CN111454983B - 一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，将苗的下胚轴切下进行愈伤组织诱导，待胚性愈伤长出后扩繁四到五次，即所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体。该方法与传统番木瓜愈伤组织转化相比，通过改良愈伤组织的诱导培养基，愈伤诱导时间显著缩短，并且愈伤状态好利于转化，番木瓜转化效率高。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法，属于转基因技术领域。
背景技术
番木瓜(Carica papaya L.)又称木瓜、乳瓜、万寿果，为热带、亚热带常绿软木质大型番木瓜科多年生草本植物，常绿软木质小乔木。番木瓜与香蕉、菠萝并称为热带三大草本果树，是人们喜爱的果蔬兼药用的热带水果，在我国南方享有“万寿果”和“岭南佳果”的美誉。番木瓜除鲜食外，还可加工成果汁、果酱、蜜饯、腌渍；番木瓜素有很强的分解蛋白质的能力，可制造健胃药、驱虫剂，还可作酒类、果汁的澄清剂和肉类的软化剂。番木瓜是一种具有很高经济价值和药用价值的植物。然而目前在番木瓜生产中遇到了实际性迫切需要解决的问题:番木瓜株性复杂(有雄性株、雌性株和两性株)，并且番木瓜是异花授粉果树，即使通过杂交手段成功选育抗耐病品种，其后代的性状必然严重分离，很难保持其抗病优良性状不变。因此，通过转基因技术培育出稳定、高抗、谱抗，且安全性好的新品种是发展番木瓜生产的当务之急，是防治番木瓜病毒病的根本途径。但是，目前，现有技术中比较缺乏成熟的番木瓜转基因技术，番木瓜转化周期很长，并且体系不是特别稳定，严重制约着番木瓜育种产业的发展。
发明内容
本发明提供了一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，将苗的下胚轴切下进行愈伤组织诱导，待胚性愈伤长出后扩繁四到五次，即所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体，此时的愈伤状态利于转化。
作为进一步改进的，所述消毒为在无菌环境中，将番木瓜种子先后经过体积浓度为70～80％的酒精、体积浓度为3～4％的NaClO溶液和质量浓度为0.05～0.15％氯化汞消毒，最后用无菌水清洗数次，这种消毒方式显著抑制了木瓜内生菌的繁殖。
作为进一步改进的，所述浸泡为将番木瓜种子浸泡在体积浓度为18～22％的NaClO溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床3.5～4.5h；然后将番木瓜种子从NaClO溶液中取出，用无菌水清洗数次，浸泡在浓度为0.5～1.5mol/L的KNO3溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床20～26h，番木瓜种子经过KNO3的处理，显著提高了种子的萌发率。
作为进一步改进的，所述抗生素为浓度为450～550mg/L的羧苄青霉素。
作为进一步改进的，所述萌发长芽为将番木瓜种子从KNO3溶液中取出，用无菌水清洗数次，放入含有抗生素的无菌水中，置于28～32℃，110～130rpm摇床，每天更换含有抗生素的无菌水，直至番木瓜种子出芽，这种方法保证了种子萌发过程中不被污染。
作为进一步改进的，所述愈伤组织诱导为当待长出的苗的高度达8～10cm，顶端的两片子叶张开时，取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上培养1个月，优选为将下胚轴切成5mm，然后转到M13培养基上诱导愈伤组织，长出愈伤组织后换成Ci培养基，通过将外植体在三种不同配比的培养基上培养，使得愈伤诱导时间短，状态好，利于转化。
作为进一步改进的，所述K4培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L，所述M13培养基为：MS2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L；所述Ci培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖70g/L，2,4-D 10mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2。
本发明还提供一种应用上述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的农杆菌介导的转化方法，包括以下步骤：
S1：在无菌环境中，用含有目的基因的农杆菌的侵染液侵染所述番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体，吹干；
S2：将侵染过的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体转移至Ci培养基上加无菌滤纸共培22～26小时，吹干，置于Ci双抗培养基上培养17～20天后，每7～10天更换新的Ci双抗培养基，然后转移至M1/2BNTH培养基上中共抑菌培养40～50天，每2～4周更换一次新的M1/2BNTH培养基，然后转接到MBNTH培养基上，每3～4周更换一次新MBNTH培养基，直至长出嫩黄色小圆芽；
S3：将步骤S2中中愈伤组织长出的嫩黄色小圆芽转接至MBNT培养基中，每4周更换一次MBNT培养基，待嫩黄色小圆芽长成2～2.5cm高的幼苗时，将幼苗的基部切掉，放入Rooting培养基中，培养3～5周进行生根；
S4：将步骤S3中生根的幼苗进行PCR和Southern鉴定；
S5：将步骤S4得到的阳性幼苗转移至蛭石+1/2MS培养基中，液体的1/2MS培养基浸湿蛭石即可，培养7天，观察有细根和根毛长出时，转移到培养土中，于培养箱里光照培养，待幼苗生长的健壮，转移至大棚。
作为进一步改进的，所述Ci培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖70g/L，2,4-D 10mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2；所述Ci双抗培养基为在Ci培养基基础上添加羧苄200mg/L、头孢200mg/L；所述MBNTH培养基为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后加6BA 0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，特美汀100mg/L，潮霉素50mg/L；所述M1/2BNTH培养基即MBNTH培养基中的MS为一半2.215g/L，其他相同；所述MBNT培养基即MBNTH培养基不加潮霉素其他不变的培养基；所述Rooting培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 5.5～6.0，高压灭菌后加IBA 0.2mg/L。
作为进一步改进的，所述侵染液含有农杆菌的OD600值为0.5～0.8。
本发明的有益效果是：
本发明所提供的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法及番木瓜农杆菌介导的转化方法，操作简单易行，愈伤组织诱导所需培养基配方简单高效，目的基因转化效率高，转化周期短，转化体系稳定，这个方法的应用为研究番木瓜基因功能、发掘有益基因并应用于育种具有非常重要的价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例的番木瓜种子萌发长芽的图。
图2是本发明实施例的切好后放置于K4培养基上的下胚轴的图。
图3是本发明实施例的转到M13培养基上一个月的下胚轴的图。
图4是本发明实施例的正在扩繁中的愈伤组织的图。
图5是本发明实施例的农杆菌侵染后置于Ci双抗培养基上的愈伤组织的图。
图6是本发明实施例的愈伤组织长出的嫩黄色小圆芽转接至MBNT培养基的图。
图7是本发明实施例的芽长大成苗的图。
图8是本发明实施例的目的基因35s-CpYh-1以35s-CpYh-1F/R为引物的扩增图。其中，1,2泳道为引物35s-CpYh-1F/R扩增片段。
图9是本发明实施例的重组载体以HYG-F/R和35s-CpYh-1F/R为引物的扩增图。其中，1,2泳道为载体序列HYG-F/R扩增结果，3,4泳道为35s-CpYh-1F/R扩增结果。
图10是本发明实施例的幼苗的PCR鉴定结果图。
图11是本发明实施例的幼苗的Southern鉴定结果图。其中，1-10泳道为1-10转基因株系，11为质粒对照。
图12是本发明实施例的幼苗的qPCR检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法
包括以下步骤：
(1)种子消毒：取木瓜种子250粒于灭过菌的组培瓶中，①、75％乙醇消毒1min，无菌水清洗3～5遍，②、3.5％NaClO溶液消毒20min，无菌水清洗3～5遍，③、0.1％升汞消毒10min，无菌水清洗3～5遍后，④、将种子用无菌镊子放到灭过菌的锥形瓶中，加入100ml25％的NaClO溶液，放入28，180rpm摇床4h；
(2)1M KNO3处理：取步骤(1)处理得到的种子，从25％NaClO溶液中取出，用无菌水清洗3～5遍，换成1mol/L的KNO3溶液，置于28℃，180rpm摇床24h。
(3)萌发换水：取步骤(2)处理得到的种子，从1mol/L的KNO3溶液中取出，用无菌水清洗3～5遍，换成含羧苄的无菌水，同时换新的灭过菌的锥形瓶，将漂浮的种子挑出丢弃，置于30℃，120rpm摇床，每天换无菌水，直至种子出芽。
(4)转移至水琼脂：待步骤(3)处理得到的种子芽长约0.5cm时，将其转移至水琼脂培养基上，将芽竖直轻轻插入水琼脂中，每瓶可放10粒左右出芽种子。直至出苗(如图1)，种子萌发率达100％。
(5)切下胚轴，诱导愈伤：待步骤(4)处理得到的芽长成苗，高度为8～10cm，顶端的两片子叶张开时，可取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上一个月(如图2)，然后转到M13培养基诱导愈伤(如图3)，长出愈伤组织后换成Ci培养基(如图4)；Ci上的愈伤组织约3～4周要进行一次扩繁，过程中将发生褐变、变硬及出现的白色芽状组织等愈伤去除，留下长势较好的愈伤组织进行扩繁，并做好标记，扩繁四到五次，即为番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体，此愈伤状态利于转化。
在本发明中，所述番木瓜的品种包括中白、中黄、中红或红飞。在本发明中，所述番木瓜优选采用中白番木瓜品种。
在步骤(3)中所述含羧苄(cb)的无菌水为100ml水中加入50μl cb母液，终浓度为500mg/L。
在步骤(4)中所述水琼脂培养基是按照9g/L的琼脂配置的，并高压灭菌后使用。
在步骤(5)中所切的下胚轴以两片子叶正好碰到组培瓶瓶口为佳，切记不可长太长，否则难以膨化。
在步骤(5)中所述K4培养基为：1/2MS即2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4～D 5mg/L(母液浓度1mg/ml)，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 6.1左右，高压灭菌后加激动素(KT)0.5mg/L；步骤(5)所述M13培养基为：1/2MS即MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L(母液浓度1mg/ml)，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 6.1左右，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L；步骤(5)所述Ci培养基为：1/2MS即MS 2.215g/L，蔗糖70g/L，2,4-D 10mg/L(母液浓度1mg/ml)，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 6.1左右。
实施例2
目的基因载体构建
含有35s-CpYh-1目的基因的重组载体是按照包括如下步骤的方法构建的：以sunup品种番木瓜的cDNA为模板，采用引物35s-CpYh-1F和35s-CpYh-1R进行PCR扩增，将扩增产物735bp的片段(如图8所示)以同源重组的方式插入到质粒pMC202(购自ABRC官网)载体的M13通用引物之间，得到重组载体pMC202-35s-CpYh-1，重组载体用引物HYG-F/R和引物35s-CpYh-1F/R扩增确定载体构建成功(如图9所示)。
目的基因35s-CpYh-1的核苷酸序列如SEQ IDNO.01所示：
该目的基因35s-CpYh-1属于转录因子ZF-HD(Zinc-finger homeodomain)，该转录因子在植物生长发育中扮演着重要角色。根据对该基因在不同性别番木瓜花上的分析，发现该基因存在于性别特异区域，在调控植物生长发育中扮演着重要的角色，此外它还与植物应对胁迫有关。ZF-HD家族可分为ZHD和MIF两个亚族。而ZF-HD最初是在水稻中被鉴定出来的，是一类新型的锌指结构同源域蛋白，能够间接的调控编码C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因。
引物35s-CpYh-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.02所示：GACCTCGACTCTAGAACTAGTATGGAGTTTGAGGATCAAGATGAGCAAG。
引物35s-CpYh-1R的核苷酸序列如SEQ IDNO.03所示：TTTACTCATTTTTTCTACCGGTACCGGGTTTCATACCCAGGGTTTGC。
引物HYG-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.04所示：CCACGGCCTCCAGAAGAAGATG。
引物HYG-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.05所示：CGAAGAATCTCGTGCTTTCAGC。
构建成功后转化到农杆菌中，使用液体LB溶液进行摇菌。其中卡那霉素的终浓度为50mg/L、利福平的终浓度为100mg/L。将菌液于50mL离心管中18℃3500rpm条件下离心10min，加入1/2MS重悬液(液体MS培养基，配方：1/2MS即2.215g/L，蔗糖30g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后放至常温)重悬，使其最终OD600值在0.5-0.8左右即可进行侵染。
实施例3
番木瓜愈伤组织的农杆菌介导的番木瓜转化方法
包括以下步骤：
1.侵染：将用1/2MS液体培养基悬浮的实施例2制备含有目的基因的农杆菌侵染液OD值调整为0.5～0.8，用侵染液将实施例1制备得到的番木瓜愈伤组织(即番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体)震荡浸泡15～20分钟(振荡侵染3～4分钟，静止11～17分钟)。竖立沉淀愈伤，倒掉上清液，愈伤用滤纸吸干，吹10分钟即可，不要吹太久。
2.共培养：将侵染过的愈伤组织置于Ci培养基上加无菌滤纸在暗室共培24小时，见到肉眼可见的农杆菌则需洗菌，无肉眼可见农杆菌则将共培好的愈伤组织于超净台内吹干。
3.抑菌：将吹干的愈伤组织置于Ci双抗培养基上(如图5)，约7～10天更换新的Ci双抗培养基，共抑菌培养17～20天，暗室内培养。
4.筛选：将培养的愈伤组织转接到M1/2BNTH培养基上置于光照下筛选，每2～4周更换一次新的M1/2BNTH培养基。共培养40～50天，然后转接到MBNTH培养基上，每3～4周更换一次新MBNTH培养基，直至长出嫩黄色小圆芽。
5.再生：将中愈伤组织长出的嫩黄色小圆芽转接至MBNT培养基中。每4周左右更换一次新培养基，待黄芽长大变成绿芽(如图6)，将绿色的嫩芽转移至含MBNTH培养基的培养瓶中再次筛选。根据幼苗生长情况进行培养基的更换。待长到2cm高，叶子和生长点都比较正常时(如图7)，进行生根。
6.生根：将得到的幼苗的基部切掉，不保留块状的愈伤组织部分，放入含生根Rooting培养基(IBA为0.2mg/L)的培养瓶中，约3～5周会有根长出。
7.将生根得到的幼苗进行PCR和Southern鉴定。
PCR使用引物为：正向引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.06所示：GCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACT；反向引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.07所示：TTCTACCACCCGCATCCCCATCA。PCR结果如图10所示，结果显示，15株植株中有13株为阳性苗，阳性率达86.7％。
Southern鉴定结果如图11所示，结果显示，1-10株系都能检测到阳性条带，说明我们得到的转基因植株都是单拷贝插入。
通过qPCR检测了转基因株系4号和8号株系的表达水平，结果如图12所示，结果显示植株超表达，并且植株中生长素合成相关基因YUC与生长素信号通路基因IAA表达都发生变化，这表明该基因可能参与调控生长素信号通路。
8.炼苗：待验证后为阳性的幼苗根长得比较多时，转移至蛭石+液体的1/2MS培养基中，液体培养基不要太多，只浸湿蛭石即可。培养7天。观察有细根和根毛长出时，放入培养土中，于培养箱里光照培养，保持培养箱内湿度。待苗生长健壮，即可转移至大棚。这样植株能保持3至4个月的良好生长状态，可广泛应用于转基因木瓜的研究。
步骤2所述Ci培养基为：1/2MS即MS 2.215g/L，蔗糖70g/L，2,4～D10mg/L(母液浓度1mg/ml)，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 6.1左右。
步骤3所述Ci双抗培养基为在Ci培养基基础上添加羧苄(cb)200mg/L、头孢(Cef)200mg/L。
步骤4所述MBNTH培养基为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后加6BA 0.2mg/L，NAA0.2mg/L，特美汀100mg/L，潮霉素50mg/L；步骤5所述M1/2BNTH培养基即MBNTH培养基中的MS为一半2.215g/L，其他相同；
步骤5所述MBNT培养基即MBNTH培养基不加潮霉素其他不变的培养基。
步骤6所述Rooting培养基为：1/2MS即2.215g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3～3.6g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后加IBA 0.2mg/L。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备及转化方法
<130> 2020
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 735
<212> DNA
<213> Carica papaya
<400> 1
atggagtttg aggatcaaga tgagcaagat gaagagatgg gaatgggaac tggttgtggg 60
tcactccgta actcgaccgg ggtcaaactg ggcggtccga aggctgtggg gacggggaca 120
gggacggatc atcggcagaa caggaaaccg aggtatagag agtgtctgaa gaaccacgcg 180
gtgggaattg gtggccaggc cgtggatggg tgcggcgagt tcatgccggc ggggatggag 240
ggctcgcttg atgctttgaa atgcgctgct tgtaactgtc atcgtaattt ccaccgtaag 300
gagacggaac cgccgtcatc ttcggcgggt gagttctacc acccgcatcc ccatcaggtg 360
atgccgcagt tcgcagccta ttatcgggga tcgtcggggt ttttgcaggt ggcgggggat 420
ggacagcatc agaggccgct gccgctgcgg tcgacgtcca gtaggcagag cagggagagg 480
gagtttgacc aagaggacat gtcgaacccg atgagcggcg ccggcggaag tgggtcgagc 540
aggaagaggt tcaggaccaa gttcacgcag gagcagaagg agaggatgct ggggctggcg 600
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gagactggac tgaagcgaca tgttctcaag gtgtggatgc ataataacaa gcaaaccctg 720
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<400> 7
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Claims (5)
1.一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中在黑暗的条件下培养至长苗，将苗的下胚轴切下进行愈伤组织诱导，待胚性愈伤长出后扩繁四到五次，即所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体；所述愈伤组织诱导为当待长出的苗的高度达8～10cm，顶端的两片子叶张开时，取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上培养1个月，然后转到M13培养基上诱导愈伤组织，长出愈伤组织后换成Ci培养基；所述K4培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L，所述M13培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4～D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L；所述Ci培养基为：MS2.215g/L，蔗糖70g/L，2,4-D 10mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2；
所述消毒为在无菌环境中，将番木瓜种子先后经过体积浓度为70～80％的酒精、体积浓度为3～4％的NaClO溶液和质量浓度为0.05～0.15％氯化汞消毒，最后用无菌水清洗数次；
所述浸泡为将番木瓜种子浸泡在体积浓度为18～22％的NaClO溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床3.5～4.5h；然后将番木瓜种子从NaClO溶液中取出，用无菌水清洗数次，浸泡在浓度为0.5～1.5mol/L的KNO3溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床20～26h。
2.根据权利要求1所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述抗生素为浓度为450～550mg/L的羧苄青霉素。
3.根据权利要求1所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：所述萌发长芽为将番木瓜种子从KNO3溶液中取出，用无菌水清洗数次，放入含有抗生素的无菌水中，置于28～32℃，110～130rpm摇床，每天更换含有抗生素的无菌水，直至番木瓜种子出芽。
4.一种应用权利要求1至3任一项中所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的农杆菌介导的转化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：在无菌环境中，用含有目的基因的农杆菌的侵染液侵染所述番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体，吹干；
S2：将侵染过的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体转移至Ci培养基上加无菌滤纸共培22～26小时，吹干，置于Ci双抗培养基上培养17～20天后，每7～10天更换新的Ci双抗培养基，然后转移至M1/2BNTH培养基上中共抑菌培养40～50天，每2～4周更换一次新的M1/2BNTH培养基，然后转接到MBNTH培养基上，每3～4周更换一次新MBNTH培养基，直至长出嫩黄色小圆芽；
S3：将步骤S2中中愈伤组织长出的嫩黄色小圆芽转接至MBNT培养基中，每4周更换一次MBNT培养基，待嫩黄色小圆芽长成2～2.5cm高的幼苗时，将幼苗的基部切掉，放入Rooting培养基中，培养3～5周进行生根；
S4：将步骤S3中生根的幼苗进行PCR和Southern鉴定；
S5：将步骤S4得到的阳性幼苗转移至蛭石+1/2MS培养基中，液体的1/2MS培养基浸湿蛭石即可，培养7天，观察有细根和根毛长出时，转移到培养土中，于培养箱里光照培养，待幼苗生长的健壮，转移至大棚；
所述Ci培养基为：MS2.215g/L，蔗糖70g/L，2,4-D 10mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2；所述Ci双抗培养基为在Ci培养基基础上添加羧苄200mg/L、头孢200mg/L；所述MBNTH培养基为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后加6BA0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，特美汀100mg/L，潮霉素50mg/L；所述M1/2BNTH培养基即MBNTH培养基中的MS为一半2.215g/L，其他相同；所述MBNT培养基即MBNTH培养基不加潮霉素其他不变的培养基；所述Rooting培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 5.5～6.0，高压灭菌后加IBA0.2mg/L。
5.根据权利要求4所述的农杆菌介导的转化方法，其特征在于：所述侵染液含有农杆菌的OD 600值为0.5～0.8。
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| CN111771724B (zh) * | 2020-07-24 | 2022-07-22 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种基于单细胞起源的番木瓜高效植株再生方法 |
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| CN113455396A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-10-01 | 中国热带农业科学院橡胶研究所 | 一种番木瓜组培苗生根及移栽方法 |
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2020
- 2020-01-20 CN CN202010065345.0A patent/CN111454983B/zh active Active
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| CN108040875A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-18 | 青岛袁策生物科技有限公司 | 一种高效诱导胚愈伤组织的培养基的筛选配置方法 |
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