只有少量愈伤组织的产生。

在本发明的又一实施例中，针对诱导这两种水稻品种的N6培养基中的培养基凝固剂进行探究，筛选出最优的培养基和培养条件。

在配置水稻愈伤组织诱导培养基的时候一般需要固体培养基，因此在配置培养基的时候，需加入凝固剂使培养基更好的供愈伤组织生长附着。在日常实验操作的过程中，通常将琼脂糖作为培养基凝固剂，但往往得到的愈伤组织诱导率和其产量较差。因此本发明改使用植物凝胶来代替琼脂糖，使水稻愈伤组织的诱导率提高以及其产量的提高。

配置两组加入不同凝固剂的愈伤诱导培养基，其中一组加入琼脂，另一组加入植物凝胶，并接入相同数量的武育粳7号种子和日本晴种子。14天后将这40皿培养基拿出，观察两组中的愈伤组织诱导情况。结果如下图1所示：本发明实施例中，图1为加入琼脂凝固剂和植物凝胶凝固剂的两种脱分化培养基长出的愈伤组织生长情况。其中，图1A中的诱导培养基中添加了琼脂，图1B中的诱导培养基中添加了植物凝胶。

如图1所示，添加琼脂的培养基中虽也有很多已诱导出的愈伤组织，但仍有部分种子未被诱导出愈伤组织，而添加植物凝胶的培养基中基本上都被诱导出愈伤组织。

重复该实验3次，对和B组的培养皿内的愈伤组织个数进行统计。其中添加了琼脂的诱导培养基内平均诱导出了338个愈伤组织，诱导率为56.33％。添加了植物凝胶的诱导培养基内平均诱导出了493个愈伤组织，诱导率为82.17％。具体结果如下表所示：

表4.添加两种不同凝固剂的培养基内愈伤组织诱导率

表5.添加两种不同凝固剂的培养基内愈伤组织产量

由表4和表5可知，在添加琼脂的诱导培养基(A组)所诱导的愈伤组织中，由此我们可以得知添加植物凝胶的诱导培养基所诱导的愈伤组织无论是在诱导率和产量上面均优于添加了琼脂的诱导培养基。

水稻基因型是影响水稻愈伤组织培养成功的最重要的因素之一，是影响绿苗分化的重要内在因子。愈伤组织的诱导及分化或胚状体的发生均与材料的基因型有着密切的关系。不同基因型的水稻，即使在相同的实验条件下，愈伤组织的反应程度存在很大的差异。水稻的粳亚种的品种一般都能诱导出愈伤组织，而籼亚种的品种却较难诱导出愈伤组织。

同一作物的不同品种间单倍体培养所用的培养基类型也会有所不同。如粳稻适用N6培养基，籼稻常用的合5培养基，籼粳杂种的SK培养基，以及粳稻与籼稻均适用的KM8p培养基。影响水稻愈伤组织脱分化、再分化及器官发生的重要因素之一是培养基中的渗透压。高渗透压可以增加绿苗的数量而减少白化苗的数量。对培养基渗透压起决定作用的是糖类，同时糖类也是愈伤组织产生的能量来源，且有利于花粉的脱分化和再分化。

培养基中作为碳源的糖类种类多样，可以是蔗糖，也可以是麦芽糖、葡糖糖、果糖等。培养基中糖的种类和浓度会因作物种类的不同而不同。本发明采用不同碳源对水稻愈伤组织培养诱导率的影响，结果显示在9种糖类或组合中，麦芽糖为最优碳源，可以诱导较多的水稻愈伤组织。

本发明中麦芽糖浓度为60g/L时，虽然愈伤组织产量最高。

在愈伤组织的培养过程中，给予一定的胁迫处理是必要的，可以是高温热激作用，射线的处理，或在培养基中添加一定的物质，使其愈伤组织受到一定程度的胁迫，从而改变生理状态、改变愈伤组织细胞的分裂方式及其发育途径，进而来获得更高的愈伤组织产量及绿苗产量。本发明在诱导培养基中添加不同浓度的PEG可以模拟不同程度的水分胁迫，结果显示添加2％PEG的愈伤组织的再分化能力要好于不添加的，其绿苗产量要远远高于空白对照0％的，且比空白对照提高了3.7倍左右。说明PEG的添加对培养在其中的水稻愈伤组织以刺激，改变了其生理生化状态。但浓度不能过高，PEG浓度达到5％时，只有少量的愈伤组织存活，没有再生植株的分化；浓度继续升高时，达到8％时，最终水稻愈伤组织全部失水死亡，更没有再生植株的分化。

激素的作用可以促进愈伤组织的发生和分化，是水稻愈伤组织培养基中的重要成分。适当的激素组分及浓度对水稻愈伤组织的发育、诱导及其形态的发生均有一定的影响，激素具有促进愈伤组织生长的作用。生长素2，4-D或NAA等，分裂素KT或6-BA等均是水稻愈伤组织培养中常用的激素。单一激素的使用效果较差，一般是2，4-D、KT、6-BA和NAA等多种激素的合理配比效果较佳。诱导愈伤组织细胞分裂的必要条件是存在一定浓度的2，4-D和KT，且起主要作用的是激素2，4-D。粳稻一般只需2mg/L的2，4-D即可获得较高的愈伤组织产量。2，4-D浓度过高，虽可以继续提高愈伤组织的诱导率，但其形成的愈伤组织的质量却下降了，其绿苗率明显下降。

在分化培养基中NAA浓度一定时，绿苗分化率随KT浓度的增加而上升。不同的基因型对激素的敏感性和耐受性不同。本发明表明诱导培养基中2，4-D浓度为2.0mg/L和6-BA浓度为0.5mg/L的配比时为最佳。

同时在诱导两种水稻成熟种子胚的时候，加入植物凝胶的培养基比加琼脂糖的培养基的诱导效果更好，体现在愈伤组织诱导率和诱导的愈伤组织产量上。

以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

Claims (10)

1.一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.将作物成熟种子去壳并烘干处理；

B.配置多种待筛选的脱分化培养基，并将前述步骤去壳已烘干的作物成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内；

C.将已接入成熟种子的培养基密封，放入25-32℃恒温培养室内进行愈伤组织诱导培养；

D.10-18天后将培养室内的培养基取出，统计培养基内的愈伤组织的诱导率和其大小。

2.根据权利要求1所述的高效诱导胚愈伤组织的培养基的筛选方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：

①配置两种愈伤组织脱分化诱导培养基；

②取烘干去壳的作物成熟种子，用75％乙醇进行消毒处理2次；

③清洗后将乙醇倒出，随后加入20％的次氯酸钠浸泡并摇床160rpm震荡30-40min进行消毒；

④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗一次或多次；同时用75％的乙醇清洗超净台，之后接种。

3.根据权利要求2所述的高效诱导胚愈伤组织的培养基的筛选方法，其特征在于，所述子步骤③中，加入的次氯酸钠的浓度为20％，160rpm摇床震荡消毒30-40min。

4.一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，其特征在于，包括以下步骤：

①.配置N6培养液；

②配置愈伤组织诱导培养基：

吸取60ml-70ml的N6母液放入1L的烧杯内；

随后，加入3ml-5ml的B5溶液和7ml-10ml的B5有机液，再加入1-3g铁盐；

最后，加入20g-40g蔗糖溶液、3-5g脯氨酸、0.1-0.5g谷氨酰胺、0.3g-0.7g水解酪蛋白、20g-50g蔗糖、1mg-10mg生长素2，4-D；

添加8-14g琼脂粉；

本培养基配置过程中不添加植物凝胶。

5.一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，其特征在于，包括以下步骤：

①.配置N6培养液；

②配置愈伤组织诱导培养基：

吸取60ml-70ml的N6母液放入1L的烧杯内；

随后，加入3ml-5ml的B5溶液和7ml-10ml的B5有机液，再加入1-3g铁盐；

最后，加入20g-40g蔗糖溶液、3-5g脯氨酸、0.1-0.5g谷氨酰胺、0.3g-0.7g水解酪蛋白、20g-50g蔗糖、1mg-10mg生长素2，4-D；

添加8-14g植物凝胶；

本培养基配置过程中不添加琼脂粉。

6.根据权利要求4或5所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：

③加入麦芽糖，终浓度为60-90g/L。

7.根据权利要求4或5所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：

③加入生长调节剂2，4-D或6-BA；终浓度为2，4-D 1.5-2.5mg/L或6-BA0.3-0.7mg/L。

8.根据权利要求4或5所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：本培养基配置过程中不添加聚乙二醇。

9.根据权利要求4或5所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：

③加入麦芽糖，终浓度为70-80g/L；加入生长调节剂2，4-D，终浓度为1.6-2.4mg/L。

10.根据权利要求4或5所述高效诱导胚愈伤组织的培养基的配置方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：

③加入麦芽糖，终浓度为65-85g/L；6-BA；终浓度为0.4-0.6mg/L。