CN108094212A - 一种高效诱导成熟种子愈伤组织的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，包括以下步骤：A.种子烘干；B.接入培养基；C.恒温光照愈伤组织诱导培养；D.观察统计诱导率。所述步骤进一步包括：A.将水稻成熟种子去壳并烘干处理。所述步骤进一步包括：B.配置脱分化培养基，并将去壳已烘干的水稻成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内。本发明方法在对水稻品种武育粳7号进行成熟种子组织培养的实验中，在愈伤组织脱分化诱导阶段采取了光照处理。通过与暗处理结果相比，其愈伤组织的获得率和质量均比暗处理较好。本发明此项技术为首次报道，可作为将来的水稻成熟胚组织培养工作提供新的思路和方法。

Description

一种高效诱导成熟种子愈伤组织的方法

技术领域

本发明涉及农业技术组织培养技术领域，特别涉及一种高效率从水稻成熟胚诱导愈伤组织的方法。

背景技术

植物组织培养技术建立于20世纪初，经过多年发展，其已广泛应用于植物的快速繁殖、品种改良，基因工程育种、种质资源保存、次生代谢产物生产等方面，产生了巨大的经济效益和社会效益，对现代农业和医药等领域产生了巨大的影响。在植物组织培养的过程中包含脱分化和再分化，其中脱分化即植物的组织和器官在一定的条件下被诱导形成愈伤组织，再分化为愈伤组织进一步形成新的植株。

水稻(Oryza Sativa L.)是我国重要的粮食作物之一，关于水稻组织培养的研究工作已有许多相关报道。根据前人研究结果可知，已有用根尖、节、盾片、叶鞘、胚芽鞘、花药、胚囊、幼胚、叶片和幼穗组织成功进行离体再生培养的报道，但选择上面的水稻材料均有受到环境和季节时间的限制，无法随时取材，随时进行培养，这便造成了难以满足常年试验的要求的困难局面。越来越多的研究者将水稻组培的工作重点放在水稻成熟种子上面，即水稻水稻的成熟胚。郑文静等以成熟胚、幼胚、幼穗及花药为外植体，进行水稻组织培养，考察相同培养条件下4种外植体的愈伤组织诱导率和幼苗率。结果显示，以水稻成熟胚为外植体进行组培时，愈伤组织的诱导率最高。同时选择水稻成熟胚进行组培时，其选择的时间和操作上具有很大的灵活性和简便性。提高水稻愈伤组织的诱导率，为用转基因方法改良水稻品种奠定了技术基础。

由于水稻的基因型，外植体来源，培养基，外源植物生长调节物质、渗透压、固化剂以及培养温度、光照等因素的不同，往往导致水稻成熟种子胚组织的脱分化和再分化不同。其中成熟胚组织的脱分化是水稻组织培养的过程中第一步也是极其关键的步骤，较低的愈伤组织诱导率，便可导致所获得的愈伤组织质量较差，无法满足后续的试验需求，需要重复做很多遍才能达到最终预期，甚至无法满足。因此在水稻成熟胚组织愈伤组织的实验过程中，愈伤组织的脱分化诱导是极其需要注意的。

在正常情况下，植物组织的脱分化阶段是需要在适宜的培养基和一定的光照、温度的条件下才能顺利进行，光照是其中一个关键的因素。植物组织的脱分化是需要在暗环境下进行，原因是因为植物愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织，如果在光照条件下容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织。

水稻成熟胚组织愈伤组织诱导阶段也需要在暗环境下进行处理，而未见在光下进行水稻成熟胚组织诱导的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种高效诱导成熟种子愈伤组织的方法。本发明方法在对水稻品种武育粳7号进行成熟种子组织培养的实验中，在愈伤组织脱分化诱导阶段采取了光照处理(L/N＝16h/8h)。通过与暗处理结果相比，其愈伤组织的获得率和质量均比暗处理较好。本发明此项技术为首次报道，可作为将来的水稻成熟胚组织培养工作提供新的思路和方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，包括以下步骤：

A.种子烘干；

B.接入培养基；

C.恒温光照愈伤组织诱导培养；

D.观察统计诱导率。

所述步骤进一步包括：A.将水稻成熟种子去壳并烘干处理。

所述步骤进一步包括：B.配置脱分化培养基，并将去壳已烘干的水稻成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内。

所述步骤进一步包括：C.将接人种子的培养基密封，放入28℃恒温光照培养室内进行愈伤组织诱导培养。

所述恒温光照愈伤组织诱导培养L/N＝16h/8h。

所述步骤进一步包括：D.14天后将暗培养室和光照培养室中的愈伤组织取出，观察并统计培养基内水稻种子胚的愈伤组织的诱导率和其大小。

所述步骤B进一步包括：

①配置愈伤组织脱分化诱导培养基；

②取烘干去壳的稻米，用75％乙醇进行消毒处理2次；

③清洗后将乙醇倒出，随后加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床震荡消毒；

④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗多次；同时用75％乙醇清洗超净台，之后接种。

所述步骤②取烘干去壳的稻米，用75％乙醇进行消毒处理2次，每次3-5min。

所述步骤③清洗后将乙醇倒出，随后加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床160rpm震荡消毒30-40min。

所述步骤进一步包括：A.将种子剥完壳之后，放入干净的不带盖的培养皿内，随后再放入35度恒温培养箱内进行烘干处理1-2天。

本发明有益效果包括：在愈伤组织脱分化诱导阶段采取了光照处理(L/N＝16h/8h)。通过与暗处理结果相比，其愈伤组织的获得率和质量均比暗处理较好。本发明此项技术为首次报道，可作为将来的水稻成熟胚组织培养工作提供新的思路和方法。

附图说明

图1为本发明实施例所述两种光照处理下的武育粳7号愈伤组织诱导情况照片；其中，

图1A为武育粳7号成熟种子胚在暗培养室愈伤组织诱导情况；

图1B为武育粳7号成熟种子胚在光照培养室(L/N＝16h/8h)内愈伤组织诱导情况；

图2为本发明实施例所述两种光照环境下诱导的愈伤组织的大小柱形图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。如无特别说明，本发明的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，包括以下步骤：

A.种子烘干；

B.接入培养基；

C.恒温光照愈伤组织诱导培养；

D.观察统计诱导率。

所述步骤进一步包括：A.将水稻成熟种子去壳并烘干处理。

所述步骤进一步包括：B.配置脱分化培养基，并将去壳已烘干的水稻成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内。

所述步骤进一步包括：C.将接入种子的培养基密封，放入28℃恒温光照培养室内进行愈伤组织诱导培养。

所述恒温光照愈伤组织诱导培养L/N＝16h/8h。

所述步骤进一步包括：D.14天后将暗培养室和光照培养室中的愈伤组织取出，观察并统计培养基内水稻种子胚的愈伤组织的诱导率和其大小。

所述步骤B进一步包括：

①配置愈伤组织脱分化诱导培养基；

②取烘干去壳的稻米，用75％乙醇进行消毒处理2次；

③清洗后将乙醇倒出，随后加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床震荡消毒；

④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗多次；同时用75％乙醇清洗超净台，之后接种。

所述步骤②取烘干去壳的稻米，用75％乙醇进行消毒处理2次，每次3-5min。

所述步骤③清洗后将乙醇倒出，随后加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床160rpm震荡消毒30-40min。

所述步骤进一步包括：A.将种子剥完壳之后，放入干净的不带盖的培养皿内，随后再放入35度恒温培养箱内进行烘干处理1-2天。

本发明一种更高效的诱导水稻成熟胚愈伤组织的新方法，其实验操作步骤包括：

A.将武育粳7号水稻成熟种子去壳并烘干处理；

B.配置脱分化培养基，并将去壳已烘干的武育粳7水稻成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内；

C.将接入武育粳7号种子的培养基密封，放入28℃恒温暗培养室和光照培养室(L/N＝16h/8h)室内进行愈伤组织诱导培养。

D.14天后将暗培养室和光照培养室中的愈伤组织取出，观察并统计培养基内稻种子胚的愈伤组织的诱导率和其大小。

上述步骤B的详细步骤包括如下：①配置愈伤组织脱分化诱导培养基；②取适当的烘干去壳的武育粳7号的稻米，然后用75％酒精进行消毒处理2次；③清洗后将酒精倒出，随后再加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床震荡消毒；④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗数次。同时用75％的无水乙醇清洗超净台，之后便可接种。

下面是本发明光照培养和暗培养两个条件下的诱导的愈伤组织统计情况。

光照培养室和暗培养室内分别共有20个培养皿，并分别接入600粒的武育粳7号的稻米粒。诱导培育14天后，将两个培养室中的培养皿取出，观察愈伤组织诱导情况，如图1所示。由图1可知，在暗培养室诱导的暗培养室中的武育粳7号种子的愈伤组织诱导情况明显比光照培养室中的愈伤组织差很多。暗培养中的种子被诱导出愈伤组织个数远远低于在光照培养室中被诱导出愈伤组织。

同时对暗培养和光照培养室中的的愈伤组织进行统计，两组中分别接入了600个武育粳7号成熟种子，并重复该实验3次，取最终平均值。结果为在暗培养室内长出愈伤组织的平均值为169个，在光培养室内(L/N＝16h/8h)长出愈伤组织的平均值有563个。具体愈伤诱导率结果如下表

表1-1.在光培养室和暗培养室内诱导14天后的愈伤组织平均诱导情况

表1-2.光培养室和暗培养室内诱导14天后的愈伤组织数量

由表1-1，表1-2可知，在光照培养室(L/N＝16h/8h)下诱导14天后的愈伤组织的平均诱导率为93.83％，而在暗培养室内诱导14天后的愈伤组织平均诱导率为28.16％，远远小于在光照培光室(L/N＝16h/8h)中的愈伤组织诱导率。光照条件(L/N＝16h/8h)对该品种的水稻愈伤组织的诱导率具有很大的促进作用，可为后续愈伤组织再分化提供更多的可用的愈伤组织。

同时，我们对3次实验中光照条件下所诱导出的愈伤组织和暗培养室条件下的愈伤组织的大小进行统计，将愈伤组织长与宽的乘积值作为比较数据，取最终平均值，结果如下表2-1，表2-2，表2-3和图2所示：

表2-1.三次实验室中两种光照环境下诱导的愈伤组织的大小平均值统计

表2-2.三次光照培养室环境下诱导的愈伤组织的大小统计

表2-3.三次暗培养室环境下诱导的愈伤组织的大小统计

由表2和图2可知，在光照培养室所诱导的愈伤组织中，其面积在1cm2～0.36cm2平均有361个，同时也有23个面积超过1cm2；而在暗培养室内诱导出的169个愈伤组织中，处于0.16cm2与0.36cm2之间平均有67个，远低于在光照培养室诱导的处于该大小区间的愈伤组织个数。由此我们可以得知在光照培养室内所诱导的愈伤组织无论是在数量，大小都超过了在暗培养室内所诱导的愈伤组织。

1.取适当的武育粳7号成熟干燥的种子，将其外壳用镊子小心剥掉，在剥壳的过程中注意小心别把种子的胚损伤。将所有的种子剥完壳之后，放入干净的不带盖的培养皿内，随后再放入35度恒温培养箱内进行烘干处理1-2天。

2.配置水稻愈伤组织诱导的培养基。其培养基配置方法如下：

①.配置N6培养液；②配置愈伤组织诱导培养基：吸取60ml-70ml的N6母液放入1L的烧杯内，随后加入少量的B5溶液和B5有机液，再加入少量铁盐，最后加入20g-40g蔗糖溶液、3-5g脯氨酸、0.1-0.5g谷氨酰胺、0.3g-0.7g水解酪蛋白、20g-50g蔗糖、1mg-10mg 2，4-D8-14g琼脂粉。

3.将烘干的武育粳7号的稻米取出，装入小锥形瓶内，倒入75％酒精清洗稻米表面杂质，清洗两遍，每遍3-5min；

4.清洗后将酒精倒出，随后再加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床震荡(160rpm)30-40min；

5.浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗数次。同时用75％的无水乙醇清洗超净台，之后便可接种。

以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

Claims (10)

1.一种高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.种子烘干；

B.接入培养基；

C.恒温光照愈伤组织诱导培养；

D.观察统计诱导率。

2.根据权利要求1所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：A.将水稻成熟种子去壳并烘干处理。

3.根据权利要求1所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：B.配置脱分化培养基，并将去壳已烘干的水稻成熟种子在组培室的超净台上接入培养基内。

4.根据权利要求1所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：C.将接人种子的培养基密封，放入28℃恒温光照培养室内进行愈伤组织诱导培养。

5.根据权利要求1所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述恒温光照愈伤组织诱导培养L/N＝16h/8h。

6.根据权利要求1所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：D.14天后将暗培养室和光照培养室中的愈伤组织取出，观察并统计培养基内水稻种子胚的愈伤组织的诱导率和其大小。

7.根据权利要求1所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：

①配置愈伤组织脱分化诱导培养基；

②取烘干去壳的稻米，用75％乙醇进行消毒处理2次；

③清洗后将乙醇倒出，随后加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床震荡消毒；

④浸泡完成之后，倒掉次氯酸钠溶液，并用灭菌过的蒸馏水清洗多次；同时用75％乙醇清洗超净台，之后接种。

8.根据权利要求7所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤②取烘干去壳的稻米，用75％乙醇进行消毒处理2次，每次3-5min。

9.根据权利要求7所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤③清洗后将乙醇倒出，随后加入20％浓度次氯酸钠浸泡并摇床160rpm震荡消毒30-40min。

10.根据权利要求1所述高效诱导成熟种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：A.将种子剥完壳之后，放入干净的不带盖的培养皿内，随后再放入35度恒温培养箱内进行烘干处理1-2天。